DE60313659T2

DE60313659T2 - Borrelidin-derivate und ihre medizinische anwendung

Info

Publication number: DE60313659T2
Application number: DE60313659T
Authority: DE
Inventors: Jose A. c/o The Univ SALAS; Carmen c/o The Univ MENDEZ; Carlos c/o The Univ OLANO; Cesar c/o The Univ SANCHEZ; Alfredo F. c/o The Univ BRANA; Barrie c/o Biotica Nr Saffron Walden WILKINSON; Christine J. c/o Biotica Nr Saffron Walden MARTIN; Steven c/o Biotica Nr Saffron Walden MOSS; Peter F. Biotica Technology Limited Nr Saffron Walden LEADLAY; Marko c/o Universi Cambridge OLIYNYK
Original assignee: Universidad de Oviedo; Biotica Technology Ltd
Current assignee: Universidad de Oviedo; Biotica Technology Ltd
Priority date: 2002-12-27
Filing date: 2003-12-24
Publication date: 2008-04-03
Anticipated expiration: 2023-12-25
Also published as: EP1840216A2; WO2004058976A3; AU2003295169A8; US7560252B2; AU2003295169B2; ES2287552T3; DE60313659D1; EP1576160B8; MXPA05005323A; EP1961747A2; AU2003295169A1; US20090286291A1; GB0230217D0; BR0317118A; EP1840216A3; CN1732264A; EP1576160A2; US20070065920A1; WO2004058976A2; JP2006514548A

