JP2006514548A - ボルレリジン−製造ポリケチドシンターゼ、及びその使用 - Google Patents

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Abstract

【課題】なし
【解決手段】
本発明は、ポリケチドシンターゼをコードしている核酸のクローニングからのポリケチド、及び誘導体の生合成、及び該ポリケチドボレリジンの合成に関与した、他の関連タンパク質に関するものである。ボレリジン及び類似体を含むポリケチド、及びその誘導体の調製用の、酵素システム、核酸、ベクター、及び細胞を含む、物質及び方法を提供する。

Description

本発明は、ポリケチド調製用物質、及び方法に関するものである。ポリケチド、及び特に該ポリケチドマクロライドボルレリジンの調製用の酵素系、核酸、ベクター、及び細胞を提供する。
（本発明の背景）
ポリケチドは、広範囲の生物体により、及び特に微生物により産生される天然物である。ポリケチドは、多くの重要な薬学、獣医学、及び農学の用途を有する。ポリケチドは、非常に多くの化学構造種を含み、かつ広範囲の関連する生物学的活性を有する。医療において使用されるポリケチドは、広範囲の治療的、及び生物学的特性を有する、抗生物質、免疫抑制剤、抗癌剤、他の化学療法剤、及び他の化合物を含む。グラム陽性菌ストレプトマイセス（Streptomyces）、及びこれらの同属類は、ポリケチドの並外れた産生体であり、かつこれらの生物体において、該遺伝子、及びポリケチド生合成の生化学は、比較的よく特性化されている（Hopwoodらの論文、1997）。ストレプトマイセスにおいて、ポリケチド生合成のための遺伝子は、クラスター化され、かつDNA技術の利用は、これらの生合成に関与する遺伝子をコードするDNAプローブを用いて、完全な生合成遺伝子クラスターを単離することが可能である。従って、ストレプトマイセス、及び他の微生物におけるポリケチド生合成のための、増加した多数の遺伝子クラスターが、単離され、かつ配列決定されており、例えば、ポリエーテルモネンシン（国際公開第01/68867号）、ポリエンナイスタチン（国際公開第01/59126号）、及びラパマイシン（Schweckeらの論文、1995）がある。
ポリケチドは、カルボン酸官能基を含む、基礎単位の繰返し縮合を介して合成される。該工程の各段階で、新たなβ-ケト官能基、及び該成長鎖のα-側鎖分岐を形成する。ポリケチドの構造多様性は、下記を含む、これらの生合成過程の多くの局面から誘導される：これらの生合成に利用され得る、多種多様の開始単位；可能な、異なる長さのポリケチド鎖；該ポリケチド鎖の組立ての間、又は後に導入される様々なα-側鎖；該ポリケチド鎖の組立ての間、又は後に導入される様々なβ-置換体；該β-ケト基が起こし得る（ケト、ヒドロキシル、エノイル、及びメチレン）、プロセシングの様々な度合い；及び該α-、及びβ-中央で可能な、様々な立体化学である。
ポリケチド合成は、酵素により、又はポリケチドシンターゼ（PKS）と称される、酵素の複合体により、脂肪酸生合成と類似した様式で触媒される。ストレプトマイセス、及び関連属PKSは、３つの主な種類：I型、II型、及びIII型に分類される。III型PKSは、植物体のカルコン合成に関連した、低分子タンパク質であり、最近になって発見された（Moore、及びHopkeの論文、2000）。III型システムは、少数の二次代謝産物に関係している。しかし、一般的には、溶解性色素の生合成に関与している（Cortesらの論文、2002）。該II型PKSは、幾つかの一官能性タンパク質から構成されており、多ポリペプチド複合体として働く。アクチノルホジン（actinorhodin）のような、単純な芳香族ポリケチドは、幾つかの一連の鎖組立により形成され、該組立は、一連のPKS遺伝子によりコードされている、一連のII型PKS酵素を反復して行われる（Hopwoodの論文、1997）。I型PKSは、多官能性タンパク質であり、かつさらにエリスロマイシン、及びラパマイシンのような、複合ポリケチドの合成に必須である。本特許の焦点として、I型PKSの組織化、及び機能を、以下に詳細に記述する。
I型PKSは、モジュールに分けられ、そのため、各モジュールは、一連の鎖組立を実行するために必須である、幾つかの触媒的‘ドメイン’から構成される（Staunton、及びWilkinsonの論文、1997）。通常、モジュールPKSは、正確な数のモジュール（装填に加えて、伸長モジュール）を含み、正確な数の装填、及び伸長単位を選択し、かつ縮合する。例えば、該エリスロマイシンPKSは、7つのモジュール（１個の装填、及び６個の伸長モジュール）から構成され、該エリスロマイシン前駆体6-デオキシエリスロノライドB（6-deoxyerythronolide B）の生合成に必須である、１つの開始剤、及び６つの伸長単位を縮合する。従って、該PKS内にあるモジュールの数と組込まれる単位の数との間に相関関係がある。この相関関係は、‘共直線性’として、記載される。
本明細書中で使用する、該用語‘伸長モジュール’とは、β-ケトアシル-アシルキャリアタンパク質シンターゼ（KS）ドメインから、該次のアシルキャリアタンパク質（ACP）ドメインまでの一連の近接ドメインのことを言い、ポリケチド鎖伸長の一サイクルを行う。本明細書中で使用する、該用語‘装填モジュール’とは、全グループの近接ドメインのことを言い、該PKS上に、該開始単位の装填を行い、かつ従って、第一伸長モジュールのKSドメインに利用できるものを与える。該重要なKSドメインの触媒活性により実行される、該成長ポリケチド鎖上の該次の伸長カルボン酸（又はケチド）単位の縮合に加え、I型PKSのモジュールは、β-ケトレダクターゼ（KR）、デヒドロゲナーゼ（DH）、及びエノイルレダクターゼ（ER）活性を含むことができ、これらは、鎖伸長の間の、β-ケト基を新たに形成する、さらなる工程に関与している。該アシルトランスフェラーゼ（AT）、及び該ACPドメインは、伸長単位の選択に、及びそれぞれ、該PKS上のその経過の間に、成長鎖のつなぎに関与している、各モジュール内に存在する。また、モジュラーPKSの該ATドメインを、個々のタンパク質として見出すことができる（Chengらの論文、2003）。通常、該完成ポリケチドは、ターミナルチオエステラーゼ（TE）ドメインの活性により、PKSから放出され、また通常、最終生成物の環化（ラクトン化）を伴う。また、他の鎖終結/環化の方法は、ラパマイシン（Schweckeらの論文、1995）に対して観察されるような、アミノ酸残基の付加、及びマクロラクタム形成、リファマイシン（Augusらの論文、1998）に関するマクロラクタム形成、及びマイキサラミド（myxalamid）生合成（Silakowskiらの論文、2001）に関する、アミノ酸の組込み、続く還元的脱離のように用いられる。要約すると、一つの酵素的ドメインは、該PKS上の生合成の間に生じる、各連続的触媒工程に存在し、かつこれらは、該タンパク質、及び行われる該特定の機能内の、これらの局在に依存した、規定配列中に使用される。この機序を、‘前進的（processive）’と称する。
I型PKSのモジュラー配置が、該エリスロマイシンPKS（6-デオキシエリスロノライド B シンターゼとしても知られている、DEBS）の変異体により、モジュール５の該KSドメイン領域のインフレーム除去を介して、初めて確認された（Donadioらの論文、1991）。これは、前進的生合成のこの段階で、該β-ケト基５を還元する変異KRドメインの能力がないため、該エリスロマイシン類似体、5,6-ジデオキシ-3-α-マイカロシル-5-オキソエリスロノライドB（5,6-dideoxy-3-α-mycarosyl-5-oxoerythronolide B）、及び5,6-ジデオキシ5-オキソエリスロノライドBの製造へと導かれる。さらに、該対応するPKSコードDNAの遺伝子工学による、DEBS2のモジュール４の該ERドメイン内にある、該活性部位残基の変更、及びサッカロポリスポラ エリスラエア（Saccharopolyspora erythraea）内へのその導入により、6,7-無水エリスロマイシンCの製造へと導かれる（Donadioらの論文、1993）。さらに、DEBSにより形成された、該ポリケチド鎖の長さは、DEBS3からDEBS1末端への該TEドメインの特定の再配置を介して変更されており；該予測されるトリケチドラクトン生成物が、よい収量で製造される（Cortesらの論文、1995）。記載された該変化は、配列除去による、又は配列の特定の不活性化による、又は該同一PKSクラスター内から、DNA配列の代わりの配置による、改質を含む（すなわち、これらは‘相同的変化’と考えられる。）。該エリスロマイシンPKSに対する、他のそのような‘相同的’変化は、国際公開第93/13663号に記載されている。
I型PKS遺伝子の該モジュラー構成は、これらの遺伝子操作に適しており、変化したポリケチド構造体を製造する。I型PKSは、モジュールの数を変えることにより；異なるカルボン酸開始単位、及び伸長単位のために、これらの特異性を変えることにより；異なる活性、及び特異性を有するドメインを、不活性化、変異化、除去、交換、又は挿入により；及び終結、又は環化ドメインの再配置を介して、該鎖、又は環サイズを変更することにより操作され得る、ポリケチド生合成に対する、組立ラインを表す（Staunton、及びWilkinsonの論文、1997）。
国際公開第98/01546号には、非相同的DNAの組込みを含む、ハイブリッド型PKS遺伝子構築体の製造が記載されている。国際公開第98/01546号には、非相同的モジュール、サブ-モジュール、又は該天然遺伝子のドメインをコードしている遺伝子の置換が、変化した構造を有する新規ポリケチドを生成する、ハイブリッド型PKSの生成方法が記載されている。変化したアルキル分岐を有する、新規ポリケチドを製造するために、特に、例えば、ラパマイシン、又はモネンシンPKS由来の、非相同的DNAの該ATドメインを、該エリスロマイシンPKSの野生型ドメインと交換することができる。そのような、ATドメイン交換は、正確に、ハイブリッド型PKSの製造の初めての例を示した（Oliynykらの論文、1996）。また、国際公開第98/01546号には、一般的用語、装填モジュール、及び少なくとも１個の伸長モジュールを含む、ハイブリッド型PKS構築体の製造が記載されている。特に、該エリスロマイシンPKS（DEBS1）の第一タンパク質上に、該通常の装填モジュールの代わりに、該アベルメクチン-産生PKSに対する広範囲特異的な装填モジュールを接合することによる、ハイブリッド型PKS遺伝子組立構造体が記載されている（Marsdenらの論文、1998も参照されたい。）。また、基質特異的である、装填モジュールの交換を含む、さらなる例が記載されている（国際公開第00/00618号；米国特許第5876991号；Kuhstossらの論文、1996）。国際公開第00/01827号には、PKAモジュールのβ-ケトプロセッシング能力を、‘還元性ループ’を交換する能力、すなわち、モジュール内のケトレダクターゼ、デヒドロゲナーゼ、及びエノイルレダクターゼドメインの数、及び種を変える、迅速な、かつコンビナトリアル方法における能力を通して、変える方法が記載されている。β-ケト基のプロセッシングの水準を変えることに加えて、また、そのような変化は、該変化したモジュールにより形成される、該α-アルキル、及びβ-ヒドロキシル基の立体化学の変化を生じ得る。
モジュラーPKSは、前述の共直線、及び前進的方法において、‘通常'に機能するが、この様式の機能からはずれた例を、次に記載し、かつ論じる。
ストレプトマイセス ベネズエラエ（Streptomyces venezuelae）における、該ピクロマイシン（picromycin）PKS遺伝子クラスターは、ピクロマイシン（14-員環、ヘプタケチドマクロライド）、及びメチマイシン（methymycin）（12-員環、ヘキサケチドマクロライド）（Xueらの論文、1998）、双方の生合成に関与する。環サイズの異なる、２つの関連マクロライドを製造する、単独PKSの能力は、最終PKS遺伝子pikA4の選択的発現から誘導される（Xue、及びShermanの論文、2000）。‘通常'発現が生じ、かつ全長PikA4が形成された場合、第6番目の伸長単位が組込まれ、かつ該ピクロマイシンアグリコンが製造され；別の発現が生じ、かつPikA4のN-末端切断形態が生じた場合、組込まれる第6番目の伸長単位はなく、かつ該成長ポリケチド鎖は、直接的に該TEドメインを通過し、該メチマイシンアグリコンの形成を導く。従って、共直線性の崩壊が生じ、かつ‘環収縮’生成物が形成される。この影響に対する該生化学的基礎を調査し、かつ介在するKS6ドメインに対して共有結合を失い、ACP5からACP6転移となることを示した；共直線性のこのような崩壊は、‘スキッピング（skipping）’と呼ばれている（Beckらの論文、2002）。
また、スキッピングは、該天然ヘプタケチド-製造PKSを、オクタケチド-製造PKSに変換するために、該ラパマイシン由来の特別な伸長モジュールを、該エリスロマイシンPKS内に挿入した場合に起こることが観察されている（Roweらの論文、2001）。16員環マクロライドである、該予測されたオクタケチドが製造されたが、主な生成物は、通常のヘプタケチド生成物6-デオキシエリスロノライドであった。該挿入されたモジュールの‘スキッピング’は、該前記モジュールから、一連の鎖伸長を行わない、次の下流のモジュールに、該成長鎖が移動する‘シャトル（shuttle）’のような、幾つかの原因に影響する該挿入されたモジュールに起因して生じると考えられる。該挿入モジュールのACPドメインは、前述のメチマイシン生合成に対して記載した機序と類似している機序のスキッピングの間に、先行ACPドメインの成長ポリケチド鎖の移動、及び該次のモジュールのKSドメインへの移動において、必須であることが、その後に示された（Thomasらの論文、2002）。スキッピングは、該KSドメインの活性部位求核試薬なしに生じ得る。環収縮（スキッピング）したネマデクチン（nemadectin）（駆虫性マクロライド）が、化学的変異により改質された、ストレプトマイセス土壌単離体の突然変異体から報告されている（Ruddらの論文、1990）；該天然PKS生成物の生合成は、無効化された。
モジュラーPKSが、共直線作用から外れる、別の方法には、モジュールの反復作用がある。例えば、該エリスロマイシンPKSのモジュール4は、低水準で、反復的に作用するようであり、6-デオキシエリスロノライドBに関連する、環拡大した16-員環のオクタケチドマクロライドを生成する（Wilkinsonらの論文、2000）。この作用のある、該エリスロマイシンPKSの能力は、‘スタッタリング（stuttering）’と称されている。該エリスロマイシンPKSの‘スタッタリング’は、このスタッタリングの生成物が、低収率で形成され、かつ該エリスロマイシンPKSの主生成物が、‘共直線作用’により形成される、標準的ヘプタケチド6-デオキシエリトノライドBであるので、異常な過程と考えられる。また、スタッタリング、及びスキッピング、双方により形成されたようである生成物が、エポチロン（epothilone）産生株のソランギウム細胞（Sorangium cellulosum）から、微量成分として、報告されている（Hardtらの論文、2001）。スティグマテラ アウランティアカ（Stigmatella aurantiaca）のスティグマテリン（stigmatellin）生合成クラスターは、１０個のモジュール（１個の装填、及び９個の伸長）を含む、PKSをコードしている（Gaitatzisらの論文、2002）；しかし、構造の解明、及び安定同位体ラベルした基質の供給の結果に基づくと、スティグマテリンは、１１個のモジュラー派生単位から形成されている。従って、スティグマテリンPKSモジュールの一つは、反復作用を（２度）操作することを現しているであろう。
本件出願の優先権出願以後、ストレプトマイセス ロケイ（Streptomyces rochei）による、該マクロライドのランカシジン（lankacidin）の生合成に関連したPKS配列が、報告されている（Mochizukiらの論文、2003）。また、このPKSは、ランカシジン生合成に必須な伸長サイクルの数に比べて、非常にわずかなモジュールを含んでいるようである。しかし、その機序は、明らかとなっていない。
付加的な構造多様性を、幾つかのアンサマイシン（ansamycin）の生合成の間に見られるような、鎖組立工程の間（Flossの論文、2001）、又は該鎖組立工程の次の該PKSからの放出の後に、該PKS以外の酵素によるポリケチド修飾を介して、生じさせることができる。このような非-PKS媒介反応には、制限されないが、下記反応がある：還元、酸化、ヒドロキシル化、アシル化、アルキル化、アミノ化、脱炭酸、脱水、二重結合異性化/転移、環化、環開裂、共役、グリコシル化、還元的脱離、及びこれらのすべての組合せである。これらの反応を、鎖組立後に行う場合、これらは、ポスト-PKS、又はテイラー段階と称される。通常、このようなテイラー段階は、常にではないが、生物学的活性を有する該ポリケチド天然産物を与えるために必須である。
さらに、生合成的に行うことができる、ポリケチドの構造変化を、非相同的ポスト-PKSテイラー酵素を用いることにより、並びに該天然ポリケチドを、自然に改質した酵素を用いることにより、向上することができる（Gaisserらの論文、2000）。国際公開第01/79520号には、グリコシル化、エポキシ化、ヒドロキシル化、及びメチル化を介して、ポリケチドマクロライド構造体の該非相同的改質が記載されている。別のデオキシヘキソースを用いたグリコシル化を介して、農業化合物スピノシン（spinosyn）の類似体を生成する能力が、報告されている（Gaisserらの論文、2002）。
ボルレリジン（Borrelidin）1（図１）は、制限されないが、下記のものを含む、幾つかの菌株から産生された、18員環マクロライドである：ストレプトマイセス ロケイ ATCC23956、ストレプトマイセス パルブルス（Streptomyces parvulus）Tue113、及びストレプトマイセス パルブルス Tue4055である。ここには、トランス-シクロペンタン-1,2-ジカルボン酸開始酸、３つのマロニル-CoA、及びメチルマロニル-CoA伸長単位から誘導される、ボルレリジンを示す（図２参照）。該結晶構造に基づき、かつ最近の全合成により確証された、ボルレリジンの絶対立体化学から、実際の該開始酸は、トランス-シクロペンタン-（1R,2R）-ジカルボン酸になることが予測される。安定同位体ラベル化アセテート、及びプロピオネート基質の供給後に単離したボルレリジンは、これらの基礎的要素の予測された組込みを、明瞭に示した；さらに、該開始単位の形成を伴うと考えられる、特定の遺伝子が破壊された突然変異体への、トランス-シクロペンタン-1,2-ジカルボン酸の供給が、再建ボルレリジン生合成にとって十分であったことを、本出願で示している。ボルレリジンは、該C12位置に結合したニトリル基を含み、この位置にある、メチル分岐を派生しているメチルマロニル-CoAに従って、テイラー酵素の作用を生じることを、本明細書中に示す。該ボルレリジンの全体構造は、1967年に初めて明らかにされ（Keller-Scheirleinの論文、1967）、かつ、その後、詳細なNMR分析により、洗練された（Kuoらの論文、1989）。該ボルレリジンの絶対配置は、X-線結晶学により確認された（Andersonらの論文、1989）。該抗体トレポネマイシン（treponemycin）として、その同一性が実証されている（Maehr、及びEvansの論文、1987）。
多くのグループが、該ボルレリジン構造体の断片の合成を報告しており、かつ本出願の優先権出願以来、２つの独立したボルレリジン全合成が、報告されている（Hanessianらの論文、2003；Duffeyらの論文、2003）。
ボルレリジンの抗菌作用（Bergerらの論文）が初めて発見されたが、この抗菌作用は、の限定された数のミクロコッカスに対してのみ示され、かつすべての一般的試験バクテリアに対しては、見出されていない。感受性微生物における作用の機序は、トレオニルtRNAシンテターゼの選択的阻害が含まれる（Paetz、及びNassらの論文、1973）。トレポネーマ属のスピロヘータに対する他の活性、ウイルスに対する他の活性（Dickinsonらの論文、1965）、動物ペスト、及び雑草の制御に対する使用、及び農業殺菌剤としての使用（DE 19835669；US 6,193,964）が報告されている。さらに、本出願の優先権出願以来、薬剤耐性熱帯熱マラリア原虫菌株に対する、抗マラリア活性を有するボルレリジンが報告されている（Otoguroらの論文、2003）。これらのすべての報告のうち、２つのみが、合成的に改質した誘導体を報告している。これらの第一は、該ベンジルエステル、及びそのビス-O-（4-ニトロベンゾイル）誘導体を記述している。これらの第二は、該ボルレリジンメチルエステル、該メチルエステルビスO-アセチル誘導体、及び該メチルエステルΔ14-15-ジヒドロ-、Δ14-15,12-13-テトラヒドロ-、及びΔ14-15,12-13-テトラヒドロ-C12-アミノ誘導体を記述している（Anderton、及びRickardsらの論文、1965）。これらの化合物すべては、生物活性がないと報告されている。
特定の対象について、最近の開示は、ボルレリジンが、抗-血管新生活性を示すという発見である（Wakabayashiらの論文、1997）。血管新生は、新たな血管の形成工程である。血管新生は、成人において、下記工程を伴う：次の局所的外傷、及び女性生殖周期を修復することを伴って、局所的に、かつ一時的にのみ生じる。癌、関節リュウマチ、及び糖尿病性網膜症を含む、幾つかの病原工程における主要要素として確立されている。直径1〜2 cmを超えて成長することが可能な腫瘍に対する、その重要性は、Folkmanによって確立され（Folkmanらの論文、1986）、かつ低酸素症に関連した腫瘍により誘発される。その下流において、重要な血管新生は、主にホスト-誘導工程であり、従って血管新生の阻害は、癌の種類、及び薬剤耐性の多様性のような、他の抗癌治療様式の障害を回避した、癌治療の十分な可能性を提案する（Matterらの論文、2001）。最近の公報は、血管新生の制御において、チロシニル-、及びトリプトファニルtRNAシンテターゼの機能的関与を記載している（Wakasugiらの論文、2002；Otaniらの論文、2002）。
血管新生のラット大動脈マトリックス培養モデルにおいて、ボルレリジンは、強力な血管新生阻害効果を示し、かつ、また、該毛細血管形成細胞のアポトーシスを誘発する、投与量依存方法において、形成された毛細血管の破壊を引き起こす（Wakabayashiらの論文、1997）。ボルレリジンは、IC50値0.4 ng/ml（0.8 nM）で、毛細血管形成を阻害した。該同じ研究において、ボルレリジンは、細胞増殖アッセイにおけるヒト臍静脈内皮細胞（HUVEC）に関して、抗-増殖活性を有することが示された；該IC50値は、6 ng/mlと測定され、これは、該同じ培地内で測定された抗-血管新生活性よりも、15倍弱い。ボルレリジンのこの抗-増殖活性は、様々な細胞株に関して、一般的であることが示された。これらのデータに加え、該著者らは、ボルレリジンが、培養ラット細胞において、tRNAシンテターゼ、及びタンパク質合成を阻害することを報告している；しかし、抗-血管新生に対する該IC50値は、該化合物の別の活性を示すタンパク質合成の阻害に対して、報告されたIC50よりも、50倍低い。
また、ボルレリジンは、マウス背部空気嚢モデルを用いたインビボにおいて、強い血管新生阻害を示し（Funahashiらの論文、1999）、VEGF-誘発血管新生を調査し、かつ腫瘍血管新生の研究の優れたモデルである。ボルレリジンを、腹腔内投与により、1.8 mg/kgの量で投与し、かつWiDr細胞により誘発される血管量の増加を、有意に減少することが示され、かつ臨床試験において、合成的血管新生阻害剤である、TNP-470投与量よりも高い値である。詳細なコントロールは、これらのデータが、血管新生を阻害し、かつ該腫瘍細胞増殖を阻害しないに対して変化するということを実証した。また、該著者らは、ボルレリジンが、同じ投与量で、これらの形成を伴う、該血管形成過程を阻害することにより、B16-BL6メラノーマ細胞の自発的肺転移の形成阻害に効果的であることを示した。
JP 9-227,549、及びJP 8-173,167は、ボルレリジンが、ヒト大腸癌のWiDr細胞株に対して、また、ヒト前立腺癌のPC-3細胞株に対して効果的であることを、確認している。JP 9-227,549は、ストレプトマイセス ロケイ Mer-N7167（Ferm P-14670）による、ボルレリジンの製造、及び該得られる発酵培養液からのその単離を記載している。ボルレリジンに加えて、1,12-デスニトリル-12-カルボキシルボルレリジン2（おそらく、生合成中間体、又は分路代謝産物である。）、10-デスメチルボルレリジン3（おそらく、該ボルレリジンPKSのモジュール4内の別のマロニル-CoA伸長単位の間違った組込みにより生じる、生合成類似体）、11-エピボルレリジン4、及び該C14,C15-シスボルレリジン類似体5を記載している（図１参照）。従って、JP 9-227,549は、ボルレリジン、及びボルレリジン類似体を明記しており、ここで、ニトリル、又はカルボキシル基は、該炭素骨格C12に結合しており、かつ水素原子、又は低級アルキル基は、該炭素骨格C10に結合している。
国際公開第01/09113号は、該シクロペンタン環のカルボン酸部位での、合成的改質を受けた、ボルレリジンの調製を開示している。これらの化合物の活性を、前記方法と類似した方法で、内皮細胞増殖、及び内皮毛細血管形成アッセイを用いて調査した。一般に、該カルボキル部分の改良は毛細血管形成阻害についての選択性を改善した。選択性におけるこの改善に関する主な理由は、該細胞増殖阻害活性の低下を介するものであり、一方、該毛細血管形成阻害活性は、さらに低い程度に変わる。特に、ボルレリジンについての細胞増殖に対する該毛細血管形成阻害活性に対して、該ボルレリジン-ボルレリジン-モルホリノエチルエステルは、60倍の選択性指数を示し、該ボルレリジン-アミドは、37倍の選択性指数を示し、該ボルレリジン-（2-ピリジル）-エチルエステルは、7.5倍の選択性指数を示し、かつ該ボルレリジン-モルホリノエチルアミドは、6倍の選択性指数を示した。これらの、及び他のボルレリジン誘導体の該毛細血管形成阻害活性は、微細血管形成アッセイを用いて実証された。さらに、該著者らは、ルイス肺腺癌モデルを用いた場合、該原発腫瘍の除去後に、ボルレリジンが、転移性小結節の伝播を、弱く阻害することを示した。しかし、該ボルレリジン-（3-ピコリルアミド）誘導体を、ラットにおいて、亜毒性投与量で、腹腔内、及び経口的に投与することにより、微小転移の増加を非常に大幅に阻害することが報告された。同様に、大腸38脾臓肝臓モデルを用いた場合、マウス脾臓内に移植したマウス大腸腺癌細胞の該転移形成能が、このボルレリジンの亜毒性投与量で処置後、大幅に低下した。これらのデータから、転移形成を阻害する、初期に報告された、ボルレリジン、及びその誘導体の能力が確証された。
また、ボルレリジンは、IC50値が12μg/ml（24μM）である、サッカロミセス セリビジアエ（Saccharomyces cerivisiae）のサイクリン依存性キナーゼ阻害剤Cdc28/Cln2として同定されている（Tsuchiyaらの論文、2001）。ボルレリジンは、後期G1相（α-接合フェロモンから区別できない時点）において、かつ全体のタンパク質生合成に影響しない濃度で、単相体、及び二倍体細胞、双方を停止することが示された。これらのデータは、ボルレリジンが、抗-腫瘍剤開発のためのリード化合物となる可能性があることを示している。
さらに、本件出願の優先権出願以来、ボルレリジンの生物学的活性に関する、２つの報告が公表されている。これらのうちの第一は、ボルレリジンの抗-血管形成作用が、異なる過程を通して、介在することを示している（Kawamuraらの論文、2003）。高濃度トレオニンが、該ラット大動脈培養モデルの毛細血管形成、及びHUVEC細胞増殖、双方を阻害するボルレリジンの能力を弱めることがわかった。しかし、形成した毛細血管を虚脱させ、かつHUVECのアポトーシスを誘発する、ボルレリジンの該能力に影響はなかった。また、ボルレリジンは、カスパーゼ-3、及びカスパーゼ-8を活性化し、かつ、これらの抑制されたボルレリジンの双方の阻害剤は、HUVECのアポトーシスを誘発することがわかった。これらの論文の第二は、サッカロミセス セレビジアエ（Saccharomyces cerevisiae）のボルレリジン作用を洞察する、全体的な細胞mRNAプロファイリングを用いた（Eastwood、及びSchausの論文、2003）。この分析は、ボルレリジンを処置した時間-依存方法において、アミノ酸生合成酵素の誘導を示し、かつ、この過程の誘導が、該GCN4転写因子を伴うことが判明した。
要約すると、ボルレリジンの該血管新生阻害作用は、増殖、及び毛細血管形成の二つの腫瘍-生物学的作用に向かったものである。さらに、ボルレリジン、及びその誘導体は、転移の伝播を阻害することが示されている。また、ボルレリジンは、腫瘍組織を処置する治療薬としての調査に対して、単剤として、又は他の治療の付加物としての使用に対して、特に魅力的な対象である。さらに、これらは、制限されないが、下記リストを含む、血管新生が病原性プロセスに関わる、他の疾病の処置に使用され得る：関節リュウマチ、乾癬、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性網膜症、及び様々な眼科疾患である。
（本発明の要旨）
本発明は、ストレプトマイセス パルブルス Tue4055における、該ポリケチドマクロライドボルレリジン合成の制御に関与する、該生合成遺伝子クラスターの全核酸配列を提供する。また、他のポリケチド生合成遺伝子クラスターの特異的検出において、ストレプトマイセス パルブルス、及び向上した水準の産生のための、又は改質又は新規ポリケチドの産生、及び改質又は新規ポリケチドの該生合成のPKSシステムをコードしている組換え型遺伝子の産生のための、他の適切な宿主株の突然変異株の工学技術において、該クローンDNA、及びその核酸配列のすべて、又は一部の使用を提供する。
本発明は、ボルレリジン生合成遺伝子クラスターのすべて、又は一部を含む、単離核酸分子を提供する。
ストレプトマイセス パルブルス Tue4055由来の該ボルレリジン生合成遺伝子クラスターの完全ヌクレオチド配列を、配列番号：１に示す。その構成を、図３に示し、かつ下記に示す遺伝子、及び読み取り枠を含む：borA1、borA2、borA3、borA4、borA5、borA6、borB、borC、borD、borE、borF、borG、borH、borI、borJ、borK、borL、borM、borN、borO、orfB1、orfB2、orfB3、orfB4、orfB5、orfB6、orfB7、orfB8、orfB9、orfB10、orfB11、orfB12、orfB13、orfB14、orfB15、orfB16、orfB17、orfB18、orfB19、orfB20、orfB21、及びorfB22である。
該クローン遺伝子の提案される機能を、図４（該開始単位の提案される生合成）、５（該ボルレリジンPKSの構成、及び前駆ボルレリジンの生合成）、及び６（該C12-ニトリル部位の導入）に記載し、かつ以下に記載する。
従って、本発明は、下記を含む単離核酸分子を提供する：
（a）配列番号：１に示すヌクレオチド配列、又はその一部又は断片；又は
（b）配列番号：１の相補体であるヌクレオチド配列、又はその一部又は断片；又は
（c）配列番号：１のコード配列を有する、縮重したヌクレオチド配列、又はその一部又は断片である。
ここで使用される、ヌクレオチド配列に関する該用語“断片”とは、少なくとも１０個、好ましくは少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも５０個、少なくとも７５個、少なくとも１００個、少なくとも１５０個、又は少なくとも２００個のヌクレオチド長さである、核酸残基の長さのことである。好ましくは、配列番号：１の一部、又は断片が、配列番号：１の第7603〜59966番目のヌクレオチド位置間に伸びている配列である。
該配列は、ポリケチド生合成遺伝子クラスター、又はその一部のポリペプチドをコードし得る、又はコードしている配列に対して、相補的であり得る。“ポリケチド生合成遺伝子クラスターのポリペプチド”は、ポリケチド生合成遺伝子クラスター、及び特に該ボルレリジン生合成遺伝子クラスターの一以上の読み取り枠によりコードされているポリペプチドを意味する。
ポリケチド生合成遺伝子クラスターは、ポリケチド、又はマクロライド部位の生合成において、活性を有するポリペプチドをコードしている、複数の遺伝子を含む、DNA断片である。これは、とりわけ、該ポリケチド骨格の合成、及び側鎖の還元工程に機能する、該ポリケチドシンターゼ（PKS）の構成要素に制限されない。しかし、また、該ポリケチド合成の補助的な機能を有するポリペプチドを含む。従って、また、該生合成遺伝子クラスターのポリペプチドは、マクロライド環、又はポリケチド鎖改質に（例えば、ボルレリジンの該C12ニトリル部位を形成する反応を触媒する）、ポリケチド又はマクロライド部位の前駆体又は開始酸の合成（例えば、該ボルレリジンPKS、又は該鎖の開始剤、及び伸長単位の該コエンザイム-Aのような分子の活性に関与する該トランス-シクロペンタン-1,2-ジカルボン酸開始単位を合成する反応を触媒する）、調節活性（例えば、ポリケチド又はマクロライド合成を伴う、該遺伝子、又はタンパク質の発現の調節）、輸送体活性（例えば、該細胞内のポリケチド又はマクロライド部位に対応する基質の、又は該細胞外のポリケチド又はマクロライド分子のような合成生成物の輸送に）、及び該合成生成物に対する産生細胞の与えられた耐性（例えば、該合成分子に対する特異的結合を通して、又は該合成分子が、該細胞の内側、又は外側に結合し得る、他の内在性タンパク質に対する置換のような）に作用し得る。
また、該遺伝子クラスターは、該遺伝子クラスターの該コード領域に、機能し得るように結合した、プロモーター、及び他の転写制御配列のような、非コード領域を含む。当業者は、ここで提供した情報を基に、その構成を同定することが可能であり、かつこれらは、本発明の範囲内である。
好ましくは、配列番号：１内をコードしている遺伝子、及び読み取り枠は、配列番号：１の一部、又は断片を表す。従って、“単離”核酸分子は、ボルレリジン生合成遺伝子クラスター由来のポリペプチドをコードしている配列を含むことができ、ここで、前記ポリペプチドは、配列番号：２〜４３、及び１１３からなる群から選択されたアミノ酸配列を有する。
好ましい実施態様において、該核酸配列は、下記からなる、配列番号：１の読み取り枠群から選択された読み取り枠を含む：borA1、borA2、borA3、borA4、borA5、borA6、borB、borC、borD、borE、borF、borG、borH、borI、borJ、borK、borL、borM、borN、borO、orfB1、orfB2、orfB3、orfB4、orfB5、orfB6、orfB7、orfB8、orfB9、orfB10、orfB11、orfB12、orfB13a、orfB13b、orfB14、orfB15、orfB16、orfB17、orfB18、orfB19、orfB20、orfB21、及びorfB22である。前記読み取り枠は、それぞれ、下記塩基により記載されている：配列番号：１の第16184*-18814番目、第18875-23590番目、第23686-34188番目、第34185*-39047番目、第39122*-45514番目、第45514-50742番目、第7603-8397c番目、第8397-9194c番目、第9244-9996c番目、第9993-11165c番目、第11162-11980c番目、第11992-13611c番目、第13608-15659*c番目、第50739*-52019番目、第52113-53477番目、第53486-54466番目、第54506-56176番目、第56181*-57098番目、第57112-57858番目、第57939-59966番目、第2-313番目（不完全）、第501*-3107番目、第3172-3810c番目、第3935-4924c番目、第5123-5953番目、第5961-6518*c番目、第6564*-7538番目、第60153-60533*c番目、第60620-61003番目、第61188*-61436番目、第61526-61738番目、第61767-62285c番目、第62750-63067c番目、第62586-62858c番目、第63155-65071c番目、第65374-65871番目、第65942-68305*c番目、第68290-68910*c番目、第69681-70436番目、第70445-71848番目、第71851-72957番目、第73037-73942番目、及び第73995-74534c番目である。
前述のリストにおいて、‘c’は、該遺伝子が、配列番号：１に示すそれに対して、相補鎖によりコードされていることを示す。前述の各読み取り枠は、現在、最も長い有望な読み取り枠を表している。２以上の潜在的な開始コドンが同定され得る場合が時々ある。当業者は、これを認識し、かつ別の可能な開始コドンを同定することができるであろう。二以上の可能な開始コドンを有する、これらの遺伝子は、記号‘*'で示した。至るところに、我々は、該開始コドンであると考えられることを示しているが、当業者は、別の開始コドンを用いた活性タンパク質、これらの別の開始コドンを用いて産生されたタンパク質が、本発明の範囲内であると考えることができることを認識するであろう。
多くのこれらの読み取り枠が、さらに標準的なATG開始コドン以外の他のコドンで始まることに注目すべきである。幾つかの細菌システムにおいて、バリン（GTG）、又はロイシン（CTG、TTG）を通常示す、そのようなコドンが、該ポリペプチド鎖のN末端でのメチオニンをコードしている開始コドンとして読まれ得ることは、周知である。従って、ここで提供した該アミノ酸配列（配列番号：２〜４３、及び１１３）において、そのようなコドンメチオニンとして翻訳される。
また、ここで同定された該読み取り枠の一部を含む核酸分子を提供する。例えば、そのような核酸配列は、ここで同定された該読み取り枠から誘導される、一以上の単離ドメインを含むことができる。これらの該読み取り枠の単離部分によりコードされているポリペプチドは、例えば、触媒活性のような、独立的な活性を有することができる。特に、該ボルレリジンを構成する該ポリペプチドは、前述したように、個々のドメインが、特定の触媒活性を有するモジュラー構造を有する。従って、すべてのこれらのドメインは、ここで記載した該ボルレリジンPKS由来の他のポリペプチド又はそのドメインとともに、又は他のポリケチドの該PKS由来のポリペプチドとともに、独りで、又は組合わせて発現され得る。特に、すべてのこれらのドメインを、該ボルレリジンPKS内の、又は他のポリケチドシンターゼ内の該等価ドメインと置換することができ、かつさらに、他のPKS由来の等価ドメインを、該ボルレリジンPKS内のドメインと置換することができる。この状況において、等価ドメインは、同じ種類の機能を有するが、例えば、これらの特異性が異なるドメインを含み、本発明により考えられる置換の例を挙げると：メチルマロニル-CoA特異的ATドメインの対応するマロニル-CoA特異的ATドメインの置換、又はKR、DH、及びERを含む、１つのためだけのKRドメインを含む還元性ループの置換がある。好ましい実施態様において、該発現したドメインは、下記するように、少なくとも１つのPKSモジュールを表す。
ここで使用した、該用語‘PKSドメイン'は、該PKSの残余の独立的折畳みが可能であり、かつ個々の酵素活性、又は制限されないが、下記を含む、ポリケチド又はマクロライド合成の他の機能を有する、ポリペプチド配列のことを言う：β-ケトアシル-アシル キャリア タンパク質 シンターゼ（KS）、アシル キャリア タンパク質（ACP）、アシル トランスフェラーゼ（AT）、β-ケトレダクターゼ（KR）、デヒドロゲナーゼ（DH）、エノイルレダクターゼ（ER）、又はターミナルチオエステラーゼ（TE）である。
したがって、本発明は、下記核酸分子を提供する：
（a）AT0、及びACP0から選択された、PKSドメインをコードしている配列を含み、前記ドメインが、それぞれ、配列番号：２の第322〜664番目、及び第694〜763番目のアミノ酸により記述されている、単離核酸分子である。好ましい実施態様において、該PKSドメインは、配列番号：１の第17147〜18175番目、及び第18263〜18472番目の塩基からなる群から選択された配列を含む；
（b）KS1、AT1、KR1、及びACP1から選択されたPKSドメインをコードしている配列を含み、前記ドメインが、それぞれ、配列番号：３の第34〜459番目、第557〜885番目、第1136〜1379番目、及び第1419〜1486番目のアミノ酸により記述されている、核酸分子である。好ましい実施態様において、該PKSドメインは、配列番号：１の第18974〜20251番目、第20543〜21529番目、第22280〜23011番目、及び第23129〜23332番目の塩基からなる群から選択された配列を含む；
（c）KS2、AT2、DH2、KR2、ACP2、KS3、AT3、DH3、KR3、及びACP3から選択されたPKSドメインをコードしている配列を含み、前記ドメインが、それぞれ、配列番号：４の第34〜459番目、第559〜887番目、第903〜1050番目、第1354〜1597番目、第1628〜1694番目、第1724〜2149番目、第2245〜2576番目、第2593〜2734番目、第3060〜3307番目、及び第3340〜3406番目のアミノ酸により記述されている、核酸分子である。好ましい実施態様において、該PKSドメインは、配列番号：１の第23785〜25062番目、第25360〜26346番目、第26392〜26835番目、第27745〜28476番目、第28567〜28767番目、第28855〜30132番目、第30418〜31413番目、第31462〜31887番目、第32863〜33606番目、及び第33703〜33903番目の塩基からなる群から選択された配列を含む；
（d）KS4、AT4、KR4、及びACP4から選択されたPKSドメインをコードしている配列を含み、前記ドメインが、それぞれ、配列番号：５の第34〜459番目、第555〜886番目、第1179〜1423番目、及び第1459〜1525番目のアミノ酸により記述されている、請求項１、又は２記載の核酸分子である。好ましい実施態様において、該PKSドメインが、配列番号：１の第34284〜35561番目、第35847〜36842番目、第37719〜38453番目、及び第38559〜38759番目の塩基からなる群から選択された配列を含む；
（e）KS5、AT5、DH5、ER5、KR5、及びACP5から選択されたPKSドメインをコードしている配列を含み、前記ドメインが、それぞれ、配列番号：６の第34〜457番目、第553〜888番目、第905〜1046番目、第1401〜1690番目、第1696〜1942番目、及び第1975〜2041番目のアミノ酸により記述されている、核酸分子である。好ましい実施態様において、該PKSドメインは、配列番号：１の第39221〜40492番目、第40778〜41785番目、第41834〜42259番目、第43322〜44191番目、第44207〜44947番目、及び第45044〜45244番目の塩基からなる群から選択された配列を含む；
（f）KS6、AT6、KR6、ACP6、及びTEから選択されたPKSドメインをコードしている配列を含み、前記ドメインが、それぞれ、配列番号：７の第37〜457番目、第555〜883番目、第1101〜1335番目、第1371〜1437番目、及び第1461〜1708番目のアミノ酸により記述されている、核酸分子である。好ましい実施態様において、該PKSドメインは、配列番号：１の第45622〜46884番目、第47176〜48162番目、第48814〜49518番目、第49624〜49824番目、及び第49894〜50637番目の塩基からなる群から選択された配列を含む。
他のその態様において、本発明は、PKSモジュールをコードしている配列を含む核酸分子を提供し、前記モジュールは、それぞれ、配列番号：２の第322〜763番目、配列番号：３の第34〜1486番目、配列番号：４の34〜1694番目、配列番号：４の第1724〜3406番目、配列番号：５の第34〜1525番目、配列番号：６の第34〜2041番目、及び配列番号：７の第37〜1437番目又は1708番目のアミノ酸からなる群から選択される。好ましい実施態様において、該モジュールは、配列番号：１の第17147〜18472番目、第18974〜23332番目、第23785〜28767番目、第28855〜33903番目、第34284〜38759番目、第39221〜45244番目、第45622〜49824番目、又は第50637番目の塩基からなる群から選択された配列を含む。
ここで使用した、該用語‘モジュール'は、制限されないが、下記を含むポリケチド又はマクロライド合成の個々の酵素活性を各々有する、複数のPKSドメインを含む、単独ポリペプチドのことを言う：β-ケトアシル-アシル
キャリア タンパク質 シンターゼ（KS）、アシルトランスフェラーゼ（AT）、アシル キャリア タンパク質（ACP）、β-ケトレダクターゼ（KR）、デヒドロゲナーゼ（DH）、又はエノイルレダクターゼ（ER）、又はターミナルチオエステラーゼ（TE）である。通常、伸長モジュールは、KS、AT、及びACPドメインを含む（幾つかのモジュラーPKSは、個々のタンパク質として、これらのATドメインをコードし得るにもかかわらず）。さらに、伸長モジュールは、ベータ-ケト基を、ヒドロキシル、エノイル、又はメチレン基に還元可能な、一以上のドメインを含み得る（ここで、ドメインの前記基とは、“還元性ループ”のことを言う。）。従って、通常、還元性ループを含むモジュールは、KRドメイン、KR、及びDHドメイン、又はKR、DH、及びERドメインを含む。
さらに、PKSは、鎖終結、及び／又は該最終生成物の環化を行う、TEドメインを含み得る、又は代りに、ラパマイシンに観察されるアミノ酸残基の付加、及びマクロラクタム形成（Schweckeらの論文、1995）、リファマイシンに関するマクロラクタム形成（Augustらの論文、1998）、及びマイキサラミド生合成に関するアミノ酸組込み、続いて還元的脱離（Silakowskiらの論文、2001）のような、類似した機能を行うことが知られている、別の機能性を含み得る。
また、前述した、一以上の該ドメイン、又はモジュールをコードしている配列を含む、ポリケチドシンターゼをコードしている核酸分子を提供する。
ここで提供される該配列は、ポリケチド合成を操作する、及び／又は向上するための方法を提供する。従って、前記親ポリケチドシンターゼを発現する宿主細胞内に、ここで記載したような、ボルレリジンポリケチドシンターゼ、又はその誘導体由来のドメインを発現することを含む、親ポリケチドシンターゼの改質方法を提供し、その結果、該ドメインが、前記ポリケチドシンターゼ内に組み込まれる。さらに、宿主細胞内に、ボルレリジンポリケチドシンターゼ、又はその誘導体由来のドメインをコードしている核酸を導入することを含む、親ポリケチドシンターゼの改質方法を提供し、該宿主細胞が、前記親ポリケチドシンターゼをコードしている核酸を含み、その結果、発現した場合、該ドメインが前記親ポリケチドシンターゼ内に組込まれる。該親PKSの天然ドメインに加えて、該ボルレリジンPKSドメインを挿入することができ、又は天然親ドメインを置換することができる。通常、該親PKSは、I型PKSとなるであろう。
さらに、本発明は、親ボルレリジンPKSの改質方法を提供する。ドナードメイン（例えば、I型PKS由来）を、前記親ボルレリジンPKSを発現する宿主細胞内で、発現させることができる。さらに、宿主細胞内に、ドナーポリケチドシンターゼ由来のドメインをコードしている核酸を導入することを含む、親ボルレリジンポリケチドシンターゼの改質方法を提供し、該宿主細胞が、前記親ボルレリジンポリケチドシンターゼをコードしている核酸を含み、その結果、発現した場合、該ドメインが前記親ボルレリジンポリケチドシンターゼ内に組込まれる。
付加的に、又は代りに、該親PKSのドメインを、除去し、又は他の不活性化することができ、例えば、単に、親ドメインを除去し、又はドナーPKS由来のドメインで置換し、又はドナーPKS由来のドメインを、該親に付加することができる。ドメインが、付加、又は置換される場合、該ドナードメインは、該親シンターゼから、又は別のシンターゼから誘導され得る。
これらの方法を、ボルレリジンの生合成を向上させるために使用することができ、新規ボルレリジン誘導体又は類似体、又は他の新規ポリケチド又はマクロライド構造体を製造する。該システムにおいて、モジュールの数、及び性質を、補充される伸長単位の数、及び種類を変えるために、及び該ポリケチド構造を決定する、該様々なシンターゼ、レダクターゼ、及びデヒドロゲナーゼ活性を変えるために変更することができる。そのような変化を、該PKSを含む該モジュールの順番を変更することにより、該PKSを含むモジュールの重複又は除去により、非相同源由来のモジュールの導入により、又はこれらの様々なアプローチの幾つかの組合せにより行うことができる。
従って、該ボルレリジンPKSのドメイン、又はモジュールを、除去し、重複し、又は該ボルレリジンPKS由来、又は他のポリケチドの合成に関与するPKSシステム（非相同的PKSシステム、特にI型PKSシステム）由来の他のドメイン又はモジュールを用いて交換することができ、別の菌株、又は種由来となり得る。あるいは、新規ボルレリジン、又はマクロライドを製造するために、該ボルレリジンPKS由来のドメイン、又はモジュールを、非相同的PKSシステム内に導入することがきる。また、連結モジュールを、該ボルレリジンポリケチドシンターゼ、及び他のポリケチドシンターゼの間に交換することができ、これらの連結モジュールは、２つの天然種モジュールの対応するドメイン間（例えば、１モジュールのATから、その次のATに）を伸長する。
例えば、特定のモジュールを、別の伸長単位に特異性を有する（例えば、国際公開第98/01571号、及び国際公開第98/01546号に記載されている）、又は下に記載するように、別の伸長単位に特異性又は選択性を示すような変異したモジュールと交換することができる。付加的に、又は代りに、与えられるβ-ケト部位の処理に関与する、ドメイン又はモジュールの導入、除去、交換、又は変異を、ポリケチド合成の間に、伸長単位の還元処理の水準を変更するように、使用することができる。また、そのような変化は、変更されたモジュールにより形成される、該アルファ-アルキル、及びベータ-ヒドロキシル基の立体化学における変化を生じ得る。好ましい実施態様において、該BorA5モジュールを、親PKS内に導入し、ポリケチド骨格に、伸長単位の繰返し付加を提供することができる。例えば、該親PKSにより天然に製造された、その関連するマクロライドポリケチドの環サイズを拡大する。
該ボルレリジン装填モジュールは、脂環式ジカルボン酸開始単位に特異性を有することが確認された、該第一PKS装填モジュールである。従って、脂環式開始単位を、非相同的ポリケチドシンターゼ内に導入するように、このモジュール、又はその誘導体を使用することができる。これは、該ボルレリジン開始単位として通常使用される、トランス-シクロペンタン-1,2,-ジカルボン酸の使用に制限する必要はない。また、ここに、該ボルレリジン装填モジュールが、トランス-シクロブタン-1,2-ジカルボン酸、2,3-メチルコハク酸、及び2-メチルコハク酸を含む、他の開始単位を直接的に組込むことができることを示した。また、該ボルレリジン開始単位をボルレリジン産生細胞内で改質し、又は非相同的装填モジュールにより置換し、代わりの開始単位を、該ボルレリジン合成過程内に導入することができる。
該PKSの装填モジュールの位置を、該得られるポリケチド/マクロライド分子の環サイズを調節するために、（例えば、該PKS内の特定の位置にそれを融合することにより）選択することができる。
該カルボン酸-CoAチオエステル伸長単位を決定するATドメインを、除去し、改質し、又は置換することができる。また、該ACPドメインを除去し、改質し、又は置換することができる。さらに、該ボルレリジンPKS内に通常存在しないが、他のモジュラーPKS、及び／又は混合PKS/NRPSシステム内にあるドメインを挿入することができる。例えば、制限されないが、下記ドメインがある：O-メチルトランスフェラーゼドメイン、C-メチルトランスフェラーゼドメイン、エピマー化ドメイン、モノオキシゲナーゼドメイン、デヒドロゲナーゼドメイン、アミノトランスフェラーゼドメイン、又は非リボソーム型ペプチドシンテターゼドメインである。
さらに、該ボルレリジンPKSのチオエステラーゼドメインを、選択された環サイズを有するポリケチド/マクロライド分子を放出するために、変更し、又は再配置することができる（例えば、該PKS内の選択された位置への融合）。あるいは、非相同的チオエステラーゼドメインを、該ボルレリジンPKS内に挿入し、該親PKSにより正常に製造された分子に対して、変更された環サイズを有する分子を製造する、又は遊離酸を製造することができる。
さらに、もう一つの代わりにおいて、ラパマイシンに対応する混合NRPS/PKSシステム、又はリファマイシン生合成及びマイキサラミド生合成の対応するような関連システム由来の該アミノ酸組込み、及びマクロラクタム形成ドメイン、又はNRPSシステム由来のモジュールを、該PKS内に挿入し、混合された起源の分子に関連した、新規ポリケチドを製造することができる。
また、ここで記載したPKSをコードしている該読み取り枠は、該PKSの該酵素的活性ドメイン、及び／又はモジュールに、適切な距離及び配置で間隔をあけ、かつ固定された足場領域のような機能的役割を有するにもかかわらず、非酵素的活性部位をコードしている部位を含むことができ、かつ正確な空間的配置において、該PKS内にドメイン、及びモジュールを順序付ける認識、及び結合機能を有することができる。従って、本発明の核酸配列は、前述した、このような足場領域、単独、又はドメイン又はモジュールをコードしている配列の組み合わせをコードしている配列を含む。前述のコード配列PKSの様々な操作が、ハイブリッド型PKS遺伝子、又はシステムを生じ得ることは明らかであろう。従って、また、本発明は、そのようなハイブリッドPKSシステムをコードしている核酸を提供する。それ故に、本発明は、ボルレリジンPKSの少なくとも１のドメインをコードしている、少なくとも１の第一核酸部位、及び前記ボルレリジンPKSと非相同的である、少なくとも１のI型PKSドメインをコードしている、第二核酸の１部位、又は複数部位を含む、核酸構造体を提供する。好ましい実施態様において、該構造体は、ハイブリッド型ポリケチドシンターゼ遺伝子を含み、前記遺伝子は、ボルレリジンPKSの少なくとも１のドメイン、及び前記ボルレリジンPKSと非相同的である、少なくとも１のI型PKSドメインをコードしている。さらに好ましい実施態様は、前述した。
さらなる態様において、本発明は、ポリケチド合成のための開始単位又は基質の合成、好ましくは、該ボルレリジンPKSの開始単位として用いられる該トランス-シクロペンタン-1,2-ジカルボン酸部位の合成の段階を触媒するポリペプチドをコードしている配列を含む、単離核酸分子を提供する。該ポリペプチドは、デヒドロゲナーゼ、3-オキソアシルACP-レダクターゼ、シクラーゼ、F420依存性デヒドロゲナーゼ、又は2-ヒドロキシヘプタ-2,4-ジエン-1,7-ジオエート
イソメラーゼとしての活性を有し得る。好ましくは、該ポリペプチドは、下記遺伝子からなる群の一つによりコードされている配列を含む：配列番号：８、９、１０、１２、１３、１４、１７、１８、１９、又は２０に示されている、borC、borD、borE、borF、borG、borH、borK、borL、borM、及びborNである。
ボルレリジン-産生細胞において、ボルレリジン産生を無効化するために、これらの遺伝子を、除去し、破壊し、又は他の不活性化をさせることができる。このような変化から得られる細胞株を、該天然開始単位の代わりに組込まれ得る、外来のカルボン酸の添加により、補うことができる。従って、新規ボルレリジン関連分子を合成することができ、該合成は、外来的に供給されたカルボン酸から開始される。そのようなアプローチは、変異合成（mutasynthesis）と称される。トランス-シクロペンタン-1,2,-ジカルボン酸合成に関与する該遺伝子を、非相同的ポリケチド産生細胞内に導入することができ、それ自体のPKSの開始単位として、該脂環式ジカルボン酸を合成する細胞となる。
従って、さらに、本発明は、改善された滴定量で、ボルレリジン、及びボルレリジン類似体を製造する方法を提供し、前記方法は、該宿主株内のborGを破壊すること、該得られる細胞株を発酵すること、及び外来のカルボン酸を供給することを含む。様々な好ましい実施態様において、該外来カルボン酸は、下記からなる群から選択される、トランス-シクロペンタン-1,2-ジカルボン酸、又は該外来のカルボン酸を含み、及び／又は該方法は、一以上のボルレリジン生合成遺伝子、又はボルレリジンポリケチドシンターゼドメイン又はモジュールを、除去し、改質し、又は置換することを、付加的に含む：トランス-シクロブタン-1,2-ジカルボン酸、2,3-ジメチルコハク酸、及び2-メチルコハク酸である。また、当業者は、ポリケチドシンターゼを、非相同的宿主内に発現することができることを承知する。従って、また、本発明は、非相同的宿主内に、高滴定量のボルレリジン及びボルレリジン類似体を製造する方法を意図し、前記方法は、該遺伝子クラスターが転写されてすぐに、その場でborGを除外した、又は該borG遺伝子を破壊した、ボルレリジン遺伝子クラスター全体を用いて、宿主細胞を形質転換することを含む。
代わりに、該開始単位の合成に関与する遺伝子を、ボルレリジン、又はボルレリジン関連分子の発酵滴定量を改善するために、過剰発現することができる。従って、さらに、本発明は、ボルレリジン、及びボルレリジン誘導体又はボルレリジン関連分子、及びこれらの誘導体の滴定量を増加する方法を提供し、前記方法は、該開始単位の製造に伴う、ボルレリジン生合成遺伝子を上方制御することを含み、前記遺伝子は、borC、borD、borE、borF、borH、borK、borL、borM、及びborNからなる群から選択される。好ましい実施態様において、該上方制御される遺伝子は、borE、又はborLである。
もう一つのアプローチにおいて、該開始単位の合成に関与する該遺伝子を、変更カルボン酸の製造を導く、他の合成遺伝子により改質し、又は置換することができ、ボルレリジン関連分子の製造を導く。これらの技術は、前述の該PKSの装填モジュールの改質により補われ得る。
さらなる態様において、本発明は、ポリケチド部位の側鎖の改質工程を触媒するポリペプチドをコードしている配列を含む、単離核酸分子を提供し、例えば、前駆-ボルレリジン（14）のC12で、メチル基からニトリル基への変換がある。該ポリペプチドは、シトクロムP450オキシダーゼ、アミノトランスフェラーゼ、又はNAD/キノンオキシドレダクターゼのような活性を有し得る。好ましくは、該ポリペプチドは、配列番号：１５、１６、又は１７に示す、borI、borJ、及びborKからなる遺伝子の群の一つによりコードされている配列を含む。
様々なこれらの遺伝子を、除去し/不活性化することができ、その結果、該ニトリル部位を導入する過程の中間段階を表す、ボルレリジン-関連分子、又はその分路代謝産物を蓄積する。このようなシステムへの、非相同的遺伝子の付加は、全ての蓄積した生合成中間体、又はその分路代謝産物の別の合成を可能にする。代わりに、該遺伝子を、これらの基質の特異性を変更するために、変異することができ、その結果、これらは、ボルレリジン-関連分子を提供するために、前駆-ボルレリジン分子の別位置で機能する。さらに、該ニトリル基の形成に関与する遺伝子を、ボルレリジン、又はボルレリジン-関連分子の該発酵滴定量を改善するために、過剰発現することができる。
あるいは、１つ、幾つか、又はすべてのこれらの遺伝子を、他のポリケチドを製造することができる細胞内に導入することができ、例えば、ニトリル基の導入のような、そのポリケチドの所望の側鎖処理を提供する。これは、ポリケチド内に、特に、メチルマロニル-CoA、又はエチルマロニル-CoA伸長単位から誘導される側鎖で、ニトリル部位の特異的生合成導入の可能性を切り開く。また、インビトロにおいて、精製酵素（下記）を、ポリケチド側鎖のニトリル部位への変換に作用するように使用することができる。
さらなる態様において、本発明は、ボルレリジンに耐性を与えることを伴う、ポリペプチドをコードしている配列を含む、単離核酸分子を提供する。該ポリペプチドは、トレオニルtRNAシンターゼと相同性を有することができ、かつ好ましくは、トレオニルtRNAシンターゼ活性を有する。好ましくは、該ポリペプチドは、配列番号：２１に示す該borO遺伝子によりコードされた配列を含む。適切なベクター（下記）で実行される、borOのような耐性遺伝子を、選択的マーカーとして使用することができる。従って、そのようなベクターを用いて形質転換された細胞を、濃縮ボルレリジンの存在する培養液により、明確に選択することができ、そのような遺伝子を欠いた細胞の増殖を阻害、又は殺すことができる。
さらなる態様において、本発明は、該ボルレリジン遺伝子クラスターの一以上の遺伝子発現制御を伴う、ポリペプチドをコードしている配列を含む、単離核酸分子を提供する。好ましい実施態様において、該ポリペプチドは、配列番号：１８に示す該borL遺伝子によりコードされている、又は配列番号：２９又は３３に示すorfB8又はorfB12によりコードされているような、配列を含む。調節遺伝子を、ボルレリジン、及びボルレリジン誘導体又はボルレリジン-関連分子、及び該得られる細胞株の発酵により製造されるこれらの誘導体の滴定量を増加するように設計することができる。例えば、リプレッサーを、除去し/不活性化し、及び／又は活性化因子を、例えば、遺伝子複製の数を増やすことにより、又は強い構成的活性、又は誘発性のプロモーターの制御下、該コード配列を配置することにより、上方制御、又は過剰発現することができる。また、該borL遺伝子、又はその部位を、ハイブリダイゼーションプローブとしての使用を見つけ、他の生合成遺伝子クラスター内、又は外側にある、類似した調節遺伝子を同定することができる。
さらなる態様において、本発明は、II型チオエステラーゼ活性を有するポリペプチドをコードしている配列を含む、単離核酸分子を提供する。好ましい実施態様において、該ポリペプチドは、配列番号：８に示す該borB遺伝子によりコードされた配列を含む。この核酸を、宿主細胞内に導入し、その細胞により合成されるポリケチドの滴定量を調節することができる。特に、該滴定量を、不要な副反応生成物の‘編集（editing）'により増加することができる（例えば、KSドメインに結合した伸長単位の不適切な脱炭酸により形成されるアシル基の除去である。）。しかし、様々な態様において、例えば、その細胞により製造される、様々なポリケチド生成物を増加するため、又はこのような編集作業により、通常、抑制されるであろう天然産生性ポリケチド類似体の産生を促進するため、産生細胞からそのような活性を除去することが所望され得る。
本発明のヌクレオチド配列は、配列番号：１に示した該配列の一部、又はその相補体、又はこれらの配列の突然変異体（mutant）、変異体（variant）、誘導体、又は対立遺伝子であり得る。該配列は、示した該配列の一以上のヌクレオチドの、一以上の付加、挿入、除去、及び置換による変化で示されるものとは異なり得る。コードヌクレオチド配列の変化は、過剰な遺伝子コードにより決定されるような、タンパク質レベル、又はそれ以外でのアミノ酸変化を含み得る。従って、本発明の核酸は、今までの同じ該アミノ酸を有するポリペプチドをコードしている配列番号：１に示す配列とは異なる配列を含み得る。好ましくは、提供した配列の突然変異体、変異体、誘導体、又は対立遺伝子は、ここで記載したような、同じ酵素活性を有するポリペプチドをコードしている。