Description

TECHNISCHES GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft neuartige Polyketide und deren Verwendungen.
STAND DER TECHNIK
Bei Polyketiden handelt es sich um Naturprodukte, die von einer Vielfalt von Organismen und insbesondere von Mikroorganismen produziert werden. Polyketide besitzen viele wichtige pharmazeutische, tierärztliche und landwirtschaftliche Anwendungen. Polyketide umfassen einen enorm breiten Raum chemischer Strukturen und weisen eine große Vielzahl von biologischen Aktivitäten im Zusammenhang damit auf. Zu den Polyketiden mit Eignung für medizinische Behandlungen gehören Antibiotika, Immunsuppressiva, Antitumormittel, andere chemotherapeutische Mittel sowie weitere Verbindungen, die eine große Bandbreite an therapeutischen und biologischen Eigenschaften besitzen. Die Gram-positiven Bakterien Streptomyces und ihre verwandten Gattungen sind außerordentliche Produzenten von Polyketiden, wobei die Genetik und Biochemie der Polyketidbiosynthese in diesen Organismen relativ gut charakterisiert ist (Hopwood, 1997). Die Gene für die Polyketidbiosynthese in Streptomyces liegen in einem Cluster vor, und durch die Ausnutzung von DNA-Technologie wurde die Isolierung kompletter Biosynthesegencluster ermöglicht, indem Genbibliotheken mit DNA-Sonden, die für die für ihre Biosynthese verantwortlichen Gene codieren, durchsucht wurden. So konnten mehr und mehr Gencluster für die Polyketidbiosynthese in Streptomyces und anderen Mikroorganismen isoliert und sequenziert werden, einschließlich beispielsweise denjenigen für den Polyether Monensin ( WO 01/68867 ), das Polyen Nystatin ( WO 01/59126 ) und für Rapamycin (Schwecke et al., 1995).
Polyketide werden über wiederholte Kondensation von Bausteinen, die eine Carbonsäurefunktion enthalten, synthetisiert. Dies führt in den einzelnen Verfahrensschritten jeweils zur Bildung einer neuen β-Keto-Funktion sowie einer α-Seitenkettenverzweigung in die wachsende Kette. Die strukturelle Unterschiedlichkeit von Polyketiden rührt von einer Reihe von Aspekten ihres Biosynthesewegs her, einschließlich: den vielfältigen Startereinheiten, die bei ihrer Biosynthese genutzt werden können, der unterschiedlichen Polyketidkettenlängen, die möglich sind; der verschiedenen α-Seitenketten, die entweder während oder nach Zusammenbau der Polyketidkette eingeführt werden; der verschiedenen β-Substitutionen, die während oder nach Zusammenbau der Polyketidkette eingeführt werden können; des unterschiedlichen Prozessierungsgrads, den die β-Ketogruppen durchlaufen können (Keto, Hydroxyl, Enoyl und Methylen); und der verschiedenen Stereochemiearten, die an den α- und β-Zentren möglich sind.
Die Synthese von Polyketiden wird von einem Enzym oder von einem Enzymkomplex mit der Bezeichnung Polyketidsynthase (PKS) in ähnlicher Weise wie die der Fettsäurebiosynthese katalysiert. Dabei fallen die PKS von Streptomyces und verwandten Gattungen in drei Hauptkategorien: Typ-I, Typ-II und Typ-III. Bei den PKS vom Typ-III handelt es sich um kleine Proteine, die mit pflanzlichen Chalconsynthasen verwandt sind und die erst kürzlich entdeckt wurden (Moore & Hopke, 2000). Typ-III-Systeme wurden mit der Biosynthese einer geringen Anzahl sekundärer Metabolite in Verbindung gebracht, doch dürften im allgemeineren Sinne an der Biosynthese löslicher Pigmente beteiligt sein (Cortes et al., 2002). Die Typ-II-PKS bestehen aus mehreren monofunktionellen Proteinen, die als Multipolypeptidkomplex wirken. Einfache aromatische Polyketide, wie beispielsweise Actinorhodin, werden über mehrere Runden Kettenzusammenbau gebildet, wobei letztere iterativ auf einem Satz von Typ-II-PKS-Enzymen erfolgen, die von einem Satz PKS-Genen codiert werden (Hopwood, 1997). Bei den Typ-I-PKS handelt es sich um Multifunktionsproteine, die für die Synthese komplexerer Polyketide, wie beispielsweise Erythromycin und Rapamycin, benötigt werden. Als Schwerpunkt dieses Patents wird die Organisation und Funktion von Typ-I-PKS nachfolgend ausführlich beschrieben:
Typ-I-PKS sind in Form von Modulen organisiert, wodurch jedes Modul aus mehreren katalytischen „Domänen" besteht, die zur Durchführung einer Runde Kettenzusammenbau benötigt werden (Staunton & Wilkinson, 1997). Im allgemeinen enthält eine modulare PKS die korrekte Anzahl von Modulen (Ladungs- plus Verlängerungsmodulen) zur Auswahl und Kondensierung der korrekten Anzahl an Ladungs- und Verlängerungseinheiten. So besteht beispielsweise die Erythromycin-PKS aus 7 Modulen (einem Ladungsmodul und sechs Verlängerungsmodulen) zur Auswahl und Kondensation der einen Startereinheit und sechs Verlängerungseinheiten, die für die Biosynthese der Erythromycinvorstufe 6-Desoxyerythronolid B benötigt werden. Somit besteht eine eins-zu-eins-Beziehung zwischen der Anzahl der in der PKS vorhandenen Module und der Anzahl eingebauter Einheiten. Diese eins-zu-eins-Beziehung wird als „Colinearität" beschrieben.
Der Begriff „Verlängerungsmodul", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf den Satz zusammenhängender Domänen, und zwar von der β-Ketoacyl-Acylträgerproteinsynthase (KS)-Domäne bis zur nächsten Acylträgerprotein (ACP)-Domäne, womit ein Polyketidkettenverlängerungszyklus bewerkstelligt wird. Der Begriff „Ladungsmodul", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf jede Gruppe aufeinanderfolgender Domänen, mit der die Beladung der PKS mit der Startereinheit bewerkstelligt und diese somit für die KS-Domäne des ersten Verlängerungsmoduls verfügbar gemacht wird. Neben der Kondensation der nächsten Verlängerungscarbonsäureeinheit (bzw. Ketideinheit) an die wachsende Polyketidkette, die von der katalytischen Aktivität der essentiellen KS-Domäne durchgeführt wird, können Module von Typ-I-PKS auch Domänen mit β-Ketoreduktase (KR)-, Dehydratase (DH)- und Enoylreduktase (ER)-Aktivitäten enthalten, die für die weitere Prozessierung der neu gebildeten β-Ketogruppen während der Kettenverlängerung verantwortlich sind. Die in jedem Modul vorhandenen Acyltransferase (AT)- und ACP-Domänen sind für die Wahl der Verlängerungseinheit bzw. die Anbindung der wachsenden Kette während ihres Wegs auf der PKS verantwortlich. Die AT-Domänen einer modularen PKS können auch als diskrete Proteine angetroffen werden (Cheng et al., 2003). Die vollständige Polyketidkette wird im allgemeinen von den PKS durch die Wirkung einer terminalen Thioesterase (TE)-Domäne freigesetzt, die ebenso allgemein an der Cyclisierung (Lactonisierung) des Endprodukts beteiligt ist. Dabei werden auch andere Kettenterminations-/Cyclisierungsstrategien eingesetzt, wie beispielsweise die zur Addition eines Aminosäurerests und die Makrolactambildung, wie sie für Rapamycin beobachtet wird (Schwecke et al., 1995), für die Macrolactambildung wie bei Rifamycin (August et al., 1998) sowie für den Aminosäureeinbau mit anschließender reduktiver Eliminierung wie bei der Myxalamidbiosynthese (Silakowski et al., 2001). Zusammenfassend gibt es für jeden nacheinander erfolgenden katalytischen Schritt, der während der Biosynthese auf der PKS stattfindet, jeweils eine enzymatische Domäne, wobei diese Domänen in einer definierten Abfolge verwendet werden, die von deren Lokalisierung im Protein und der von ihnen durchgeführten bestimmten Funktion abhängt. Dieser Mechanismus wird „prozessiv" genannt.
Die modulare Anordnung der Typ-I-PKS wurde zuerst durch Mutation der Erythromycin-PKS (auch unter dem Namen 6-Desoxyerythronolid-B-Synthase, DEBS bekannt) über eine im Leseraster erfolgte Deletion eines Bereichs der KR-Domäne von Modul 5 bestätigt (Donadio et al., 1991). Dies führte zur Produktion der Erythromicinanaloge 5,6-Didesoxy-3-α-mycarosyl-5-oxoerythronolid B und 5,6-Didesoxy-5-oxoerythronolid B, und zwar aufgrund der Unfähigkeit der mutierten KR-Domäne, die β-Ketogruppe 5 in diesem Schritt der prozessiven Biosynthese zu reduzieren. Gleichfalls führte eine Änderung der Reste des aktiven Zentrums in der ER-Domäne von Modul 4 von DEBS2 durch gentechnische Manipulation der entsprechenden PKS-codierenden DNA und ihrer Einführung in Saccharopolyspora erythraea zur Produktion von 6,7-Anhydroerythromycin C (Donadio et al., 1993). Darüber hinaus wurde die Länge der von DEBS gebildeten Polyketidkette durch die spezifische Relokalisierung der TE-Domäne von DEBS3 an das Ende von DEBS1 verändert; dabei wurde das erwartete Triketidlactonprodukt in guter Ausbeute produziert (Cortés et al., 1995). Es sollte hier angemerkt werden, daß die beschriebenen Änderungen eine Modifikation durch Sequenzdeletion oder durch sequenzspezifische Inaktivierung oder durch das alternative Nebeneinanderstellen von DNA-Sequenz aus dem gleichen PKS-Cluster beinhaltete (d.h. diese Änderungen werden als „homologe Änderungen" betrachtet). Andere derartige „homologe" Änderungen der Erythromycin-PKS sind in der WO 93/13663 beschrieben.
Die modulare Organisation von Typ-I-PKS-Genen bietet sich für die Manipulation dieser Gene zur Herstellung veränderter Polyketidstrukturen an. Die Typ-I-PKS repräsentieren ein Fließband für die Polyketidbiosynthese, das sich über die Änderung der Anzahl der Module, die Änderung ihrer Spezifitäten gegenüber unterschiedlichen Carbonsäurestartereinheiten und Verlängerungseinheiten, durch Inaktivierung, Mutation, Abtrennen, Austauschen oder Inserieren von Domänen mit unterschiedlichen Aktivitäten und Spezifitäten sowie die Veränderung der Ketten- oder Ringgröße durch die Umgruppierung von Terminations- oder Cyclisierungsdomänen manipulieren läßt (Staunton & Wilkinson, 1997).
In der WO 98/01546 ist die Herstellung hybrider PKS- Genkonstruktionen beschrieben, wobei heterologe DNA eingebaut wird. In der WO 98/01546 sind Verfahren zur Erzeugung hybrider PKS beschrieben, bei denen durch den Austausch der nativen Gene gegen für heterologe Module, Submodule oder Domänen codierende Gene neuartige Polyketide mit veränderten Strukturen erzeugt werden. Insbesondere kann beispielsweise die native AT-Domäne der Erythromycin-PKS gegen die AT-Domänen heterologe DNA aus der Papamycin- oder Monensin-PKS ausgetauscht werden, um neuartige Polyketide mit veränderter Alkylverzweigung zu erzeugen. Ein solcher AT-Domänenaustausch stellte das erste Beispiel für die Herstellung einer wirklich hybriden PKS dar (Olynyk et al., 1996). Ebenso wird in der WO 98/01546 in allgemeiner Form die Herstellung hybrider PKS-Konstruktionen beschrieben, die ein Lademodul und mindestens ein Verlängerungsmodul umfassen. Dabei wird insbesondere die Konstruktion einer hybriden PKS-Genkonstruktion durch Aufpfropfen des eine breite Spezifität aufweisenden Lademoduls für die Avermectin produzierende PKS auf das erste Protein der Erythromycin-PKS (DEBS1) anstelle des normalen Lademoduls beschrieben (siehe auch Marsden et al., 1998). Weitere Beispiele, bei denen substratspezifische Lademodulaustausche stattfinden, wurden ebenso beschrieben ( WO 00/00618 ; US 5876991 ; Kuhstoss et al., 1996). In der WO 00/01827 sind Verfahren zur Variierung der β-Keto-Prozessierungsfähigkeit eines PKS-Moduls über die Fähigkeit zum Austausch von „reduktiven Loops", d.h. die Fähigkeit zur Veränderung der Anzahl und Art der Ketoreduktase-, Dehydratase- und Enoylreduktasedomänen innerhalb eines Moduls auf schnelle und kombinatorische Weise, beschrieben. Zusätzlich zur Änderung des Niveaus der β-Ketogruppenprozessierung können solche Änderungen auch zu Änderungen der Stereochemie der auf diese Weise von den veränderten Modulen gebildeten α-Alkyl- und β-Hydroxylgruppen führen.
Zwar arbeiten modulare PKS „normalerweise", wie oben beschrieben in colinearer und prozessiver Weise, doch gibt es Beispiele für eine Abweichung von diesem Arbeitsmodus, die beschrieben sind und nachfolgend erörtert werden.
Der Picromycin-PKS-Gencluster in Streptomyces ist verantwortlich für die Biosynthese sowohl von Picromycin (einem 14-gliedrigen Heptaketid-Macrolid) als auch Methymycin (einem 12-gliedrigen Hexaketid-Macrolid) verantwortlich (Xue et al., 1998). Die Fähigkeit einer einzigen PKS zur Produktion von zwei verwandten Macroliden unterschiedlicher Ringgröße rührt von der alternativen Expression des finalen PKS-Gens pikA4 her (Xue & Sherman, 2000). Findet eine „normale" Expression statt und wird das Vollängen-PikA4 gebildet, so wird eine sechste Verlängerungseinheit eingebaut und das Picromycinaglycon produziert; findet die alternative Expression statt und wird dabei eine N-terminal verkürzte Form von PikA4 produziert, so wird keine sechste Verlängerungseinheit eingebaut und die wachsende Polyketidkette direkt an die TE-Domäne weitergeleitet, was zur Bildung des Methymycinaglycons führt. Somit erfolgt eine Störung der Colinearität und die Bildung eines „ringverengten" Produkts. Die biochemische Basis für dieses Phänomen wurde untersucht, wobei gezeigt werden konnte, daß es sich dabei um eine Übertragung von ACP5 auf ACP6 handelt, wobei die covalente Anbindung an die dazwischen liegende KS6-Domäne fehlt; eine solche Störung der Colinearität ist als „Skipping" bezeichnet worden (Geck et al., 2002).
Ebenso wurde beobachtet, daß Skipping bei der Interpolation eines zusätzlichen Verlängerungsmoduls aus der Rapamycin-PKS in die Erythromycin-PKS zur Umwandlung der natürlichen Heptaketid produzierenden PKS in eine Oktaketid produzierende PKS auftrat (Rowe et al., 2001). Zwar wurde dabei das erwartete Oktaketid, 16-gliedrige Macrolid produziert, doch handelt es sich bei dem Hauptprodukt um das normale Heptaketidprodukt 6-Desoxyerythronolid. Man glaubt, daß dieses „Skipping" des interpolierten Moduls aufgrund der Tatsache erfolgt, daß das interpolierte Modul gelegentlich als ein „Shuttle" fungiert und die wachsende Kette von dem vorhergehenden Modul an das folgende nachgeschaltete Modul weiterleitet, ohne daß dabei eine Kettenverlängerungsrunde durchgeführt wird. Später konnte gezeigt werden, daß die ACP-Domäne des interpolierten Moduls für die Weiterleitung der wachsenden Polyketidkette von der vorhergehenden ACP-Domäne und dessen Weiterleitung an die KS-Domäne des folgenden Moduls während des Skipping essentiell ist (Thomas et al., 2002), einem Mechanismus, der dem für die Methymycinbiosynthese oben beschriebenen Mechanismus ähnlich ist. Es wird gezeigt, daß das Skipping ohne das Nukleophil des aktiven Zentrums der KS-Domäne stattfinden kann. Es wurde ein ringverengtes („skipped") Nemadectin (ein antiparasitäres Macrolid) aus einer Mutante eines Streptomyces-Bodenisolats, die durch chemische Mutation modifiziert wurde, beschrieben (Rudd et al., 1990); die Biosynthese des natürlichen PKS-Produkts wurde dabei beseitigt.
Auf andere Art und Weise weichen modulare PKS von einer colinearen Arbeitsweise durch die iterative Arbeitsweise von Modulen ab. So scheint beispielsweise das Modul 4 der Erythromycin-PKS iterativ auf einem niedrigen Niveau zu arbeiten, so daß ein mit 6-Desoxyerythronolid B verwandtes ringerweitertes 16-gliedriges Oktaketid-Macrolid produziert wird (Wilkinson et al., 2000). Die Fähigkeit der Erythromycin-PKS, auf diese Weise zu arbeiten, ist als „Stuttering" bezeichnet worden. Das „Stuttering" der Erythromycin-PKS wird dabei als anomaler Vorgang betrachtet, da die Produkte dieses Stuttering mit geringer Ausbeute gebildet werden und es sich bei dem Hauptprodukt der Erythromycin-PKS um das normale, durch colineare Arbeitsweise gebildete Heptaketid 6-Desoxyerythronolid B handelt. Es wurden auch Produkte, die sowohl durch Stuttering als auch durch Skipping gebildet zu werden scheinen, als Nebenkomponenten aus den Epothilonproduzenten Sorangium cellulosum beschrieben (Hardt et al., 2001). Der Stigmatellin-Biosynthesecluster aus Stigmatella aurantiaca codiert für eine PKS, die 10 Module (ein Lade- und neun Verlängerungsmodule) umfaßt (Galtatzis et al., 2002); allerdings wird auf der Grundlage von Ergebnissen aus der Strukturaufklärung sowie des Zufütterns von mit stabilen Isotopen markierten Substraten Stigmatellin aus 11 modularen abgeleiteten Einheiten gebildet. Somit scheint eines der Stigmatellin-PKS-Module (zweimal) iterativ zu arbeiten.
Nach Anmelden der Priorität der vorliegenden Erfindung wurde inzwischen die Sequenz der für die Biosynthese des Macrolids Lankacidin durch Streptomyces rochel verantwortlichen PKS beschrieben (Mochizuki et al., 2003). Diese PKS scheint ebenso im Vergleich zur Anzahl der für die Lankacidinbiosynthese benötigten Verlängerungszyklen zu wenige Module zu enthalten, obwohl der Mechanismus, mit dem diese erfolgen würde, nicht klar ist.