該配列が、コード配列である場合、該コードされたポリペプチドは、配列番号：２〜４３、及び１１３に示したアミノ酸配列の一以上のアミノ酸残基で異なるアミノ酸配列を含み得る。示したすべての該配列のアミノ酸配列の突然変異体、変異体、誘導体、又は対立遺伝子である、ポリペプチドをコードしている核酸を、本発明において、さらに提供する。このようなペプチドを、以下で論じる。このようなポリペプチドをコードしている核酸は、配列番号：１の該コード配列とともに、約60％を越える配列同一性、約70％を越える配列同一性、約80％を越える配列同一性、又は90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、又は99％を越える配列同一性を示し得る。同一性のパーセンテージを、初期パラメータを使用する、ウィスコンシンの大学から入手可能なジェネティクスコンピューターグループ（GCG）バージョン１０ソフトウェアパッケージ（Genetics Computer Group（GCG）Version 10 software package）からBLAST、又はBestFitのようなプログラムの一つを用いて、計算することができる。
好ましい実施態様において、コード、又は非コードであろうと、本発明のヌクレオチド配列を、配列番号：１の配列の少なくとも一部、又はその相補体と特異的にハイブリダイゼーションすることができる。
例えば、ハイブリダイゼーションを、下記を含むハイブリダイゼーション溶液を用いて、Sambrookらの論文（Sambrookらの論文、1989）の方法に従って行うことができる：5×SSC、5×デンハート試薬（Denhardt's reagent）、0.5〜1.0％ SDS、100 mg/ml変性剤、鮭精子DNA断片、0.05％ピロリン酸ナトリウム、及び50％以下のホルムアミドである。ハイブリダイゼーションを、少なくとも６時間、37〜42℃で行うことができる。ハイブリダイゼーションの次に、フィルターを次のように洗浄した：（1）2×SSC、及び1％SDS中、室温で5分；（2）2×SSC、及び1％SDS中、室温で15分；（3）1×SSC、及び1％SDS中、37℃で30分〜1時間；（4）1×SSC、及び1％SDS中、42〜65℃で30毎に該溶液を交換し、2時間である。
特定配列相同性の核酸分子間のハイブリダイゼーションを達成するために要求されるストリンジェント条件を計算する、一つの一般式（Sambrookらの論文、1989）は：二本鎖において、Tm = 81.5℃+ 16.6Log[Na+] + 0.41（％G+C）- 0.63（％ホルムアミド）- 600/#bpである。
前述の式の実例として、GC含有率42％、及び200塩基の平均プローブサイズを有し、[Na+] = [0.368]、及び50％ホルムアミド用いた場合、該Tmは、57℃である。DNA二本鎖のTmは、相同性が1％減少する毎に、1〜1.5℃減少する。従って、約75％を越える配列同一性を有する標的は、42℃のハイブリダイゼーション温度を使用することが認められるであろう。このようなハイブリダイゼーションは、本発明の該核酸配列に、実質的に特異的と考えられるであろう。
好ましくは、本発明の核酸は、少なくとも15個連続した、配列番号：１のヌクレオチド配列を含む。これらは、配列番号：１の20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、150、200、300、500個、又はそれ以上連続したヌクレオチド配列を含むことができる。
該核酸は、例えば、該PKS、又はそのドメイン又はモジュールの酵素をコードしている配列、開始単位の生合成に関わる酵素、ポリケチド部位の側鎖を改質する酵素、輸送体、耐性遺伝子、及び前述の調節分子のような、ポリケチド、又はマクロライド生合成遺伝子クラスター由来の転写制御配列のような、新規遺伝子、又は他の遺伝要素を同定するためのプライマー、又はプローブとして使用することができる。
従って、本発明は、新規ポリケチド生合成遺伝子クラスター、又はその一部分の同定方法を提供し、該方法は、標的核酸の試料と、配列番号：１の配列、又はその一部を有する核酸に特異的にハイブリダイゼーションすることができる、本発明の核酸とをハイブリダイゼーションすることを含む。該標的核酸は、すべての適合する核酸であり得、かつ好ましくは、細菌ゲノムDNAである。
通常、さらに該方法は、該核酸試料と本発明の核酸との間のハイブリダイゼーションを検出する工程を含む。ハイブリダイゼーションを、当業者が自由に使える、様々な技術すべてを使用して測定することができる。例えば、プローブを、放射線、蛍光、又は酵素的にラベルすることができる。プローブラベル化以外の他の方法は、PCR、RNAアーゼ開裂、及び対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブ化を使用した増幅を含む。
該方法は、標的分子に対する一以上（例えば、二つ）のプローブ、又はプライマーのハイブリダイゼーションを含む。該核酸が、二本鎖DNAである場合、通常、ハイブリダイゼーションは、一本鎖DNAとなるように、先に変性させるであろう。該ハイブリダイゼーションは、PCR手順の一部として、又はPCRを含まない、プローブ手順の一部として行なわれ得る。例えば、手順は、PCR、及び低ストリンジェントハイブリダイゼーションの組合せとなるであろう。当業者が利用できる多くのスクリーニング手順から選択された、該手順を、成功したハイブリダイゼーション、及び単離ハイブリダイゼーション核酸の同定に使用する。
当業者は、選択的ハイブリダイゼーションに対して、オリゴヌクレオチド長、及び塩基組成のようなアカウント因子を取り入れた、適切な所望のストリンジェント条件を使用することができる。
本発明の単離核酸分子を、発現する可能な一以上の調節塩基配列を除いた、該細菌ゲノムの遺伝子に隣接する遊離、又は実質的に遊離した核酸のような、単離自然発生的核酸分子（すなわち、通常、自然に見られる成分から単離、又は分離した核酸分子）とすることができる。核酸を、完全な、又は部分的な合成品とすることができ、かつゲノムDNA、cDNA、又はRNAを含み得る。本発明の核酸が、RNAである場合、示された該配列の引用は、Tの代わりにUを有する、RNA等価体を示していると解釈されるべきである。
さらに本発明は、本発明の核酸分子を含むベクターを提供する。好ましくは、該ベクターは、前述したポリケチド生合成遺伝子クラスター（好ましくは、ボルレリジン生合成遺伝子クラスター）のポリペプチド、又はその一部をコードしている核酸を含む、発現ベクターである。細菌、又は真菌宿主細胞中に導入した核酸を含む、適切なベクターを選択し、又は構築することができ、プロモーター配列、ターミネーター断片、エンハンサー配列、マーカー遺伝子、及び他の適切な配列を含む、適切な調節塩基配列を含む。さらに詳細に見ると、例えば、Sambrookらの論文（1989）がある。核酸操作のための多くの公知技術、及びプロトコル、例えば、核酸構造体の調製、突然変異誘発、配列決定、細胞内へのDNAの導入、及び遺伝子発現、及びタンパク質の分析が、分子生物学第二版（Molecular Biology、Second Edition、Ausubel、Eds、John Wiley、及びSonsらの著書、1992）の短いプロトコル（Short Protocols）中に詳細に記載されている。該Sambrook、及びAusubelらの著書の公表は、引用により、本明細書中に取り込まれている。
もう一つの態様において、本発明は、ここで記載した本発明の核酸分子によりコードされた単離ポリペプチドを提供する。特に、配列番号：２〜４３、及び１１３のどれか一つ以上、又はその一部に示したアミノ酸配列を含む、単離ポリペプチドを提供する。前述のように、これらのアミノ酸は、配列番号：１の配列、及びその相補体にある最長の可能な読み取り枠の翻訳により示される。該最初のアミノ酸は、開始コドンが、ATG、GTG、CTG、又はTTGにもかかわらず、常にMetを示す。
本明細書中で使用する“ポリペプチド”は、ペプチド、ポリペプチド、及びタンパク質を含み、これらの用語は、他に特定するまで、同義的に使用される。
アミノ酸配列変異体（variant）、対立遺伝子、誘導体、又は示した該アミノ酸配列のどれか一つの突然変異体である、ポリペプチドは、配列番号：２〜４３、及び１１３のどれか一つのポリペプチドと、又はその一部と、少なくとも60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、又は99％の配列同一性を示し得る。特定のアミノ酸配列変異体は、1アミノ酸、2、3、4、5-10、10-20、20-30、30-50、50-100、100-150、又は150よりも多くのアミノ酸の挿入、付加、置換、又は除去により示されるものとは異なる。同一性パーセンテージは、初期パラメータを使用する、ウィスコンシンの大学から入手可能なジェネティクスコンピューターグループ（GCG）バージョン１０ソフトウェアパッケージ（Genetics Computer Group（GCG）Version 10 software package）からFASTA、又はBestFitのようなプログラムの一つを用いて、計算することができる。
また、本発明は、本発明のポリペプチドの活性部位、断片、及び誘導体を含む。
“活性部位”とは、ポリペプチドの全長未満のペプチドを意味するが、少なくとも幾らかのその本質的な生物学的活性を保持する。例えば、前述した該PKSの単離ドメイン、又はモジュールは、該PKSの活性部位として見なされ得る。
“断片”とは、少なくとも５、少なくとも６、又は少なくとも７個連続したアミノ酸、多くの場合、少なくとも８、又は少なくとも９個連続したアミノ酸、通常少なくとも１０、少なくとも１３個連続したアミノ酸、及び最も好ましくは、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも５０、少なくとも７５、又は少なくとも１００以上連続したアミノ酸のアミノ酸残基の範囲を意味する。該配列の断片は、該関連ポリペプチドの部位にに対する抗体の発生に有用な抗原決定基、又はエピトープを含み得る。従って、該ポリペプチドは、配列番号：２〜４３、及び１１３のどれか一つの提供された完全配列を含む必要はない。しかし、例えば、前述の該PKSの単離ドメイン、又はモジュールのような、該所望の活性を有するその部位を含み得る。該用語部分、部位、及び断片は、本明細書中で、同義的に使用し；特定の意味は、すべての特定の前後関係における、これらの用語の一つの特定使用に起因しないであろう。
本発明のポリペプチド、又はその断片の“誘導体”とは、該タンパク質のアミノ酸配列の変更により、例えば、該タンパク質をコードしている核酸の操作により、又はタンパク質自身の変更により、改質されたポリペプチドのことを意味する。そのような該天然アミノ酸配列の誘導体は、該野生型ポリペプチドの本質的な活性を、根本的に変更することなく、１、２、３、又は５以上のアミノ酸の挿入、付加、除去、又は置換を含み得る。
本発明のポリペプチドを、例えば、事実上、関連していることが、通常わかっている一以上の成分から単離された、単離形態で提供する。これらは、天然に発現する宿主から単離され得、又は合成品又は組換え型となり得る。
また、本発明は、（公表された）ポリペプチドの製造方法を含み、該方法は、該ポリペプチドをコードしている核酸（通常、本発明の核酸）の発現を含む。これは、該ポリペプチドの発現が生じる、又は可能となる、適切な条件下で、前述の発現ベクターを含む培養液中の宿主細胞を増殖することにより、都合よく達成され得る。また、ポリペプチドは、網状赤血球溶解物システムのような、インビトロシステム中で発現され得る。
該方法は、宿主細胞内に該核酸を導入する工程を含み得る。通常、形質転換としての制限はないと見なされ得る該導入（特に、インビトロ導入）は、すべての利用可能な技術を使用することができる。真核細胞に対して、又は昆虫細胞バキュロウイルスに対して、適切な技術は、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE-デキストラン、電気穿孔法、リポソーム-媒介トランスフェクション、及びワクチニアのようなレトロウイルス又は他のウイルスを用いた形質導入を含む。細菌細胞に対して、適切な技術は、バクテリオファージを用いる、塩化カルシウム形質転換、共役、電気穿孔法、及びトランスフェクションを含み得る。代わりとして、該核酸の直接的注入を使用することができる。当業者にとって周知であるように、抗体耐性、又は感受性遺伝子のような、マーカー遺伝子を、対象の核酸を含むクローンの同定に使用することができる。
好ましい宿主細胞は、放線菌類であり、好ましくは、ストレプトマイセート（Streptomycetes）であり、かつ特に、下記からなる群から選択される：サッカロポリスポラ エリスラエア（Saccharopolyspora erythraea）、ストレプトマイセス コエリカラー（Streptomyces coelicolor）、ストレプトマイセス アベルミチリス（Streptomyces avermitilis）、ストレプトマイセス グリセオフスクス（Streptomyces griseofuscus）、ストレプトマイセス キンナモネンシス（Streptomyces cinnamonensis）、ミクロモノスポラ グリセオルビダ（Micromonospora griseorubida）、ストレプトマイセス ハイグロスコピカス（Streptomyces hygroscopicus）、ストレプトマイセス フラジアエ（Streptomyces fradiae）、ストレプトマイセス ロンギスポロフラブス（Streptomyces longisporoflavus）、ストレプトマイセス ラサリエンシス（Streptomyces lasaliensis）、ストレプトマイセス ツクバエンシス（Streptomyces tsukubaensis）、ストレプトマイセス グリセウス（Streptomyces griseus）、ストレプトマイセス ベネズエラエ（Streptomyces venezuelae）、ストレプトマイセス アンチバイオチクス（Streptomyces antibioticus）、ストレプトマイセス リビダンス（Streptomyces lividans）、ストレプトマイセス リモスス（Streptomyces rimosus）、及び ストレプトマイセス アルブス.（Streptomyces albus.）ストレプトマイセス ロケイ（Streptomyces rochei）ATCC23956、ストレプトマイセス パルブルス（Streptomyces parvulus）Tue113、及びストレプトマイセス パルブルス Tue4055であり、さらに、ストレプトマイセス ロケイ ATCC23956、ストレプトマイセス パルブルス Tue113、及びストレプトマイセス パルブルス Tue4055から選択されるものが、より好ましい。
本発明のポリペプチド、ペプチド断片、対立遺伝子、突然変異体、又は変異体を、免疫原として、又は得られる特異的抗体において使用することができ、ポリペプチド、及びペプチドの精製、及び他の操作、スクリーニング、又は他の応用に有用となり得る。
もう一つのその態様において、本発明は、本発明の目的から誘導され得る分子、及びそれから形成される修飾化合物、及びこれらの製造方法を提供する。本発明の目的から誘導される分子を、式１に示し、かつその医薬として許容し得る塩、又は一以上の該ケチド単位の酸化状態において、該対応する“天然”化合物とは異なる図２に示すような類似体（すなわち、下記群からの代替の選択：-CO-、-CH（OH）-、=CH-、及び-CH2-）：及び
Figure 2006514548
（式中、R1は、大きさが変化し（n = １〜２）、かつ下に示すように置換されたシクロアルキル基であり；
Figure 2006514548
また、式中、R1を、一以上のハロ原子、又は一以上のC1〜C3アルキル基で、任意に置換することができ；R2、R3、R6、R7、R8、R9、又はR11は、それぞれ独立して、H、OCH3、CH3、又はCH2CH3であり；R4は、CN、CO2H、CHO、CH3、CONH2、CHNHであり、R5、R10は、OHである。）を提供する。但し、前記化合物は、図１に示されている、ボルレリジン（1）、12-デスニトリル-12-カルボキシルボルレリジン（2）、10-デスメチルボルレリジン（3）、11-エピボルレリジン（4）、又はC14,C15-シスボルレリジン類似体（5）ではない。
好ましい実施態様において：
（a）R7、R8、及びR9が、全てCH3である。
（b）R4がCH3、又はCOOHである。
（c）R7、R8、及びR9が、すべてCH3であり、かつR4が、CH3、又はCOOHである。
（d）R1が、シクロブタン-1'-カルボキシラート（カルボン酸塩、又はエステル）である。
（e）R1が、シクロブタン-1'-カルボキシラートであり、かつR7、R8、及びR9が、すべてCH3である。
（f）R6、R7、R8、及びR9が、全てCH3であり、R2、及びR11が、Hであり、R5、及びR10が、OHであり、R4が、CH3、COOH、又はCNのどれかであり、かつR1が、シクロペンタン-1'-カルボキシラート、又はシクロブタン-1'-カルボキシラートである。
（g）R1が、シクロブタン-1'-カルボキシラートであり、R7、R8、及びR9が、全てCH3であり、かつR4が、CH3、又はCOOHである。
また、本発明は、下記式２の化合物、及びその医薬として許容し得る塩、又は一以上の該ケチド単位の酸化状態において、該対応する“天然”化合物とは異なる、図２に示すような類似体（すなわち、下記群からの代替の選択：-CO-、-CH（OH）-、=CH-、及び-CH2-）を提供する：
Figure 2006514548
（式中、R2、R3、R6、R7、R8、R9、又はR11、それぞれ独立して、H、OCH3、CH3、又はCH2CH3であり；R4は、CN、CO2H、CHO、CH3、CONH2、CHNHであり、R5、R10は、OHであり；かつR12、及びR13は、それぞれ独立して、H、又はOH、F、Cl、SHで任意に置換され得るC1〜C4アルキル基である。）。但し、R12、及びR13は、同時にHではないとする。
好ましい実施態様において：
（a）R7、R8、及びR9が、全てCH3である。
（b）R4が、CH3、又はCOOHである。
（c）R7、R8、及びR9が、全てCH3であり、R4が、CH3、又はCOOHである。
（d）R12、及びR13が、独立してCH3、又はHである。
（e）R12、及びR13が、独立してCH3、又はHであり、かつR7、R8、及びR9が、全てCH3である。
（f）R6、R7、R8、及びR9が、全てCH3であり、R2、及びR11が、Hであり、R5、及びR10が、OHであり、R4が、CH3、COOH、又はCNのどれかであり、かつR12、及びR13が、独立してCH3、又はHである。
（g）R6、R7、R8、及びR9が、全てCH3であり、R2、及びR11が、Hであり、R5、及びR10が、OHであり、R4が、CH3、COOH、又はCNのどれかであり、かつR12、及びR13が、両方ともCH3である。
（h）R12、及びR13が、独立してCH3、又はHであり、R7、R8、及びR9が、全てCH3であり、かつR4が、CH3、又はCOOHである。
本発明の化合物は、tRNAシンテターゼ-阻害活性を有し得る（例えば、これらは、トレオニル-、チロシニル-、又はトリプトファニル-tRNAシンテターゼを阻害し得る。）。これらは、バクテリア、スピロヘータ（例えば、トレポネマ属）、マラリア、ウイルス、及び菌類のような、細胞内、又は細胞外寄生生物、及び生命体に対する活性を含む、抗菌活性を示し得る。付加的に、又は代りに、これらは、tRNAシンテターゼ阻害の結果、又は幾つかの他の様式の作用、どちらかを介する、哺乳類細胞に対する抗増殖活性、及び／又は抗血管新生活性を有し得る。これは、抗癌剤（例えば、腸癌、前立腺癌、又はその他の治療剤）として特に適切な、本発明の化合物となり得、かつ、また乾癬のような、他の増殖障害の治療、又は乾癬、関節リュウマチ、アテローム性動脈硬化症、及び糖尿病性網膜症のような、不適切な脈管化を発症する状況の治療への応用を提供する。
本発明の化合物は、当業者にとって周知である、医薬として許容し得る賦形剤、キャリア、緩衝液、安定剤、又は他の物質とともに混合することにより、医薬として許容し得る組成物中に配合され得る。また、このような組成物は、本発明の範囲内である。
このような医薬として許容し得る物質は、無毒性であり、かつ該有効成分の作用を妨げることはないであろう。該キャリア、又は他の物質の正確な種類は、例えば、経口、静脈内、皮膚又は皮下、経鼻、筋肉内、腹腔内経路ような投与経路に依存し得る。
経口投与用の医薬組成物を、錠剤、カプセル、粉、又は液体形態とすることができる。錠剤は、ゼラチン、又はアジュバントのような、固体キャリアを含み得る。通常、液体医薬組成物は、水、石油、動物性又は植物性油、鉱物油、又は合成油のような、液体キャリア含む。生理食塩水、デキストロース、又は他のエチレングリコール、プロピレングリコール、又はポリエチレングリコールのような、サッカライド溶液、又はグリコールを含み得る。
静脈内、皮膚、又は皮下注入、又は痛む部位への注入に対して、該有効成分は、発熱物質フリーであり、かつ適切ｐＨ、等張性、及び安定性を有する、非経口に許容し得る水溶液の形態中にあるであろう。当業者に関連したこれらは、例えば、塩化ナトリウム注入、緩衝液、抗酸酸化剤、リンガー液、乳酸リンガー液のような、等張性ビヒクルを用いて、適切な溶液を調製する。前述の該技術、及びプロトコルの例には、レミントンの薬学（Remington's Pharmaceutical Sciences、第20版、公表、Lippincott、Williams、及びWilkinsらの著書）に見ることができる。
さらに、本発明は、前述の化合物、及び組成物の治療方法への使用を提供する。また、前述の微生物状況（マラリアを含む）の治療用、血管新生の阻害用、増殖障害の治療用、又は不適切な脈管化による特徴的な状況の治療用薬剤の調製において、本発明の化合物の使用を提供する。
（発明の詳細な説明）
S.パルブルスTue4055ゲノムDNAのコスミドを、Sau3AIを有する部分的消化から得られる断片を用いて構築し、pWE15内にクローン化し、かつGigapackR III ゴールドパッケージングエクストラクトキット（ストラタジーン）（GigapackR III Gold Packaging Extract kit（Stratagene））を用いて、E.コリ細胞内に導入した。3000のE.コリ形質転換体のライブラリーを、DIG DNA ラベリング、及び検出キット（ロシュ）（DIG DNA Labelling and Detection Kit（Roche））を用いて製造したラベル化プローブを用いて相同的にスクリーニングした。該使用したプローブは、ストレプトマイセス アンチバイオチクス由来のオレアンドマイシンの第三サブユニットのモジュール6をコードしている遺伝子から得られた、PKS 1.7 kbpのBglII-BamHI断片でとした。
正の応答を与えたクローンを選択し、かつコスミドDNAを単離した。コスミドDNAをBamHIで消化し、かつ3 kbp未満の断片長さを、pOJ260内にサブ-クローン化した（Biermanらの論文）。次いで、該プラスミドを、S.パルブルスTue4055プロトプラストの形質転換に使用し、かつ得られた突然変異体を、ボルレリジンを産生する該能力のためにスクリーニングした。２つの突然変異体を、ボルレリジン非産生株であると同定し、その双方を、cosBor32A2の断片を含むプラスミドから誘導した。これらの２つの断片は、1.97、及び2.80 kbp長さであり、かつ後者は、該ボルレリジンPKS（borA2、及びborA3）の部分をコードしている隣接断片として同定された。該プローブとして、第二重なりコスミドであるcosBor32A2を用いて、cosBor19B9を、オリジナルのライブラリーから同定した。これらの２つのコスミドは、全体のボルレリジン生合成遺伝子クラスターをカバーするのに十分である（図３参照）。
cosBor32A2、及びcosBor19B9の完全ヌクレオチド配列を、pHSG397内に1.5〜2.0 kbp断片を含む各コスミドに対する、Sau3AI-誘導化サブクローンライブラリのショットガン配列法により決定した（Takeshitaらの論文、1987）。特定の詳細を、実施例３に示す。重なっているcosBor32A2、及びcosBor19B9のヌクレオチド-コード配列の完全体を、配列番号：１に示す。該コスミドcosBor32A2によりコードされている領域は、配列番号：１の0-40217bpのヌクレオチド位置の配列を表す。コスミドcosBor19B9によりコードされている領域は、第4452番目のヌクレオチド近くの領域と重なり、かつ配列番号：１の第357766〜74787bp番目の該ヌクレオチド位置に対応する。次の文章でさらに詳細に記載するように、我々は、配列番号：１内にコードされていることを同定した、多くの該orfの遺伝子不活性化実験を行い、かつ、これにより、該クラスターの制限を確認する。該ボルレリジン生合成遺伝子クラスターは、配列番号：１の第7603〜59966番目のヌクレオチド位置の間に含まれている（該borA領域を含む、borBからborO）。従って、作用を組合わせたこれらの、全ボルレリジン生合成遺伝子クラスターを含む、該DNA領域の同定、及び配列決定すること、及びこの領域内にコードされている機能性配列の同定、及び記述することができる。
（PKS遺伝子）
配列番号：１の第16184〜50742番目の間にコードされた6 orfsは、公知のマクロライド産生生物体の該PKSをコードしている該遺伝子と、非常に高度に相同的であることを示す。これらの遺伝子は、borA1、borA2、borA3、borA4、borA5、及びborA6と命名し、かつborA2内の1.97 kbpの破壊により前述したように、該ボルレリジンPKSをコードしている。該６つのorfsは、頭-尾様式で配列しており、かつ各々は、インフレーム終止コドンにより終結している。該ヌクレオチド配列、及び対応するポリペプチド配列の詳細を表1に示す。
Figure 2006514548
該遺伝子borA1は、該開始、又は装填モジュールをコードする（配列番号：１の第16184〜18814番目）は、該開始コドンの配置は、この読み取り枠では、明らかになっていない。ここで与えられた該開始コドンは、我々が、本当の開始コドンであると考えたものである。しかし、該AT0ドメイン配列の最初と始まりとの間に、少なくとも他に３つの可能性のある開始コドンがあり、当業者は、これらの別の開始コドン一つを用いて、活性タンパク質を生成することができることを、認識するであろう。ここで与えられた該開始コドンは、該AT0ドメインの前の有効な第321番目のアミノ酸のN-末端尾を残す。比較のために、該エリスロマイシン装填モジュールのAT0ドメイン前のN-末端尾は、第108番目のアミノ酸であり、該アベルメクチン装填モジュールのそれは、第28番目のアミノ酸である。従って、他の候補開始コドンの一つは、正しいとすることができ；最も適当なのは、配列番号：１の第16298番目、第16607番目、及び第16901番目の位置である。該N-末端尾の長さは、触媒活性を示し得る長さであると提案する。しかし、該データベース中の他の配列に対して、有意な相同性は全くない。該開始モジュール内の該機能性ドメイン各々に対する、該ヌクレオチド配列位置、及び対応するアミノ酸配列を、表２に示した。
Figure 2006514548
遺伝子borA2は、該第一伸長モジュールをコードしている（配列番号：１の第18875〜23590番目の位置）。該第一伸長モジュール内の機能性ドメイン各々に対応する、該ヌクレオチド配列位置、及び該対応するアミノ酸配列を、表３に示した。
Figure 2006514548
遺伝子borA3は、該第二、及び第三伸長モジュールをコードしている（配列番号：１の第23686〜34188番目の位置）。該第二、及び第三伸長モジュール内の機能性ドメイン各々に対応する、該ヌクレオチド配列位置、及び該対応するアミノ酸配列を、表４に示した。
Figure 2006514548
遺伝子borA4は、該第四伸長モジュールをコードしている（配列番号：１の第34185〜39047番目の位置）。該第四伸長モジュール内の機能性ドメイン各々に対応する、該ヌクレオチド配列位置、及び該対応するアミノ酸配列を、表５に示した。
Figure 2006514548
遺伝子borA5は、該第五伸長モジュールをコードしている（配列番号：１の第39122〜45514番目の位置）。該第五伸長モジュール内の機能性ドメイン各々に対応する、該ヌクレオチド配列位置、及び該対応するアミノ酸配列を、表６に示した。
Figure 2006514548
遺伝子borA6は、該第六伸長モジュールをコードしている（配列番号：１の第45514〜50742番目の位置）。該第六伸長モジュール内の機能性ドメイン各々に対応する、該ヌクレオチド配列位置、及び該対応するアミノ酸配列を、表７に示した。
Figure 2006514548
前述の機能性ドメインの同定、及びこれらの境界を、該ラパマイシン（Schweckeらの論文、1995；Aparicioらの論文、1996）、及びエリスロマイシン（Cortesらの論文、1990）生合成のそれらのように、他のモジュラーPKSの保存アミノ酸配列の類似性に基づき、決定した。該触媒的ドメインの制限を、他のPKSクラスターの相同性に基づき確立し、該ドメインが開始、又は終了する該選択点は、完全に確定しなかった。しかし、前述の考えに基づき選択した。ドメインを加工する該β-ケトの場合、一般的に、該KRドメインの前の機能性ドメインに配置されていない大きな領域であるので、明らかになっていない、この領域は、構造的に重要となり、又は該PKS二量体の安定性に必須であり得る。該ボルレリジンPKSの異常な特性は、該個々の酵素的ドメインのすべてが、これらのヌクレオチド/アミノ酸配列に基づいて、触媒的に有能になるように見えることであり、かつボルレリジンに観測される機能性基を製造するために必須である該β-ケト加工を提供するために、すべて必要である。これまでの報告では、モジュラーPKS配列の大部分が、例えば、該スピノシンPKSであることを除いて、位置以上の不活性ドメインを含むので、これは、とても異常である（Waldronらの論文、2001；US 6,274,50）。
当業者は、遺伝コードの縮重を知っている。従って、当業者は、本開示により提供された、特定のDNA配列を変更することができ、本明細書中で提供した特定のこれらのポリペプチドに比べて、同一、又は変更、又は改良した特性を有するタンパク質を提供することができる。また、当業者は、高水準で発現するにもかかわらず、提供されたポリペプチドと同一のポリペプチドを発現する、DNA配列を変更することができる。さらに、当業者は、組換え型DNAベクター、又は本発明に含まれるコード配列の調製に有用であろうDNA配列の一部、又は全体を合成的に調製する方法を知っている。さらに、提供された該DNA配列を変更する組換え方法には、例えば、サイト-直接的除去、又は部位特異的突然変異誘発がある。これらの技術は、当業者にとって周知であり、かつここでさらに説明する必要はない。従って、ここで使用する、合成的に、又は半合成的に調製され、又は組換え型DNA法により変更された、天然源から単離されたDNAは、本発明の範囲内である。
同様に、当業者は、本発明のポリペプチドが、組換え型的に発現され得ることを認識するであろう。あるいは、従来の公知の非-組換え型技術；例えば、固相合成により、これらのポリペプチドの全体、又は一部、合成することができる。従って、本発明は、すべての特定のベクター構造、又は例示した該ポリケチドシンターゼを含む、特定の生合成クラスターの製造方法に、必ずしも制限されると解釈されるべきでない。
該ボルレリジンPKSの装填モジュールは、個々のタンパク質として存在する。これは、装填モジュールの大部分が、該第一伸長モジュールと同じタンパク質として見つかっているので、とても異常なことである。この例外は、例えば、ナイスタチン（Brautasetらの論文、2000）、及びアンフォテリシン（Caffreyらの論文、2001）PKSがある。AT-ACPジドメインからなる、該装填モジュールは、多くの代わりの開始酸を受け取り、かつ新規ポリケチドのライブラリー生成に使用される、該アベルメクチンPKSの広特異的装填モジュールと類似している（Marsdenらの論文、1998；Paceyらの論文、1998）。該活性部位セリン残基が、システインで置換され、その結果、該活性部位のモチーフが、GXCXG（具体的には、GHCYG）となるので、該ボルレリジンPKS装填モジュールのATドメインは、大部分のATドメインから分岐する。最も利用できるI型PKSのATドメイン配列において、該保存された活性部位モチーフはGXSXGであり；該同一モチーフが、リパーゼ、脂肪酸シンターゼ、及び多くのチオエステラーゼに観察されている。該求核性セリンは、２つのNRPSチオエステラーゼドメイン内、特にミコバクチン、及びピヨチェリン（pyochelin）（Shaw-Reidらの論文、1999）の製造に関与しているシンターゼのシステインで置換されている。また、GXCXGモチーフは、ビアラホス（bialaphos）クラスター内の該ORF1のチオエステラーゼ-様ドメインに観測される（Raibaudらの論文、1991）。一つの塩基交換により、2種類のセリンコドンの間を移動させることができないので、必須のセリン残基を含む活性部位は、その活性部位のセリンの代わりにシステインを有する古い先駆酵素由来の２つの系列にあり得る（Brennerの論文、1988）。該活性部位にシステインを含む酵素の存在は、この観点をサポートし得る。代わりに、システインが、これらの活性部位に生じる場合があり得る。その結果、1種類のセリンコドンから、活性を保持するであろうシステインを介して他の部分に移動させることができる。
PKSの該ATドメインは、基質として、特定のカルボン酸単位を選択する。この選択性は、該ATドメイン内の特定モチーフのサインと関連するように示されている（Reevesらの論文、2001；国際公開第02/14482号）。該ボルレリジン装填モジュールATドメインモチーフは、これまでに記載された、すべてのものとは異なり、このATドメインは、脂環式ジカルボン酸を選択するように配列される最初のものであるので、驚くことではない。該ボルレリジンPKS伸長モジュールのATドメインは、予測された活性部位モチーフGXSXGを示し、かつ、また、各々は、マロニル-CoA、又はメチルマロニル-CoAの選択に対して、該予期されたモチーフを含む（Reevesらの論文、2001；国際公開第02/14482号）。該マロニル-CoA選択性ATドメイン（AT1、AT2、及びAT6）は、お互い、該タンパク質、及び該DNAレベル、双方で、非常に高度な類似性を示す。該同じものは、該メチルマロニル-CoA選択性ATドメインに対して正確である；２つのこれらのATドメイン（AT3、及びAT4）は、該保存領域を介して、同一アミノ酸配列を有する。AT5からAT3、及びAT4の該高度な類似性は、明らかであり、モジュール内に選択される該伸長単位が、メチルマロニル-CoAであり、かつ従って該ボルレリジンC12-メチル基が、該PKS内に組込まれた後、ニトリル官能基に実質的に変更される。
ボルレリジン構造を誘導する該PKSを変更することができることを示すために、モジュール4の該ATドメイン（borA4によりコードされている該ATドメイン）を、置換手順（実施例６を参照）を用いて、該ラパマイシンPKS（rapAT2）のモジュール2の該ATドメインで置換した。これは、菌株S.パルブルス Tue4055/467を与える。この突然変異体の培養抽出液の発酵、及びLCMS分析の結果、幾つかのボルレリジンを産生し、かつ、また、ボルレリジンよりも、m/z値が14単位小さい、新しい高極性化合物を観察した。これは、該PKSのモジュール4による、マロネート（マロン酸塩、又はエステル）の多少のそれのメチルマロネート伸長単位の組込みと一致し、10-デスメチルボルレリジン3を産生している。
ドメイン交換方法による製造に加え、また、3を、該モジュール4ATドメイン選択性モチーフ内に、特定の変化を導入することにより製造する（Reevesらの論文、2001；国際公開第02/14482号）（実施例７を参照）。このような変化は、該ATドメインの選択性に影響を与え、メチルマロニル-CoAよりも優先的に、マロニル-CoA基質分子を選択する。従って、配列番号：５の第739〜742番目の該アミノ酸モチーフYASHを、HAFHに変え、菌株S.パルブルスTue4055/472を得る。この突然変異体の培養抽出液の発酵、及びLCMS分析の結果、ボルレリジン、さらに、ボルレリジンよりも、m/z値が14単位小さい、新しい高極性化合物を産生した。この新しい化合物は、前述の化合物と同一であり、かつ従って、該PKSのモジュール4によるメチルマロネート伸長単位よりもむしろ、マロネートの組込みと一致し、３を産生する。
これらの結果は、該ボルレリジンPKSが、遺伝子操作、及び非相同的菌株のその天然配列の交換の影響を受けることを、はっきりと示している。当業者にとって、ボルレリジンPKSの前記方法の該生合成工学技術が、新規ボルレリジン-様分子の製造を可能にするであろうことは明らかである。
該ボルレリジン装填モジュールは、その同起源基質の唯一の構造のため、興味深い。他のシステムにおいて、その可能な使用を調査するため、該エリスロマイシンPKSの装填モジュールを、サッカロポリスポラ エリスラエアの該ボルレリジン装填モジュールで置換した；この実験は、以前の該アベルメクチン装填モジュールを用いて行った実験と類似している（国際公開第98/01546号；Marsdenらの論文、1998）。該新しい菌株が、該C13-エチル基が外から供給されたラセミ体トランス-シクロペンタン-1,2-ジカルボン酸部位で置換された、新規エリスロマイシン様分子を産生可能であることを予測する。この実験を行うために用いた方法論は、国際公開第98/01546号に記載された方法論と類似しているが、該形質転換は、十分に進行したマクロライドよりもむしろ、アグリコン生成物エリスロノライドBを蓄積する、突然変異体サッカロポリスポラ エリスラエア DM（Gaisserらの論文、2000）、並びにS.エリスラエアWTを用いて行った。この実験は、実施例８に記載する。
配列番号：１の４つの候補の開始コドンが、borA1に対して適当であることは、配列番号：１から明白ではない。該４つの最も明白な候補開始コドンは、配列番号：１の第16184、16298、16607、及び16901番目のヌクレオチドである。初期には、これらの可能な開始コドンは、配列番号：２の該アミノ酸配列を与えるように使用された。該エリスロマイシン、及びアベルメクチン装填モジュールを有する、この装填モジュールの蓄積は、該AT0ドメインが、配列番号：２の第321番目の位置で開始し、かつ長いN-末端尾があることを示している。borA1の最初の298アミノ酸に、有意な相同性がないことがわかっている。該ボルレリジン装填モジュールは、個々のorfによりコードされ、かつこの構造を保持するために、該ボルレリジンPKS装填モジュール配列を該エリスロマイシンPKS装填モジュール配列に結合するために選択されたスプライス部位は、配列番号：３の第42〜44番目のアミノ酸位置である、borA2の該KS1ドメインの最初の相同的領域である。このアプローチは、機能性PKS組立てを生じるために必須であると考えられる、BorA1末端及びBorA2の最初の部分で、推定される結合領域を維持する。この実験の連続性を維持するために、この装填モジュールを、eryA1の該KS1ドメインの始めの等価点と融合する。該得られる突然変異体S.エリスラエアDM/CJM400-403を、発酵し、かつ標準的プロトコルの陰イオンLCMSにより分析した。この分析は、予想通り、m/z = 485.3を有する新たな化合物６の存在を、はっきりと示した（図７）。当業者にとって、これらの実験の生成物が、S.エリスラエアJC2（Roweらの論文、1998）のような、適切な菌株を用いて、生体内変換され、新規な生物学的活性エリスロマイシン類似体を製造し得ることは明らかである。当業者にとって、該ボルレリジン装填モジュールが、他のPKS（すなわち、該ボルレリジンPKSでない）の該生合成工学技術に有用であり、トランス-シクロペンタン-1,2-ジカルボン酸部位を有する、さらなる新規ポリケチドを製造することは明らかである。また、該ボルレリジン装填モジュールから誘導されたハイブリッド型PKSから生じる生成物の多様性は、該同起源基質以外のカルボン酸の外来供給を介してさらに向上され得ることは明らかである。
該ボルレリジンPKSの最も印象的な特徴は、I型モジュラーPKS作用の前進的様式である、通常の共直線からの明らかな相違である。ボルレリジンは、ノナケチド（予測：１つの装填に加えて、８つの伸長工程）である。しかし、該クラスター内には、７つのモジュール（１つの装填、および６つの伸長）のみしかない。該ボルレリジンの化学構造に関して、PKSドメインの分析は、図５に示す鎖伸長に３回反復使用される、第５の伸長モジュール（BorA5）と相関がある。従って、５、６、及び７回目の鎖伸長は、３つのメチルマロニル-CoA伸長単位の組込み、及びβ-ケト基から、メチレン部位への全還元処理を有するBorA5で生じる。前述したように、モジュラーPKSの共直線作用の相違は、異常であり、かつ少しの例に制限される。本例は、興味深く、該β-ケト基を完全にメチレン部位に還元し、かつ続いて、該成長鎖のタンパク質内移動よりむしろ、タンパク質間移動する、モジュール上で生じる。また、これは、該エリスロマイシン（Wilkinsonらの論文、2000）、及びエポチロン（Hardtらの論文、2001）PKSのI型モジュールの間違った反復使用である、２つの公知の例である。この完全な還元が、脂肪酸シンターゼ（FAS）に機能的に等価な、これらのモジュールを作ることは、注目すべきである。反復作用し得る該I型PKSモジュールは、FAS様活性を保有し得る。
BorA5が、反復使用（３回）されると思われるが、２つの他の可能なシナリオは、該ボルレリジン生合成クラスター内にあるボルレリジン生合成の特定遺伝子を明らかにすることができる。第一に、２つのモジュールは、クラスターから‘欠落'し得るが、該ゲノム中の幾つかの他の位置にあり得る。しかし、調査した大部分の場合において、放線菌類の二次代謝産物の生合成に要求される遺伝子は、単一遺伝子内に集まる。第二の可能性は、３つの別々のBorA5二量体を組立て、かつ各々が、一連の鎖伸長を触媒し；従って、該工程は、前進的となるであろうことである。しかし、このシナリオは、該他のPKSタンパク質に関して、３倍量のBorA5を製造する必要があるが、該ボルレリジン遺伝子クラスターの構成は、borA5の該調節が、すべての他のPKS遺伝子の調節とは異なることを示していない。さらに、このシナリオは、タンパク質間結合ドメインの役割に関して、一般的な考えには合わなく、異なるタンパク質をコードしたモジュール間に特異的に結合することができる対象に必要である、該生合成複合体のタンパク質のN-、及びC-末端間に、特異的認識があることを提案する（Ranganathanらの論文、1999；Wuらの論文、2001；Broadhurstらの論文、2003）。
前述の課題に取組むため、borA4、及びborA5によりコードされている該２つのタンパク質を、遺伝子レベルで操作後に融合し、菌株S.パルブルスTue4055/borA4-A5を製造し（実施例９を参照）、かつ別に、borA5、及びborA6によりコードされている該２つのタンパク質を、類似した方法により融合し、菌株S.パルブルスTue4055/borA5-A6を製造した（実施例１０を参照）。さらに、前述の融合を組合せ、borA4、borA5、及びborA6を融合した、菌株S.パルブルスTue4055/borA4-A5-A6を製造し、二重の突然変異体を製造した（実施例１１を参照）。従って、該新規、融合、ビ-、トリ-モジュラー遺伝子は、BorA5の３つの個々の分子、又はBorA5と直列して作動するように、該ボルレリジンクラスターから離れた遺伝子によりコードされているもう一つのタンパク質に対して、組立てることができない。菌株S.パルブルスTue4055/borA4-A5、/borA5-A6、及び/borA4-A5-A6の発酵、続いて抽出、及び分析の結果、ボルレリジン産生の減少を確認した。しかし、該WT菌株と比べた場合、有意な水準であった（それぞれ、21±4％、27±4％、及び18±5％）。従って、これらの突然変異体のボルレリジン産生は、該融合BorA4-A5、又はBorA5-A6のモジュール５は、反復方法を作動する。本出願の優先権出以来、これらの制限したデータは、公表されている（Olanoらの論文、2003を参照）。
反復作用するBorA5の能力は、非相同的PKSの該工学技術にとって、大きな可能性を有し、拡大した環サイズを有するマクロラクトンを提供する。この可能性を調査するために、BorA5を、DEBS2のモジュール４の代わりに、該エリスロマイシンPKS内に交換した。これは、該エリスロマイシン産生株S.エリスラエアWT、及びS.エリスラエアDM、双方の適切な遺伝子断片の置換により行った。この実験は、メチルマロニル-CoA伸長単位を補強するモジュール、及びメチレン基を形成するβ-ケト機能を処理するモジュール、双方として選択する。さらに、該ポリケチド鎖内の得られたメチル基の立体化学は、双方の場合において、同じである。最も有意な事実は、DEBS2のモジュール４が、鎖伸長の間違った反復回数を行うことが知られていることであり（Wilkinsonらの論文、2000）、そのような工程は、該PKS内のこの位置で実際に生じ、かつDEBS3で完全に処理され得る生成物を生じ得ることを示し、16-、及び18-員環マクロライドを製造するように、非相同的モジュールの特定の反復使用を導入するための誘因的標的を調節する。
簡潔に、borA5をコードしているDNA領域を、eryA2のモジュール４をコードしたそれと交換し、それは、該エリスロマイシンPKSのDEBS2のC-末端部位をコードしている（実施例１２を参照）。該得られた突然変異体S.エリスラエアDM/421を、生育させ、かつS.エリスラエア菌株の代謝産物の産生に関して抽出し、かつ次いでLCMSにより分析した。エリスロノライドBよりも極性の低い、２つの新しい有意な化合物が観察された。これらは、それぞれ、m/z 435.5（7, [MNa+]）、及び477.5（8, [MNa+]）を有し、２つの新しい環拡大したエリスロノライドB類似体（図８）の産生と一致する。m/z = 435.5を有する化合物７は、S.エリスラエアWT発酵の微量成分として、以前に報告されたマクロライドに関連した、該16-員環-拡大エリスロノライドBの存在と一致する（Wilkinsonらの論文、2000）。当業者にとって、このような新規生成物を、適切内生物体の生物内変化により、抗菌性分子に変換することができることは明らかである。また、当業者にとって、該エリスロマイシンPKSの他の位置内に、又は他のPKS内に、そのようなモジュールの包含は、類似した方法により、新規環拡大ポリケチドの産生を可能にし得ることは明らかである。さらに、該KS4の保存領域の始めから該ACP4ドメインの終わりの、該DEBSモジュール４の領域のみを交換する実験を行うことが可能であり；この配置は、それぞれ、DEBS2、及びDEBS3の末端で、該C-、及びN-末端領域を保有し、これらのタンパク質の該共通認識、及び結合を確実にする。
（非-PKS遺伝子）
遺伝子をコードしている該PKSの上流域、及び下流域、双方は、ボルレリジン生合成を伴う他のorfである。orfは、少なくとも１００個の隣接ヌクレオチドからなるように設計され、適切な開始コドンで始まり、かつ適切な終止コドンで終り、かつヌクレオチドのグアニン、及びシトシンが豊富なDNAを有する生物体のタンパク質コード領域の適切なコドン偏位を有する。該ボルレリジンPKS遺伝子（borA1-borA6）の上流域、及び下流域、双方の該DNA配列において、該NCBIデータベース中の他の配列との比較により同定することができた、多くのorfがある（図３を参照）。これらのorfの詳細なヌクレオチド配列を、表８に示す。
Figure 2006514548
（注意１：cは、該遺伝子が、DNA相補鎖によりコードされていることを示す；注意２：前述の各読み取り枠に対して、該最長の有望な読み取り枠を記載する。時々、二以上の可能な候補開始コドンを、同定することができる場合がある。当業者は、これを認識し、かつ別の可能な開始コドンを同定することができるであろう。我々は、‘*'シンボルを用いて、二以上の可能な開始コドンを有する遺伝子を示している。我々は、該開始コドンになると考えられるものを示しているが、しかし、当業者は、別の開始コドンを用いた活性タンパク質が、生成可能となり、また、これらの別の開始コドンを用いて生成したタンパク質は、本発明の範囲内と考えられることが理解されるであろう。注意３：配列番号：割当てられた個々の配列、及び配列番号を明らかにする以外、orfB13bに対して、配列番号：３４を独創的に設計した。）
該予測されたポリペプチド（配列番号：７〜４３）の潜在的機能を、BLASTサーチを用いて、該NCBIデータベースから得た。これらのサーチから得た、最適合を表９に記載した。
Figure 2006514548
Figure 2006514548
推定上の遺伝子産物の機能分析は、該遺伝子borBからborOが、該ボルレリジン生合成クラスターの境界を、最も好ましく形成することを示す。これをサポートする証拠は、borB2の破壊によってもたらされ、野生型親菌株と区別がつかないレベルで、ボルレリジンを産生する。さらに、borB3〜borB7は、コスミドSCF76をコードしている、ストレプトマイセス コエリカラーA3（2）ゲノムにおいて、相同体を有する。該borB8〜borB10のorfは、該S.コエリカラーA3（2）コスミドSC5E3において、相同体と同じように配置される。該borB18〜borB21のorfは、該S.コエリカラーA3（2）コスミドSC1A2と同様に配置される相同体を有する。borB13のorfは、フレームシフトを含み、かつ従って、最も好ましくは、すべての遺伝子産物が、不活性化されているであろう。さらに、これらのorfの産物が、ボルレリジン生合成の間、無機能であることは、容易に推定することができる。
（開始単位生合成遺伝子）
該トランス-シクロペンタン-1,2-ジカルボキシル基開始単位の生合成を伴う、該遺伝子を同定するために、該遺伝子borB〜borNの各々を破壊した（例えば、実施例１３〜２５）。これは、極性効果の可能性を最小にするように設計された方法であり、該ermE*プロモーターの制御下、該破壊した遺伝子の全長コピーを有する、トランス相補性の成功により実証し、いずれの場合にも、おおよそ、WT水準のボルレリジン産生に戻る。
該破壊した突然変異体の各々を、実施例１に記載したように、３通りで生育し、かつボルレリジン産生を評価した。これと平行して、各突然変異体を、３通りで生育し、かつ２４時間後、最終濃度が1 mMとなるように、外来の開始酸を補足し、そして、ボルレリジン産生を評価した。ボルレリジンの抽出、及び分析は、下記表１０に記載するデータを提供した。
Figure 2006514548
（注意１：括弧内の値は、幾つかの実験を繰返し行った場合を示す；注意２：N/A = 適用できず）
表１０のデータに基づき、当業者にとって、該遺伝子産物BorC〜F、及びK〜Mが、トランス-シクロペンタン-1,2-ジカルボン酸の生合成に必須であり、又は非常に重要であることは明らかであり、その理由は、該WT生物体のそれに近い水準で、又はそれより多くのボルレリジンを産生するとすぐに、これらの突然変異体は、外来の開始酸の添加がなくなり、ボルレリジンを産生しない、又は非常に低水準となるためである。さらに、該遺伝子産物に加えて、BorG、H、及びNは、該開始単位の生合成に、必須ではないが、関与するようである。その理由は、該WT生物体のそれよりも近い、又は多い水準で、ボルレリジンを産生するとすぐに、これらは、外来の開始酸が添加されるまで、ボルレリジンの産生が、有意に低い水準であったためである。これは、該borG-突然変異体の場合に、特に注目すべきである。
BorN相同体の通常の代謝機能は、4-ヒドロキシフェニル酢酸9（図９）を介した、チロシンの異化作用の重要段階である、2-オキソヘプタ-3-エン-1,7-ジオエート10の製造である（Prietoらの論文、1996）。従って、10は、トランス-シクロペンタン-1,2-ジカルボキシル基の生合成過程における中間体であり得る。ボルレリジンを製造するためのborNを破壊した突然変異体の能力は、減少した水準であるにもかかわらず、おそらく、相同体の存在下にあり、ゲノムの他に、一次代謝の間のチロシン異化作用に利用される。
該中間体10は、トランス-シクロペンタン-1,2-ジカルボン酸から生じる形成すべての要求された機能を含む。最も有望な次の段階は、エノイルレダクターゼにより触媒されるものと類似した反応の該3-エン位置の還元生合成である。この段階に関与する可能な酵素は、BorC、BorD、BorK、又はBorMであり、これらの酵素は、表１０のデータに見られるように、すべてのボルレリジン開始単位生合成を伴う。該得られた2-オキソヘプタ-1,7-ジオエート11は、新しいC-C結合の形成を介して、環化する、一つの可能な基質である。この環化において、もう一つの可能な基質は、2-ヒドロキシヘプタ-1,7-ジオエート12、又はその幾つかの不活性化形態であろう。これは、おそらく、BorC、BorD、又はBorMのような、オキシドレダクターゼの作用により、11から形成されるであろう。
該重要な環化段階は、おそらく、BorEにより触媒され、O-スクシニルベンゾイル-CoA シンターゼ、及びクロロムコネートシクロイソメラーゼに類似性を示す。これらの酵素は、該エノラーゼ上科に属し、その類は、カルボキシラート（カルボン酸塩、又はエステル）基に隣接した炭素原子上に、アニオンの形成を安定化する共通能力を共有する（Schmidtらの論文、2001）。ムコネートシクロイソメラーゼの基質が、11、及び12の全体構造において類似しているヘキサ-1,6-ジオエートであることをさらに注目する。11、又は12（又はその活性化形態、例えば13）のC6で、次のC2への環化を伴うプロトン除去、及びアニオン等価体の形成は、正確に置換した、シクロペンタン環構造を提供する。一方、基質としての11の仲介は、おそらく、対称シクロペンタ-1-エン-1,2-ジカルボン酸、又は可能な該Δ1-未飽和化合物シクロプロパ-1-エン-1,2-ジカルボン酸を与えるように、水の脱離を介して、該置換シクロペンタンの幾つかのさらなる処理を要求するであろう。しかし、シクロペンタ-1-エン-1,2-ジカルボン酸、又はそのエチルエステルを、borC〜Eのすべてを破壊したS.パルブルスTue4055菌株、又はWT菌株に供給することにより、どのボルレリジンをも製造せず、又は未供給コントロールと比べて、すべての増加した量のボルレリジンを製造しなかった。これらのデータは、この化合物が、おそらく、開始単位生合成の中間体でないこと、及びBorEの基質が、おそらく、該2-ヒドロキシヘプタ-1,7-ジオエート12、又はその活性化形態（例えば、13）であることを示している。トランス-シクロペンタン-1,2-ジカルボン酸への該生合成過程の推定される工程を、図４に示す。
該組合せた、トランス-シクロペンタン-1,2-ジカルボン酸の生合成段階に要求される、特定遺伝子の組合せは、明らかでない。しかし、おそらく、borC〜H、borK、borM、及びborNの幾つかの組合せによりコードされている。4-ヒドロキシフェニル酢酸9の異化作用を伴い、かつ該工程において、BorNに優先して作用するであろう遺伝子の特定相同体の欠落は、おそらく、一次代謝遺伝子が、これらの作業を行うことを、おそらく示している。外来のトランス-シクロペンタン-1,2-ジカルボン酸を、S.パルブルスTue4055、及び関連菌株に添加することにより、我々の条件下において、2〜3倍のオーダーで、ボルレリジンの滴定量が増加し、開始酸の該生合成は、ボルレリジン生合成において、制限因子であることを示している。これらのデータは、トランス-シクロペンタン-1,2-ジカルボン酸の源となる、チロシンの一次代謝分解と一致する。
遺伝子が、該開始単位の生合成に特異的に関与し得ることを、さらに明確にする試みにおいて、多くの共-培養実験を、該異なる突然変異体の組合せを用いて行った。これらは、borI、及びborJの遺伝子産物が、該C12ニトリル部位の形成に特異的に伴うという知識を必要とし、表１０のデータと組合わせて、次の下記セクションに示したデータにより、明らかとなる。まとめると、突然変異体borE-とborD-、及びborE-とborM-の該共-培養は、すべてのボルレリジン産生に失敗した。一方、突然変異体borM-とborI-、及びborM-とborK-の該共-培養は、おおよそWT水準でボルレリジンを産生した。表１０、及び下記と組合わせて、これらのデータは、borD、borE、及びborMが、開始単位生合成を伴い、一方borI、及び可能なborKが、ボルレリジンのC12ニトリル部位の形成を伴うことをはっきりと示す。
開始単位生合成を伴う遺伝子が、破壊されている場合、外来のトランス-シクロペンタン-1,2-ジカルボン酸の添加が、突然変異体において、おおよそWT水準、又はより多くのボルレリジン産生を、再建させるのに十分であることは、表１０のデータから明らかである。これらのデータは、S.パルブルスTue4055による、添加カルボン酸の積極的な摂取に関して問題はなく、かつ該カルボン酸をCoAチオエステル等価体に変換することができる活性があることを示している。従って、公知の変異合成技術は与えられており、外来のカルボン酸を、前述の突然変異体、例えば、実施例１６に記載した該borE-菌株S.パルブルスTue4055/borE：aac3（IV）の一つに添加することにより、該開始単位カルボン酸部位が、外来の添加カルボン酸から誘導される部位と置換し、ボルレリジン類似体の産生を導き得ることは、当業者にとって明らかである。
この可能性を調査するために、実施例１に記載した該プロトコルに従って、菌株S.パルブルスTue4055/borE：aac3（IV）に、トランス-シクロブタン-1,2-ジカルボン酸を供給し、かつ次いで、実施例４に記載したように分析した。図１０に記載した該構造18は、このカルボン酸の供給から得られた、新規ボルレリジン構造を示す；この化合物18は、ボルレリジンの予測されたUV発色団を示したが、早い保持時間で溶出し、かつLCMSで期待された質量を示した（m/z = 474.3 [M -H]-XX）。この方法論の検証を、18の製造、単離、及び特性により提供した（実施例３３）。また、他のカルボン酸を、類似した供給実験に使用することができ、さらなる新規ボルレリジン類似体を提供することは、当業者にとって（RS）-2Itは明らかである。すべてではないが、カルボン酸を、ここに記載した正しい方法論を用いて組込むことが可能であるが、当業者は、供給開始単位の組込みを高める、多くの利用可能な方法を承知している。
borE内を除去した該菌株の使用に加え、該bor PKS の天然開始単位を供給した場合、borGが破壊されている該菌株S.パルブルスTue4055/borG：aac3（IV）は、該野生型生物体を供給（4倍増加）、又は未供給（15倍増加）した時に見られる滴定量よりも、十分に高い滴定量で、ボルレリジンを産生することを観測した。さらなる調査のために、外来の基質として、該天然、及び非天然開始酸、双方を用いて、野生型、該borE突然変異体、及び該borG突然変異体に同時に供給して、この実験を繰り返した。該得られたデータを、表１１に記載する。
Figure 2006514548
表１１に見られるように、変異合成のために、S.パルブルスTue4055/borE：aac3（IV）の代わりに、S.パルブルスTue4055/borG：aac3（IV）を使用することにより、該滴定量が、約１９倍増加し、かつ天然開始酸を供給したS.パルブルスTue4055/borG：aac3（IV）は、野生型単独よりも、３８倍多くボルレリジンAを、又はシクロペンタントランス-1,2-ジカルボン酸を同量供給した該野生型菌株よりも、１３倍多くボルレリジンAを産生する。これらのデータは、変異合成実験のために、菌株S.パルブルスTue4055/borG：aac3（IV）を使用することは、ボルレリジン類似体の滴定量を改善し、産生にとって有利になる。この方法は、ボルレリジン、及びボルレリジン類似体の産生、双方に対して、一般的適用を有する。
この結果に基づき、別のカルボン酸を用いた該供給実験を、S.パルブルスTue4055/borG：aac3（IV）において繰り返し、かつ2,3-ジメチルコハク酸、及び2-メチルコハク酸を含むように拡張し；それぞれ、これらの別の開始単位、19、及び20の組込みから誘導された該新規化合物を、図１０に記載した。
他の方法を介した、S.パルブルスTue4055の発酵培養液内に産生したボルレリジンの滴定量を改善する試みにおいて、該遺伝子borE、及びborLの付加的コピーを、強力な構成的プロモーターermE*の制御下にあるベクター中、該生物体内に導入した。これらの遺伝子の過剰発現は、該開始酸の細胞内水準を増加させ、ボルレリジン産生に関して制限すべきであることを予測した。
該遺伝子borE、及びborLは、PCRにより増幅し、該ベクターpEM4内にクローン化し、かつ次いで、それぞれ、実施例２９、及び３０に記載したようにS.パルブルスTue4055内に導入した。さらに、また、該ベクターpEM4単独（挿入を含まない）を、S.パルブルスTue4055に導入し、かつコントロールとして使用した。該得られた菌株を、実施例１〜４に記載したように、生育し、抽出し、かつ分析した。コントロールとして、該ベクターの導入は、ボルレリジン産生の水準に、有意な影響はなかった。しかし、この方法において、borE、又はborLのどちらかの付加的コピーの発現は、該野生型菌株に対するボルレリジン滴定量において、それぞれ、4.2±0.3、及び4.3±0.7倍の増加をもたらした。推定上、これらの遺伝子産物により触媒された生合成の段階は、律速であり、又は代わりに、これらの遺伝子産物は、正の制御的機能を有し得る。例えば、borLは、植物のオーキシン応答タンパク質（auxin response proteins）に対して、最大の相同性を示す。オーキシンは、植物において、様々な細胞過程の調節を伴うホルモンであり、かつborLは、細菌の制御的機能を有する関連遺伝子の最初の例を示し得る。コントロールとして、pEM4中のermE*の制御下、borJ、borO、及びborA5の付加的コピーを、S.パルブルスTue4055内に導入したが、ボルレリジン滴定量にほとんど影響はなかった。これにより、該各遺伝子産物のどれも、開始単位生合成を伴うことが見込まれないと予測された。さらに、該推定上の‘スタッタリング'PKSモジュール（borA5）の上方制御は、ボルレリジン滴定量を増加させず、さらに、利用した３つの単独のコピーよりもむしろ、このモジュールの反復使用を生じることを示している。borOが上方制御された場合、滴定量への影響の欠落は、産生する生物体に毒性がないために、ボルレリジン産生の制限はおそらくないことを示し、かつ滴定量改善のさらなる範囲であることを示す。
（C12での該ニトリル部位の形成）
該ボルレリジンPKSモジュール3のATドメインの配列分析は、３回目の鎖伸長に利用された基質が、メチルマロニル-CoAであることを示した。従って、該ニトリル部位の炭素原子は、おそらく、メチルマロニル-CoAのメチル基から生じる。これを、安定同位体供給実験により、実証した。[2,3-13C2]プロピオン酸ナトリウムを、S.パルブルスTue113に供給することで、予想通りに、C4-C24、C6-C25、C8-C26、C10-C27、及びC12-C28の炭素原子の無処置標識（intact labelling）、及び同一の特異的組込み（我々の実験方法の制限内に決定されたように）を示すボルレリジンを得た（図２）。これらのデータは、該C12-メチル基の変換が、３回目の伸長単位の組込み時、又は組込み後、鎖組立の間に生じるか、又はポリケチド鎖組立後に生じ、かつ該PKSから放出されることを示す。表１０に示す該遺伝子破壊データと共に、該ボルレリジン生合成遺伝子に与えられた、官能基の割当に基づき、borI、及びborJ、双方は、C12での該ニトリル部位形成に、明らかに関係しており、さらに、また、borKのような他のものも、関係し得る。