Zusätzliche strukturelle Unterschiedlichkeit läßt sich über die Modifikation von Polyketiden mit anderen Enzymen als der PKS erzeugen, und zwar entweder während des Kettenzusammenbauvorgangs, wie es während der Biosynthese einiger Ansamycine beobachtet wird (Floss, 2001), oder nach dem Kettenzusammenbauvorgang im Anschluß an die Freisetzung von der PKS. Zu solchen nicht durch PKS vermittelten Reaktionen können, ohne darauf beschränkt zu sein, die folgenden gezählt werden: Reduktion, Oxidation, Hydroxylierung, Acylierung, Alkylierung, Aminierung, Decarboxylierung, Dehydratisierung, Doppelbindungsisomerisierung/-verschiebung, Cyclisierung, Ringspaltung, Konjugation, Glycosylierung, reduktive Eliminierung und alle Kombinationen daraus. Finden diese Reaktionen nach dem Kettenzusammenbau statt, so werden sie als Post-PKS- bzw. „Tailoring"-[etwa: „Zuschneide„]-Schritte bezeichnet. Derartige Tailoring-Schritte sind im allgemeinen, jedoch nicht immer, für die Ausstattung des Polyketidnaturprodukts mit biologischer Aktivität essentiell.
Zusätzlich läßt sich die auf dem Biosyntheseweg erhältliche strukturelle Verschiedenheit der Polyketide weiter durch die Verwendung definierter heterologer Post-PKS-Tailoring-Enzyme ebenso wie durch die Verwendung von Enzymen, die das natürliche Polyketid naturgemäß modifizieren, verbessern (Gaisser et al., 2000). In der WO 01/79520 ist die heterologe Modifikation von Polyketid-Macrolidstrukturen über Glycosylierung, Epoxidierung, Hydroxylierung und Methylierung beschrieben. Die Fähigkeit zur Erzeugung von Analogen der landwirtschaftlichen Verbindung Spinosyn durch Glycosylierung mit alternativen Desoxyhexosesubstituenten ist beschrieben (Gaisser et al., 2002).
Bei Borrelidin 1 (1) handelt es sich um ein 18-gliedriges Macrolid, das von mehreren Bakterienstämmen, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, Streptomyces rochel ATCC23956, Streptomyces parvulus Tü113 und Streptomyces parvulus Tü4055, produziert wird. Hier wird gezeigt, daß Borrelidin sich von einer trans-Cyclopentan-1,2-dicarbonsäure-Startersäure, drei Malonyl-CoA- und fünf Methylmalonyl-CoA-Verlängerungseinheiten herleitet (siehe 2). Von der auf der Kristallstruktur beruhenden und kürzlich durch Gesamtsynthese bestätigten absoluten Stereochemie von Borrelidin her wird als die tatsächliche Startersäure trans-Cyclopentan-(1R,2R)-dicarbonsäure vorhergesagt. Nach der Zuführung von mit stabilen Isotopen markierten Acetat- und Propionatsubstraten isoliertes Borrelidin zeigte eindeutig den erwarteten Einbau dieser Bausteine; darüber hinaus konnte in der vorliegenden Anmeldung demonstriert werden, daß die Zuführung von trans-Cyclopentan-1,2-dicarbonsäure ausreichte, um die Borrelidinbiosynthese in Mutanten zu reetablieren, bei denen spezifische Gene, von denen vermutet wird, daß sie an der Bildung der Startereinheit beteiligt sind, unterbrochen worden waren. Borrelidin enthält eine an der C12-Stellung gebundene Nitrilgruppe, von der hier gezeigt wird, daß sie durch die Aktivität von auf eine in dieser Stellung vorliegende, von Methylmalonyl-CoA abgeleitete Methylverzweigung wirkenden Tailoring-Enzymen entsteht. Die grobe Struktur von Borrelidin wurde zuerst 1967 aufgeklärt (Keller-Scheirlein, 1967) und wurde anschließend durch ausführliche NMR-Analyse verfeinert (Kuo et al., 1989). Die absolute Konfiguration von Borrelidin wurde durch Röntgenkristallographie bestätigt (Anderson et al., 1989). Seine gleichzeitige Identität als Antibiotikum Treponemycin wurde verifiziert (Maehr & Evans, 1987).
Die Synthese von Fragmenten der Borrelidinstruktur wurde von mehreren Gruppen beschrieben, wobei seit dem Anmelden der Priorität der vorliegenden Anmeldung über zwei unabhängige Gesamtsynthesen von Borrelidin berichtet wurde (Hanessian et al., 2003; Duffey et al., 2003).
Borrelidin wurde zuerst aufgrund seiner antibakteriellen Aktivität entdeckt (Berger et al., 1949), obwohl sich diese antibakterielle Aktivität nur" auf eine beschränkte Anzahl von Mikrokokken erstreckt und gegen keine der allgemeinen Testbakterien nachgewiesen wird. Die Wirkungsweise in darauf ansprechenden Mikroorganismen beinhaltet die selektive Hemmung von Threonyl-tRNA-Synthetase (Paetz & Nass, 1973). Andere Aktivitäten gegen Spirochäten der Gattung Treponema (Singh et al., 1985; US 4,759,928 ), gegen Viren (Dickinson et al., 1965), Verwendungen zur Bekämpfung von tierischen Schädlingen und Unkraut ( DE 3607287 ) sowie die Verwendung als landwirtschaftliches Fungizid ( DE 19835669 ; US 6,193,964 ) wurden beschrieben. Darüber hinaus wurde seit dem Anmelden der Priorität der vorliegenden Anmeldung berichtet, daß Borrelidin Antimalariaaktivität gegen wirkstoffresistente Plasmodium falciparum-Stämme besitzt (Otoguro et al., 2003). Von allen diesen Berichten erwähnten lediglich zwei überhaupt synthetisch modifizierte Derivate. Dabei beschreibt der erste Gereicht den Benzylester und sein bis-O-(4-Nitrobenzoyl)-Derivat (Berger et al., 1949). Der zweite Bericht beschreibt den Borrelidinmethylester, das Methylester-bis-O-Acetylderivat sowie das Methylester-Δ_14-15-dihydro- , Δ_14-15,12-13-tetrahydro- und das Δ_14-15,12-13-tetrahydro-C12-amino-Derivat (Anderton & Rickards, 1965). Für keine dieser Verbindungen wurde eine biologische Aktivität beschrieben.
Von besonderem Interesse ist die kürzlich offenbarte Entdeckung, daß Borrelidin anti-Angiogenese-Aktivität zeigt (Wakabayashi et al., 1997). Bei der Angiogenese handelt es sich um den Vorgang der Bildung neuer Blutgefäße. Die Angiogenese findet nur örtlich und transient in Erwachsenen statt und ist dabei beispielsweise an der Reparatur nach örtlichem Trauma sowie am weiblichen Fortpflanzungszyklus beteiligt. Sie wurde als eine Schlüsselkomponente bei mehreren krankhaften Vorgängen, einschließlich Krebs, rheumatoider Arthritis und diabetischer Retinopathie, etabliert. Ihre Wichtigkeit für die Fähigkeit von Tumoren, über einen Durchmesser von 1-2 cm hinaus zu wachsen, wurde von Folkman (Folkman, 1986) festgestellt und wird durch die Reaktion des Tumors auf Hypoxie hervorgerufen. Hinsichtlich ihrer nachgeschalteten Folgen handelt es sich bei der Angiogenese meistens um einen vom Wirt stammenden Vorgang, so daß eine Hemmung der Angiogenese ein signifikantes Potential bei der Behandlung von Krebserkrankungen bietet, wobei die Hürden für andere therapeutische Antikrebsmodalitäten, wie beispielsweise die Verschiedenheit von Krebsarten und Arzneistoffresistenz vermieden werden (Matter, 2001). Von zusätzlichem Interesse ist dabei, daß in neueren Veröffentlichungen die funktionelle Beteiligung von Tyrosinyl- und Tryptophanyl-tRNA-Synthetasen bei der Regulation der Angiogenese beschrieben wurden (Wakasugi et al., 2002; Otani et al., 2002)
Im Rattenaortamatrixkulturmodell der Angiogenese zeigt Borrelidin einen wirksamen Angiogenese-Hemmeffekt und verursacht ebenso das Aufbrechen gebildeter Kapillarröhrchen in dosisabhängiger Weise durch Induzieren der Apoptose der kapillarbildenden Zellen (Wakabayashi et al., 1997). Dabei wurde die Kapillarröhrchenbildung durch Borrelidin mit einem IC₅₀-Wert von 0,4 ng/ml (0,8 nM) gehemmt. In der gleichen Untersuchung konnte gezeigt werden, daß Borrelidin antiproliferative Aktivität gegenüber HUVEG (Human Umbilical Vein Endothelial Cells)-Zellen in einem Zellwachstumstest besitzt; dabei wurde der IC₅₀-Wert mit 6 ng/ml gemessen, was 15mal schwächer ist als die im gleichen Medium gemessene anti-Angiogenese-Aktivität. Es konnte gezeigt werden, daß diese antiproliferative Aktivität von Borrelidin allgemein gegenüber verschiedenen Zellinien besteht. Zusätzlich zu diesen Daten wurde von den Autoren berichtet, daß Borrelidin tRNA-Synthetase und die Proteinsynthese in den kultivierten Rattenzellen hemmt; allerdings lag der IC₅₀-Wert für die anti-Angiogenese-Aktivität (0,4 ng/ml) um das 50fache unterhalb dem für die Hemmung der Proteinsynthese angegebenen Wert (20 ng/ml), was auf unterschiedliche Aktivitäten der Verbindung hindeutet.
Ebenso zeigt Borrelidin eine wirksame Hemmung der Angiogenese in vivo bei Verwendung des dorsalen Maus-Luftsackmodells (Funahashi et al., 1999), bei dem die VEGF-induzierte Angiogenese untersucht wird und das ein ausgezeichnetes Modell für die Untersuchung der Tumor-Angiogenese darstellt. Borrelidin wurde in einer Dosis von 1,8 mg/kg durch intraperetoniale Injektion verabreicht, wobei gezeigt wurde, daß dadurch die durch WiDr-Zellen induzierte Zunahme des Gefäßvolumens in signifikanter Weise reduziert wurde, und zwar in einem höheren Ausmaß als durch TNP-470, bei dem es sich um einen synthetischen Angiogeneseinhibitor in klinischen Versuchen handelt. Durch ausführliche Kontrollen wurde verifiziert, daß diese Daten für die Angiogenesehemmung und nicht die Hemmung des Wachstums der Tumorzellen gelten. Ebenso konnte von den Autoren gezeigt werden, daß Borrelidin bei der Hemmung der Bildung spontaner Lungenmetastasen von B16-BL6-Melanomzellen in der gleichen Dosierung wirksam ist, indem die an deren Bildung beteiligten angiogenen Prozesse gehemmt werden.
JP 9-227,549 und JP 8-173,167 bestätigen, daß Borrelidin gegen WiDr-Zellinien von menschlichem Kolonkarzinom und auch gegen PC-3-Zellinien von menschlichem Prostatakrebs wirksam ist. In der JP 9-227,549 wird die Produktion von Borrelidin durch Streptomyces rochel Mer-N7167 (Ferm P-14670) sowie seine Isolierung aus der erhaltenen Fermentationskultur beschrieben. Neben Borrelidin 1 wurden 12-Desnitril-12-carboxylborrelidin 2 (vermutlich ein Biosynthesezwischenprodukt oder Shunt-Metabolit), 10-Desmethylborrelidin 3 (vermutlich ein sich aus dem Fehleinbau einer alternativen Malonyl-CoA-Verlängerungseinheit in Modul 4 der Borrelidin-PKS ergebendes Biosyntheseanalog), 11-Epiborrelidin 4 sowie das C14,C15-cis-Borrelidinanalog 5 beschrieben (siehe 1). Somit sind in der JP 9-227,549 Borrelidin und Borrelidinanaloge angegeben, bei denen eine Nitril- oder Carboxylgruppe an das C12 des Kohlenstoffgerüsts sowie ein Wasserstoffatom oder ein niedere Alkylgruppe an das C10 des Kohlenstoffgerüsts gebunden ist.
Aus der WO 01/09113 ist die Herstellung von Borrelidinanalogen bekannt, die einer synthetischen Modifikation an der Carbonsäuregruppierung des Cyclopentanrings unterzogen wurden. Die Aktivität dieser Verbindungen wurde unter Verwendung von Endothelzellenproliferations- und Endothelkapillarbildungstests in ähnlicher Weise wie oben beschrieben untersucht. Dabei wurde allgemein durch die Modifikation der Carboxylgruppierung die Selektivität für die Hemmung der Kapillarbildung verbessert: der Hauptgrund für diese Verbesserung der Selektivität liegt an einer Abnahme der Zellproliferationshemmaktivität, wohingegen die Kapillarbildungshemmakti vität in einem wesentlich geringeren Ausmaß verändert wurde. Insbesondere zeigte der Borrelidinmorpholinoethylester einen 60fachen Selektivitätsindex, das Borrelidinamid zeigte einen 37fachen Selektivitätsindex, der Borrelidin-(2-pyridyl)-ethylester einen 7,5fachen Selektivitätsindex und das Borrelidinmorpholinoethylamid einen 6fachen Selektivitätsindex, und zwar für die Kapillarbildungshemmaktivität gegenüber der Zellproliferation in bezug auf Borrelidin. Die Kapillarbildungshemmaktivität dieser und anderer Borrelidinderivate wurde unter Verwendung eines Mikrogefäßbildungstests verifiziert. Darüber hinaus wurde von den Autoren gezeigt, daß Borrelidin die Verbreitung metastatischer Knötchen nach Entfernen des Primärtumors bei Verwendung eines Lewis-Lungenadenokarzinommodells schwach hemmte. Allerdings wurde berichtet, daß das Borrelidin-(3-picolylamid)-Derivat die Zunahme von Mikrometastasen in Ratten nach intraperetonealer und ebenso bei per-os-Verabreichung in subtoxischen Dosierungen ganz beträchtlich hemmt. In ähnlicher Weise wurde bei Verwendung des Colon-38-Milz-Lebermodells die metastasenbildende Fähigkeit von in Mausmilz transplantierten Colon-Adenokarzinomzellen der Maus nach Behandlung mit einer subtoxischen Dosis dieses Borrelidinderivats beträchtlich reduziert. Durch diese Daten wurde die zuvor berichtete Fähigkeit von Borrelidin und seinen Derivaten zur Hemmung der Ausbildung von Metastasen bestätigt.
Borrelidin wurde ebenso als ein Inhibitor der cyclinabhängigen Kinase Cdc28/Cln2 aus Saccharomyces cerivisiae mit einem IC₅₀-Wert von 12 μg/ml (24 μM) identifiziert (Tsuchiya et al., 2001). Es konnte gezeigt werden, daß Borrelidin sowohl haploide als auch diploide Zellen in der späten G₁-Phase (zu einem vom α-Paarungspheromon nicht unterscheidbaren Zeitpunkt) arretiert, und zwar bei Konzentrationen, die sich auf die Proteinbiosynthese im ganzen nicht auswirken. Diese Daten wurden genommen, um darauf hinzuweisen, daß Borre lidin ein Potential als Leitverbindung bei der Entwicklung von Antitumormitteln aufweist.
Seit dem Anmelden der Priorität der vorliegenden Anmeldung wurden zwei weitere Berichte veröffentlicht, die sich mit der biologischen Aktivität von Borrelidin beschäftigen. Dabei deutet der erste Bericht an, daß die antiangiogenen Effekte des Borrelidin über bestimmte Wege vermittelt werden (Kawamura et al., 2003). Dabei wurde festgestellt, daß hohe Konzentrationen an Threonin die Fähigkeit des Borrelidin zur Hemmung sowohl der Kapillarröhrchenbildung im Rattenaortakulturmodell als auch der Proliferation von HUVEC-Zellen abschwächen; dabei war allerdings die Fähigkeit des Borrelidin zum Aufbrechen der gebildeten Kapillarröhrchen oder zur Induktion der Apoptose in HUVEC-Zellen nicht betroffen. Ebenso wurde festgestellt, daß Borrelidin Caspase-3 und Caspase-8 aktiviert, wobei Inhibitoren dieser beiden Substanzen die durch Borrelidin induzierte Apoptose in HUVEC-Zellen unterdrückten. In der zweiten Arbeit wurde das Verfahren der globalen Profilerstellung zellulärer mRNA verwendet, um einen Einblick in die Effekte von Borrelidin auf Saccharomyces cerecisiae zu gewähren (Eastwood und Schaus, 2003). Diese Analyse zeigte die Induktion von Enzymen der Aminosäurebiosynthese in zeitabhängiger Weise bei Behandlung mit Borrelidin, wobei ermittelt wurde, daß an der Induktion dieses Wegs der Transkriptionsfaktor GCN4 beteiligt ist.
Zusammenfassend richtet sich der Angiogenese-Hemmeffekt des Borrelidin auf die doppelten tumorbiologischen Effekte der Proliferation und Kapillarbildung. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, daß Borrelidin und Derivate davon die Verbreitung von Metastasen hemmen. Ebenso weist Borrelidin Indikationen für die Verwendung bei der Zellzyklusmodulation auf. Somit stellen Borrelidin und verwandte Verbindungen besonders attraktive Ziele für die Untersuchung als Therapeutika zur Behandlung von Tumorgeweben, und zwar entweder als Einzelmittel oder zur Verwendung als Begleitmittel für andere Therapien, dar. Darüber hinaus können sie zur Behandlung anderer Krankheiten, bei denen Angiogenese mit dem Krankheitsprozeß in Verbindung gebracht wird, verwendet werden, einschließlich, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, der folgenden Liste: rheumatoide Arthritis, Psoriasis, Atherosklerose, diabetische Retinopathie und verschiedene Augenerkrankungen.
KURZE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Durch die vorliegende Offenbarung wird die gesamte Nukleinsäuresequenz des für die Steuerung der Synthese des Polyketid-Macrolids Borrelidin in Streptomyces parvulus Tü4055 verantwortlichen Biosynthese-Genclusters bereitgestellt. Ebenso wird die Verwendung der gesamten oder eines Teils der klonierten DNA und der Nukleinsäuresequenzen davon beim spezifischen Nachweis anderer Polyketidbiosynthese-Gencluster, bei der gentechnischen Herstellung mutanter Stämme von Streptomyces parvulus und anderer geeigneter Wirtsstämme zur Produktion erhöhter Borrelidinniveaus oder zur Produktion modifizierter oder neuartiger Polyketide sowie von für PKS-Systeme zur Biosynthese modifizierter oder neuartiger Polyketide codierenden rekombinanten Genen bereitgestellt.
Die vollständige Nukleotidsequenz des Borrelidinbiosynthese-Genclusters aus Streptomyces parvulus Tü4055 ist in SEQ ID Nr.: 1 dargestellt. Ihre Organisation ist in 3 dargestellt und umfaßt Gene und offene Leseraster mit den folgenden, im weiteren Verlauf verwendeten Bezeichnungen: borA1, borA2, borA3, borA4, borA5, borA6, borB, borC, borD, borE, borF, borG, borH, borI, borJ, borK, borL, borM, borN, borO, orfB1, orfB2, orfB3, orfB4, orfB5, orfB6, orfB7, orfB8, orfB9, orfB10, orfB11, orfB12, orfB13, orfB14, orfB15, orfB16, orfB17, orfB18, orfB19, orfB20, orfB21 und orfB22.
Die vorgeschlagenen Funktionen der klonierten Gene sind in 4 (vorgeschlagene Biosynthese der Startereinheit), 5 (Organisation der Borrelidin-PKS und Biosynthese von prä-Borrelidin) und 6 (Einführung der C12-Nitrilgruppierung) sowie nachfolgend beschrieben.
Somit wird durch die vorliegende Offenbarung ein isoliertes Nukleinsäuremolekül bereitgestellt, umfassend:

(a) eine wie in SEQ ID Nr.: 1 dargestellte Nukleotidsequenz oder einen Teil oder ein Fragment davon; oder
(b) einen Nukleotidsequenz, bei der es sich um das Komplement der SEQ ID Nr.: 1 handelt, oder einen Teil oder ein Fragment davon; oder
(c) eine Nukleotidsequenz, die gegenüber einer codierenden Sequenz der SEQ ID Nr.: 1 degeneriert ist, oder einen Teil oder ein Fragment davon.

Der Begriff „Fragment", wie er hier verwendet wird, bezieht sich hinsichtlich Nukleotidsequenzen auf einen Abschnitt von Nukleinsäureresten, der eine Länge von wenigstens 10, vorzugsweise wenigstens 20, wenigstens 30, wenigstens 50, wenigstens 75, wenigstens 100, wenigstens 150 oder wenigstens 200 Nukleotiden aufweist. Als Teil oder Fragment der SEQ ID Nr.: 1 ist dabei die sich zwischen den Nukleotidpositionen 7603 und 59966 der SEQ ID Nr.: 1 erstreckende Sequenz bevorzugt.
Die Sequenz kann für eine für ein Polypeptid eines Polyketidbiosynthese-Genclusters codierende Sequenz oder einen Teil davon codieren oder dazu komplementär sein. Unter „einem Polypeptid eines Polyketidbiosynthese-Genclusters" versteht man dabei ein Polypeptid, das von einem oder mehreren offenen Leserastern eines Polyketidbiosynthese-Genclusters und insbesondere des Borrilidinbiosynthese-Genclusters codiert wird.
Bei einem Polyketidbiosynthese-Gencluster handelt es sich um ein DNA-Segment, das mehrere für Polypeptide mit Aktivität bei der Biosynthese einer Polyketid- oder Macrolidgruppierung codierende Gene umfaßt. Dabei ist dies nicht auf Komponenten der Polyketidsynthase (PKS), die unter anderem bei der Synthese des Polyketidrückrads und der reduktiven Prozessierung von Seitengruppen eine Funktion ausüben, beschränkt, sondern umfaßt auch Polypeptide mit Hilfsfunktionen bei der Synthese des Polyketids. Somit können Polypeptide des Biosynthese-Genclusters auch bei der Modifikation des Macrolidrings oder der Polyketidkette (z.B. eine Reaktion bei der Bildung der C12-Nitrilgruppierung des Borrelidin katalysieren), bei der Synthese einer Vorläufer- oder Startereinheit für einen Polyketid- oder Macrolidgruppierung (z.B. eine Reaktion bei der Synthese der trans-Cyclopentan-1,2-dicarbonsäure-Startereinheit für die Borrelidin-PKS katalysieren oder für die Aktivierung solcher Moleküle als Coenzym-A-Thioester der Starter- und Verlängerungseinheiten der Kette verantwortlich sein), der regulatorischen Aktivität (z.B. Regulation der Expression der Gene oder Proteine, die an der Polyketid- oder Macrolidsynthese beteiligt sind), der Transporteraktivität (z.B. beim Transport von Substraten für die Polyketid- oder Macrolidgruppierung in die Zelle oder von Syntheseprodukten, wie beispielsweise des Polyketid- oder Macrolidmoleküls aus der Zelle) sowie bei der Verleihung einer Resistenz der produzierenden Zelle gegenüber den synthetisierten Produkten (z.B. über spezifische Bindung an das synthetisierte Molekül oder als Ersatz für andere endogene Proteine, an die das synthetisierte Molekül innerhalb oder außerhalb der Zelle binden kann) mitwirken.
Der Gencluster enthält auch nichtcodierende Bereiche, wie beispielsweise Promotoren und andere Transkriptionsregulationssequenzen, die mit den codierenden Bereichen des Genclusters in operativer Verknüpfung stehen. Dabei ist der Fachmann sehr wohl in der Lage, solche Elemente aufgrund der hier angegebenen Informationen zu identifizieren, wobei diese Elemente im Umfang der vorliegenden Offenbarung liegen.
In der SEQ ID Nr.: 1 vorliegende codierte Gene und offene Leseraster repräsentieren bevorzugte Teile oder Fragmente der SEQ ID Nr.: 1. So kann ein isoliertes Nukleinsäuremolekül eine Sequenz umfassen, die für ein Polypeptid aus einem Borrelidinbiosynthese-Gencluster codiert, wobei das Polypeptid eine aus der Gruppe der SEQ ID Nr.: 2 bis 43 und 113 ausgewählte Aminosäuresequenz aufweist.
In bevorzugten Ausführungsformen umfaßt die Nukleinsäuresequenz ein offenes Leseraster, das aus der folgenden Gruppe von offenen Leserastern der SEQ ID Nr.: 1 ausgewählt ist:
borA1, borA2, borA3, borA4, borA5, borA6, borB, borC, borD, borE, borF, borG, borH, borI, borJ, borK, borL, borM, borN, borO, orfB1, orfB2, orfB3, orfB4, orfB5, orfB6, orfB7, orfB8, orfB9, orfB10, orfB11, orfB12, orfB13a, orfB13b, orfB14, orfB15, orfB16, orfB17, orfB18, orfB19, orfB20, orfB21 und orfB22, wobei die offenen Leseraster von den Basen 16184*-18814, 18875-23590, 23686-34188, 34185*-39047, 39122*-45514, 45514-50742, 7603-8397c, 8397-9194c, 9244-9996c, 9993-11165c, 11162-11980c, 11992-13611c, 13608-15659*c, 50739*-52019, 52113-53477, 53486-54466, 54505-56176, 56181*-57098, 57112-57858, 57939-59966, 2-313 (unvollständig), 501*-3107, 3172-3810c, 3935-4924c, 5123-5953, 5961-6518*c, 6564*-7538, 60153-60533*c, 60620-61003, 61188'-61436, 61526-61738, 61767-62285c, 62750-63067c, 62586-62858c, 63155-65071c, 65374-65871, 65942-68305*c, 68290-68910*c, 69681-70436, 70445-71848, 71851-72957, 73037-73942 bzw. 73995-74534c der SEQ ID Nr.: 1 beschrieben sind.
In der obigen Liste bedeutet „c", daß das Gen von dem zu dem in der SEQ ID Nr.: 1 dargestellten strangkomple mentären Strang codiert wird. Die obigen offenen Leseraster repräsentieren jeweils das längste mögliche vorhandene offene Leseraster. Dabei passiert es manchmal, daß mehr als ein potentielles Startcodon identifiziert werden kann. Der Fachmann ist sich dessen bewußt und in der Lage, alternative mögliche Startcodons zu identifizieren. Diejenigen Gene, die mehr als ein mögliches Startcodon aufweisen, sind mit einem „*"-Symbol gekennzeichnet. In allen Sequenzen sind jeweils die von uns vermuteten Startcodons gekennzeichnet, doch ist dem Fachmann ersichtlich, daß die Möglichkeit besteht, aktives Protein unter Verwendung eines alternativen Startcodons zu erzeugen, wobei mit diesen alternativen Startcodons erzeugte Proteine auch als im Umfang der vorliegenden Offenbarung liegend betrachtet werden.
Es sollte hier festgehalten werden, daß eine Reihe dieser offenen Leseraster mit einem anderen Codon (GTG, CTG oder TTG) als dem eher normalen ATG-Startcodon beginnen. Es ist allgemein bekannt, daß in einigen Bakteriensystemen derartige Codons, die normalerweise Valin (GTG) oder Leucin (CTG, TTG) bezeichnen, als für Methionin am N-Terminus der Polypeptidkette codierende Startcodons gelesen werden können. In den hier bereitgestellten Aminosäuresequenzen (SEQ ID Nr.: 2 bis 43 und 113) sind solche Codons daher als Methionin übersetzt.
Ebenso werden Nukleinsäuremoleküle bereitgestellt, die Teile der hier identifizierten offenen Leseraster umfassen. So kann beispielsweise eine derartige Nukleinsäuresequenz eine oder mehrere von den hier identifizierten offenen Leserastern abgeleitete isolierte Domänen umfassen. Die für diese isolierten Teile der offenen Leseraster codierenden Polypeptide können eine unabhängige Aktivität, z.B. katalytische Aktivität, aufweisen. Insbesondere weisen die Polypeptide, aus denen die Borrelidin-PKS besteht, modulare Strukturen auf, bei denen individuelle Domänen bestimmte katalytische Aktivitäten, wie oben angegeben, aufweisen. So können alle diese Domänen jeweils allein oder in Kombination, mit anderen Polypeptiden aus der hier beschriebenen Borrelidin-PKS oder Domänen davon oder mit Polypeptiden von der PKS für andere Polyketide exprimiert werden. Insbesondere können diese Domänen jeweils gegen die äquivalenten Domänen entweder innerhalb der Borrelidin-PKS oder in anderen Polyketidsynthasen ausgetauscht werden, wobei zusätzlich äquivalente Domänen aus anderen PKS gegen Domänen innerhalb der Borrelidin-PKS ausgetauscht werden können. In diesem Zusammenhang umfaßt eine äquivalente Domäne Domänen, die die gleiche Art von Funktion aufweisen, sich jedoch beispielsweise hinsichtlich ihrer Spezifität unterscheiden, wobei zu den von der vorliegenden Offenbarung in Betracht gezogenen Austauschen beispielsweise der Austausch einer Malonyl-CoA-spezifischen AT-Domäne gegen eine Methylmalonyl-CoA-spezifische AT-Domäne oder der Austausch eines lediglich eine KR-Domäne enthaltenden reduktiven Loop gegen einen Loop mit KR, DH und ER gehört. In bevorzugten Ausführungsformen repräsentieren die exprimierten Domänen wenigstens ein PKS-Modul, wie nachfolgend beschrieben.
Der Begriff „PKS-Domäne", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf eine Polypeptidsequenz, die sich unabhängig vom Rest der PKS falten kann und eine einzige bestimmte enzymatische Aktivität oder andere Funktion in der Polyketid- oder Macrolidsynthese aufweist, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, β-Ketoacyl-Acylträgerprotein-Synthase (KS), Acylträgerprotein (ACP [Acyl Carrier Protein]), Acyltransferase (AT), β-Ketoreduktase (KR), Dehydratase (DH), Enoylreduktase (ER) oder terminale Thioesterase (TE).
Dementsprechend wird durch die Offenbarung ferner folgendes bereitgestellt:

(a) ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, umfassend eine Sequenz, die für eine aus AT0 und ACP0 ausgewählte PKS-Domäne codiert, wobei die Domänen durch die Aminosäuren 322-664 bzw. 694-763 der SEQ ID Nr.: 2 beschrieben sind. In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt die PKS-Domäne eine aus der aus den Basen 17147-18175 und 18263-18472 der SEQ ID Nr.: 1 bestehenden Gruppe ausgewählte Sequenz;
(b) ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, umfassend eine Sequenz, die für eine aus KS1, AT1, KR1 und ACP1 ausgewählte PKS-Domäne codiert, wobei die Domänen durch die Aminosäuren 34-459, 557-885, 1136-1379 bzw. 1419-1486 der SEQ ID Nr.: 3 beschrieben sind. In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt die PKS-Domäne eine aus der aus den Basen 18974-20251, 20543-21529, 22280-23011 und 23129-23332 der SEQ ID Nr.: 1 bestehenden Gruppe ausgewählte Sequenz;
(c) ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, umfassend eine Sequenz, die für eine aus KS2, AT2, DH2, KR2, ACP2, KS3, AT3, DH3, KR3 und ACP3 ausgewählte PKS-Domäne codiert, wobei die Domänen durch die Aminosäuren 34-459, 559-887, 903-1050, 1354-1597, 1628-1694, 1724-2149, 2245-2576, 2593-2734, 3060-3307 bzw. 3340-3406 der SEQ ID Nr.: 4 beschrieben sind. In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt die PKS-Domäne eine aus der aus den Basen 23785-25062, 25360-26346, 26392-26835, 27745-28476, 28567-28767, 28855-30132, 30418-31413, 31462-31887, 32863-33606 und 33703-33903 der SEQ ID Nr.: 1 bestehenden Gruppe ausgewählte Sequenz;
(d) ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, umfassend eine Sequenz, die für eine aus KS4, AT4, KR4, und ACP4 ausgewählte PKS-Domäne codiert, wobei die Domänen durch die Aminosäuren 34-459, 555-886, 1179-1423 bzw. 1459-1525 der SEQ ID Nr.: 5 beschrieben sind. In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt die PKS-Domäne eine aus der aus den Basen 34284-35561, 35847-36842, 37719-38453 und 38559-38759 der SEQ ID Nr.: 1 bestehenden Gruppe ausgewählte Sequenz;
(e) ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, umfassend eine Sequenz, die für eine aus KS5, AT5, DH5, ER5, KR5, und ACP5 ausgewählte PKS-Domäne codiert, wobei die Domänen durch die Aminosäuren 34-457, 553-888, 905-1046, 1401-1690, 1696-1942 bzw. 1975-2041 der SEQ ID Nr.: 6 beschrieben sind. In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt die PKS-Domäne eine aus der aus den Basen 39221-40492, 40778-41785, 41834-42259, 43322-44191, 44207-44947 und 45044-45255 der SEQ ID Nr.: 1 bestehenden Gruppe ausgewählte Sequenz;
(f) ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, umfassend eine Sequenz, die für eine aus KS6, AT6, KR6, ACP6 und TE ausgewählte PKS-Domäne codiert, wobei die Domänen durch die Aminosäuren 37-457, 555-883, 1101-1335, 1371-1437 bzw. 1461-1708 der SEQ ID Nr.: 7 beschrieben sind. In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt die PKS-Domäne eine aus der aus den Basen 45622-46884, 47176-48162, 48814-49518, 49624-49824 und 49894-50637 der SEQ ID Nr.: 1 bestehenden Gruppe ausgewählte Sequenz.