該シトクロムP450ヒドロシキラーゼBorIは、TylHIに対して、最大の類似性を共有し、デオキシヘキソース部位の付加前に、該タイロシン（tylosin）マクロラクトンの環外メチル基のヒドロキシル化を触媒する（Foucesらの論文、1999）。従って、BorIは、ボルレリジン生合成の間に、該C12-メチル基の酸化を触媒すると考えられる。これに従って、該borI-突然変異体S.パルブルスTue4055/borI：：aac3（IV）は、ボルレリジンを産生することができない。しかし、ボルレリジンよりも極性の低い、新規生成物14（図６）を蓄積する。14は、該PKS開始単位を合成する能力を欠いた、borE-突然変異体（mutant）S.パルブルスTue4055/borE：：aac3（IV）に供給された場合、該直ちにボルレリジンに変換される。しかし、該ボルレリジン生合成遺伝子無処置の残りを維持する。S.パルブルスTue4055/borI：：aac3（IV）の発酵、続く抽出、及び単離は、14を〜30 mg提供した（実施例３１）。14の全体の構造分析により、12-デスニトリル-12-メチルボルレリジン（前駆ボルレリジン）として同定した。これは、ボルレリジン生合成において、BorIの提案された役割と一致し、かつ該マクロラクトン環のC12に結合したメチル基を有する、新規ボルレリジン類似体への経路を提供する。
該推定されるPLP依存アミノトランスフェラーゼBorJは、該活性化したC28-位置で、おそらく、C12-ホルミル部位を介して、ボルレリジン中への窒素原子導入を触媒すると考えられる。これに従って、該borJ-突然変異体S.パルブルスTue4055/borJ：：aac3（IV）は、ボルレリジンを産生せず、かつボルレリジンよりもさらに極性の高い新規化合物を蓄積する。この新規化合物は、突然変異体S.パルブルスTue4055/borE：：aac3（IV）に供給された場合、ボルレリジンに変換されず、おそらく、ボルレリジン生合成中間体よりもむしろ、分路代謝産物であることを示す。S.パルブルスTue4055/borJ：：aac3（IV）の発酵は、17 mgの蓄積化合物の単離を可能にした（実施例３２）。詳細な構造分析により、12-デスニトリル-12-カルボキシルボルレリジン2として、該蓄積を同定した。
該ボルレリジン生合成遺伝子の突然変異体から単離した該化合物に加えて、12-デスニトリル-12-ホルミルボルレリジン15を、S.パルブルスTue113の発酵上清から単離する。これらの実験に使用した、該発酵培地、及び条件は、我々が今までここで記載していたものとは異なる。しかし、ボルレリジンの産生を最大限にするために設計した。我々は、この特定の発酵の間に生じることを観測した、該溶存酸素濃度の低下とともに、該この変更した培地は、15の蓄積を促進させることを提案する。15は、該PKS開始単位を合成する能力を欠いた、該突然変異体S.パルブルスTue4055/borE：：aac3（IV）に供給された場合、直ちにボルレリジンに変換される。しかし、該ボルレリジン生合成遺伝子無処置の残りを維持する。
上述のデータにより、我々は、図６にあるような、ボルレリジンのニトリル部位に対する生合成経路を提案するに至った。初め、前駆ボルレリジン14の該C12-メチル炭素は、BorIにより酸化され、C28にアリルヒドロキシル基を導入する（16）。次いで、このヒドロキシル基は、下記を含む群から選択される方法を用いて、C12に結合する該ホルミル部位に変換される（15）：自然酸化（幾つかの背景酵素（background enzyme）により媒介された酸化を含む。）、該ボルレリジン生合成遺伝子クラスターの特定遺伝子の作用；従って、候補遺伝子産物が、多機能性様式を作用し、かつジェム-ジオール構造の形成、続く脱水を介して；又は代わりに、borC、又はborKのような、該オキシドレダクターゼコード化遺伝子の一つを介して作動する、BorI自身である次の段階は、アミン形成において、ピリドキサミンリン酸媒介工程を介して、C28の窒素原子を導入するために、15のBorJ-触媒トランスアミノ化を行うと予測される。推定上の生成物アミン17は、おそらく、BorIのような酵素活性、又はborC又はborKのような、該オキシドレダクターゼコード化遺伝子の一つの生成物、又はプロテオーム中の該一般的なオキシドレダクターゼによるものではない、自然酸化を受ける（特定の類似点を、植物中でのニトリル生合成に描くことができる（Celenzaらの論文、2001；Hahnらの論文、1999；Nielson、及びMollerらの論文、1999）。）。
さらに詳細に、この提案される経路を調査するために、多くの生物内変化実験を、borI-Kの個々の作用を調査するための基質として、前駆ボルレリジン14を用い、かつ合わせて、べクターとしてpEM4、及び発現菌株としてS.アルブスJ1074を用いて行った。borI、又はborJ個々の発現は、14の添加に対して、ボルレリジン産生を与えなかった。該添加した14は、borIを用いた生物内変化の間に消耗されるだけであった（そして、すべての該コントロール実験においてはなかった。）；該添加した14は、該分路代謝産物2に変換されることが確認された。しかし、borI、及びborJの共発現は、該添加した14をボルレリジンに変換した。従って、S.アルブスにおいて、BorI、又は一般的なプロテオーム活性は、該ボルレリジン生合成経路において、該提案されたアミン中間体17を酸化することができるようである。前駆ボルレリジン14の供給に加えて、12-デスニトリル-12-カルボキシルボルレリジン2を、前述の３つの菌株に、また供給した。2が分路代謝産物である考えを補足する、これらのすべての実験において、2がボルレリジンに変換されないことが、観察された。
３つのボルレリジン産生菌株S.ロケイATCC23956、S.パルブルスTue113、及びS.パルブルスTue4055のゲノムDNAの詳細な調査を、多くの制限消化、及び続くサザンブロット分析を用いて行い、これらの３つの生物体の該ボルレリジン生合成遺伝子クラスターが、非常に綿密に保存されていることを示した。従って、これらの菌株の該ボルレリジン生合成経路は、非常に類似しているようである。この仮定により、我々は、一つの生合成に対して規定どおりに、異なる菌株から得られた上述のデータを考えることが可能である。
borI、又はborJのような、ボルレリジンの該C12-ニトリル部位を形成する遺伝子操作が、通常、C12で別の官能性を有する、新規ボルレリジン関連分子、及びボルレリジン誘導体の産生方法として有用であることは、当業者にとって明らかである。天然、又は人工ポリケチドを産生する、他の生物体に対して、これらの遺伝子の転写は、そのような化合物内に、ニトリル部位の組込みを可能にし得る。
この仕事の伸長において、borI、及びborJの破壊を、該菌株S.パルブルスTue4055/borG：aac3（IV）内に別々に行い、二重変異菌株S.パルブルスTue4055/borG：aac3（IV）/borI：：hyg、及びS.パルブルスTue4055/borG：aac3（IV）/borJ：：hygを得た（それぞれ、実施例２７、及び２８）。これらの菌株に、別のカルボン酸である、トランス-シクロブタン-1,2-ジカルボン酸、2,3-ジメチルコハク酸、及び2-メチルコハク酸を（上述のように）供給し、かつ該ニトリル部位に代わって、メチル（それぞれ、21、22、及び23）、又はC12でのカルボキシル官能基（それぞれ、24、25、及び26）を有する、該変異合成ボルレリジン類似体を産生し、また、これらは、外来の供給カルボン酸に対応する、別の開始単位から誘導されることがわかった。新規化合物の直交ライブラリー（orthogonal library）を、図１１に記載し、かつ各化合物の該観察されたUV発色団、及びマススペクトルデータを示す。
（ボルレリジン産生を伴う、他の遺伝子）
該ボルレリジンPKSのI型ターミナルチオエステラーゼドメインに加えて、個々のII型チオエステラーゼは、該生合成遺伝子クラスターの上流境界に配置され、かつ該遺伝子borBにより、コードされている。このような個々のII型TEタンパク質は、一般的に、I型PKSと関連していることがわかっており、かつKSドメインに結合した伸長単位のな脱炭酸により形成される単鎖アシル基の除去により、PKSの該'編集（editing）'の役割を行うと考えられている（Heathcoteらの論文、2001）。このような、該ピクロマイシン（Xueらの論文、1998）、及びタイロシン生合成クラスターの個々のII型TEの該破壊は、双方のマクロライド滴定量の有意な低下を導く。これらの結果に従って、borBの破壊（実施例１３）は、親野生型の滴定量の43〜75％の間で産生する突然変異体を与える。
ボルレリジンに対する、S.パルブルス菌株の自己耐性は、おそらく、トレオニルtRNAシンテターゼ相同体をコードしているborOの生成物のためである。トレオニルtRNAシンテターゼは、感受性菌株において、ボルレリジンの標的分子である（Paetz、及びNessの論文、1973）。BorOは、ボルレリジン作用に耐性を示し、かつ阻害される正常のトレオニルtRNAを効果的に補完した、ボルレリジン産生細胞内のトレオニルtRNAを産生するようにふるまうことが予測される。この仮定を検証するために、borOをPCRにより増幅し、かつ強力な構成的プロモーターermE*の制御下にborOを置いた、該発現ベクターpEM4Aをクローン化した（実施例２６）。次いで、該得られたベクターpborORを、該ボルレリジン-感受性菌株ストレプトマイセスアルブスJ1074内に形質転換した（Chater、及びWildeの論文、1980）。浸漬した円板状バイオアッセイを用いた、該発現ベクターpEM4Aのみを含む菌株を用いた、この菌株の比較により、borOの発現がボルレリジンに対する耐性を与えることを、明確に示した。
（一般方法）
制限酵素、他の分子生物学的試薬、抗生物質、及び化学物質を、標準的な商業用提供先から購入した。制限エンドヌクレアーゼ消化、及び連結を、標準的方法に従った（Sambrook, J.らの論文、1989）。
（実施例１）
（S.パルブルス菌株の発酵）
次の方法は、一般的に、ボルレリジン、及び／又はボルレリジン類似体を産生するS.パルブルスの培養に有用である。
NYG培地（250 ml三角フラスコ内に30 ml）を含む、種フラスコを、通常在庫（0.5 ml）から接種させた。NYG培地は、脱イオン水中：牛肉エキス（0.3％）、バクトペプトン（0.5％）、グルコース（1％）、及び酵母エキス（0.5％）を含む。ロータリーインキュベーター（距離5.08 cm（2インチ）；30℃；250 rpm）で、2日間振盪後、該得られたクリーム状の培養液を、PYDG産生培地（250 ml三角フラスコ内に30 ml；10％接種材料）を接種するように使用した。PYDG 培地は、脱イオン水１リットルにつき：ペプトン化ミルク栄養素（1.5％）、酵母菌自己消化物（0.15％）、デキストリン（4.5％）、及びグルコース（0.5％）を含み、pH 7.0に調節した。ロータリーインキュベーター（距離5.08 cm（2インチ）；30℃；250 rpm）で、5日間振盪後、該培養液を、実施例４に記載した分析のために、又は要求に応じて、単離目的のために収集した。定量分析のために、これらの実験を３連で行った。
（次の方法は、外来のカルボン酸をS.パルブルス菌株に供給するために有用である。）
該S.パルブルス菌株を、上述のように生育させた。PYDG産生培地中で生育24時間後、選択した該カルボン酸を、50 mlの単一の一定分量（5NのNaOHで中和後、70％メタノール中、0.6 M溶液）として加えた。該得られた培養液を、5日間、すべて発酵後に収集し、かつ実施例４に記載されているように分析した。定量性研究のために、これらの実験を、３通り行い、かつ等量供給、及び未供給WT菌株を、コントロールとして扱った。
（実施例２）
（S.パルブルス菌株の低温保存）
栄養菌糸の通常在庫を、低温保存剤（0.5 ml）を有するNGY培地（0.5 ml）中で、2日間生育させた種培養物を混合することにより調製した。低温保存剤は、脱イオン水中、20％グリセロール、及び10％ラクトースを含む。
（胞子ストック）
S.パルブルスの菌株を、HA寒天プレート上で、30℃でインキュベートした。14日後、一つのプレートから得られた胞子を収集し、かつ保存剤（1 ml）の中に懸濁させた。HA寒天は、脱イオン水中：0.4％酵母エキス、1％麦芽エキス、0.4％デキストロース、及び1.5％寒天を含み、pH 7.3に調節されている。
（実施例３）
（該ボルレリジン生合成遺伝子クラスターのクローニング及びborA2、及びborA3の破壊）
（コスミドライブラリー生成）
コスミドライブラリーを、製造会社のハンドブック（ストラタジーン（Stratagene））に従い、GigapackR III ゴールドパッケージング抽出キット（Gold Packaging Extract kit ）を用いて、pWE15コスミドベクター中に構築した。染色体DNAを、標準的プロトコル（Kieserらの論文、2000）に従って、S.パルブルスTue4055から抽出し、かつpWE15内にクローニングする前に、Sau3AIで処置した。多くの該得られたE.コリ形質転換体（3300）を選択し、かつアンピシリン（100μg/ml）を有する、ルリアブロス（Luria Broth）（LB）培地を含む９６ウェルマイクロタイタープレート（１ウェルにつき、0.1 ml）に移動させた。該得られたクローンを、アンピシリン（100μg/ml）を含む、ルリア寒天（Luria agar）（LA）プレートに、レプリカ-プレート（replica-plated）した。37℃で一晩インキュベート下後、コロニーを、その場のコロニーハイブリダイゼーション分析のために、公表されているプロトコル（Sambrookらの論文、1989）に従って、ナイロン膜フィルターに移動させた。
（ライブラリースクリーニング）
該コスミドライブラリーを、製造会社の取扱説明書に従って、該DIG DNAラベリング、及び検出キット（ロシュ）を用いて製造したプローブを用いて、スクリーニングした。該使用したプローブは、ストレプトマイセス アンチバイオチクスの該オレアンドマイシンPKSの第三サブユニットのモジュール6をコードしている該遺伝子から得られた、BglII-BamHI断片（1.7 kbp）であった。
（該ボルレリジン生合成遺伝子クラスターの破壊）
上述のようにスクリーニングした場合に、肯定応答を与えたコスミドを、BamHIで消化し、かつ3kbp未満の断片を、pOJ260内にサブクローン化した（Biermanらの論文、1992）。次いで、これらを、実施例５に示すように、S.パルブルスTue4055のプロトプラストの形質転換に使用した。次いで、該得られた形質転換体を、ボルレリジン産生能力に対して評価した。２つのクローンは、ボルレリジン非産生体であり、双方は、cosBor32A2から得られ、かつ通常のモジュラーPKSの配列を含む。次いで、該残りのコスミドは、該２つのBamHI断片から得られたプローブを用いて、スクリーニングし、該ボルレリジン遺伝子クラスターの残物を含む、該重なったコスミドcosBor19B9の同定を可能にした。
（cosBor32A2、及びcosBor19B9の配列決定）
該コスミドcosBor32A2、及びcosBor19B9を、E.コリDH10B、及び2×TY培地（30 ml）中、37℃で生育させたクローン内に形質転換した。15日後、該細胞を収集し、かつキアゲンチップ１００キット（Qiagen Tip 100 kits）を用いて、コスミドDNAを調製した。約5μgの該コスミドDNAを、Sau3AI（1 U）を用いて消化した。試料を、該酵素添加後、2、4、6、8、及び10分間隔で取り、かつ等量のアイスコールド0.5M EDTA中でクエンチした。該試料を混合し、かつ次いでゲル電気泳動法により分析し、かつ1.5〜2.0 kbpのこれらの断片を、該ゲルから回収した。該断片を、線形化し、かつ脱リン酸化したpHSG397（Takeshitaらの論文、1987）を、クローン化し、かつE.コリDH10B内に形質転換した。挿入を含む、該得られたクローンを、クロラムフェニコール（30μg/ml）を含む、2xTY培地（2 ml）中で生育させ、ウィザードキット（Wizard kits）（プロメガ（Promega））を用いて精製した。
該ジデオキシターミネーター反応を行う、アプライドバイオシステム８００分子生物学触媒ロボット（Applied Biosystems 800 Molecular Biology CATALYST robot）を用いて、DNA配列決定を行い、次いで、ABIプリズム3700（ABI Prism 3700）自動配列決定装置にロードした（アプライドバイオシステム）。該生配列データを、該シュターデンソフトウェアパッケージ（Staden software package）を用いて処理した。組立、及びコンティグ編集を、GAP（ゲノム組立プログラム（Genome assembly Program））バーション4.2（Bonfieldらの論文、1995）を用いて行った。該GCGパッケージ（Devereuxらの論文、1984）バージョン10.0を、配列分析のために使用した。
（実施例４）
（S.パルブルス菌株の化学的分析）
次の方法は、天然ボルレリジン、及び人工ボルレリジン類似体の産生のための発酵分析に有用である。
2 mlのエッペンドルフテチューブ内に、5日間経過した発酵ブロス（1 ml）の一定分量を、90％ギ酸の添加により、pH 3に調節した。酢酸エチル（1 ml）を、該試料中に加え、かつボルテックストレイ（vortex tray）を用いて、10分間、強く混合した。該混合液を、微量遠心管中、遠心分離により分離し、かつ該上相を、きれいな2 mlエッペンドルフチューブに取り除いた。該酢酸エチルを、スピード-バック（Speed-Vac）を用いて留去した。残留物を、メタノール（250μl）中に溶かし、かつ微量遠心管を用いて浄化した。前述した、アギレント（Agilent）HP1100 HPLCシステムで分析を行った：
注入量：50μl
カラム固定相：150×4.6mmカラム、ベース-不活性化逆相シリカゲル、粒径3μm（Hypersil C18-BDS）
移動相A：10mM酢酸アンモニウム、及び0.1％TFAを含む、10％アセトニトリル：90％水
移動相B：10mM酢酸アンモニウム、及び0.1％TFAを含む、90％アセトニトリル：10％水
移動相勾配：T = 0分、25％B；T = 15、100％B；T = 19、100％B；T = 19.5、25％B；T = 25、25％B
流速：1 ml/分
検出：258nmのUV（190〜600 nmに渡って、DAD収集）；イオンモードスイッチを有する、100〜1000 amu範囲のエレクトロスプレーイオン化によるMS検出
（実施例５）
（S.パルブルスTue4055のためのプロトプラスト形質転換プロトコル）
トリプトンソイブロス（TSB）培地（100 ml三角フラスコ中、10 ml）を含む、種フラスコを、通常在庫（0.15 ml）から接種させた。ロータリーインキュベーター（30℃、250 rpm）で、3日間振盪後、該培養液5 mlを用いて、R5培地に接種させ（Kieserらの論文、2000）（250 ml三角フラスコ中、50 ml）、次いで、ロータリーインキュベーター（30℃、250 rpm）で、24時間振盪させた。次いで、プロトプラストの該PEGを媒介した形質転換を、標準的な公表されているプロトコルに従って行った（Kieserらの論文、2000）。
（実施例６）
（rapAT2を用いたborAT4の置換−C10-デスメチルボルレリジンの産生）
該ボルレリジンPKS AT4ドメインを、下記のように、該ラパマイシンポリケチドシンターゼAT2ドメインを用いて置換した。
CosBor32A2を、EcoRIで消化し、かつ該5429bpバンドを単離した。これを、該オリゴCM410（5’-AAAATGCATTCGGCCTGAACGGCCCCGCTGTCA-3’）（配列番号：４４）、及びCM411（5’-AAATGGCCAGCGAACACCAACACCACACCACCA-3’）（配列番号：４５）を用いるPCRの鋳型として使用した。CM410は、クローニングの目的のために、NsiI制限酵素認識部位を導入し、かつCM411は、非相同的ATの導入に使用するMscI部位を導入する。該〜1.1 kbp生成物を、SmaIで消化し、かつ脱リン酸化したpUC18内にクローン化した。該挿入断片は、２つの方向に結合することができ、かつ該逆方向を、制限酵素分析、及び配列決定した該挿入断片により、スクリーニングした。一つの正確なプラスミドを、pCJM462と命名した。pCJM462、及びpCJR26（Roweらの論文、1998）のメチル化欠乏性DNA（具体的に、dcm-）を、E.コリET12567に該プラスミドを通過させることにより、単離した。次いで、各プラスミドを、MscI、及びXbaIを用いて消化し、かつ該ラパマイシンAT2、及びpCJR26における下流の配列を含む、pCJR26由来の該〜7.8kbp断片を、pCJM462の消化により生じた該〜3.8kbp骨格に結合させた。プラスミドpCJM463を、制限分析により同定した。
CosBor32A2を、EcoRI、及びEcoRV消化し、かつ該2871bpバンドを単離した。これを、該オリゴCM412（5’-AAAGTCCTAGGCGGCGGCCGGCGGGTCGACCT-3’）（配列番号：４６）、及びCM413（5’-TTTAGATCTCGCGACGTCGCACGCGCCGAACGTCA-3’）（配列番号：４７）を用いるPCRの鋳型として使用した。CM412は、AvrII制限酵素認識部位を導入し、結合、インフレーム、非相同的ATと該下流域ボルレリジン相同体、及びCM413が、クローニング目的のためにBglII部位を導入する。該〜1.1 kbp産物を、SmaIで消化し、かつ脱リン酸化したpUC18内にクローン化した。該挿入断片は、２つの方向に結合することができ、かつ該逆方向を、制限酵素分析、及び配列決定した該挿入断片により、スクリーニングした。一つの正確なプラスミドを、pCJM464と命名した。
pCJM463、及びpCJM464を、AvrII、及びXbaIで消化し、かつpCJM464由来の該〜1.1 kbp断片を、pCJM463の該〜4.7 kbp骨格内に結合させ、pCJM465を得て、制限酵素分析により同定した。pCJM465は、。一体化、及び第二の組換えに対する相同性を提供する、ボルレリジン配列の側面領域を有する、該ハイブリッド型ラパマイシンAT2を含む。
プラスミドpCJM465を、NsiI、及びBglIIで消化し、かつ該〜3kbp断片を、NsiI、及びBamHIで前もって消化したpSL1180内にクローン化し、pCJM466を得た。次いで、プラスミドpCJM466を、NsiIで消化し、かつ該アプラマイシンカセットを、pEFBA由来のPstI断片に組込み（Lozanoらの論文 2000）、該置換ベクターpCJM467を得た。pCJM467を、実施例５に記載したように、プロトプラスト形質転換により、S.パルブルスTue4055内に導入した。アプラマイシン（25μg/ml）耐性コロニーを、最初に同定し、かつ次いで、該第二の組換えを促進するために、抗生物質選択なしに、MA培地を介して、数回通過させた（Fernandezらの論文、1998）。幾らかのアプラマイシン-感受性コロニーを単離し、かつPCR、及びサザンブロットにより分析した。該新しい突然変異体は、S.パルブルスTue4055/467と命名した。
S.パルブルスTue4055/467を、実施例１に記載したように分析し、かつ正確なUVスペクトルを有する混合化合物を産生することを示した。該新しい主要成分は、ボルレリジンよりもさらに極性があり、10-dデスメチルボルレリジン3に対して、正確な保持時間を有する。LCMS分析は、予想通り、ボルレリジンよりも質量単位が14低い化合物のm/z比を示し、かつ妥当なマスフラグメントパターンを有する。しかし、該WT生物体よりも低い水準である。
（実施例７）
（10-デスメチルボルレリジンを産生する、borAT4の該メチルマロニル-CoA感受性モチーフの突然変異体）
また、アシルトランスフェラーゼドメインの部位特異的突然変異誘発を使用し、ATの特異性を変えることができる。この例において、該borAT4の特異性は、メチル-マロニル-CoAから、マロニル-CoAに導く。ATの特異性を導くアミノ酸モチーフは、同定されている（Reevesらの論文、2001；国際公開第02/14482号）。borAT4中に観察された該モチーフYASHは、メチルマロニル-CoA特異的AT内に見つかり、かつこの例において、それを、マロニル-CoA特異的AT内に見つかったHAFHに変えた。
CosBor32A2を、NcoIで消化し、かつ該5167bpバンドを単離した。これを、該プライマーCM414（5’-AAACTGCAGAGTCGAACATCGGTCACACGCAGGC-3’）（配列番号：４８）、及びCM413（5’-TTTAGATCTCGCGACGTCGCACGCGCCGAACGTCA-3’）（配列番号：４７）を用いるPCRの鋳型として使用した。CM414は、クローニングの目的のために、PstI制限酵素認識部位を導入し、かつCM415は、該アミノ酸変化に影響を与えるであろう該AT領域をコードしているモチーフを変換する、変異プライマーであり、かつクローニング目的のためにNsiI部位を含む。該〜1.1 kbp断片を、SmaIで消化し、かつ脱リン酸化したpUC18内にクローン化した。該挿入断片を、どちらかの方向に結合させることができ、かつ前方方向を制限酵素分析、及び、該配列決定した挿入断片により、スクリーニングした。一つの正確なプラスミドを、pCJM468と命名した。
第二のPCR反応を、CosBor32A2のNcoI断片5167 bp、及び該プライマーCM416（5’-TAAATGCATTCCATTCGGTGCAGGTGGAGTTGATCC-3’）（配列番号：５０）、及びCM417（5’-ATAGGATCCCCTCCGGGTGCTCCAGACCGGCCACCC-3’）（配列番号：５１）を用いて行った。CM416は、NsiI制限酵素認識部位を導入し、かつ、また、該ATの領域をコードしている該モチーフを、カバーしている変異プライマーであり、かつCM417は、クローニングのために、BamHI部位を導入する。該〜1.1 kbp断片を、前もってSmaIで消化し、かつ脱リン酸化したpUC18内にクローン化した。該挿入断片を、２つの方向に結合させることができ、かつ前方方向を、制限酵素分析、及び、該配列決定した挿入断片により、スクリーニングした。一つの正確なプラスミドを、pCJM468と命名した。
プラスミドpCJM468、及びpCJM469を、NsiI、及びXbaIを用いて消化し、かつpCJM468由来の該〜1.1 kbp断片を、pCJM469の該〜3.8kbp骨格内に結合させ、pCJM470を得て、制限酵素分析により同定した。pCJM470は、両側に、相同的DNAの〜1.1 kbpを有するborAT4の突然変異モチーフを含み、一体化、及び第二の組換えに対する相同性を提供する。
プラスミドpCJM470を、PstI、及びBamHIを用いて消化し、かつ該〜2.2 kbp断片を、前もってPstI、及びBamHIを用いて消化した、pSL1180（アマシャムバイオサイエンス（Amersham Biosciences））内にクローン化し、pCJM471を得た。次いで、プラスミドpCJM471を、PstIを用いて消化し、かつ該アプラマイシンカセットを、pEFBA由来のPstI断片に組込み、該置換ベクターpCJM472を提供した。
該置換ベクターpCJM472を、実施例５に記載したように、プロトプラスト形質転換により、S.パルブルスTue4055内に導入した。アプラマイシン耐性コロニーを、最初に同定し、かつ次いで、該第二の組換えを促進するために、抗生物質選択なしに、MA培地を介して、数回通過させた（Fernandezらの論文、1998）。幾らかのアプラマイシン-感受性コロニーを単離し、かつPCR、及びサザンブロットにより分析し、一つを、該突然変異モチーフ、及び該NsiI部位を含む、該新しいAT4配列を含むように選択した。該新しい突然変異体を、S.パルブルスTue4055/467と命名した。
S.パルブルスTue4055/472を、実施例１に記載したように生育させ、かつ分析し、かつボルレリジンに対する正確なUVプロファイルを有する混合化合物を産生することを示した。該新しい主要成分の一つは、ボルレリジンよりもさらに極性があり、信頼できる３に対する正確な保持時間を有する。LCMS分析は、予想通り、ボルレリジンよりも質量単位が14低い化合物のm/z比を示し、かつ妥当なマスフラグメントパターンを有する。また、ボルレリジン自身を産生するが、該WT生物体よりも低い水準である。
（実施例８）
（エリスロマイシンPKS内への該ボルレリジン装填モジュールの導入）
該ボルレリジン装填モジュールを、４つの推定上の開始コドン各々に対して増幅した。該PCRの鋳型は、配列番号：１の第15858〜19234番目のヌクレオチド領域をカバーする、cosBor32A2のBamHI断片3376 bpとした。該リバースプライマーCM368（5’-TTTCCTGCAGGCCATCCCCACGATCGCGATCGGCT-3’）（配列番号：５２）は、borA2のKS1の開始に対応する配列で、SbfI部位を導入し（保存されたMACRLモチーフ）、かつ該フォワードプライマーCM369（5’-TTTCATATGACAGGCAGTGCTGTTTCGGCCCCATT-3’）（配列番号：５３）、CM370（5’-TTTCATATGGCGGATGCCGTACGTGCCGCCGGCGCT-3’）（配列番号：５４）、CM371（5’-TTTCATATGCCCCAGGCGATCGTCCGCACCAC-3’）（配列番号：５５）、及びCM372（5’-TTTCATATGGTCTCGGCCCCCCACACAAGAGCCCTCCGGGC-3’）（配列番号：５６）の各々を用いて、使用した。該４つのPCR産物（それぞれ、2834、2720、2411、及び2117 bp）を、前もってSmaIで消化し、かつ脱リン酸化したpUC18内にクローン化した。該得られたプラスミドは、pCJM370（最大の挿入断片を含む。）、pCJM371、pCJM372、及びpCJM373（最小の挿入断片を含む。）と命名した。
該４つのボルレリジン装填モジュール断片を、該ベクターpKS1W中に導入し、該保存されたMACRLモチーフ中、DEBS1-TEのeryKS1の開始点であるPstIを含む（Roweらの論文、2001）；PstIは、SbfIのような、同じ突出部を生じる。pKS1Wは、該装填モジュールの側面にある唯一の部位、遺伝子をコードしている該DEBS1-TEの第1698番目のヌクレオチド位置の唯一のPstI部位、及び該開始コドンの唯一のNdeI部位を有する、NdeI/XbaI断片にDEBS1-TEを含むpT7-ベースプラスミドである。該ボルレリジン装填モジュール断片を、次のように切除した：pCJM370を、NdeI、及びSbfIで消化し、pCJM371、及びpCJM373を、NdeI、及びPstIで消化し、かつpCJM372を、NdeI、PstI、及びDraIで消化した。断片を含む、各装填モジュールを、前もってNdeI、及びPstIで消化したpKS1W内にクローン化した。該得られたプラスミドを、pCJM384（最大の挿入断片を含む。）、pCJM386、pCJM388、及びpCJM390（最小の挿入断片を含む。）と命名した。
該ハイブリッド型PKS断片を、S.エリスラエアWT、及びS.エリスラエアDMの形質転換、及び該得られるハイブリッド型PKSの発現に適切なベクターである、pCJR24内に移行した（国際公開第98/01546号）。該染色体内に組込むために、各装填モジュール構造体を、DEBS1のDNAの2346bp断片とともに切除した。これを達成するために、pCJR24を、XbaIで消化し、かつDNAポリメラーゼIのKlenow断片を用いて、末端を補充した。次いで、これを、NdeIで消化し、該骨格断片を得た。この中に、該ボルレリジン装填モジュールと組込みのためのDEBS1配列の領域とを含む、該４つのハイブリッド型PKS断片を、pCJM384、pCJM386、pCJM388、及びpCJM390のNdeI/EcoRV断片としてクローン化し、それぞれ、pCJM400、pCJM401、pCJM402、及びpCJM403を得た。
プラスミドpCJM400、pCJM401、pCJM402、及びpCJM403を、他に記載されているように、S.エリスラエアDMプロトプラストの形質転換により、S.エリスラエア内に導入した（Gaisserらの論文、2000）。該得られた突然変異体を、PCR、及びサザンブロットにより分析し、該染色体に該プラスミドの存在を確認し、かつ正確な組込みが生じていることを証明した。これらの方法による、正確と思われる、多くの突然変異体を、S.エリスラエア菌株からのポリケチド産生の標準的な方法に従って、生育し、抽出し、かつ分析した（Wilkinsonらの論文、2000）。LCMS方法を用いて、コントロール菌株と比較した場合、これらの突然変異体の幾つかの該抽出物には、妥当な水準で、新規化合物を含んでいた。これらのMSスペクトルの分析は、負イオンモードにおいて、m/z = 485.3（[M-H]-, 6）を有する化合物の存在を示した。これは、予測していた生成物（M = 486.3）と一致する。
（実施例９）
（PKSモジュール4、及び5の融合（S.パルブルスTue4055/borA4-A5））
モジュール5の反復作用を調査するために、モジュール4、及び5をコードしている、２つの別々のタンパク質を、該遺伝子レベルでの操作を通して、共に融合させた。該融合を、遺伝子置換により行い、それぞれ重複した終止、及び開始コドンを、アルギニン残基に変換すること、新しいXbaI部位を導入すること、及び該２つの別々のorfを一つに変換することにより、borA4の最後の〜1kbp、及びborA5の最初の〜1 kbpを融合させた。
該突然変異誘発の最初の段階において、２つ別々にPCR増幅を行った。該第一のPCR反応において、該DNA鋳型をcosBor19B9とし、かつ該プライマーを、B1819A（5’-GTCATGCATGCGGCGGGCTC-3’）（配列番号：５７）、及びB1819B（5’-GGTCTAGAACGGCCGAACTT-3’）（配列番号：５８）とした。
該1063bp産物を精製し、NsiI-XbaIを消化し、かつプラスミドpSL18-19AB を得るように同様に、pSL1180（アマシャムバイオサイエンス）内にクローン化した。該第二のPCR反応は、該borA5断片を増幅し、かつ該プライマーB1819C（5’-GTTCTAGAACCTCGGTCGGC-3’）（配列番号：５９）、及びB1819D（5’-CTGGATCCCACGCTGCTGCG-3’）（配列番号：６０）を使用した。該1033bp産物を精製し、XbaI-BamHIで消化し、かつプラスミドpSL18-ABCDを得るように同様に消化したpSL18-19AB内にクローン化した。最後に、pEFBA由来の該アプラマイシンカセット（Lozanoらの論文、2000）を、PstI断片として切除し、かつNsiIで消化したpSL18-19ABCD内にクローン化し、該置換ベクターpSL18-19Apraを得た。
該置換ベクターpSL18-19Apraを、実施例５に記載したプロトプラスト形質転換により、S.パルブルスTue4055内に導入した。アプラマイシン（25μg/ml）耐性コロニーを、最初に選択し、かつ次いで、選択なしに、MA培地を通して数回通過した。幾つかのアプラマイシン-感受性コロニーを得て、その２つが、ボルレリジンを産生したが、他は、産生しなかった。
染色体DNAを、すべての該アプラマイシン感受性コロニーから抽出し、かつ最初に、該装填モジュール（borA1）に対して感受性を有する、該プライマーBLDA（5’-GGAGACTTACGGGGGATGC-3’）（配列番号：６１）、及びBLDB（5’-CTCCAGCAGCGACCAGAAC-3’）（配列番号：６２）を用いて、PCRにより確認した。断片2.9 kbpを、該コントロール、及び該２つのボルレリジン-産生突然変異体に対して観察したが、該非-産生菌株に対しては観察されなかった。この結果は、該染色体の非-特異的欠失の徴候、及び特性である。
該融合部位を確認するために、該２つのボルレリジン-産生コロニーを、該プライマーB19A（5’-CCCATGCATCACCGACATAC-3’）（配列番号：６３）、及びB19B（5’-GCGATATCCCGAAGAACGCG-3’）（配列番号：６４）を用いて、PCRにより、さらに分析した。該方法は、上述した。該コロニー、及び該コントロール、双方は、1010 bpのPCR産物を生じた。しかし、XbaIで消化した場合、該融合-産生突然変異体を行ったものにのみ、断片600〜400bpの消化を生じた。該ボルレリジン-産生コロニーの一つのみが、該融合を提供し、一方、該他方は、野生型に戻っていた。最終確認は、XbaI、及びBclIで消化した、染色体DNA全体のプローブとして、borA5由来のBamHI-XhoI反復断片を用いて、サザン分析により行った。該コントロール、及び野生型復帰突然変異体コロニーは、予測通り、11.5 kbpの断片を示し、一方、該融合突然変異体は、予想通り、7.8 kbpの断片を示した。この新しい突然変異体を、S.パルブルスTue4055/borA4-A5と命名した。S.パルブルスTue4055/borA4-A5は、実施例１に記載した該プロトコルの後に、該WT滴定量の26±5％で、ボルレリジンを産生することを示した。
（実施例１０）
（PKSモジュールの融合（S.パルブルスTue4055/borA5-A6））
この実験を、上述の実施例９と同じ理由、及び類似した方法として行った。これらのorfの融合は、付加的なロイシン残基を、該融合位置で該新しいタンパク質内に、さらに該遺伝子レベルで新しいSpeI部位に導入した。該プロセスの第一段階において、鋳型としてcosBor19B9を用いて、２つのPCR断片を生成した。該第一のPCR反応は、該borA5領域を増幅し、かつ該プライマーB1920A（5’-GCCAAGCTTCCTCGACGCGC-3’）（配列番号：６５）、及びB1920B（5’-CACTAGTGCCTCACCCAGTT-3’）（配列番号：６６）を使用した。該804bp産物を精製し、かつHindIII-SpeIで消化した。該第二のPCR反応は、該borA6領域を増幅し、かつ該プライマーB1920C（5’-CACTAGTGACGGCCGAAGCG-3’）（配列番号：６７）、及びB1920D（5’-TCGGATCCGTCAGACCGTTC-3’）（配列番号：６８）を使用した。該960bp産物を精製し、かつSpeI-BamHIで消化した。精製し、かつ消化した２つの遺伝子産物を、次いで、HindIII-BamHIで消化したpOJ260内に共にクローン化し、置換ベクターpOJF19-20を得た。pOJF19-20を、プロトプラスト形質転換により、S.パルブルスTue4055内に導入し、アプラマイシン耐性コロニーを得た。一つのそのコロニーを、二重組換えを促進するために、選択なしに、MA培地を通して、数回通過させた。２つのアプラマイシン感受性コロニーを得て、かつこれらの染色体DNAを、サザンハンブリダイゼーションにより調査し、3.2 kbpのBamHI断片（該装填モジュール内の不要な除去に対するコントロールに対して）、及び該borA5〜A6融合の正確な導入を変更する、3.4 kbpのSpeI-BamHI断片（該WTにおいて、5.8 kbpのBamHI断片）の存在を確認した。該アプラマイシンコロニーの一つは、除去なしに、正確な突然変異を行い、かつS.パルブルスTue4055/borA5-A6と命名する。S.パルブルスTue4055/borA5-A6は、実施例１に記載したプロトコルの後に、該WT滴定量の25±4％で、ボルレリジンを産生することを示した。
（実施例１１）
（PKSモジュール4、5、及び6の融合（S.パルブルスTue4055/borA4-A5-A6））
該菌株S.パルブルスTue4055/borA4-A5-A6を製造するために、我々は、前に得た菌株S.パルブルスTue4055/borA4-A5（実施例９）、及びプラスミドpOJF19-20（実施例１０）の利点を使った。pOJF19-20を、プロトプラスト形質転換により、S.パルブルスTue4055/borA4-A5内に導入し、アプラマイシン耐性コロニーを得た。一つのそのコロニーを、二重組換えを促進するために、選択なしに、MA培地を通して、数回通過させた。１つのアプラマイシン感受性コロニーを得て、かつその染色体DNAを、サザンハンブリダイゼーションにより調査し、3.2 kbpのBamHI断片（該装填モジュール内の不要な除去に対するコントロールに対して）、及び該borA5〜A6融合の正確な導入を変更する、3.4 kbpのSpeI-BamHI断片（該WTにおいて、5.8 kbpのBamHI断片）、及び該同じ菌株内のborA4〜A5、及びborA5〜A6、双方の融合の存在を変更する、6.4 kbpのSpeI-XbaIの存在を確認した。該選択したコロニーは、除去なしに、正確な突然変異を行い、かつS.パルブルスTue4055/borA4-A5-A6と命名した。S.パルブルスTue4055/borA4-A5-A6は、実施例１に記載した該プロトコルの後に、該WT滴定量の18±5％で、ボルレリジンを産生することを示した。
（実施例１２）
（該ボルレリジンPKSのモジュール5を有する、該エリスロマイシンPKSモジュール4の置換-環拡大マクロライドの産生）
実施例１２は、ボルレリジンモジュール5を有するエリスロマイシンモジュール4の置換を記載する。ボルレリジンモジュール5は、反復方法において、該ボルレリジンPKS内で、メチルマロニル-CoAの３回の縮合に関与すると考えられる。以前に、エリスロマイシンモジュール4は、第二のメチルマロニル-CoAを‘誤（mis）'-組込みする反復方法を時々行い、該エリスロマイシンPKS由来の微少量の16-員環マクロライドを製造することが示されている。該エリスロマイシンモジュール4を、ボルレリジンモジュール5に置換した菌株は、次の置換手順により処理され、かつ該エリスロマイシンPKS内へのモジュール挿入として記載した誘導工程に基づく（Roweらの論文、2001年）。
該ボルレリジンモジュール5を、該エリスロマイシンPKSの相同性の適切な領域に隣接したプラスミドを生成するために、初めに一連のプラスミドを製造した。これを促進させるために、最初に、該SbfI部位を、PstIで消化し、T4ポリメラーゼで最終精錬し、かつ再連結することにより、pUC18のポリリンカーから除去した。該新しいプラスミドpCJM409を、制限酵素消化により同定した。
ボルレリジンモジュール5を、4のPCR断片と連結することにより、SbfI断片上に単離した。鋳型としてcosBor19B9のXcmI断片6062bp、及びプライマーCM384（5’-AACCTGCAGGTACCCCGGTGGGGTGCGGTCGCCCGA-3’）（配列番号：６９）、及びCM385（5’-CGCCGCACGCGTCGAAGCCAACGA-3’）（配列番号：７０）を用いるボルレリジンモジュール5の該開始点の〜1.4 kbを増幅することにより、PCRAを製造した。CM384は、該保存されたアミノ酸配列MxCR内に、ボルレリジンモジュール5の開始点で、SbfI部位を導入している。CM385は、該クローニング手順に使用する、自然発生的MluIを組込んでいる。PCRAを、T4ポリヌクレオチドキナーゼ（T4 PNK、NEB）で処置し、前もってSmaIで消化したpCJM409内にクローン化し、かつエビアルカリホスファターゼ（Shrimp Alkaline Phosphatase）（SAP、ロシュ（Roche））で、脱リン酸化した。前方向でクローン化した挿入断片を、制限酵素消化により、スクリーニングし、かつ一つの正確なクローンに対して、該挿入断片を、配列決定により検証した。このプラスミドを、pCJM410と命名した。
鋳型としてcosBor19B9のXcmI断片6062bp、及びプライマーCM386（5’-TGTGGGCTGGTCGTTGGCTTCGAC-3’）（配列番号：７１）、及びCM387（5’-GGTGCCTGCAGCGTGAGTTCCTCGACGGATCCGA-3’）（配列番号：７２）を用いるボルレリジンモジュール5の隣接した〜1.4 kbを増幅することにより、PCRBを製造した。CM386は、CM385と同じMluI部位の上流域と結合し、それは、該クローニング手順に使用される。CM387を、該ボルレリジンPKSモジュール5内にあるSbfI部位の除去に使用し、一方、クローニングのために、重なっているPstI部位を残している。PCRBを、T4 PNKで処置し、かつ前もってSmaIで消化したpCJM409内にクローン化し、SAPで脱リン酸化した。前方向でクローン化した挿入断片を、制限酵素消化により、スクリーニングし、かつ一つの正確なクローンに対して、該挿入断片を、配列決定により検証した。このプラスミドを、pCJM411と命名した。
鋳型としてcosBor19B9のXcmI断片6062bp、及びオリゴヌクレオチドCM388（5’-GAGGAACTCACCCTGCAGGCACCGCT-3’）（配列番号：７３）、及びCM395（5’-CGAACGTCCAGCCCTCGGGCATGCGT-3’）（配列番号：７４）を用いるボルレリジンモジュール5の該下流域に隣接した〜1.5 kbを増幅することにより、PCRCを製造した。CM388は、CM387と同じSbfI部位で結合している。しかし、変異原性でなく、かつ該SbfI部位を保持している。CM395は、クローニングのためにSphI部位を組込んでいる。PCRCを、T4 PNKで処置し、かつ前もってSmaIで消化したpCJM409内にクローン化し、SAPで脱リン酸化した。前方向でクローン化した挿入断片を、制限酵素消化により、スクリーニングし、かつ一つの正確なクローンに対して、該挿入断片を、配列決定により検証した。このプラスミドを、pCJM412と命名した。
鋳型としてcosBor19B9のBbvCI断片7211bp、及びプライマーCM396（5’-TGGCACGCATGCCCGAGGGCTGGACGTT-3’）（配列番号：７５）、及びCM397（5’-TTTCCTGCAGGCCATGCCGACGATCGCGACAGGCT-3’）（配列番号：７６）を用いるボルレリジンモジュール5の該下流域に隣接した〜2.1kbを増幅することにより、PCRDを製造した。CM396は、クローニングのためにSphI部位を含んでおり、かつCM397は、SbfI部位を、該保存されたアミノ酸配列MxCR内に、ボルレリジンモジュール5の末端で導入している。PCRDを、T4 PNKで処置し、かつ前もってSmaIで消化したpCJM409内にクローン化し、SAPで脱リン酸化した。前方向でクローン化した挿入断片を、制限酵素消化により、スクリーニングし、かつ一つの正確なクローンに対して、該挿入断片を、配列決定により検証した。このプラスミドを、pCJM413と命名した。
該４つのPCR産物（PCRA〜D）を、次のように、SbfI断片上に、該ボルレリジンモジュール5を構築するために使用した。
pCJM412を、SphIで消化し、かつ単離した〜1.5 kb断片を、前もってSphIで消化したpCJM413内にクローン化し、かつSAPで脱リン酸化した。これにより、プラスミドpCJM414を得て、制限酵素消化により同定した。
pCJM414を、SphIで消化し、かつ単離した〜3.6 kb断片を、前もってPstIで消化したpCJM411内にクローン化し、かつSAPで脱リン酸化した。これにより、プラスミドpCJM415を得て、制限酵素消化により同定した。
pCJM410を、MluI、及びHindIIIIで消化し、かつ単離した〜1.4 kb断片を、前もってMluI、及びHindIIIIで消化したpCJM415内にクローン化した。これにより、プラスミドpCJM416を得て、制限酵素消化により同定した。pCJM416は、SbfI断片として、該ボルレリジンモジュール5を含む、pUC18-ベースプラスミドである。
該ボルレリジンモジュール5を、該エリスロマイシンPKS内に置換手順により導入するために、該エリスロマイシンPKSの相同性の側面領域を、次のように、組換えのために組込んだ。
鋳型としてpIB023のXmnI断片6428bp、及びプライマーCM398（5’-AAACATATGGTCCTGGCGCTGCGCAACGGGGAACTG-3’）（配列番号：７７）、及びCM399（5’-TTTCCTGCAGGCGATGCCGACGATGGCGATGGGCT-3’）（配列番号：７８）を用いる該モジュール4KSの該上流域に直接的に、該エリスロマイシンPKSの〜3.3 kbを増幅することにより、PCREを製造した。CM398は、クローニングのためにNdeI部位を含んでおり、CM399は、SbfI部位を、該保存されたアミノ酸配列M/IxCR内に、エリスロマイシンモジュール4の開始点で導入している。PCREを、T4 PNKで処置し、かつ前もってSmaIで消化したpCJM409内にクローン化し、かつSAPで脱リン酸化した。前方向でクローン化した挿入断片を、制限酵素消化により、スクリーニングし、かつ一つの正確なクローンに対して、該挿入断片を、配列決定により検証した。このプラスミドを、pCJM417と命名した。
鋳型としてpIB023のXmnI/NheI断片7875bp、及びプライマーCM400（5’-AAACCTGCAGGTTCCCCGGCGACGTGGACTCGCCGGAGTCGTT-3’）（配列番号：７９）、及びCM401（5’-TTTTCTAGAGCGACGTCGCAGGCGGCGATGGTCACGCCCGT-3’）（配列番号：８０）を用いる該モジュール5KSの該下流域に直接的に、該エリスロマイシンPKSの〜3.4 kbを増幅することにより、PCRFを製造した。CM400は、SbfI部位を、該保存されたアミノ酸配列M/IxCR内に、エリスロマイシンモジュール4の開始点で導入しており、かつプライマーCM401は、クローニングのためにXbaI部位を含んでいる。PCRFを、T4 PNKで処置し、かつ前もってSmaIで消化したpCJM409内にクローン化し、かつSAPで脱リン酸化した。前方向でクローン化した挿入断片を、制限酵素消化により、スクリーニングし、かつ一つの正確なクローンに対して、該挿入断片を、配列決定により検証した。このプラスミドを、pCJM418と命名した。
pCJM417を、NdeI、及びSbfIで消化し、かつ該〜3.3kb断片を、NdeI、及びSbfIで消化したpCJM418（〜5.8 kbp）内にクローン化し、pCJM419を得て、その制限酵素消化パターンにより同定した。pCJM419は、唯一のSbfI部位を含み、該部位を、該KSドメインの保存領域内に正確に、フレーム内に、該入来モジュールを配置することに適した、SbfI（又はPstI）側面部位を有する、すべての完全なモジュールを受け入れるように使用することができる。
側面SbfI部位を有する該ボルレリジンモジュール5を、pCJM419の該唯一のSbfI部位内のSbfI断片として、pCJM416からクローン化し、pCJM420を得て、制限酵素分析により同定し、該存在、及び該挿入断片の正確な配置を確認した。従って、pCJM420は、該エリスロマイシンのモジュール3と5との間のフレーム内に、それを導入する、相同性の側面領域を有する、ボルレリジンモジュール5を含む。該完全な挿入断片を、pCJM420からNdeI/XbaI断片として除去し、かつNdeI、及びXbaIで消化したpCJM24内にクローン化し、該最終プラスミドpCJM421を得た。pCJR24、及び結果的にpCJM421は、S.エリスラエア形質転換体の選択用の適切な耐性マーカーを含む。
プラスミドpCJM421を使用し、S.エリスラエア菌株NRRL2338（野生型）、及びS.エリスラエアDM（eryCIII-、eryBV-）プロトプラストを形質転換した（Yamamotoらの論文、1986；Roweらの論文、1998）。要素を、チオストレプトン（thiostrepton）（50 mg/L）に耐性を有するように選択し、かつ多くの要素（通常５〜８）を、サザンブロットによりさらに分析し、該菌株が正確であることを確認し、かつ該組込み部位を同定した。いずれの場合にも、２つの正確な要素を、該第二の組込みを促進するために、抗菌性の選択なしに、TSB液体培地内にサブ培養した。幾らかのチオストレプトン-感受性コロニーを単離し、PCR、及びサザンブロットにより分析し、かついずれの場合にも、該新しいモジュールを含む、選択した一つを正確に挿入した。これは、菌株S.エリスラエアWT/421、及びS.エリスラエアDM/421を生じる。
菌株S.エリスラエアDM/421を、エリスロノライドの産生に適した条件下で、培養した（Wilkinsonらの論文、2000）。LCMS方法を用いた、発酵ブロス抽出液の分析は、該コントロールと比較した場合、エリスロノライドBよりも極性の低い、２つの新しい有意なピークの存在を示した。これらは、それぞれ、435.5（MNa+）、及び477.5（MNa+）のm/zを有し、新しい環拡大エリスロノライドB類似体の産生と一致する。m/z = 435.5（7）を有する該化合物は、エリスロノライドWT発酵の微量成分として、以前に報告（Wilkinsonらの論文、2000）されたマクロライドに関連した、該16員環拡大エリスロノライドBの存在と一致し；該化合物m/z = 477.5（8）は、マクロライドに関連した、18員環、二重に環拡大したエリスロノライドBの存在と一致する（図８参照）。当業者にとって、このような新しい生成物を、適切な生物体を用いた生物内変化により、又は該菌株S.エリスラエアWT/421の発酵を介して、抗菌分子に変換することができることは明白である。さらに、当業者にとって、該エリスロマイシンPKSの他の位置に、又は他のPKSに、このようなモジュールの含有が、類似の方法において、新規、環拡大ポリケチドの産生を可能にし得ることは明白である。
このハイブリッド型PKSを製造する別の方法は、全ハイブリッド型PKSを含む、大きなプラスミド内に、エリスロマイシンモジュール4の代わりに、該ボルレリジンモジュール5を組込み、続いて、eryA-S.エリスラエア菌株を形質転換することである。このような適切な存在するeryA-は、S.エリスラエアJC2（Roweらの論文、1998）、及び該actI プロモーター下、eryA遺伝子を含む、該プラスミドであり、また、チオストレプトン耐性遺伝子、及びactII-ORF4活性化因子を含むpIB023である。この手順は、次のように達成された。
pIB023を、NdeI、及びBsmIで消化し、かつ該13.4kbp断片を、NdeI、及びBsmIで消化したpCJM419内にクローン化し、プラスミドpCJM425を得た。pIB023を、BbvCI、及びXbaIで消化し、かつ該約6 kbp断片を、BbvCI、及びXbaIで消化したpCJM425内にクローン化し、プラスミドpCJM426を得た。pCJM426の該NdeI/XbaI断片を、NdeI、及びXbaIで消化したpCJM395内にクローン化した。pCJM395は、SbfIでpCJR24を消化し、T4ポリメラーゼで最終精錬し、かつ再連結することにより製造されたプラスミドであり、SbfIで切れないpCJR24の変形を得た。該得られたプラスミドpCJM427は、モジュール4が除去された、該エリスロノライドPKSの人工的変形を含む。次いで、この骨格を、適切な側面部位を有する、全ての完全なモジュールを受け入れるように準備し、ハイブリッド型PKSを製造する。該単一のボルレリジンモジュール5の導入は、pCJM427をSbfIで消化し、SAPで該骨格を脱リン酸化し、かつpCJM416のSbfI断片内に結合することにより達成され、pCJM430を得た。
プラスミドpCJM430を用いて、S.エリスラエアJC2を形質転換した。要素を、チオストレプトン（50 mg/L）に耐性を有するように選択し、かつ多くの要素（通常５〜８）を、サザンブロットによりさらに分析し、該菌株が正確であることを確認し、かつ要素の該部位を同定した。該得られた正確な菌株S.エリスラエアJC2/430を、エリスロマイシンの産生に適切な条件下で培養し（Wilkinsonらの論文、2000）、かつ新規化合物7、及び8の産生を分析した。
（実施例１３）
（borBの破壊（S.パルブルスTue4055/borB：：aac3（IV））
borBを破壊するために、borBを含む2751 bpの領域を、プライマーB5B（5-’AACTAGTCCGCAGTGGACCG-3’）（配列番号：９１）、及びB5A（5’-TCGATATCCTCACCGCCCGT-3’）（配列番号：９２）、及び鋳型としてコスミドBor32A2を用いて、PCRにより増幅した。該PCR産物を精製し、かつ次いで、該側面部位SpeI-EcoRVの位置で消化し、同じ制限酵素を用いて消化したpSL1180内にサブクローン化し、pSLBを製造した。borBの5’-末端を含む、pSLBのSpeI-AgeI断片（該挿入断片内の後者部位）を、該アプラマイシン耐性遺伝子aac（3）IVの上流域である、pEFBAのSpeI-XmaI部位内にサブクローン化し、pEB1を製造した。次いで、borBの3’-末端を含む、pSLBのBsaAI-EcoRV断片（該挿入断片内の前者部位）を、正確な方向で、aac（3）IVのpEB1下流域のEcoRV部位内にサブクローン化した。この方法において、borB内の741bpのAgeI-BsaAI断片を除去し、かつaac（3）IVにより置換した。最終的に、該SpeI-EcoRV断片を、pEB2から救い、かつpLHygのhyg遺伝子を含むPstI-SpeI断片とともに、pSL1180のPstI-EcoRV部位内にサブクローン化し、pSLBr1を製造した。このアプローチは、起こり得る極性効果を避けるために使用した。
該ベクターpSLBr1を、実施例５に記載したように、プロトプラスト形質転換により、S.パルブルスTue4055内に導入した。アプラマイシン耐性コロニーを選択し、かつ次いで、選択なしに、MA培地を通して、数回通過させた。該置換を、サザンハイブリダイゼーションにより確認し、かつ該新しい突然変異体を、S.パルブルスTue4055/borB：：aac3（IV）と命名した。菌株S.パルブルスTue4055/borB：：aac3（IV）を、実施例１に記載したように、生育し、抽出し、かつ分析した。ボルレリジン産生を観察し、かつ野生型コントロールと比較した。さらに、S.パルブルスTue4055/borB：：aac3（IV）を、実施例１に記載したプロトコルの後に、トランス-1,2-ジシクロペンタンジカルボン酸で化学的に補った。
（実施例１４）
（borCの破壊（S.パルブルスTue4055/borC：：aac3（IV））
borCを破壊するために、borCを含む3553bpの領域を、プライマーB6B（5’-AACTAGTGTGGCAGACGGTC-3’）（配列番号：９３）、及びB5A（5’-TCGATATCCTCACCGCCCGT-3’）（配列番号：９４）、及び鋳型としてコスミドBor32A2を用いて、PCRにより増幅した。該PCR産物を精製し、かつ次いで、SpeI-EcoRVで消化し、pSL1180の同じ制限酵素認識部位内にサブクローン化し、pSLCを製造した。次いで、borCの5’-末端、及び3’-末端を、それぞれ含む、このプラスミドpSLCのSpeI-SphI、及びBalI-EcoRV断片を、pEFBAのSpeI-SphI、及びEcoRV部位内に段階的に、かつ正確な配列でクローン化した。この方法において、borCのSphI-BalI内部断片741 bpを、該aac（3）IVにより置換した。次いで、該得られたプラスミドを、SpeI、及びEcoRVで消化し、かつ該得られた断片を、上述のように、該hyg遺伝子とともに、pSL1180内にサブクローン化し、最終構造体pSLCr1を生じた。このアプローチは、起こり得る極性効果を避けるために使用した。
該ベクターpSLCr1を、実施例５に記載したように、プロトプラスト形質転換により、S.パルブルスTue4055内に導入した。アプラマイシン耐性コロニーを選択し、かつ次いで、選択なしに、MA培地を通して、数回通過させた。該置換を、サザンハイブリダイゼーションにより確認し、かつ該新しい突然変異体を、S.パルブルスTue4055/borC：：aac3（IV）と命名した。菌株S.パルブルスTue4055/borC：：aac3（IV）を、実施例１に記載したように、生育し、抽出し、かつ分析した。ボルレリジン産生を、野生型コントロールと比較した。さらに、S.パルブルスTue4055/borC：：aac3（IV）を、実施例１に記載したプロトコルの後に、トランス-1,2-ジシクロペンタンジカルボン酸で化学的に補った。
極性効果を導入していないことを確認するために、該ermE*プロモーターの制御下、borCの全長コピーを、該破壊した突然変異体に対して、トランス内（in trans）に導入した。全長borCを、該プライマーB6T1（5’-CGGATGCATCACCGGCACGG-3’）（配列番号：９５）、及びB6T2（5’-TGGGATCCGCGGGGCGGTAC-3’）（配列番号：９６）を用いて、鋳型としてコスミドBor32A2を用いて、PCRにより増幅した。該943bp産物を精製し、かつ次いで、NsiI-BamHIで消化し、かつpLHyg（該hyg遺伝子を運ぶ）のBamHI-SpeI断片とともに、前もってPstI-XbaIで消化したpIJ2925内にサブクローン化した。次いで、BglII断片（該ベクターのこの部位を用いて）を単離し、かつpEM4内に、かつ該プロモーターermE*の制御下、borCを置いた正確な方向で、サブクローン化した。プラスミドpborCH、及び該コントロールプラスミドpEM4を、実施例５に記載したように、プロトプラスト形質転換により、S.パルブルスTue4055/borC：：aac（3）IV内に導入した。該得られた菌株S.パルブルスTue4055/borC：：aac（3）IV/pborCHを、実施例１に記載したように分析し、かつWTコントロールと同様の滴定量で、ボルレリジンを産生することを示した。
（実施例１５）
（borDの破壊（S.パルブルスTue4055/borD：：aac3（IV））
borDを破壊するために、2777bpの断片を、プライマーBBB（5’-AACTAGTGCGATCCCGGGGA-3’）（配列番号：９７）、及びBBA（5’-CGTCGATATCCTCCAGGGGC-3’）（配列番号：９８）、及び鋳型としてコスミドBor32A2を用いて、PCRにより増幅した。該PCR産物を精製し、かつ次いで、SpeI-EcoRVで消化し、pSL1180内にサブクローン化し、pSLDを製造した。次いで、これを、NdeI-StuIで消化し、該aac（3）IV遺伝子を含むpEFBAから単離したSmaI-NdeI断片で置換した、borDの内部679 bp領域を除去した。該得られた構造体を、SpeI-EcoRVで消化し、かつ該4.3 kb断片を、該hyg遺伝子を含むpLHygのSpeI-PstI断片とともに、PstI-EcoRVで消化したpSL1180内にサブクローン化した。このアプローチは、起こり得る極性効果を避けるために使用した。
該ベクターpSLDr1を、実施例５に記載したように、プロトプラスト形質転換により、S.パルブルスTue4055内に導入した。アプラマイシン耐性コロニーを選択し、かつ次いで、選択なしに、MA培地を通して、数回通過させた。該置換を、サザンハイブリダイゼーションにより確認し、かつ該新しい突然変異体を、S.パルブルスTue4055/borD：：aac3（IV）と命名した。菌株S.パルブルスTue4055/borD：：aac3（IV）を、実施例１に記載したように、生育し、抽出し、かつ分析した。ボルレリジン産生を、野生型コントロールと比較した。さらに、S.パルブルスTue4055/borD：：aac3（IV）を、実施例１に記載したプロトコルの後に、トランス-1,2-ジシクロペンタンジカルボン酸で化学的に補った。