In einem weiteren Aspekt der Offenbarung wird ein isoliertes Nukleinsäuremolekül bereitgestellt, umfassend eine Sequenz, die für ein PKS-Modul codiert, wobei das Modul aus der aus den Aminosäuren 322-763 der SEQ ID Nr.: 2, 34-1486 der SEQ ID Nr.: 3, 34-1694 der SEQ ID Nr.: 4, 1724-3406 der SEQ ID Nr.: 4, 34-1525 der SEQ ID Nr.: 5, 34-2041 der SEQ ID Nr.: 6 und 37-1437 oder 1708 der SEQ ID Nr.: 7 bestehenden Gruppe ausgewählt ist. In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt das Modul eine aus der aus den Basen 17147-18472, 18974-23332, 23785-28767, 28855-33903, 34284-38759, 39221-45244, 45622-49824 oder 50637 der SEQ ID Nr.: 1 bestehenden Gruppe ausgewählte Sequenz.
Der Begriff „Modul", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf ein einzelnes Polypeptid, das mehrere PKS-Domänen umfaßt, die jeweils eine einzelne bestimmte enzymatische Aktivität in der Polyketid- oder Macrolitsynthese aufweisen, einschließlich, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, β-Ketoacyl-Acylträgerprotein-Synthase (KS), Acyltransferase (AT), Acylträgerprotein (ACP), β-Ketoreduktase (KR), Dehydratase (DH) oder Enoylreduktase (ER) oder terminale Thioesterase (TE). Eine Verlängerungsmodul umfaßt typischerweise eine KS-AT- und ACP-Domäne (obwohl einige modulare PKS ihre AT-Domänen als unabhängige Proteine codieren können). Ferner kann ein Verlängerungsmodul eine oder mehrere Domänen umfassen, die zur Reduktion einer β-Ketogruppe zu einer Hydroxylgruppe-, Enoyl- oder Methylengruppe (diese Gruppe von Domänen wird vorliegend als „reduktiver Loop" bezeichnet) fähig sind. So enthält ein einen reduktiven Loop umfassendes Modul typischerweise eine KR-Domäne, KR- und DH-Domänen oder KR-, DH- und ER-Domänen.
Eine PKS kann ferner eine TE-Domäne zur Durchführung einer Kettentermination und/oder Cyclisierung des Endprodukts umfassen oder als Alternative eine andere Funktionalität, von der man weiß, daß sie eine ähnliche Funktion durchführt, wie beispielsweise die für die Addition eines Aminosäurerests und die Macrolactambildung, wie sie für Rapamycin beobachtet wird (Schwecke et al, 1995), für die Macrolactambildung, wie bei Rifamycin (August et al., 1998) und für den Aminosäureausbau mit anschließender reduktiver Eliminierung, wie für die Myxalamid-Biosynthese (Silakowski et al., 2001), enthalten.
Durch die hier bereitgestellten Sequenzen werden Mittel zur Verfügung gestellt, mit denen die Polyketidsynthese manipuliert und/oder verstärkt wird. Somit wird ein Verfahren zur Modifizierung einer Ausgangspolyketidsynthase bereitgestellt, bei dem man eine Domäne aus einer Borrelidin-Polyketidsynthase oder einem Derivat davon, wie hier beschrieben, in einer die Ausgangspolyketidsynthase exprimierenden Wirtszelle so exprimiert, daß die Domäne in die Ausgangspolyketidsynthase eingebaut wird. Ferner wird ein Verfahren zur Modifikation einer Ausgangspolyketidsynthase bereitgestellt, bei dem man eine für eine Domäne aus einer Borrelidin-Polyketidsynthase codierenden Nukleinsäure oder ein Derivat davon in eine Wirtszelle einführt, wobei die Wirtszelle für die Ausgangspolyketidsynthase codierende Nukleinsäure enthält, so daß die Domäne bei ihrer Expression in die Ausgangspolyketidsynthase eingebaut wird. Die Borrelidin-PKS-Domäne kann dabei zusätzlich zu den nativen Domänen der Ausgangs-PKS inseriert werden oder eine native Ausgangsdomäne ersetzen. Typischerweise handelt es sich bei der Ausgangs-PKS um eine Typ-I-PKS.
Durch die vorliegende Offenbarung werden ferner Verfahren zur Modifikation einer Ausgangs-Borrelidin-PKS bereitgestellt. Dabei kann eine Donordomäne (z.B. aus einer Typ-I-PKS) in einer die Ausgangs-Borrelidin-PKS exprimierenden Wirtszelle exprimiert werden. Ferner wird ein Verfahren zur Modifikation einer Ausgangs-Borrelidin-Polyketidsynthase bereitgestellt, bei dem man eine für eine Domäne aus einer Donor-Polyketidsynthase codierende Nukleinsäure in eine Wirtszelle einführt, wobei die Wirtszelle für die Ausgangs-Borrelidin-Polyketidsynthase codierende Nukleinsäure enthält, so daß die Domäne bei ihrer Expression in die Ausgangs-Borrelidin-Polyketidsynthase eingebaut wird.
Zusätzlich oder als Alternative kann eine Domäne der Ausgangs-PKS deletiert oder sonst wie inaktiviert sein; beispielsweise kann eine Ausgangsdomäne einfach deletiert oder durch eine Domäne aus einer Donor-PKS er setzt werden, oder eine Domäne aus einer Donor-PKS kann an das Ausgangsmolekül addiert werden. Dabei kann bei einer Addition oder einem Austausch einer Domäne die Donordomäne aus der Ausgangssynthase oder aus einer anderen Synthase abgeleitet sein.
Diese Verfahren können zur Verstärkung der Biosynthese von Borrelidin, zur Herstellung neuer Borrelidinderivate oder Analoge oder anderer neuartiger Polyketid- oder Macrolidstrukturen verwendet werden. Dabei kann die Anzahl und Eigenschaft von Modulen im System verändert werden, um die Anzahl und Art der eingesetzten Verlängerungseinheiten sowie die verschiedenen Synthase-, Reduktase- und Dehydrataseaktivitäten, die die Struktur der Polyketidkette bestimmen, zu ändern. Solche Änderungen lassen sich durchführen, indem man die Reihenfolge der Module, die die PKS umfassen, verändert, Module, die die PKS umfassen, vervielfältigt oder entfernt, Module aus heterologen Quellen einführt oder diese verschiedenen Ansätze in gewisser Weise kombiniert.
Somit können Domänen oder Module der Borrelidin-PKS deletiert, vervielfältigt oder gegen andere Domänen oder Module aus der Borrelidin-PKS oder aus für die Synthese anderer Polyketide verantwortlichen PKS-Systemen (heterologen PKS-Systemen, insbesondere Typ-I-PKS-Systemen), die aus anderen Bakterienstämmen oder -spezies stammen können, getauscht werden. Als Alternative können Domänen oder Module aus der Borrelidin-PKS in heterologe PKS-Systeme eingeführt werden, um neuartige Polyketid- oder Macrolidmoleküle herzustellen. Ebenso können kombinatorische Module zwischen der Borrelidin-Polyketidsynthase und anderen Polyketidsynthasen getauscht werden, wobei sich diese kombinatorischen Module zwischen entsprechenden Domänen von zwei Modulen vom natürlichen Typ erstrecken, beispielsweise vom AT eines Moduls zum AT des nächsten Moduls.
So kann beispielsweise ein bestimmtes Verlängerungsmodul gegen ein Modul mit Spezifität für eine andere Verlängerungseinheit getauscht werden (wie z.B. in der WO 98/01571 und der WO 98/01546 beschrieben) oder so mutiert werden, daß es eine Spezifität oder Selektivität für eine andere Verlängerungseinheit zeigt, wie z.B. nachfolgend beschrieben. Zusätzlich oder als Alternative kann die Einführung, Deletion, das Tauschen oder die Mutation von Domänen oder Modulen, wie beispielsweise den für die Prozessierung einer gegebenen β-Ketogruppierung verantwortlichen Domänen KR, DH und ER, dazu verwendet werden, das Niveau der reduktiven Prozessierung einer Verlängerungseinheit während der Polyketidsynthese zu verändern. Derartige Änderungen können auch zu Änderungen in der Stereochemie der so durch geänderte Module gebildeten α-Alkyl- und β-Hydroxylgruppen führen. In einer bevorzugten Ausführungsform kann das BorA5-Modul in eine Ausgangs-PKS eingeführt werden, so daß damit eine iterative Addition von Verlängerungseinheiten an ein Polyketidrückgrat bereitgestellt wird, wobei z.B. die Ringgröße eines Macrolid-Polyketid relativ zu der von der Ausgangs-PKS natürlicherweise produzierten Ringgröße erweitert wird.
Bei dem Borrelidin-Lademodul handelt es sich um das erste identifizierte PKS-Lademodul, das eine Spezifität für eine alicyclische di-Carbonsäure-Startereinheit aufweist. So kann dieses Modul oder ein Derivat davon zur Einführung alicyclischer Startereinheiten in heterologe Polyketidsynthasen verwendet werden. Dies braucht nicht auf die Verwendung der normalerweise als Borrelidin-Startereinheit verwendeten trans-Cyclopentan-1,2,-dicarbonsäure beschränkt zu sein. Ebenso wird hier gezeigt, daß das Borrelidin-Lademodul zur Steuerung des Einbaus anderer Startereinheiten, einschließlich trans-Cyclobutan-1,2-dicarbonsäure, 2,3-Methylbernsteinsäure und 2-Methylbernsteinsäure, fähig ist. Die Borrelidin-Startereinheit kann auch in einer Borrelidin produzierenden Zelle modifiziert oder von einem heterologen Lademodul ersetzt werden, so daß alternative Startereinheiten in den Borrelidin-Syntheseweg eingeführt werden.
Die Position des Lademoduls der PKS kann gewählt werden (z.B. indem es an einen bestimmten Ort innerhalb der PKS fusioniert wird), um die Ringgröße der erhaltenen Polyketid/Macrolid-Moleküle zu kontrollieren.
Die AT-Domänen, die die Carbonsäure-CoA-Thioester-Verlängerungseinheiten bestimmen, können deletiert, modifiziert oder ersetzt werden. Ebenso können die ACP-Domänen deletiert, modifiziert oder ersetzt werden. Darüber hinaus können Domänen, die normalerweise nicht in der Borrelidin-PKS vorhanden sind, sich jedoch in anderen modularen PKS- und/oder gemischten PKS/NRPS-Systemen finden, inseriert werden. Hierzu gehören beispielsweise, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein: O-Methyltransferase-Domänen, C-Methyltransferase-Domänen, Epimerisierungsdomänen, Monooxygenasedomänen und Dehydrogenasedomänen, Aminotransferasedomänen und nichtribosomale Peptidsynthasedomänen.
Ferner kann die Thioesterasedomäne der Borrelidin-PKS verändert oder umgestellt werden (z.B. an einen gewählte Ort innerhalb der PKS fusioniert werden), um ihre Spezifität zu ändern und/oder Polyketid/Macrolid-Moleküle mit einer gewählten Ringgröße freizusetzen. Als Alternative können heterologe Thioesterasedomänen in die Borrelidin-PKS inseriert werden, so daß Moleküle mit geänderter Ringgröße relativ zum normalerweise von der Ausgangs-PKS produzierten Molekül produziert werden oder eine freie Säure produziert wird.
In noch einer weiteren Alternative können die aminosäureeinbauenden und macrolactambildenden Domänen aus gemischten NRPS/PKS-Systemen, wie beispielsweise dem für Rapamycin oder für verwandte Systeme, wie beispielsweise für die Rapamycin-Biosynthese und Myxalamid- Biosynthese, oder Modulen aus NRPS-Systemen (wie etwa denen für die Bleomycin-Biosynthese) in die PKS inseriert werden, so daß neuartige, mit Polyketid verwandte Moleküle gemischten Ursprungs produziert werden.
Die für die hier beschriebene PKS codierenden offenen Leseraster können auch für nicht enzymatisch aktive Portionen, die nichts desto weniger eine funktionelle Rolle als Gerüstbereiche, die die enzymatisch aktiven Domänen und/oder Module der PKS mit entsprechenden Abständen und Orientierungen beabstanden und stabilisieren, und die Erkennungs- und Ankerungsfunktionen aufweisen können, die die Domänen und Module der PKS in der richtigen räumlichen Anordnung ordnen, aufweisen können, codierende Teile umfassen. So umfassen die Nukleinsäuresequenzen der vorliegenden Offenbarung Sequenzen, die für solche Gerüstbereiche codieren, und zwar entweder allein oder in Kombination mit Sequenzen, die für wie oben beschriebenen Domänen oder Module codieren. Dabei ist ersichtlich, daß die verschiedenen Manipulationen von PKS-codierenden Sequenzen, wie oben beschrieben, zu Hybrid-PKS-Genen oder -Systemen führen können. Somit werden durch die vorliegende Offenbarung auch Nukleinsäuren bereitgestellt, die für derartige Hybrid-PKS-Systeme codieren. Durch die Offenbarung wird daher ein Nukleinsäurekonstrukt bereitgestellt, das wenigstens einen ersten Nukleinsäureanteil, der für wenigstens eine Domäne einer Borrelidin-PKS codiert, und einen zweiten Nukleinsäureanteil bzw. -anteile, der bzw. die für wenigstens eine zur Borrelidin-PKS heterologe Typ-I-PKS-Domäne codiert bzw. codieren, umfaßt. In bevorzugten Ausführungsformen umfaßt das Konstrukt ein Hybrid-Polyketidsynthase-Gen, wobei das Gen für wenigstens eine Domäne einer Borrelidin-PKS und wenigstens eine Typ-I-PKS-Domäne, die zu der Borrelidin-PKS heterolog ist, codiert. Weitere bevorzugte Ausführungen sind wie oben beschrieben.
In einem weiteren Aspekt wird durch die vorliegende Of fenbarung ein isoliertes Nukleinsäuremolekül bereitgestellt, das eine für ein Polypeptid, das einen Schritt in der Synthese einer Startereinheit oder eines Substrats für die Polyketidsynthese, vorzugsweise in der Synthese der als Startereinheit von der Borrelidin-PKS verwendeten trans-Cyclopentan-1,2-dicarbonsäuregruppierung, katalysiert, codierende Sequenz umfaßt. Dabei kann das Polypeptid eine Aktivität als Dehydrogenase, 3-Oxoacyl-ACP-Reduktase, Cyclase, F-420-abhängige Dehydrogenase oder 2-Hydroxyhepta-2,4-dien-1,7-dioat-Isomerase aufweisen. Vorzugsweise umfaßt das Polypeptid die von einem Gen der Gruppe borC, borD, borE, borF, borG, borH, borK, borL, borM und borN, wie in SEQ ID Nr.: 8, 9, 10, 12, 13, 14, 17, 18, 19 bzw. 20 dargestellt, codierte Sequenz.
Diese Gene können in einer Borrelidin produzierenden Zelle deletiert, unterbrochen oder sonstwie inaktiviert werden, so daß dadurch die Borrelidinproduktion aufgehoben wird. Die sich aus derartigen Änderungen ergebenden Zellinien können chemisch durch die Zugabe exogener Carbonsäuren, die anstelle der natürlichen Startereinheit eingebaut werden können, komplementiert werden. So können neue, mit Borrelidin verwandte Moleküle synthetisiert werden, die von der exogen zugefütterten Carbonsäure initiiert werden. Ein solcher Ansatz wird Mutatsynthese genannt. Dabei können die für die Synthese von trans-Cyclopentan-1,2-dicarbonsäure verantwortlichen Gene in eine heterologe Polyketidproduktionszelle eingeführt werden, um der Zelle die Synthese der alicyclischen Dicarbonsäure als Startereinheit für ihre eigene PKS zu gestatten.
Somit wird durch die vorliegende Offenbarung ferner ein Verfahren zur Herstellung von Borrelidin und Borrelidinanalogen mit verbesserten Titern bereitgestellt, wobei man in dem Verfahren borG im Wirtsstamm unterbricht, die erhaltene Zellinie fermentiert und eine exogene Carbonsäure zufüttert. In verschiedenen bevorzugten Ausführungsformen handelt es sich bei der exogenen Carbonsäure um trans-Cyclopentan-1,2-dicarbonsäure, oder die exogene Carbonsäure wird aus der Gruppe trans-Cyclobutan-1,2-dicarbonsäure, 2,3-dimethylbernsteinsäure und 2-Methylbernsteinsäure ausgewählt, und/oder das Verfahren umfaßt zusätzlich die Deletion, Modifikation oder den Austausch eines oder mehrerer Borrelidin-Biosynthesegenen oder Borrelidin-Polyketidsynthasedomänen oder -module. Dabei ist dem Fachmann bewußt, daß Polyketidsynthasen auch in heterologen Wirten exprimiert werden können, wodurch in der vorliegenden Offenbarung auch ein Verfahren zur Herstellung höherer Titer von Borrelidin und Borrelidinanalogen in einen heterologen Wirt betrachtet wird, wobei man in dem Verfahren eine Wirtszelle mit dem gesamten Borrelidin-Gencluster mit Ausnahme von borG transformiert oder das borG-Gen in situ nach Übertragung des Genclusters unterbricht.
Als Alternative können für die Synthese der Startereinheit verantwortliche Gene überexprimiert werden, um die Fermentationstiter von Borrelidin oder mit Borrelidin verwandter Moleküle zu verbessern. Somit wird in der vorliegenden Offenbarung ein Verfahren zur Erhöhung des Titers von Borrelidin und Borrelidinderivaten oder mit Borrelidin verwandten Molekülen und deren Derivaten bereitgestellt, wobei man in dem Verfahren ein an der Produktion der Startereinheit beteiligtes Borrelidin-Biosynthesegen heraufreguliert, wobei das Gen aus der Gruppe borC, borD, borE, borF, borH, borK, BorL, BorM und borN ausgewählt ist und es sich in einer bevorzugten Ausführungsform bei dem heraufregulierten Gen um borE oder borL handelt.
In einem weiteren Ansatz können die für die Synthese der Startereinheit verantwortlichen Gene modifiziert oder durch andere, die Produktion veränderter Carbonsäuren steuernde synthetische Gene ersetzt werden, was zur Produktion mit Borrelidin verwandter Moleküle führt. Diese Techniken können durch die Modifikation des Lademoduls der PKS, wie oben beschrieben, komplementiert werden.
In einem weiteren Aspekt wird durch die vorliegende Offenbarung ein isoliertes Nukleinsäuremolekül bereitgestellt, das eine für ein Polypeptid, das einen Schritt bei der Modifikation einer Seitenkette einer Polyketidgruppierung, beispielsweise bei der Umwandlung einer Methylgruppe zu einer Nitrilgruppierung, z.B. an C12 von prä-Borrelidin (14), katalysiert, codierende Sequenz umfaßt. Dabei kann das Polypeptid eine Aktivität als Cytochrom-P450-Oxydase, Aminotransferase oder NAD/Chinon-Oxidoreduktase aufweisen. Vorzugsweise umfaßt das Polypeptid die von einem Gen der Gruppe borI, borJ und borK, wie in SEQ ID Nr.: 15, 16 oder 17 dargestellt, codierte Sequenz.
Verschiedene dieser Gene können deletiert/inaktiviert werden, so daß Borrelidin-verwandte Moleküle oder Shunt-Metabolite davon angereichert werden, die Zwischenstufen des Vorgangs, bei dem die Nitrilgruppierung eingeführt wird, repräsentieren. Das Hinzufügen heterologer Gene zu solchen Systemen kann eine alternative Ausarbeitung eventueller angereicherter Biosynthesezwischenstufen oder Shunt-Metabolite davon gestatten. Als Alternative können die Gene mutiert werden, um ihre Substratspezifität zu verändern, so daß sie auf alternative Positionen von prä-Borrelidinmolekülen wirken und damit Borrelidin-verwandte Moleküle bereitgestellt werden. Darüber hinaus können die für die Bildung der Nitrilgruppe verantwortlichen Gene überexprimiert werden, um die Fermentationstiter von Borrelidin oder Borrelidin-verwandten Molekülen zu verbessern.