極性効果を導入していないことを確認するために、該ermE*プロモーターの制御下、borDの全長コピーを、該破壊した突然変異体に対して、トランス内（in trans）に導入した。全長borDを、該プライマーBBT1（5’-TACTGCAGCACACCCGGTGC-3'）（配列番号：９９）、及びBBT2（5’-TGGGATCCGCTGTGTCATAT-3’）（配列番号：１００）を用いて、鋳型としてコスミドBor32A2を用いて、PCRにより増幅した。該816bpのPCR産物を精製し、かつ次いで、PstI-BamHIで消化し、かつpLHygのhyg 遺伝子を含む、BamHI-SpeI断片とともに、PstI-XbaIで消化したpIJ2925内にサブクローン化し、pIJDHを得た。次いで、pIJDHのBglII断片（該ベクターのこれらの部位を用いて）を、pEM4（BamHIで前消化した）内に、かつ正確な方向で、サブクローン化し、pborDHを製造した。プラスミドpborDH、及び該コントロールプラスミドpEM4を、実施例５に記載したように、プロトプラスト形質転換により、S.パルブルスTue4055/borD：：aac（3）IV内に導入した。該得られた菌株S.パルブルスTue4055/borD：：aac（3）IV/pborDHを、実施例１に記載したように分析し、かつWTコントロールと同様の滴定量で、ボルレリジンを産生することを示した。
（実施例１６）
（borEの破壊（S.パルブルスTue4055/borE：：aac3（IV））
borEを破壊するために、該遺伝子の内部761bp断片を、プライマーB25A（5’-TTCTGCAGCCGCGGCCTTCG-3’）（配列番号：８１）、及びB25B（5’-AGAATTCGCCGGCGCCGCTG-3’）（配列番号：８２）を用いて、鋳型としてcosBor32A2を用いて、PCRにより増幅した。該PCR産物を精製し、PstI-EcoRIで消化し、かつ同様に消化したpOJ260ermE*内にクローン化し、pOJEd1を製造した。このアプローチは、起こり得る極性効果を避けるためいに使用した。該ベクターpOJEd1を、実施例５に記載したように、プロトプラスト形質転換により、S.パルブルスTue4055内に導入し、かつコロニーを、R5上の、及び次いでMA寒天上のアプラマイシン耐性に対して選択した。該破壊を、サザンハイブリダイゼーションにより確認し、かつ該新しい突然変異体を、S.パルブルスTue4055/borE：：aac3（IV）と命名した。菌株S.パルブルスTue4055/borE：：aac3（IV）を、実施例１に記載したように、生育し、抽出し、かつ分析した。ボルレリジン産生は、観察されなかったが、一方、野生型コントロールは、予想通り、ボルレリジンを産生した。
極性効果を導入していないことを確認するために、該ermE*プロモーターの制御下、borEの全長コピーを、該破壊した突然変異体に対して、トランス内（in trans）に導入した。全長borEを、該プライマーB7T1（5’-GGCTGCAGACGCGGCTGAAG-3’）（配列番号：８３）、及びB7T2（5’-CCGGATCCCAGAGCCACGTC-3’）（配列番号：８４）を用いて、鋳型としてcosBor32A2を用いて、PCRにより増幅した。該1216 bp産物を精製し、PstI-BamHIで消化し、かつハイグロマイシン耐性カセットを含むpLHygのBamHI-SpeI消化断片とともに、pIJ2925（Janssen、及びBibbの論文、1993）を消化したPstI-XbaI内にクローン化し、pIJEHを得た。2.8 kbpのBamHI断片を、pIJEHから切除し、かつ同様に消化したpEM4内にクローン化（Quirosらの論文、1998）し、pborEHを得た（該borEを、遺伝子発現に対して、正確な方向にクローン化した。）。pborEH、及び該臥位コントロールプラスミドpEM4を、実施例５に記載したように、プロトプラスト形質転換により、S.パルブルスTue4055/borE：：aac（3）IV内に導入した。該得られた菌株S.パルブルスTue4055/borE：：aac（3）IV/pborEHを、実施例１に記載したように分析し、かつWTコントロールと同様の滴定量で、ボルレリジンを産生することを示し；該コントロール菌株S.パルブルスTue4055/borE：：aac（3）IV/pEM4は、ボルレリジンを産生しなかった。
実施例１に記載したプロトコルの後に、トランス-1,2-ジシクロペンタンジカルボン酸をS.パルブルスTue4055/borE：：aac3（IV）の化学的相補性は、該WT親コントロールの122±23％で、ボルレリジンを産生することができる。従って、borEは、トランス-シクロペンタン-1,2-ジカルボン酸の生合成に必須である。
（実施例１７）
（borFの破壊（S.パルブルスTue4055/borF：：aac3（IV））
borFを破壊するために、borFを含む領域を、BCB（5’-CACTAGTCCTCGCCGGGCAC-3’）（配列番号：１０１）、及びBCA（5’-GAGGATCCCGGTCAGCGGCA-3’）（配列番号：１０２）、及び鋳型としてコスミドBor32A2を用いて、PCRにより増幅した。該得られた2132bp産物を精製し、かつ次いでSpeI-BamHIで消化し、かつpSL1180の同じ部位内にサブクローン化し、pSLFを生じた。次いで、pEFBAの該aac（3）IV遺伝子を、pSLFの該SphI部位内に、SphI断片としてサブクローン化した。最終的に、該BamHI-SpeI断片を、BamHI-NheIで消化したpLHyg内にサブクローン化した。
該ベクターpLHFr1を、実施例５に記載したように、プロトプラスト形質転換により、S.パルブルスTue4055内に導入した。アプラマイシン耐性コロニーを選択し、かつ次いで、選択なしに、MA培地を通して、数回通過させた。該置換を、サザンハイブリダイゼーションにより確認し、かつ該新しい突然変異体を、S.パルブルスTue4055/borF：：aac3（IV）と命名した。菌株S.パルブルスTue4055/borF：：aac3（IV）を、実施例１に記載したように、生育し、抽出し、かつ分析した。ボルレリジン産生を、野生型コントロールと比較した。さらに、S.パルブルスTue4055/borF：：aac3（IV）を、実施例１に記載したプロトコルの後に、トランス-1,2-ジシクロペンタンジカルボン酸で化学的に補った。
極性効果を導入していないことを確認するために、該ermE*プロモーターの制御下、borFの全長コピーを、該破壊した突然変異体に対して、トランス内に導入した。全長borFを、該プライマーBCT1（5’-GCCTGCAGCGACCTCGCCGG-3’）（配列番号：１０３）、及びBCT2（5’-CGGGATCCCGTGGCGTGGTC-3’）（配列番号：１０４）を用いて、鋳型としてコスミドBor32A2を用いて、PCRにより増幅した。該1048bpのPCR産物を精製し、かつ次いで、PstI-BamHIで消化し、かつ上述のように該hyg遺伝子とともに、pIJ2925内にサブクローン化した。次いで、BglII断片を単離し、かつpEM4内にサブクローン化し、pborFHを製造した。これを相補的菌株SPMFに使用した。プラスミドpborFH、及び該コントロールプラスミドpEM4を、実施例５に記載したように、プロトプラスト形質転換により、S.パルブルスTue4055/borF：：aac（3）IV内に導入した。該得られた菌株S.パルブルスTue4055/borF：：aac（3）IV/pborFHを、実施例１に記載したように分析し、かつWTコントロールに類似した滴定量のボルレリジンを産生することを示した。
（実施例１８）
（borGの破壊（S.パルブルスTue4055/borG：：aac3（IV））
borGを破壊するために、885bpの内部領域を、プライマーB23A（5’-ATCTGCAGCGGCATCGGTGT-3’）（配列番号：１０５）、及びB23B（5’-AGAATTCTCCACTGCGGTCG-3’）（配列番号：１０６）、及び鋳型としてコスミドBor32A2を用いて、PCRにより増幅した。該得られた産物を精製し、かつ、該側面部位PstI-EcoRIの位置で消化し、かつ次いで、該プロモーターermE*の下流域である、pOJ260P内にサブクローン化し、pOJGd1を製造した。
該ベクターpOJGd1を、実施例５に記載したように、プロトプラスト形質転換により、S.パルブルスTue4055内に導入した。アプラマイシン耐性コロニーを、MA寒天上で選択した。該破壊を、サザンハイブリダイゼーションにより確認し、かつ該新しい突然変異体を、S.パルブルスTue4055/borG：：aac3（IV）と命名した。菌株S.パルブルスTue4055/borG：：aac3（IV）を、実施例１に記載したように、生育し、抽出し、かつ分析した。ボルレリジン産生を、野生型コントロールと比較した。さらに、S.パルブルスTue4055/borG：：aac3（IV）を、実施例１に記載したプロトコルの後に、トランス-1,2-ジシクロペンタンジカルボン酸で化学的に補った。
（実施例１９）
（borHの破壊（S.パルブルスTue4055/borH：：aac3（IV））
borHを破壊するために、697 bpの内部領域を、プライマーB9A（5’-ACCTGCAGGCCGGGCTCATC-3’）（配列番号：１０７）、及びB9B（5’-AGAATTCGGGCGAGCCGCCG-3’）（配列番号：１０８）、及び鋳型としてコスミドBor32A2を用いて、PCRにより増幅した。該得られた産物を精製し、かつ次いで、PstI-EcoRIで消化し、かつ次いで、該プロモーターermE*の下流域である、pOJ260P内にサブクローン化し、pOJHd2を製造した。
該ベクターpOJHd2を、実施例５に記載したように、プロトプラスト形質転換により、S.パルブルスTue4055内に導入した。アプラマイシン耐性コロニーを、MA寒天上で選択した。該破壊を、サザンハイブリダイゼーションにより確認し、かつ該新しい突然変異体を、S.パルブルスTue4055/borH：：aac3（IV）と命名した。菌株S.パルブルスTue4055/borH：：aac3（IV）を、実施例１に記載したように、生育し、抽出し、かつ分析した。ボルレリジン産生を、野生型コントロールと比較した。さらに、S.パルブルスTue4055/borH：：aac3（IV）を、実施例１に記載したプロトコルの後に、トランス-1,2-ジシクロペンタンジカルボン酸で化学的に補った。
（実施例２０）
（borIの破壊（S.パルブルスTue4055/borI：：aac3（IV））
該遺伝子、及び周囲のDNAを、該PCRプライマーBP4501（5’-CGTATGCATGGCGCCATGGA-3’）（配列番号：８５）、及びBP4502（5’-AGCCAATTGGTGCACTCCAG-3’）（配列番号：８６）を用いて、cosBor19B9から増幅した。該2.32 kbp産物を精製し、NsiI-MfeIで消化し、かつNsiI-EcoRIで消化したpSL1180内にクローン化し、プラスミドpSLIを製造した。該アプラマイシン耐性カセットを、EcoRI断片として、pEFBAから切除し、かつEcoRIで消化したpSLI内にクローン化し、該プラスミドpSLIAを得た。最終的に、該ハイグロマイシン耐性カセットを、pLHygからSpeI-PstIを除去し、かつNsiI-SpeIで消化したpSLIA内にクローン化し、pSLIr1を得た。
該置換ベクターpSLIr1を、実施例５に記載したプロトプラスト形質転換により、S.パルブルスTue4055内に導入した。アプラマイシン（25μg/ml）耐性コロニーを、選択し、かつ次いで、選択なしに、MA培地を通して数回通過した。該置換を、サザンハイブリダイゼーションにより確認し、該新しい突然変異体を、S.パルブルスTue4055/borI：：aac3（IV）と命名した。
S.パルブルスTue4055/borI：：aac3（IV）を、実施例１に記載したように、分析した。ボルレリジン産生がないことを観察し、一方、幾つかの新しい化合物を、有意な低水準で観察した。該低極性化合物の一つは、240 nmで、UV吸収極大を示し、かつLCMS分析は、ボルレリジンよりも11質量単位小さいm/z比を示し、C12でニトリル基よりもむしろ、メチル-の存在と一致する。
極性効果を導入していないことを確認するために、該ermE*プロモーターの制御下、borIの全長コピーを、該破壊した突然変異体に対して、トランス内に導入した。borIを含む、2.1
kbのNsiI-AvrII断片を、pSLIから回収し、かつ該hyg遺伝子を含む、pLHygの該NheI-SpeI断片とともに、pEM4の該PstI-XbaI部位内にサブクローン化した。両断片を、該同じ方向にサブクローン化し、pborIHを製造した。プラスミドpborIH、及び該コントロールプラスミドpEM4を、実施例５に記載したように、プロトプラスト形質転換により、S.パルブルスTue4055/borI：：aac（3）IV内に導入した。該得られた菌株S.パルブルスTue4055/borI：：aac（3）IV/pborIHを、実施例１に記載したように分析し、かつ、該WTコントロールと同様の滴定量でボルレリジンを産生することを示した。
（実施例２１）
（borJの破壊（S.パルブルスTue4055/borJ：：aac3（IV））
該遺伝子borJ、及び周囲のDNAを、該PCRプライマーBNHT1（5’-GTCATGCATCAGCGCACCCG-3’）（配列番号：８７）、及びBNHT2（5’-GTGCAATTGCCCTGGTAGTC-3’）（配列番号：８８）を用いて、cosBor19B9から増幅した。該2.75 kbp産物を精製し、NsiI-MfeIで消化し、かつNsiI-EcoRIで消化したpSL1180内にクローン化し、プラスミドpSLを製造した。該ハイグロマイシン耐性カセットを、PstI-SpeI断片として、pLHygから切除し、かつNsiI-SpeIで消化したpSL内にクローン化し、pSLJHを得た。最終的に、該アプラマイシン耐性カセットを、SpeI-PstIを用いて、pEFBAから切除し、かつborJから453bp断片を除去するために、AvrII-BglIIで予め消化したpSLJH内にクローン化し、pSLJr1を得た。
該置換ベクターpSLJr1を、実施例５に記載したプロトプラスト形質転換により、S.パルブルスTue4055内に導入した。アプラマイシン（25μg/ml）耐性コロニーを、選択し、かつ次いで、選択なしに、MA培地を通して数回通過した。該置換を、サザンハイブリダイゼーションにより確認した。該新しい突然変異体を、S.パルブルスTue4055/borJ：：aac3（IV）と命名した。
S.パルブルスTue4055/borJ：：aac3（IV）を、実施例１に記載したように、生育し、かつ分析した。ボルレリジン産生がないことを観察し、一方、ボルレリジンよりも極性の高い新しい化合物を、262 nmのUV吸収極大で観察した。LCMS分析は、508amuの親化合物を示し、C12でニトリル官能基よりもむしろ、カルボン酸と一致する。
極性効果を導入していないことを確認するために、該ermE*プロモーターの制御下、borJの全長コピーを、該破壊した突然変異体に対して、トランス内に導入した。borJを含む、pSLI由来の2.4 kbのNsiI-SphI断片を、pLHyg由来のSphI-SpeI断片として、該hyg遺伝子とともに、pEM4の該PstI-XbaI部位内にサブクローン化した；両断片を、該遺伝子の転写として、該同じ方向にサブクローン化した。該最終構造体を、pborJHと命名した。プラスミドpborJH、及び該コントロールプラスミドpEM4を、実施例５に記載したように、プロトプラスト形質転換により、S.パルブルスTue4055/borJ：：aac（3）IVに導入した。該得られた菌株S.パルブルスTue4055/borJ：：aac（3）IV/pborJHを、実施例１、及び４に記載したように分析し、かつ、該WTコントロールと同様の滴定量でボルレリジンを産生することを示した。
（実施例２２）
（borKの破壊（S.パルブルスTue4055/borK：：aac3（IV））
borKを破壊するために、2680bpの断片を、プライマーB231（5’-ATCAAGCTTCGTGTCCATGG-3’）（配列番号：１０９）、及びB232（5’-GTCATGCATCAGGCGTTCGG-3’）（配列番号：１１０）、及び鋳型としてコスミドBor19B9を用いて、PCRにより増幅した。該得られたPCR産物を精製し、かつ次いで、HindIII-NsiIで消化し、かつpSL1180の該同一部位内にサブクローン化し、pSLKを製造した。pSLKのMluI消化、及び該クレノウ（Klenow）断片で処置した後に、pEFBAの該aac（3）IV遺伝子を、SmaI-EcoRV断片としてサブクローン化し、pSLKaを生じた。最終的に、該hyg遺伝子を含む、pLHygのPstI-SpeI断片を、NsiI-XbaIで消化したpSLKa内にサブクローン化し、pSLKr1を得た。
該ベクターpSLKr1を、実施例５に記載したように、プロトプラスト形質転換により、S.パルブルスTue4055内に導入した。アプラマイシン耐性コロニーを選択し、MA寒天上で選択した。該破壊を、サザンハイブリダイゼーションにより確認し、かつ次いで、選択なしにMA培地を通して、数回通過させた。該置換を、サザンハイブリダイゼーションにより確認し、かつ該新しい突然変異体を、S.パルブルスTue4055/borK：：aac3（IV）と命名した。菌株S.パルブルスTue4055/borK：：aac3（IV）を、実施例１に記載したように、生育し、抽出し、かつ分析した。ボルレリジン産生を、野生型コントロールと比較した。さらに、S.パルブルスTue4055/borK：：aac3（IV）を、実施例１に記載したプロトコルの後に、トランス-1,2-ジシクロペンタンジカルボン酸で化学的に補った。
極性効果を導入していないことを確認するために、該ermE*プロモーターの制御下、borKの全長コピーを、該破壊した突然変異体に対して、トランス内に導入した。pSLKの2.2 kbのBglII（平滑末端）-NsiI断片を、該hyg遺伝子を含む、pLHygの1.6 kbのPstI-SpeI断片とともに、PstI（クレノウ断片で処置した）、及び次いでXbaIで消化したpEM4内にサブクローン化した。該最終ベクターを、pborKHと命名した。プラスミドpborKH、及び該コントロールプラスミドpEM4を、実施例５に記載したように、プロトプラスト形質転換により、S.パルブルスTue4055/borK：：aac（3）IV内に導入した。該得られた菌株S.パルブルスTue4055/borK：：aac（3）IV/pborKHを、実施例１、及び４に記載されているように分析し、WTコントロールと同様の滴定量で、ボルレリジンを産生することを示した。
（実施例２３）
（borLの破壊（S.パルブルスTue4055/borL：：aac3（IV））
borLを破壊するために、全長borLを含む、cosBor19B9の3.95 kbpのBglII断片を、同様に消化したpSL1180内にサブクローン化した。該得られたクローンを、制限酵素消化により分析し、かつ正確な方法を示した一つを、選択し、pSL395を製造した。NheI、及びSpeIを用いたpSL395の消化、及び次のBglII部位を含むborMの断片を除去し、再連結により、pSLLを与えた。該アプラマイシン耐性カセットを、pEFBAのKpnIを用いて切除（Lozanoらの論文、2000）し、かつKpnIで消化したpSL内にクローン化し、pSLLAを得た。pSLLAを、BglIIで消化し、かつ次いで、クレノウ処置、続く製造指示（ロシュ）にさらした。次いで、該ハイグロマイシン耐性カセットを含む、pLHygから単離したEcoRV断片を、この調製したベクター内にクローン化し、pSLLr1を得た。
該置換ベクターpSLLr1を、プロトプラスト形質転換により、S.パルブルスTue4055内に導入し、アプラマイシン耐性コロニーを、選択し、かつ次いで、選択なしに、MA培地を通して数回通過した。該置換を、サザンハイブリダイゼーションにより確認した。該新しい突然変異体を、S.パルブルスTue4055/borL：：aac3（IV）と命名した。
菌株S.パルブルスTue4055/borL：：aac3（IV）を、実施例１に記載したように、生育し、抽出し、かつ分析した。ボルレリジン産生がないことを観察し、一方、野生型コントロールが、予想通り、ボルレリジンを産生した。実施例１に記載したように、該天然開始酸を用いる、S.パルブルスTue4055/borL：：aac（IV）の化学的相補性は、従って、該生育した菌株が、該WT親コントロール滴定量の408±70％で、ボルレリジンを産生することができることを示した。
極性効果を導入していないことを確認するために、該ermE*プロモーターの制御下、borLの全長コピーを、該破壊した突然変異体に対して、トランス内に導入した。全長borLを含む、該ベクターを、実施例３０に記載したように製造した。プラスミドpborLH、及び該コントロールプラスミドpEM4を、実施例５に記載したように、プロトプラスト形質転換により、S.パルブルスTue4055/borL：：aac（3）IV内に導入した。該得られた菌株S.パルブルスTue4055/borL：：aac（3）IV/pborLHを、実施例１に記載したように分析した。
（実施例２４）
（borMの破壊（S.パルブルスTue4055/borM：：aac3（IV））
borMを破壊するために、borMを含む、2870 bpの断片を、プライマーB251（5’-CTTCTAGATGAACCCCTCCA-3’）（配列番号：１１１）、及びB252（5’-GGGCAATTGCGCGGCAGCTT-3’）（配列番号：１１２）、及び鋳型としてコスミドBor19B9を用いて、PCRにより増幅した。該得られた産物を精製し、かつ次いで、XbaI-MfeIで消化し、かつpSL1180の該XbaI-EcoRI部位内にサブクローン化しpSLMを生じた。次いで、borMの内部780 bpのSphI-NheI断片を、SpeI-XbaI断片として、pEFBAからサブクローン化した、該aac（3）IV遺伝子で置換し、pSLMAを生じた。pSLMAを、NsiI-XbaIで消化し、かつ該hyg遺伝子を、pLHygのSpeI断片としてサブクローン化し、pSLMr1を製造した。
該置換ベクターpSLMr1を、実施例５に記載したように、プロトプラスト形質転換により、S.パルブルスTue4055内に導入した。アプラマイシン耐性コロニーを、選択し、かつ次いで、選択なしに、MA培地を通して数回通過した。該置換を、サザンハイブリダイゼーションにより確認し、該新しい突然変異体を、S.パルブルスTue4055/borM：：aac3（IV）と命名した。菌株S.パルブルスTue4055/borL：：aac3（IV）を、実施例１に記載したように、生育し、抽出し、かつ分析した。ボルレリジン産生を、野生型コントロールと比較した。さらに、S.パルブルスTue4055/borM：：aac3（IV）を、実施例１に記載したプロトコルの後に、トランス-1,2-ジシクロペンタンジカルボン酸で補った。
極性効果を導入していないことを確認するために、該ermE*プロモーターの制御下、borMの全長コピーを、該破壊した突然変異体に対して、トランス内に導入した。全長borMを、pSLMの2.0 kbのXbaI-AgeI断片としてクローン化し、かつpLHygのXmaI-EcoRV断片として、該hyg遺伝子とともに、pEM4のEcoRI（クレノウで末端が満たされた）-XbaI部位内にサブクローン化し、pborMHを得た。プラスミドpborMH、及び該コントロールプラスミドpEM4を、実施例５に記載したように、プロトプラスト形質転換により、S.パルブルスTue4055/borM：：aac（3）IV内に導入した。該得られた菌株S.パルブルスTue4055/borM：：aac（3）IV/pborMHを、実施例１に記載したように分析し、かつWTコントロールに類似した滴定量で、ボルレリジンを産生することを示した。
（実施例２５）
（borNの破壊（S.パルブルスTue4055/borN：：aac3（IV））
borNを破壊するために、pSLMのBamHI断片1201bp（borMの3’-末端、及びborNの最初の161コドンを含む）を、pSL1180の該BglII-BamHI部位内に、かつ該正確な方向でサブクローン化し、pSLMNを製造した。pborOR由来のborOを含む、BamHI-EcoRI断片（該ポリリンカーのこれらの部位を用いる）を、pSLMNの該BamHI-EcoRI部位内にクローン化し、pSLNOを製造した。pSLNOのEcoRI消化、及びクレノウ断片で末端が満たされた後に、該hyg遺伝子を、EcoRV断片としてpLHygからサブクローン化し、pSLNOHを生じた。最終的に、該aac3（IV）遺伝子を、該同じ制限酵素で消化したpSLNOH内に、pEFBAのNcoI-BamHI断片としてサブクローン化し、pSLNr1を製造した。
該置換ベクターpSLNr1を、実施例５に記載したように、プロトプラスト形質転換により、S.パルブルスTue4055内に導入した。アプラマイシン耐性コロニーを、選択し、かつ次いで、選択なしに、MA培地を通して数回通過した。該置換を、サザンハイブリダイゼーションにより確認し、該新しい突然変異体を、S.パルブルスTue4055/borN：：aac3（IV）と命名した。菌株S.パルブルスTue4055/borN：：aac3（IV）を、実施例１に記載したように、生育し、抽出し、かつ分析した。ボルレリジン産生を、野生型コントロールと比較した。さらに、S.パルブルスTue4055/borN：：aac3（IV）を、実施例１に記載したプロトコルの後に、トランス-1,2-ジシクロペンタンジカルボン酸で補った。
（実施例２６）
（ストレプトマイセス アルブス J1074における、borOの非相同的発現）
該推定上の耐性タンパク質BorOが、ボルレリジン-感受性生物体に耐性を与えるかどうかを調査するために、borOを、ストレプトマイセス アルブス J1074内で発現させた。該遺伝子borOを、該プライマーBTRNAS1（5’-TGTCTAGACTCGCGCGAACA-3’）（配列番号：８９）、及びBTRNAS2（5’-TGAATTCCGAAGGGGGTGGT-3’）（配列番号：９０）を用いて、鋳型としてcosBor19B9を用いて、PCRにより増幅した。該産物を精製し、XbaI-EcoRIで消化し、かつ同様に消化したpEM4A内にクローン化し、該プロモーターermE*の制御下にborOを置いた、プラスミドpborORを得た。該ベクターpborORを、プロトプラスト形質転換により、S.アルブスJ1074内に導入し（Chater、及びWildeの論文、1980）、かつアプラマイシン耐性に対して選択した。該新しい菌株を、S.アルブスJ1074/pborORと命名した。
ボルレリジンに対する耐性を、アプラマイシン25μg/mlを含む、ベネットの寒天（Bennett’s agar）上で評価した。S.アルブスJ1074/pborOR、及び該コントロールS.アルブスJ1074/pEM4Aの胞子を、プレート上に広げ、かつ次いで、100、及び200 mg/mlのボルレリジンを含むディスクを、胞子の芝地上に置き、かつ30℃で一晩インキュベートした。成長阻害を示すハロー（Haloes）が、pEM4Aを含む該コントロール菌株に対して観察されたが、S.アルブスJ1074/pborORに対しては、観察されなかった。
（実施例２７）
（borG、及びborIの破壊（S.パルブルスTue4055/borG：：aac3（IV）/borI：：hyg））
該hyg遺伝子を、EcoRV断片として、pLHygから単離し、かつEcoRIで消化し、かつクレノウ断片で処置したpSLI（実施例２０）内にクローン化し、pSLIHを得た；該hyg遺伝子を、borIと同じ方向にクローン化した。pSLIHを、実施例５に記載したように、プロトプラスト形質転換により、S.パルブルスTue4055/borG：：aac3（IV）内に導入し、かつアプラマイシン、及びハイグロマイシン耐性を選択し、次いで、二重の組換えを促進するために、選択なしに、MA培地を通して、数回通過させた。該置換を確認するために、アプラマイシン、及びハイグロマイシン耐性コロニーを、サザンハイブリダイゼーション、及びPCRにより分析した。
（実施例２８）
（borG、及びborJの破壊（S.パルブルスTue4055/borG：：aac3（IV）/borJ：：hyg））
該hyg遺伝子を、EcoRV断片として、pLHygから単離し、かつAvrII-BglIIIで消化し、かつクレノウ断片で処置したpSLJ（実施例２１）内にクローン化し、pSLJHを得た；該hyg遺伝子を、borIと同じ方向にクローン化した。pSLJHを、実施例５に記載したように、プロトプラスト形質転換により、S.パルブルスTue4055/borG：：aac3（IV）内に導入し、かつアプラマイシン、及びハイグロマイシン耐性を選択し、次いで、二重の組換えを促進するために、選択なしに、MA培地を通して、数回通過させた。該置換を確認するために、アプラマイシン、及びハイグロマイシン耐性コロニーを、サザンハイブリダイゼーション、及びPCRにより分析した。
（実施例２９）
（S.パルブルスTue4055のborE上方制御効果）
該トランス-1,2-シクロペンタンジカルボン酸開始単位の生合成が、ボルレリジン産生に制限効果を有し得る可能性を調査するために、borEを、親菌株中、上方制御し、ボルレリジン滴定量の該効果を分析した。該ベクターは、実施例１６に記載したpborEHを用いた。
該ベクターpborEH、及びpEM4（コントロール）を用いて、S.パルブルスTue4055のプロトプラストを形質転換し、それぞれ、菌株S.パルブルスTue4055/pborEH、及びS.パルブルスTue4055/pEM4を得た。各形質転換体の幾つかのコロニーを選択し、３通り生育し、かつ次いで、実施例１に記載したように分析した。該コントロール菌株との比較して、borEの上方制御は、ボルレリジンの該滴定量において、4.2±0.3倍の増加をもたらした。
（実施例３０）
（S.パルブルスTue4055のborL上方制御効果）
borLが、ボルレリジン産生に伴う、制御、又は幾つかの他の関連機能を有し得る可能性を調査するために、該遺伝子を、該親菌株において上方制御し、かつボルレリジン滴定量に対する効果を分析した。
該発現ベクターpborLHを、次のように製造した：pSLLを、NotIで消化し、クレノウ断片で処置し、かつ次いでBamHIで消化し、borLを含む2190 bpの断片を得た。この断片を、pLHygのBamHI-SpeIのhyg遺伝子とともに、PstI（クレノウで処置した）-XbaIで消化したpEM4内にサブクローン化し、pborLHを得た。
該ベクターpborLH、及びpEM4（コントロール）を用いて、S.パルブルスTue4055のプロトプラストを形質転換し、それぞれ、菌株S.パルブルスTue4055/pborLH、及びS.パルブルスTue4055/pEM4を得た。各形質転換体の幾つかのコロニーを選択し、３通り生育し、かつ次いで、実施例１に記載したように分析した。該コントロール菌株と比較して、borLの上方制御は、ボルレリジンの該滴定量において、約4.3±0.7倍の増加をもたらした。
（実施例３１）
（12-デスニトリル-12-メチルボルレリジン14（前駆ボルレリジン）の産生）
S.パルブルスTue4055/borI：：aac3（IV）の通常在庫（0.5 ml）を、実施例１に示すように、NYGの第一栄養前駆培養液内に接種した。第二先駆培養液を、調製した（2 Lの三角フラスコ内にNYG 250 mlであること以外、実施例１に示すように）。実施例１に示すように、かつ起泡性コントロールに加えた0.01％プルトロニック（Plutronic）L0101を用いて調製した、PYDG産生培地（4 l）を、第二前駆培養液（12.5％接種物）で接種した。中心点（centre-point）培地（4 l）、及び起泡性コントロールに0.01％プルトロニックL0101を含む第二発酵槽を、同時に組立て、かつまた、第二前駆培養液（12.5％接種物）で接種した。中心点産生培地は、脱イオン水１リットルにつき：テスコのスキムミルク粉（Tesco’s skimmed milk powder）（1.5％）、アビデックス（Avidex）W-80（4.5％）、グルコース（0.5％）、及び酵母菌自己消化物（0.15％）を含み、5 MのNaOHでpHを7.0に調節した。
これらのバッチは、それぞれ、30℃で6.5日間、7 lアプリコン発酵槽（Applikon fermenter中で発酵させた。空気流量を、傾斜導風版を用いて、0.75 vvm（1分につき、容量パー容量）にセットし、かつ羽根スピードを、400〜800 rpmの間に制御し、溶存酸素圧力を、空気飽和の30％以上に維持した。さらなる消泡剤は、加えなかった。該発酵22時間で、該開始酸トランス-シクロペンタン-1,2-ジカルボン酸を、1：1のMeOH/5 M NaOHの中和した溶液として、直列フィルターを通して加えた。外来の開始酸の該発酵容器中の最終濃度を、0.5 mMとした。
発酵6.5日後に、該ブロスを合わせ、かつ高濃度HCl（〜6 ml）を用いて、pHを3.5に酸性化し、次いで3500 rpmで、10分間遠心し透明にした。該上清を、酢酸エチル（各4時間、3×1容量等価）で抽出し、該細胞ペレットを、メタノール中に浸透させた（各4時間、2×1.5容量等価）。該有機相を、合わせ、かつ減圧下で除去し、タール状ゴムを得た。該ゴムを、0.1 Mホウ砂緩衝液（500 ml、pH 9.4）中に再懸濁し、かつヘキサン（500 ml）、及び酢酸エチル（500 ml）で洗浄した。次いで、該水相を、高濃度HClでpH 3.5に酸性化し、酢酸エチル（3×500 ml）で抽出し、組合せ、かつ乾燥した。該生じたゴムを、メタノール（15 ml）中に溶解し、水（285 ml）で希釈し、かつC18-逆相カートリッジ上に、重力下ロードした（50 g、5％水メタノール中に調製した。）。該カートリッジを、20％、及び50％水メタノール（各300 ml）で洗浄し、かつ100％メタノール（500 ml）で溶出した。この最後のフラクションを、減圧下乾燥させ、黒いゴム状オイル（gummy-oil）（600 mg）を得て、メタノール中に取り上げた。最終的に、この残留物を、連続した調製逆相HPLCにより精製した（実施例４に使用した移動層で溶出し、TFAは加えず、40％Bでisocraticallyに行った。）。動作中のフラクションを組合せ、かつC18-カートリッジ（1 g）で脱塩し、28 mgの暗黒色オイルを得た（単離収量3.5 mg/l）。表１２に、CDCl3中の12-デスニトリル-12-メチルボルレリジン14の該1H、及び13C NMR化学シフトデータをまとめた。
Figure 2006514548
（実施例３２）
（12-デスニトリル-12-カルボキシボルレリジン2の製造）
S.パルブルスTue4055/borJ：：aac3（IV）の通常在庫（0.5 ml）を、実施例１に示すように、NYGの第一栄養前駆培養液内に接種した。第二先駆培養液を、調製した（2 Lの三角フラスコ内にNYG 250 mlであること以外、実施例１に示すように）。実施例１に示すように、かつ起泡性コントロールに加えた0.01％プルトロニックL0101を用いて調製した、PYDG産生培地（4 L）を、全体の第二前駆培養液（10.0％接種物）で接種した。これを、30℃で6日間、7 Lのアプリコン発酵槽中で発酵した。空気流量を、傾斜導風版を用いて、0.75 vvmにセットし、かつ該羽根スピードを、250〜600 rpmの間に制御し、溶存酸素圧力を、空気飽和の30％以上に維持した。さらなる消泡剤は、加えなかった。第二発酵を、60時間後接種から、12時間毎に水溶液として、0.2 molのグルコースで供給されたバッチであること以外、上述のように正確に行った。
6日後に、該発酵を収集し、かつ組合わせた。該ブロスを遠心（3500 rpmで、10分間）し、透明にし、かつ該得られた上清を、10 MのHCl（aq）で、pH3.5に酸性化した。この溶液を、撹拌することにより（各4時間、3×1容量等価）、酢酸エチルで抽出した。該細胞ペレットを、1：1のメタノール/酢酸エチル（500 ml）中に浸透させることにより、2回抽出した（各4時間、2×1.5容量等価）。該有機相すべてを、合わせ、かつ減圧下で除去し、水溶性懸濁液を得た。該懸濁液を、500 mlの水で希釈し、10 MのHClで、pH 3.5に酸性化し、酢酸エチル（3×300 ml）で抽出した。該有機相を、減圧下で300 mlに濃縮し、かつ0.1 Mのホウ砂で抽出した（3×150 ml、pH 9.4）。該合わせたホウ砂溶液を、10 MのHClで、pH 3.5に酸性化し、かつ酢酸エチル6×300 mlで抽出した。分析HPLCは、幾らかの蓄積物が、該ホウ砂溶液中にまだ存在することを示し、かつこれを、重力下、C18-逆相カートリッジ（50 g）上にロードした。該カートリッジを水で洗浄し、かつ該蓄積物を、100％メタノールで溶出した。該蓄積物を含む有機相を合わせ、かつ40 mlメタノール溶液に減少させた。これを、セファデッスク（Sephadex）LH-20カラム（70 g、メタノール中で一晩膨張させた、カラム60 cm×2.5 cm）上にロードし、100％メタノールで展開し；該作動中のフラクションを組合せ、乾燥させた。次いで、該物質を、調製逆相HPLC（実施例４で使用した移動層で溶出し、TFAは加えず、40％Bでisocraticallyに行った。）で処理した。該組合わせた作動フラクションを乾燥し、メタノール（4 ml）中に溶解し、かつ水（200 ml）で希釈した。この混合液を、2つの等量フラクションに分け、かつ各々をC18-逆相カートリッジ（20 g）上に、重力下、ロードした。次いで、該カラムを、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、75％、90％、及び100％の３カラム容量で溶出した。すべてのフラクションにおいて、該蓄積物は、60％〜100％メタノールで溶出し、これらを組合せ、かつ乾燥した。次いで、最終的に、該蓄積物（DMSO中に溶解）を、連続した調製逆相HPLCにより精製した（実施例４に使用した移動層で溶出し、TFAは加えず、40％Bでisocraticallyに行った。）。動作中のフラクションを組合せ、かつC18-カートリッジ（1 g）で脱塩し、17 mgの茶色オイルを得た（単離収量2.1 mg/l）。表１３に、d4-メタノール中の12-デスニトリル-12-カルボキシボルレリジン2の該1H、及び13C NMR化学シフトデータをまとめた。
Figure 2006514548
（実施例３３）
（17-デス-（シクロペンタン-2’-カルボン酸）-17-（シクロブタン-2’-カルボン酸）ボルレリジン18の変異合成による製造）
S.パルブルスTue4055/borE：：aac3（IV）の通常在庫（0.5 ml）を、実施例１に示すように、NYGの第一栄養前駆培養液内に接種した。第二先駆培養液を、調製した（2 Lの三角フラスコ内にNYG 250 mlであること以外、実施例１に示すように）。実施例１に示すように、かつ起泡性コントロールに加えた0.01％プルトロニックL0101を用いて調製した、PYDG産生培地（4 L）を、全体の第二前駆培養液（12.5％接種物）で接種した。２つのさらなるバイオリアクターを、同じ方法で組立てた。これらのバッチを、30℃で6日間、7 Lのアプリコン発酵槽中で発酵した。空気流量を、傾斜導風版を用いて、0.75 vvm（1分につき、容量パー容量）にセットし、かつ該羽根スピードを、400〜700 rpmの間に制御し、溶存酸素圧力を、空気飽和の30％以上に維持した。さらなる消泡剤は、加えなかった。該発酵22時間で、該開始酸トランス-シクロブタン-1,2-ジカルボン酸を、1：1のMeOH/5 M NaOHの中和した溶液として加えた。外来の開始酸の該発酵容器中の最終濃度を、0.5 mMとした。
発酵5日後に、該ブロスを合わせ、かつ高濃度HCl（〜6 ml）を用いて、pHを4.0に酸性化し、次いで3500 rpmで、10分間遠心し透明にした。該上清を、メタノール（2 l）、かつ次いで5％水メタノール（2 l）で前処理した、ジアニオンHP-20SS樹脂（1 l）上に、約100 ml/分の速度で濾過により吸収させた。次いで該樹脂を、20％水メタノール（2.5 l）、及び次いで80％水アセトン（4.5 l）で溶出した。該有機溶媒を、該水アセトンから除去し、かつ該得られた水溶性懸濁液（1リットル）を、酢酸エチル（3×1l）で抽出した。該有機相を合わせ、かつ減圧下で減らし、黄色/茶色オイル（1.7 g）を得た。一方、該細胞ペレットを、1：1のメタノール/酢酸エチル（3×1l、各4時間）中に浸透させ（各4時間、2×1.5容量等価）、該得られた有機上清を減圧下で減らし、水溶性懸濁液（400 ml）を得た。粒子状物質を、メタノール（50 ml）中に溶解し、かつ該水溶性懸濁液に戻し、水500 mlにした。この懸濁液を、メタノール（500 ml）、かつ次いで5％水メタノール（500 ml）で前処理した、ジアニオンHP-20SS樹脂（300 ml）上に吸収させた。次いで該樹脂を、20％水メタノール（1 l）、及び次いで80％水アセトン（1.5 l）で溶出した。該有機溶媒を、該水アセトンから除去し、かつ該得られた水溶性懸濁液（750 mlにした）を、酢酸エチル（3×750 ml）で抽出した。該有機相を合わせ、かつ減圧下で減らし、黄色/茶色オイル（1.7 g）を得た。該粗抽出物を組合せ（3.4 g）、酢酸エチル（10 ml）に溶解し、次いでシリカカラム（5 cm ID×10 cm、EtOAcで処理）上に吸着させ、かつEtOAcで溶出した。該作動中のフラクションを組合せ、かつ該溶媒を減圧下で除去し、茶色ゴム（1.08 g）を得た。最終的に、この残留物を、連続した調製逆相HPLCにより精製した（実施例４に使用した移動層で溶出し、TFAは加えず、直線勾配を有し、25分に渡って、25％Bから75％Bで行った。）。作動中のフラクションを組合せ、かつC-18カートリッジ（5 g）で脱塩し、83.9 mg（又は単離収量7.0 mg/l）を得た。該18の13C-NMRスペクトルを、表１４に示す。
Figure 2006514548
（参考文献）
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図１は、ボルレリジン産生生物から単離した、ボルレリジンの構造、及び幾つかの関連代謝産物を図解する。 図２は、13C安定同位体標識した伸長基質、及びトランス-シクロペンタン-1,2-ジカルボン酸開始単位の派生炭素の位置を図解する。 図３は、該ボルレリジン生合成遺伝子クラスターの構成を図解する。制限酵素認識部位は：B, BamHI；Bc, BclI；E, EcoRI；X, XhoIである。 図４は、該トランス-シクロペンタン-1,2-ジカルボン酸開始単位の提案される生合成過程を示すスキームを図解する。 図５は、該ボルレリジンPKSの構成、及び該前駆ボルレリジン分子の生合成を図解する。 図６は、ボルレリジンのC12位置で、ニトリル部位の導入に対して提案される生合成経路を図解する。 図７は、該分子６の提案される構造を図解する。 図８は、該分子７、及び８の提案される構造を図解する。 図９は、E.コリWにおいて、該4-ヒドロキシフェニル酢酸の異化過程の分子特性を図解する。 図１０は、該分子18〜20の構造を図解する。 図１１は、該分子21〜26の構造を図解する。

Claims (73)

  1. 単離、又は組換え型核酸分子であって：（a）配列番号：１に示すヌクレオチド配列；（b）配列番号：１の相補体であるヌクレオチド配列；（c）配列番号：１の縮重したヌクレオチド配列；（d）、（a）、（b）、又は（c）に対して、又は配列番号：１、又はその相補体から誘導されたハイブリダイゼーションプローブに対して、高ストリンジェント条件下でハイブリダイズする、ヌクレオチド配列；（e）配列番号：１と、配列が少なくとも80％の配列同一性を有する、ヌクレオチド配列；（f）少なくとも10個のヌクレオチド長さである、前記の（a）、（b）、（c）、（d）、又は（e）の断片を含む、前記核酸分子。
  2. ボルレリジン生合成遺伝子クラスター、又はそのドメインの読み取り枠によりコードされたポリペプチドをコードし、前記ポリペプチドが、配列番号：２〜４３、及び１１３からなる群から選択されたアミノ酸配列、又はそれと少なくとも80％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１記載の核酸。
  3. AT0、及びACP0から選択された、PKSドメインをコードしている配列を含み、前記ドメインが、それぞれ、配列番号：２の第322〜664番目、及び第694〜763番目のアミノ酸により記述されている、請求項１、又は２記載の核酸。
  4. 配列番号：１の第17147〜18175番目、及び第18263〜18472番目の塩基からなる群から選択された配列を含む、請求項３記載の核酸。
  5. KS1、AT1、KR1、及びACP1から選択されたPKSドメインをコードしている配列を含み、前記ドメインが、それぞれ、配列番号：３の第34〜459番目、第557〜885番目、第1136〜1379番目、及び第1419〜1486番目のアミノ酸により記述されている、請求項１、又は２記載の核酸。
  6. 配列番号：１の第18974〜20251番目、第20543〜21529番目、第22280〜23011番目、及び第23129〜23332番目の塩基からなる群から選択された配列を含む、請求項５記載の核酸。
  7. KS2、AT2、DH2、KR2、ACP2、KS3、AT3、DH3、KR3、及びACP3から選択されたPKSドメインをコードしている配列を含み、前記ドメインが、それぞれ、配列番号：４の第34〜459番目、第559〜887番目、第903〜1050番目、第1354〜1597番目、第1628〜1694番目、第1724〜2149番目、第2245〜2576番目、第2593〜2734番目、第3060〜3307番目、及び第3340〜3406番目のアミノ酸により記述されている、請求項１、又は２記載の核酸。
  8. 配列番号：１の第23785〜25062番目、第25360〜26346番目、第26392〜26835番目、第27745〜28476番目、第28567〜28767番目、第28855〜30132番目、第30418〜31413番目、第31462〜31887番目、第32863〜33606番目、及び第33703〜33903番目の塩基からなる群から選択された配列を含む、請求項７記載の核酸。
  9. KS4、AT4、KR4、及びACP4から選択されたPKSドメインをコードしている配列を含み、前記ドメインが、それぞれ、配列番号：５の第34〜459番目、第555〜886番目、第1179〜1423番目、及び第1459〜1525番目のアミノ酸により記述されている、請求項１、又は２記載の核酸。
  10. 配列番号：１の第34284〜35561番目、第35847〜36842番目、第37719〜38453番目、及び第38559〜38759番目の塩基からなる群から選択された配列を含む、請求項９記載の核酸。
  11. KS5、AT5、DH5、ER5、KR5、及びACP5から選択されたPKSドメインをコードしている配列を含み、前記ドメインが、それぞれ、配列番号：６の第34〜457番目、第553〜888番目、第905〜1046番目、第1401〜1690番目、第1696〜1942番目、及び第1975〜2041番目のアミノ酸により記述されている、請求項１、又は２記載の核酸。
  12. 配列番号：１の第39221〜40492番目、第40778〜41785番目、第41834〜42259番目、第43322〜44191番目、第44207〜44947番目、及び第45044〜45244番目の塩基からなる群から選択された配列を含む、請求項１１記載の核酸。
  13. KS6、AT6、KR6、ACP6、及びTEから選択されたPKSドメインをコードしている配列を含み、前記ドメインが、それぞれ、配列番号：７の第37〜457番目、第555〜883番目、第1101〜1335番目、第1371〜1437番目、及び第1461〜1708番目のアミノ酸により記述されている、請求項１、又は２記載の核酸。
  14. 配列番号：１の第45622〜46884番目、第47176〜48162番目、第48814〜49518番目、第49624〜49824番目、及び第49894〜50637番目の塩基からなる群から選択された配列を含む、請求項１３記載の核酸。
  15. PKSモジュールをコードしている配列を含み、前記モジュールが、それぞれ、配列番号：２の第322〜763番目、配列番号：３の第34〜1486番目、配列番号：４の34〜1694番目、配列番号：４の第1724〜3406番目、配列番号：５の第34〜1525番目、配列番号：６の第34〜2041番目、及び配列番号：７の第37〜1437番目又は1708番目のアミノ酸からなる群から選択された、請求項１、又は２記載の核酸。
  16. 配列番号：１の第17147〜18472番目、第18974〜23332番目、第23785〜28767番目、第28855〜33903番目、第34284〜38759番目、第39221〜45244番目、第45622〜49824番目、又は第50637番目の塩基からなる群から選択された配列を含む、請求項１５記載の核酸。
  17. 請求項１〜１６のいずれか１項記載の単離された、又は組換え型核酸であって：前記核酸配列が、下記からなる遺伝子群から選択された核酸；borA1（配列番号：１の第16184〜18814番目）、borA2（配列番号：１の第18875〜23590番目）、borA3（配列番号：１の第23686〜34188番目）、borA4（配列番号：１の第34185〜39047番目）、borA5（配列番号：１の第39122〜45514番目）、borA6（配列番号：１の第45514〜50742番目）、borB（配列番号：１の相補鎖の第7603〜8397番目）、borC（配列番号：１の相補鎖の第8397〜9194番目）、borD（配列番号：１の相補鎖の第9244〜9996番目）、borE（配列番号：１の相補鎖の第9993〜11165番目）、borF（配列番号：１の相補鎖の第11162〜11980番目）、borG（配列番号：１の相補鎖の第11992〜13611番目）、borH（配列番号：１の相補鎖の第13608〜15659番目）、borI（配列番号：１の第50739〜52019番目）、borJ（配列番号：１の第52113〜53477番目）、borK（配列番号：１の第53486〜54466番目）、borL（配列番号：１の第54506〜56176番目）、borM（配列番号：１の第56181〜57098番目）、borN（配列番号：１の第57112〜57858番目）、borO（配列番号：１の第57939〜59966番目）、orfB1（配列番号：１の第2〜313番目）、orfB2（配列番号：１の第501〜3107番目）、orfB3（配列番号：１の相補鎖の第3172〜3810番目）、orfB4（配列番号：１の相補鎖の第3935〜4924番目）、orfB5（配列番号：１の第5123〜5953番目）、orfB6（配列番号：１の相補鎖の第5961〜6518番目）、orfB7（配列番号：１の第6564〜7538番目）、orfB8（配列番号：１の相補鎖の第60153〜60533番目）、orfB9（配列番号：１の第60620〜61003番目）、orfB10（配列番号：１の第61188〜61436番目）、orfB11（配列番号：１の第61526〜61738番目）、orfB12（配列番号：１の相補鎖の第61767〜62285番目）、orfB13a（配列番号：１の相補鎖の第62750〜63067番目）、orfB13b（配列番号：１の相補鎖の第62586〜62858番目）、orfB14（配列番号：１の相補鎖の第63155〜65071番目）、orfB15（配列番号：１の65374〜65871）、orfB16（配列番号：１の相補鎖の第65942〜68305番目）、orfB17（配列番号：１の相補鎖の第68290〜68910番目）、orfB18（配列番号：１の第69681〜70436番目）、orfB19（配列番号：１の第70445〜71848番目）、orfB20（配列番号：１の第71851〜72957番目）、orfB21（配列番号：１の第73037〜73942番目）、及びorfB22（配列番号：１の相補鎖の第73995〜74534番目）。
  18. 請求項１〜１７のいずれか１項記載の核酸配列によりコードされた、単離ポリペプチド。
  19. 宿主細胞内に、ボルレリジンポリケチドシンターゼ、又はその誘導体由来のドメインをコードしている核酸を導入することを含む、親ポリケチドシンターゼの改質方法であって、該宿主細胞が、前記親ポリケチドシンターゼをコードしている核酸を含み、その結果、発現した場合、該ドメインが前記親ポリケチドシンターゼ内に組込まれる、前記方法。
  20. 該親PKSの天然ドメインに加えて、該ボルレリジンPKSドメインを挿入する、請求項１９記載の方法。
  21. 該親PKSの天然ドメインの代わりに、該ボルレリジンPKSドメインを挿入する、請求項１９記載の方法。
  22. 該本願ポリケチドシンターゼのドメインを不活性化、除去、又は変更する、請求項２１記載の方法。
  23. 前記ボルレリジンポリケチドシンターゼ、又はその誘導体由来のモジュールをコードしている核酸を、前記宿主細胞内に導入することを含む、請求項１９〜２２のいずれか１項記載の方法。
  24. 前記モジュールが、少なくともACP、AT、及びKSドメインを含む、伸長モジュールである、請求項２３記載の方法。
  25. さらに、前記モジュールが、KRドメインを含む、請求項２４記載の方法。
  26. さらに、前記モジュールが、DHドメインを含む、請求項２５記載の方法。
  27. さらに、前記モジュールが、ERドメインを含む、請求項２６記載の方法。
  28. さらに、前記モジュールが、TEドメインを含む、請求項２４〜２７のいずれか１項記載の方法。
  29. 宿主細胞内に、ドナーポリケチドシンターゼ由来のドメインをコードしている核酸を導入することを含む、親ボルレリジンポリケチドシンターゼの改質方法であって、該宿主細胞が、前記親ボルレリジンポリケチドシンターゼをコードしている核酸を含み、その結果、発現した場合、該ドメインが前記親ボルレリジンポリケチドシンターゼ内に組込まれる、前記方法。
  30. 該親ボルレリジンPKSの天然ドメインに加えて、該ドナーPKSドメインを挿入する、請求項２９記載の方法。
  31. 該親ボルレリジンPKSの天然ドメインの代わりに、該ドナーPKSドメインを挿入する、請求項２９記載の方法。
  32. 該ドナーPKSドメインが、O-メチルトランスフェラーゼドメイン、C-メチルトランスフェラーゼドメイン、エピマー化ドメイン、モノオキシゲナーゼドメイン、デヒドロゲナーゼドメイン、アミノトランスフェラーゼドメイン、又は非リボソーム型ペプチドシンテターゼドメインからなる群から選択される、請求項２９〜３１のいずれか１項記載の方法。
  33. 前記ドナーポリケチドシンターゼ、又はその誘導体由来のモジュールをコードしている核酸を、宿主細胞内に導入することを含む、請求項２９〜３２のいずれか１項記載の方法。
  34. 前記モジュールが、少なくともACP、AT、及びKSドメインを含む、伸長モジュールである、請求項３３記載の方法。
  35. 前記モジュールが、さらに、KRドメインを含む、請求項３４記載の方法。
  36. 前記モジュールが、さらに、DHドメインを含む、請求項３５記載の方法。
  37. 前記モジュールが、さらに、ERドメインを含む、請求項３６記載の方法。
  38. 前記モジュールが、さらに、TEドメインを含む、請求項３３〜３７のいずれか１項記載の方法。
  39. 該ドナーPKSが、ボルレリジンPKSである、請求項２９〜３１のいずれか１項記載の方法。
  40. ボルレリジンPKSの少なくとも１のドメインをコードしている、少なくとも１の第一核酸部位、及び前記ボルレリジンPKSと非相同的である、少なくとも１のI型PKSドメインをコードしている、第二核酸の１部位、又は複数部位を含む、核酸構造体。
  41. ハイブリッドポリケチドシンターゼ遺伝子、ボルレリジンPKSの少なくとも１のドメインをコードしている前記遺伝子、及び前記ボルレリジンPKSと非相同的である、少なくとも１のI型PKSドメインを含む、請求項４０記載の構造体。
  42. ポリケチドシンターゼを発現する宿主細胞において、ボルレリジン、又はボルレリジン誘導体又は類似体を製造する宿主細胞の能力を増強する方法であって、前記細胞内の該ボルレリジン開始単位の製造に伴う、ボルレリジン生合成遺伝子を上方制御することを含む、前記方法。
  43. 前記遺伝子が、borC、borD、borE、borF、borH、borK、borL、borM、及びborNからなる群から選択される、請求項４２記載の方法。
  44. 該遺伝子が、borE、又はborLである、請求項４３記載の方法。
  45. 前記細胞内の上方制御されるべき該遺伝子をコードしている核酸の導入工程を含む、請求項４２〜４４いずれか１項記載の方法。
  46. ボルレリジン、又はボルレリジン誘導体又は類似体を製造する能力を増強するために、ボルレリジン、又は前記誘導体又は類似体のポリケチドシンターゼを発現することができる宿主細胞を改質する方法であって、前記細胞内の該ボルレリジン開始単位の製造を伴う、ボルレリジン生合成遺伝子を除去し、破壊し、又は他の不活性化をすることを含み、該遺伝子が、borGである、前記方法。
  47. 該得られた細胞を発酵すること、及び外来のカルボン酸を供給することを含む、請求項４６記載の方法。
  48. 該外来のカルボン酸が、トランス-シクロブタン-1,2-ジカルボン酸、2,3-ジメチルコハク酸、2-メチルコハク酸、及びトランス-シクロペンタン-1,2-ジカルボン酸からなる群から選択される、請求項４７記載の方法。
  49. さらに、一以上のボルレリジン生合成遺伝子、又はボルレリジンポリケチドシンターゼドメイン又はモジュールを、除去、改質、又は置換することを含む、請求項４４〜４８のいずれか１項記載の方法。
  50. ボルレリジン、又はその誘導体のためのPKSを発現する宿主細胞内において、改質ボルレリジンポリケチド、又はその誘導体を製造する方法であって、ボルレリジンのC12でのニトリル官能基形成に関与する遺伝子の除去、又は不活性化を含む、前記方法。
  51. 前記宿主細胞内に、一以上の非相同的遺伝子をコードしている核酸を導入することを含み、全ての堆積した生合成中間体、又は分路代謝産物の別の合成を可能にする、請求項５０記載の方法。
  52. 請求項１〜１７のいずれか１項記載の核酸分子、又は請求項４０、又は４１記載の構造体を含む、ベクター。
  53. 請求項５２のベクターを含む、宿主細胞。
  54. 放線菌である、請求項５３記載の宿主細胞。
  55. ストレプトマイセートである、請求項５３記載の宿主細胞。
  56. 下記からなる群から選択された、請求項５５記載の宿主細胞：サッカロポリスポラ エリスラエア、ストレプトマイセス コエリカラー、ストレプトマイセス アベルミチリス、ストレプトマイセス グリセオフスクス、ストレプトマイセス キンナモネンシス、ミクロモノスポラ グリセオルビダ、ストレプトマイセス ハイグロスコピカス、ストレプトマイセス フラジアエ、ストレプトマイセス ロンギスポロフラブス、ストレプトマイセス ラサリエンシス、ストレプトマイセス ツクバエンシス、ストレプトマイセス グリセウス、ストレプトマイセス ベネズエラエ、ストレプトマイセス アンチバイオチクス、ストレプトマイセス リビダンス、ストレプトマイセス リモスス、及びストレプトマイセス アルブス．ストレプトマイセス ロケイ ATCC23956、ストレプトマイセス パルブルス Tue113。
  57. 請求項５３〜５６のいずれか１項の宿主細胞を培養することを含む、ポリケチドの合成方法。
  58. 下記式１の化合物、又はその医薬として許容し得る塩、又は一以上の該ケチド単位の酸化状態において、該対応する“天然”化合物とは異なる類似体であって（すなわち、下記群からの代替の選択：-CO-、-CH（OH）-、=CH-、及び-CH2-）：
    Figure 2006514548
     （式中、R1は、変化する大きさの（n=１〜２）、及び下に示すように置換されたシクロアルキル基であり；
    Figure 2006514548
     また、式中、R1を、一以上のハロ原子、又は一以上のC1〜C3アルキル基で、任意に置換することができ；R2、R3、R6、R7、R8、R9、又はR11は、それぞれ独立して、H、OCH3、CH3、又はCH2CH3であり；R4は、CN、CO2H、CHO、CH3、CONH2、CHNHであり、R5、R10は、OHである。）、但し、前記化合物は、図１に示す、ボルレリジン（1）、12-デスニトリル-12-カルボキシルボルレリジン（2）、10-デスメチルボルレリジン（3）、11-エピボルレリジン（4）、又はC14,C15-シスボルレリジン類似体（5）ではない、前記化合物。
  59. 下記式２の化合物、又はその医薬として許容し得る塩、又は一以上の該ポリケチド単位の酸化状態において、該対応する“天然”化合物とは異なる類似体であって（すなわち、下記群からの代替の選択：-CO-、-CH（OH）-、=CH-、及び-CH2-）：
    Figure 2006514548
     （式中、R2、R3、R6、R7、R8、R9、又はR11、それぞれ独立して、H、OCH3、CH3、又はCH2CH3であり；R4は、CN、CO2H、CHO、CH3、CONH2、CHNHであり、R5、R10は、OHであり；かつR12、及びR13は、それぞれ独立して、H、又はOH、F、Cl、SHで任意に置換され得るC1〜C4アルキル基である。）、但し、R12、及びR13は、同時にHではないとする、前記化合物。
  60. R7、R8、及びR9が、すべてCH3である、請求項５８、又は請求項５９記載の化合物、又は塩。
  61. R4が、CH3、又はCOOHである、請求項５８、又は５９記載の化合物、又は塩。
  62. R4が、CH3、又はCOOHである、請求項６０記載の化合物、又は塩。
  63. R4が、CNである、請求項５８、又は５９記載の化合物、又は塩。
  64. R4が、CNである、請求項６０記載の化合物、又は塩。
  65. R1が、シクロブタン-1'-カルボキシラートである、請求項５８記載の化合物、又は塩。
  66. R1が、シクロブタン-1'-カルボキシラートである、請求項６０記載の化合物、又は塩。
  67. R4が、CH3、又はCOOHである、請求項６６記載の化合物、又は塩。
  68. R6、R7、R8、及びR9が、すべてCH3であり、R2、及びR11がHであり、R5、及びR10がOHであり、R4がCH3、COOH、又はCNのどれかであり、かつR1がシクロペンタン-1’-カルボキシラート、又はシクロブタン-1'-カルボキシラートである、請求項５８記載の化合物、又は塩。
  69. R12、及びR13が、独立して、CH3、又はHである、請求項５９記載の化合物、又は塩。
  70. R12、及びR13が、独立して、CH3、又はHである、請求項６０記載の化合物、又は塩。
  71. R4が、CH3、又はCOOHである、請求項７０記載の化合物、又は塩。
  72. R6、R7、R8、及びR9が、すべてCH3であり、R2、及びR11が、Hであり、R5、及びR10が、OHであり、R4が、CH3、COOH、又はCNのどれかであり、かつR12、及びR13が、独立して、CH3、又はHである、請求項５９記載の化合物、又は塩。
  73. R6、R7、R8、及びR9が、すべてCH3であり、R2、及びR11が、Hであり、R5、及びR10が、OHであり、R4が、CH3、COOH、又はCNのどれかであり、かつR12、及びR13が、双方ともCH3である、請求項５９記載の化合物、又は塩。
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