Als Alternative können diese Gene einzeln, teilweise oder insgesamt in Zellen eingeführt werden, die zur Herstellung anderer Polyketide in der Lage sind, so daß für eine gewünschte Seitenkettenprozessierung jenes Po lyketids, z.B. die Einführung einer Nitrilgruppierung, gesorgt wird. Dadurch wird die Möglichkeit einer spezifischen biosynthetischen Einführung von Nitrilgruppierungen in Polyketide, insbesondere an von Methylmalonyl-CoA- oder Ethylmalonyl-CoA-Verlängerungseinheiten abgeleiteten Seitenketten, eröffnet. Ebenso können gereinigte Enzyme (siehe unten) verwendet werden, um die Umwandlung von Polyketidseitenketten zu Nitrilgruppierungen in vitro zu bewirken.
Bei den Nukleotidsequenzen der Offenbarung kann es sich um Teilsequenzen der in SEQ ID Nr.: 1 dargestellten Sequenz oder ihres Komplements oder um Mutanten, Varianten, Derivate oder Allele dieser Sequenzen handeln. Die Sequenzen können sich dabei von der dargestellten Sequenz durch eine Änderung unterscheiden, bei der es sich um eine oder mehrere Additionen, Insertionen, Deletionen und Substitutionen eines oder mehrerer Nukleotide der dargestellten Sequenz handelt. Änderungen einer codierenden Nukleotidsequenz können gegebenenfalls zu einer Aminosäureänderung auf der Proteinebene führen, wobei dies durch die Redundanz des genetischen Codes bestimmt wird. So kann Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Offenbarung eine Sequenz enthalten, die sich von der in SEQ ID Nr.: 1 dargestellten Sequenz unterscheidet, jedoch für ein Polypeptid mit der gleichen Aminosäuresequenz codiert. Vorzugsweise codieren Mutanten, Varianten, Derivate oder Allele der bereitgestellten Sequenzen für Polypeptide mit der gleichen enzymatischen Aktivität wie die hier beschriebenen.
Handelt es sich bei der Sequenz um eine codierende Sequenz, so kann das codierte Polypeptid eine Aminosäuresequenz umfassen, die sich durch einen oder mehrere Aminosäurereste von den in SEQ ID Nr.: 2 bis 43 und 113 dargestellten Aminosäuresequenzen unterscheidet. Ferner wird durch die vorliegende Offenbarung für ein Polypeptid, bei dem es sich um einen Aminosäuresequenzmutante, -variante, ein Aminosäuresequenzderivat oder -allel ei ner der dargestellten Sequenzen handelt, codierende Nukleinsäure bereitgestellt. Derartige Polypeptide werden nachfolgend erörtert. Für ein solches Polypeptid codierende Nukleinsäure kann mehr als etwa 60% Identität mindestens teilweise der codierenden Sequenz des SEQ ID Nr.: 1, mehr als etwa 70% Identität, mehr als etwa 80% Identität oder mehr als etwa 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Identität damit zeigen. Die prozentuale Identität kann unter Verwendung eines der Programme, wie etwa BLAST oder BestFit, im Rahmen des Softwarepakets der Genetics Computer Group (GCG), Version 10, erhältlich von der University of Wisconsin, unter Verwendung der Standardparameter berechnet werden.
In bevorzugten Ausführungsformen sind sowohl die codierenden als auch die nicht codierenden Nukleotidsequenzen der Offenbarung in der Lage, spezifisch mit wenigstens einem Teil der Sequenz der SEQ ID Nr.: 1 oder dem Komplement davon zu hybridisieren.
Beispielsweise können Hybridisierungen gemäß dem Verfahren nach Sambrook et al. (Sambrook et al., 1989) unter Verwendung einer Hybridisierungslösung mit: 5 × SSC, 5 × Denhard's-Reagenz, 0,5-1,0% SDS, 100 μg/ml denaturierte, fragmentierte Lachssperma-DNA, 0,05% Natriumpyrophosphat und bis zu 50% Formamid, durchgeführt werden. Die Hybridisierung erfolgt über einen Zeitraum von mindestens sechs Stunden bei 37-42°C. Nach der Hybridisierung werden die Filter wie folgt gewaschen: (1) 5 Minuten bei Raumtemperatur in 2 × SSC und 1% SDS; (2) 15 Minuten bei Raumtemperatur in 2 × SSC und 0,1% SDS; (3) 30 Minuten – 1 Stunde bei 37°C in 1 × SSC und 1% SDS; (4) 2 Stunden bei 42-65°C in 1 × SSC und 1% SDS, mit Wechseln der Lösung alle 30 Minuten.
Eine allgemeine Formel zur Berechnung der zur Erreichung einer Hybridisierung zwischen Nukleinsäuremolekülen einer spezifischen Sequenzhomologie erforderlichen Stringenzbedingungen ist wie folgt (Sambrook et al., 1989): Tm = 81,5°C + 16,6Log[Na+] + 0,41(%G + C] – 0,63(% Formamid) – 600/Bp-Zahl in Duplex
Zur Veranschaulichung der obigen Formel liegt bei Verwendung von [Na+] = [0,368] und 50% Formamid sowie einem GC-Gehalt von 42% und einer durchschnittlichen Sondengröße von 200 Basen der T_m-Wert bei 57°C. Der T_m-Wert eines DNA-Duplex sinkt um 1-1,5°C pro 1% Homologieabnahme. Somit würden bei einer verwendeten Hybridisierungstemperatur von 42°C Ziele mit mehr als etwa 75% Sequenzidentität beobachtet. Eine solche Hybridisierung würde als weitgehend spezifisch für die Nukleinsäuresequenz der vorliegenden Offenbarung angesehen.
Die Nukleinsäuren der vorliegenden Offenbarung umfassen vorzugsweise wenigstens 15 zusammenhängende Nukleotide der SEQ ID Nr.: 1. Sie können 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 150, 200, 300, 500 oder mehr zusammenhängende Nukleotide der SEQ ID Nr.: 1 umfassen.
Die Nukleinsäuren können beispielsweise als Primer oder Sonden zur Identifizierung neuartiger Gene oder anderer genetischer Elemente, die beispielsweise Transkriptionsregulationssequenzen, aus Polyketid- oder Macrolid-Biosynthese-Genclustern, z.B. für Enzyme der PKS oder Domänen oder Module davon, an der Biosynthese einer Startereinheit beteiligte Enzyme, Seitenketten von Polyketidgruppierungen modifizierende Enzyme, Transporter, Resistenzgene und regulatorische Moleküle, wie beschrieben, codierender Sequenzen, verwendet werden.
Somit wird durch die vorliegende Offenbarung ein Verfahren zur Identifizierung eines neuartigen Polyketidbiosynthese-Genclusters oder eines Teils davon bereit gestellt, wobei man eine Probe von Zielnukleinsäure mit einer Nukleinsäure der vorliegenden Offenbarung, die zur spezifischen Hybridisierung an eine Nukleinsäure mit der Sequenz der SEQ ID Nr.: 1 oder einen Teil davon fähig ist, hybridisiert. Bei der Zielnukleinsäure kann es sich um eine beliebige geeignete Nukleinsäure handeln, vorzugsweise bakterielle genomische DNA.
Typischerweise umfaßt das Verfahren ferner den Schritt des Nachweisens der Hybridisierung zwischen der Nukleinsäureprobe und der Nukleinsäure der Offenbarung. Die Hybridisierung kann dabei unter Verwendung einer der verschiedenen Techniken, die dem Fachmann zur Verfügung stehen, gemessen werden, so können beispielsweise Sonden radioaktiv, fluoreszenz- oder enzymatisch markiert werden. Zu weiteren Verfahren, bei denen keine Markierung der Sonde eingesetzt wird, gehören die Amplifikation mittels PCR, RNAse-Spaltung und allelspezifische Oligonukleotidsondierung.
Ein Verfahren kann die Hybridisierung einer oder mehrerer (z.B. zwei) Sonden oder Primer an Zielnukleinsäure beinhalten. Handelt es sich bei der Nukleinsäure um doppelsträngige DNA, so geht der Hybridisierung im allgemeinen ein Denaturierungsschritt zur Herstellung von einzelsträngiger DNA voraus. Die Hybridisierung kann als Teil einer PCR-Verfahrensweise oder als Teil einer Sondierungsverfahrensweise ohne die Beteiligung einer PCR erfolgen. Eine beispielhafte Verfahrensweise wäre eine Kombination aus PCR und Hybridisierung mit niedriger Stringenz. Zur Identifizierung erfolgreicher Hybridisierungsereignisse und Isolierung hybridisierter Nukleinsäure wird eines der vielen, dem Fachmann zur Verfügung stehenden Screening-Verfahren gewählt.
Der Fachmann ist allgemein in der Lage, geeignete Bedingungen der gewünschten Stringenz für eine selektive Hybridisierung einzusetzen, wobei Faktoren, wie beispielsweise die Länge und Basenzusammensetzung der Oli gonukleotide, Temperatur usw., wie oben beschrieben, in Betracht gezogen werden.
Bei einem isolierten Nukleinsäuremolekül der Offenbarung kann es sich um ein isoliertes natürlich vorkommendes Nukleinsäuremolekül (d.h. isoliert oder getrennt von den Bestandteilen, mit denen zusammen es normalerweise in der Natur angetroffen wird), das beispielsweise frei oder weitgehend frei von das Gen im Bakteriengenom flankierender Nukleinsäure, mit der Ausnahme möglicherweise einer oder mehrerer Regulationssequenz(en) zur Expression, handeln. Nukleinsäure kann vollständig oder teilweise synthetisch sein und genomische DNA, cDNA oder RNA umfassen. Umfaßt Nukleinsäure gemäß der Offenbarung RNA, so sollte eine Bezugnahme auf die dargestellte Sequenz so verstanden werden, daß sie für das RNA-Äquivalent gilt, wobei U T ersetzt.
Ferner wird durch die vorliegende Offenbarung ein Vektor bereitgestellt, der eine Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Offenbarung umfaßt. Bei dem Vektor handelt es sich vorzugsweise um einen Expressionsvektor, der eine für ein Polypeptid oder einen Polyketid-Biosynthese-Gencluster (vorzugsweise einen Borrelidin-Biosynthese-Gencluster) codierende Nukleinsäure oder einen Teil davon, wie beschrieben, umfaßt. Dabei können Nukleinsäure zur Einführung in Bakterien oder eukaryontische Wirtszellen umfassende geeignete Vektoren gewählt oder konstruiert werden, die entsprechende Regulationssequenzen, einschließlich Promotorsequenzen, Terminatorfragmente, Enhancer-Sequenzen, Markergene und andere Sequenzen, wie benötigt, enthalten. Die Vektoren können wahlweise Plasmide oder Virusvektoren, z.B. „Phage" oder „Phagemid" sein. Hinsichtlich weiterer Einzelheiten siehe beispielsweise Sambrook et al., 1989. Viele bekannte Techniken und Vorschriften zur Manipulation von Nukleinsäure, beispielsweise bei der Herstellung von Nukleinsäurekonstrukten, der Mutagenese, Sequenzierung, Einführung von DNA in Zellen und Ge nexpression sowie der Analyse von Proteinen, sind ausführlich in Short Protocols in Molecular Biology, Second Edition, Ausubel et al., Hrsg. John Wiley & Sons, 1992, beschrieben. Die Veröffentlichungen von Sambrook et al. und Ausubel et al. sind hiermit durch Bezugnahme aufgenommen.
In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Offenbarung wird ein von einem Nukleinsäuremolekül der Offenbarung wie hier beschrieben codiertes isoliertes Polypeptid bereitgestellt. Insbesondere wird ein isoliertes Polypeptid bereitgestellt, das eine Aminosäuresequenz, wie sie in einer oder mehrerer der SEQ ID Nr.: 2 bis 43 und 113 dargestellt ist, oder einen Teil davon umfaßt. Wie oben ausgeführt, repräsentieren diese Aminosäuresequenzen die längsten möglichen, in der Sequenz der SEQ ID Nr.: 1 und dem Komplement davon vorhandenen offenen Leseraster. Dabei handelt es sich bei der ersten dargestellten Aminosäure immer um Met, unabhängig davon, ob es sich bei dem Startcodon um ATG, GTG, CTG oder TTG handelt.
Der Begriff „Polypeptid(e)", wie er hier verwendet wird, umfaßt Peptide, Polypeptide und Proteine, wobei diese Begriffe wechselseitig verwendet werden, falls nicht anders angegeben.
Ein Polypeptid, bei dem es sich um eine Aminosäuresequenzvariante, -mutante, ein Aminosäuresequenzallel oder -derivat einer der dargestellten Aminosäuresequenzen handelt, kann wenigstens 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Identität mit dem Polypeptid einer der SEQ ID Nr.: 2 bis 43 und 113 oder mit einem Teil davon zeigen. Bestimmte Aminosäuresequenzvarianten können von den dargestellten durch die Insertion, Addition, Substitution oder Deletion von einer Aminosäure, 2, 3, 4, 5-10, 10-20, 20-30, 30-50, 50-100, 100-150 oder mehr als 150 Aminosäuren unterscheiden. Die prozentuale Identi tät kann unter Verwendung eines der Programme, wie etwa FASTA oder BestFit, im Rahmen des Softwarepakets der Genetics Computer Group (GCG), Version 10, erhältlich von der University of Wisconsin, unter Verwendung der Standardparameter berechnet werden.
Die vorliegende Offenbarung enthält ebenso aktive Anteile, Fragmente und Derivate der Polypeptide der Offenbarung.
Unter einem „aktiven Anteil" versteht man ein Peptid, das kürzer als das Vollängen-Polypeptid ist, das jedoch wenigstens einen gewissen Teil seiner essentiellen biologischen Aktivität behält. So können beispielsweise isolierte Domänen oder Module der PKS, wie oben beschrieben, als aktive Anteile der PKS gelten.
Unter einem „Fragment" versteht man einen Abschnitt von Aminosäureresten aus mindestens 5, mindestens 6 oder mindestens 7 zusammenhängenden Aminosäuren, häufig mindestens 8 oder mindestens 9 zusammenhängenden Aminosäuren, typischerweise mindestens 10, mindestens 13 zusammenhängenden Aminosäuren und am stärksten bevorzugt mindestens 20, mindestens 25, mindestens 30, mindestens 50, mindestens 75, mindestens 100 oder mehr zusammenhängenden Aminosäuren. Fragmente der Sequenz können antigene Determinanten oder Epitope umfassen, die sich zur Herstellung von Antikörpern gegen einen Teil des relevanten Polypeptids eignen. Somit braucht das Polypeptid keine vollständige Sequenz, wie sie in einer der SEQ ID Nr.: 2 bis 43 und 113 bereitgestellt wird, zu umfassen, sondern kann einen Teil davon mit der gewünschten Aktivität, z.B. eine isolierte Domäne oder ein isoliertes Modul, wie beispielsweise die oben für die PKS beschriebenen, umfassen. Dabei sollte angemerkt werden, daß die Begriffe Teil, Anteil und Fragment in dieser Beschreibung wechselseitig verwendet werden; der spezifischen Verwendung eines dieser Begriffe in einem beliebigen bestimmten Zusammenhang sollte keine beson dere Signifikanz beigemessen werden.
Unter einem „Derivat" eines Polypeptids der Offenbarung oder eines Fragments davon versteht man ein Polypeptid, das durch Variieren der Aminosäuresequenz des Proteins, z.B. durch Manipulation der für das Protein codierenden Nukleinsäure oder durch Veränderung des Proteins selbst, modifiziert ist. solche Derivate der natürlichen Aminosäuresequenz können die Insertion, Addition, Deletion oder Substitution von einer, zwei, drei, fünf oder mehr Aminosäuren beinhalten, ohne daß dabei die essentielle Aktivität des Wildtyp-Polypeptids grundlegend verändert wird.
Polypeptide der Offenbarung werden in isolierter Form bereitgestellt, beispielsweise isoliert von einer oder mehreren Komponenten, mit denen sie normalerweise zusammen in der Natur angetroffen werden. Sie können aus einem Wirt, in dem sie natürlicherweise exprimiert werden, isoliert werden oder können synthetisch oder rekombinant sein.
Die vorliegende Offenbarung umfaßt ebenso ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids (wie offenbart), wobei das Verfahren die Expression von für das Polypeptid codierender Nukleinsäure (im allgemeinen Nukleinsäure gemäß der Offenbarung) beinhaltet. Dies kann zweckmäßigerweise durch Anzucht einer einen wie oben beschriebenen Expressionsvektor enthaltenden Wirtszelle in Kultur unter entsprechenden Bedingungen, die die Expression des Polypeptids verursachen oder gestatten, erreicht werden. Polypeptide können auch in in-vitro-Systemen, wie etwa Retikulocytenlysatsystemen, exprimiert werden.
Das Verfahren kann den Schritt der Einführung der Nukleinsäure in eine Wirtszelle beinhalten. Die Einführung, die (insbesondere für die in-vitro-Einführung) allgemein ohne Beschränkung als „Transformation" bezeichnet wird, kann dabei unter Einsatz aller verfügba ren Techniken erfolgen. Zu für eukaryontische Zellen geeigneten Techniken können die Calciumphosphat-Transfektion, DEAE-Dextran, Elektroporation, liposomenvermittelte Transfektion und die Transfektion unter Verwendung von Retrovirus oder anderen Virus, z.B. Vaccinia oder, bei Insektenzellen, Baculovirus, gezählt werden. Zu für Bakterienzellen geeigneten Techniken können die Calciumchloridtransformation, Konjugation, Elektroporation und Transfektion unter Verwendung von Bakteriophagen gezählt werden. Als Alternative könnte die direkte Injektion der Nukleinsäure eingesetzt werden. Markergene, wie beispielsweise Antibiotikaresistenz- oder Sensibilitätsgene können bei der Identifizierung von Klonen, die interessierende Nukleinsäure enthalten, verwendet werden, wie es im Fachgebiet allgemein bekannt ist.
Zu bevorzugten Wirtzellen gehören Actinocycetes, vorzugsweise Streptomycetes, und insbesondere diejenigen Zellen, die aus der Gruppe Saccharopolyspora erythraea, Streptomyces coelicolor, Streptomyces avermitilis, Streptomyces griseofscus, Strep cinnamonensis, Micromonospora griseorubida, Streptomyces hygroscopicus, Streptomyces fradiae, Streptomyces lonisporoflavus, Streptomyces lasaliensis, Strep tsukubaensis, Streptomyces griseus, Strep venezuelae, Strep antibtioticus, Streptomyces lividans, Streptomyces rimosus und Streptomyces albus, Strep rochei ATCC23956, Streptomyces parvulus Tü113 und Strep parvulus Tü4055, besonders bevorzugt aus der Gruppe Streptomyces rochel ATCC23956, Streptomyces parvulus Tü113 und Streptomyces parvulus Tü4055 ausgewählt sind.
In ihrem Hauptaspekt sieht die vorliegende Erfindung Moleküle, die aus den Aufgaben der Offenbarung abgeleitet werden können, sowie daraus gebildete modifizierte Verbindungen und Verfahren zu ihrer Herstellung vor. Die aus den Aufgaben der Offenbarung abgeleiteten Moleküle sind in der Formel 1 dargestellt, die auch für pharmazeutisch unbedenkliche Salze davon gilt, wobei:
R₁ für eine wie nachfolgend gezeigte substituierte Cycloalkylgruppe steht
wobei R₁ gegebenenfalls auch mit einem oder mehreren Halogenatomen oder einer oder mehreren C₁- bis C₃-Alkylgruppen substituiert sein kann; R₂, R₃, R₆ oder R₁₁ jeweils unabhängig für H, OCH₃, CH₃ oder CH₂CH₃ stehen; und R₄ für CN, CO₂H oder CH₃ steht.
In bevorzugten Ausführungsformen steht:

(a) R₄ für CH₃ oder COOH
(b) R₁ für Cyclobutan-1'-carboxylat
(c) R₆ für CH₃, R₂ und R₁₁ jeweils für H und R₁ für Cyclobutan-1'-carbonsäure (d) R₁ für Cyclobutan-1'-carboxylat und R₄ für CH₂ oder COOH.

Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können tRNA-Synthetase hemmende Aktivität aufweisen (z.B. können sie Threonyl-, Tyrosinyl-, oder Tryptophanyl-tRNA-Synthetase hemmen). Sie können antimikrobielle Aktivität zeigen, einschließlich Aktivität gegen intra- oder extrazelluläre Parasiten und Organismen, wie beispielsweise Bakterien, Spirocheten (z.B. Treponema), Malaria, Viren und Pilze. Darüber hinaus oder als Alternative können sie antiproliferative Aktivität gegen Sängerzellen und/oder antiangiogene Aktivität, und zwar als Ergebnis von tRNAse-Synthetase-Hemmung oder über irgendeine andere Wirkungsweise zeigen. Dadurch können die Verbindungen der vorliegenden Erfindung zu besonders geeigneten Antikrebsmitteln (z.B. Mitteln zur Behandlung von Darmkrebs, Prostatakrebs oder anderen Krebserkrankungen) und auch bei der Behandlung anderer proliferativer Störungen, wie beispielsweise Psoriasis, oder von Leiden, bei denen eine ungünstige Vaskularisierung auftritt, wie z.B. Psoriasis, rheumatoide Arthritis, Atherosklerose und diabetische Retinopathie, angewandt werden.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können zu pharmazeutisch unbedenklichen Zusammensetzungen formuliert werden, beispielsweise durch Mischen mit einem pharmazeutisch unbedenklichen Hilfsstoff, Trägerstoff, Puffer, Stabilisator oder anderen dem Fachmann allgemein bekannten Materialien. Derartige Zusammensetzungen liegen ebenso im Umfang der vorliegenden Erfindung.
Solche pharmazeutisch unbedenklichen Materialien sollten nicht toxisch sein und die Wirksamkeit des aktiven Inhaltsstoffs nicht stören. Die genaue Beschaffenheit des Trägerstoffs oder anderen Materials kann vom Verabreichungsweg, z.B. orale, intravenöse, kutane oder subkutane, nasale, intramuskuläre, intraperetoniale Wege, abhängen.
Pharmazeutische Zusammensetzungen für die orale Verabreichung können in Tabletten-, Kapsel-, Pulver- oder flüssiger Form vorliegen. Dabei kann eine Tablette einen festen Trägerstoff, wie beispielsweise Gelatine oder ein Adjuvans enthalten. Flüssige pharmazeutische Zusammensetzungen enthalten im allgemeinen einen flüssigen Trägerstoff, wie beispielsweise Wasser, Petroleum, tierische oder pflanzliche Öle, Mineralöl oder synthetisches Öl. Eine physiologische Kochsalzlösung, Dextrose- oder andere Saccharidlösung oder Glykole, wie beispielsweise Ethylenglykol, Propylenglykol oder Polyethylenglykol, können auch enthalten sein.
Für die intravenöse, kutane oder subkutane Injektion oder die Injektion an der betroffenen Stelle liegt der aktive Inhaltsstoff in Form einer parenteral unbedenklichen wäßrigen Lösung vor, welche pyrogenfrei ist und einen geeigneten pH-Wert sowie geeignete Isotonie und Stabilität aufweist. Dem Fachmann ist es leicht möglich, geeignete Lösungen beispielsweise unter Verwendung isotonischer Vehikel, wie beispielsweise Sodium Chloride Injection, Ringers Injection, Lactated Ringer's Injection, herzustellen. Dabei können auch je nach Bedarf Konservierungsstoffe, Stabilisatoren, Puffer, Antioxidantien und/oder andere Zusatzstoffe mit einbezogen werden. Beispiele für die oben erwähnten Techniken und Vorschriften finden sich in Rimington's Pharmaceutical Sciences, 20th Edition, 2000, Hrsg. Lippincott, Williams & Wilkins.
Ferner werden durch die vorliegende Erfindung die oben beschriebenen Verbindungen und Zusammensetzungen zur Verwendung in einem Verfahren zur medizinischen Behandlung bereitgestellt. Ebenso bereitgestellt wird die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung mikrobieller Leiden (einschließlich Malaria), zur Hemmung der Angiogenese, zur Behandlung proliferativer Störungen oder zur Behandlung von durch ungünstige Vaskularisierung gekennzeichneten Leiden, wie oben beschrieben.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
In 1 ist die Struktur von Borrelidin sowie einiger aus Borrelidin produzierenden Organismen isolierter Metabolite dargestellt.
In 2 sind die Einbaumuster für mit stabilem ¹³C- Isotop markierten Verlängerungssubstraten sowie die Position der von der trans-Cyclopentan-1,2-dicarbonsäure-Startereinheit abgeleiteten Kohlenstoffatome dargestellt.
In 3 ist die Organisation des Borrelidin-Biosynthese-Genclusters dargestellt. Restriktionsstellen: B, BamHI; Bc, BolI; E, EcoRI; X, XhoI.
In 4 ist ein Schema dargestellt, das den vorgeschlagenen Biosyntheseweg für die trans-Cyclopentan-1,2-dicarbonsäure-Startereinheit zeigt.
In 5 ist die Organisation der Borrelidin-PKS sowie die Biosynthese des prä-Borrelidinmoleküls dargestellt.
In 6 ist der vorgeschlagene Biosyntheseweg für die Einführung der Nitrilgruppierung an der C12-Stellung des Borrelidin dargestellt.
In 7 ist die vorgeschlagene Struktur des Moleküls 6 dargestellt.
In 8 ist die vorgeschlagene Struktur der Moleküle 7 & 8 dargestellt.
In 9 ist die molekulare Charakterisierung des katabolischen 4-Hydroxyphenylessigsäure-Wegs in E. coliW dargestellt.
In 10 sind die Strukturen der Molekül 18-20 dargestellt.
In 11 sind die Strukturen der Molekül 21-26 dargestellt.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Eine Cosmid-Bibliothek von genomischer DNA aus S. parvulus Tü4055 wurde unter Verwendung von aus einer Teilverdauung mit Sau3AI erhaltenen Fragmenten, die in pWE15 kloniert und in E. coli-Zellen unter Verwendung des Gigapack^®III Gold Packaging Extract-Kit (Stratagene) eingeführt wurden, konstruiert. Eine Bibliothek aus 3000 E. coli-Transformanden wurde auf Homologie unter Verwendung einer markierten Sonde, die mit dem DIG DNA Labelling and Detection Kit (Roche) erzeugt wurde, abgesucht. Bei der verwendeten Sonde handelte es sich um ein 1,7 kbp großes BgIII-BamHI-Fragment, das aus dem für Modul 6 der dritten Untereinheit der Oleandomycin-PKS aus Streptomyces antibioticus (Swan et al., 1994) codierenden Gen erhalten wurde.
Klone, die eine positive Reaktion ergaben, wurden ausgewählt und die Cosmid-DNA isoliert. Die Cosmid-DNA wurde mit BamHI verdaut, und Fragmente mit einer Größe von weniger als 3 kbp wurden in pOJ260 (Bierman et al., 1992) subkloniert. Die Plasmide wurden anschließend zur Transformation von S. parvulus Tü4055-Protoplasten verwendet und erhaltene Mutanten nach der Fähigkeit zur Produktion von Borrelidin abgesucht. Zwei Mutanten wurden als nicht-Borrelidin-Produzenten identifiziert, wobei beide aus Plasmiden abgeleitet waren, die Fragmente von cosBor32A2 enthielten. Diese beiden Fragmente wiesen eine Größe von 1,97 bzw. 2,80 kbp auf und wurden später als benachbarte Fragmente, die für Teile der Borrelidin-PKS codieren, identifiziert (borA2 & borA3). Mit cosBor32A2 als Sonde wurde ein zweites überlappendes Cosmid, cosBor19B9, aus der ursprünglichen Bibliothek identifiziert. Diese beiden Cosmide reichen aus, um den gesamten Borrelidin-Biosynthese-Gencluster abzudecken (siehe 3).
Die vollständige Nukleotidsequenz von cosBor32A2 und cosBor19B9 wurde durch Schrottschuß (Shotgun)-Sequenzierung einer Sau3A1 abgeleiteten Subklonbibliothek für jedes Cosmid, jeweils bestehend aus 1,5-2,0 kbp großen Fragmenten in pHSG397 (Takeshita et al., 1987), bestimmt. Spezifische Einzelheiten sind in Beispiel 3 angegeben. Die vollständige, überlappende nukleotidcodierende Sequenz für cosBor32A2 und cosBor19B9 ist als SEQ ID Nr.: 1 dargestellt. Der von Cosmid cosBor32A2 codierte Bereich repräsentiert die Sequenz von Nukleotidpositionen 0-40217 bp der SEQ ID Nr.: 1. Der vom Cosmid cosBor19B9 codierte Bereich überlappt diesen Bereich um 4452 Nukleotide und entspricht den Nukleotidpositionen 35766-74787 bp of SEQ ID Nr.: 1. Wie ausführlicher im nachfolgenden Text beschrieben wird, wurden von uns Geninaktivierungsexperimente an vielen der offenen Leseraster, die als codiert innerhalb von SEQ ID Nr.: 1 identifiziert wurden, durchgeführt, womit die Grenzen des Cluster identifiziert werden. Der Borrelidin-Biosynthese-Gencluster liegt zwischen den Nukleotidpositionen 7603 bis 59966 der SEQ ID Nr.: 1 (borB bis borO, was den borA-Bereich einschließt). Somit ermöglichte die Kombination dieser Ansätze uns die Identifizierung und Sequenzierung des DNA-Bereichs, der den gesamten Borrelidin-Biosynthese-Gencluster umfaßt, sowie die Identifizierung und Beschreibung der innerhalb dieses Bereichs codierten funktionalen Sequenzen.
PKS-GENE

Zwischen den Positionen 16184-50741 der SEQ ID Nr.: 1 sind 6 offene Leseraster codiert, die eine sehr hohe Homologie zu den Genen, die für die PKS bekannter macrolidproduzierender Organismen codieren, zeigen. Diese Gene tragen die Bezeichnungen borA1, borA2, borA3, borA4, borA5 und borA6 und codieren für die Borrelidin-PKS, wie oben durch Unterbrechung eines 1,97 kbp großen Bereichs innerhalb von borA2 demonstriert wurde. Die 6 offenen Leseraster liegen in einer Kopf-an-Schwanz-Anordnung vor und werden jeweils durch ein im Leseraster liegendes Stopcodon terminiert. Die Nukleotidsequenz und entsprechende Polypeptidsequenz sind in ihren Einzelheiten in der nachfolgenden Tabelle 1 aufgeführt: Tabelle 1

PKS-codierendes Gen	Nukleotidposition in SEQ ID Nr.: 1	Entsprechende Polypeptidsequenznummer
borA1	16184-18814	SEQ ID Nr.: 2
borA2	18875-23590	SEQ ID Nr.: 3
borA3	23686-34188	SEQ ID Nr.: 4
borA4	34185-39047	SEQ ID Nr.: 5
borA5	39122-45514	SEQ ID Nr.: 6
borA6	45514-50742	SEQ ID Nr.: 7

Das Gen borA1 codiert für das Starter- oder Lademodul (SEQ ID Nr.: 1, Position 16184-18814). Die Zuweisung des Startcodons ist bei diesem offenen Leseraster nicht offensichtlich. Das hier angegebene Startcodon wird von uns als das echte Startcodon angenommen, doch gibt es wenigstens drei weitere mögliche Startcodons zwischen dem ersten Startcodon und dem Anfang der AT0-Domäne-Sequenz, wobei dem Fachmann ersichtlich ist, daß es möglich sein könnte, aktives Protein unter Verwendung eines dieser alternativen Startcodons zu erzeugen. Das hier angegebene Startcodon führt zu einem signifikanten N-terminalen Schwanz von 321 Aminosäuren, die der AT0-Domäne vorangehen. Zum Vergleich: der dem AT0 des Erythromycin-Lademoduls vorangehende N-terminale Schwanz ist 108 Aminosäuren und der des Avermectin-Lademoduls 28 Aminosäuren lang. Daher besteht die Möglichkeit, daß einer der anderen Startcodonkandidaten korrekt sein könnte; am wahrscheinlichsten sind dies die Codons in Position 16298, 16607 und 16901 der SEQ ID Nr.: 1. Die Länge des N-terminalen Schwanzes läßt vermuten, daß er möglicherweise eine katalytische Aktivität repräsentiert, obwohl er keine signifikante Homologie zu anderen Sequenzen in den Datenbanken aufweist. Die Nukleotidsequenzposition und die entsprechende Aminosäuresequenz der funktionalen Domänen innerhalb des Startermoduls sind jeweils in der nachfolgenden Tabelle 2 identifiziert: Tabelle 2

Domäne in borA1 Basen in SEQ ID Nr.: 1 Aminosäuren in SEQ ID Nr.: 2

AT0 17147-18175 322-664

ACP0 18263-18472 694-763
Das Gen borA2 codiert für das erste Verlängerungsmodul (SEQ ID Nr.: 1, Position 18875-23590). Die Nukleotidsequenzposition und die entsprechende Aminosäuresequenz der funktionalen Domänen innerhalb des ersten Verlängerungsmoduls sind jeweils in der nachfolgenden Tabelle 3 identifiziert: Tabelle 3

Domäne in borA2 Basen in SEQ ID Nr.: 1 Aminosäuren in SEQ ID Nr.: 3

KS1 18974-20251 34-459

AT1 20543-21529 557-885

KR1 22280-23011 1136-1379

ACP1 23129-23332 1419-1486

Das Gen borA3 codiert für das zweite und dritte Verlängerungsmodul (SEQ ID Nr.: 1, Position 23686-34188). Die Nukleotidsequenzposition und die entsprechende Aminosäuresequenz der funktionalen Domänen innerhalb des zweiten bzw. dritten Verlängerungsmoduls sind jeweils in der nachfolgenden Tabelle 4 identifiziert: Tabelle 4

Domäne in borA3	Basen in SEQ ID Nr.: 1	Aminosäuren in SEQ ID Nr.: 4
KS2	23785-25062	34-459
AT2	25360-26346	559-887
DH2	26392-26835	903-1050
KR2	27745-28476	1354-1597
ACP2	28567-28767	1628-1694
KS3	28855-30132	1724-2149
AT3	30418-31413	2245-2576
DH3	31462-31887	2593-2734
KR3	32863-33606	3060-3307
ACP3	33703-33903	3340-3406

Das Gen borA4 codiert für das vierte Verlängerungsmodul (SEQ ID Nr.: 1, Position 34185-39047). Die Nukleotidsequenzposition und die entsprechende Aminosäuresequenz der funktionalen Domänen innerhalb des vierten Verlängerungsmoduls sind jeweils in der nachfolgenden Tabelle 5 identifiziert: Tabelle 5

Domäne in borA4 Basen in SEQ ID Nr.: 1 Aminosäuren in SEQ ID Nr.: 5

KS4 34284-35561 34-459

AT4 35847-36842 555-886

KR4 37719-38453 1179-1423

ACP4 38559-38759 1459-1525

Das Gen borA5 codiert für das fünfte Verlängerungsmodul (SEQ ID Nr.: 1, Position 39122-45514). Die Nukleotidsequenzposition und die entsprechende Aminosäuresequenz der funktionalen Domänen innerhalb des fünften Verlängerungsmoduls sind jeweils in der nachfolgenden Tabelle 6 identifiziert: Tabelle 6

Domäne in borA5	Basen in SEQ ID Nr.: 1	Aminosäuren in SEQ ID Nr.: 6
KS5	39221-40492	34-457
AT5	40778-41785	553-888
DH5	41834-42259	905-1046
ER5	43322-44191	1401-1690
KR5	44207-44947	1696-1942
ACP5	45044-45244	1975-2041

Das Gen borA6 codiert für das sechste Verlängerungsmodul sowie die kettenterminierende Thioesterase (SEQ ID Nr.: 1, Position 45514-50742). Die Nukleotidsequenzposition und die entsprechende Aminosäuresequenz der funktionalen Domänen innerhalb des sechsten Verlängerungsmoduls sind jeweils in der nachfolgenden Tabelle 7 identifiziert: Tabelle 6

Domäne in borA6	Basen in SEQ ID Nr.: 1	Aminosäuren in SEQ ID Nr.: 7
KS6	45622-45884	37-457
AT6	47176-48162	555-883
KR6	48814-49518	1101-1335
ACP6	49624-49824	1371-1437
TE	49894-50637	1461-1708

Die Identifizierung funktionaler Domänen und ihrer Begrenzungen, wie sie oben beschrieben sind, werden aufgrund der Ähnlichkeiten zu den konservierten Aminosequenzen anderer modularer PKS, wie beispielsweise denen für die Biosynthese von Rapamycin (Schwecke et al., 1995; Aparicio et al., 1996) und Erythromycin (Cortès et al., 1990), bestimmt. Die Begrenzungen der katalytischen Domänen werden auf der Grundlage der Homologie zu anderen PKS-Clustern erstellt, wobei der gewählte Punkt, an dem eine Domäne beginnt oder endet, nicht absolut definiert ist, sondern aufgrund der oben erwähnten Betrachtungen ausgewählt wird. Im Falle der β-Keto-Prozessierungsdomänen ist dieser Punkt am wenigsten offensichtlich, da hier typischerweise ein großer Bereich der KR-Domäne vorangeht, der keiner funktionalen Domäne zugeordnet ist. Dieser Bereich kann für die Struktur wichtig sein oder für die Stabilität des PKS-Dimers benötigt werden. Eine ungewöhnliche Charakteristik der Borrelidin-PKS besteht darin, daß alle individuellen enzymatischen Domänen aufgrund ihrer Oligonukleotid-/Aminosäuresequenz katalytisch kompetent zu sein scheinen und allesamt notwendig sind, um die für die Her stellung der in Borrelidin beobachteten funktionalen Gruppen benötigte β-Keto-Prozessierung bereitzustellen. Dies ist eher ungewöhnlich, da die Mehrzahl der bislang bekannten modularen PKS-Sequenzen eine oder mehrere inaktive Domänen enthalten, wobei beispielsweise die Spinosyn-PKS einer Ausnahme darstellt (Waldron et al., 2001; US 6,274,50 ).
Dem Fachmann ist die Degeneriertheit des genetischen Codes geläufig und es ist ihm daher möglich, die durch diese Offenbarung bereitgestellten spezifischen DNA-Sequenzen zu modifizieren, um Proteine bereitzustellen, die die gleichen oder veränderte oder verbesserte Eigenschaften im Vergleich mit den hier spezifisch bereitgestellten Polypeptiden aufweisen. Ebenso kann der Fachmann die DNA-Sequenzen so modifizieren, daß ein zu den hier bereitgestellten Polypeptiden identisches Polypeptid exprimiert wird, allerdings auf einem höheren Niveau. Weiterhin sind dem Fachmann Mittel zur synthetischen Herstellung von DNA-Sequenzen, und zwar entweder in vollständiger Form oder teilweise, die sich bei der Herstellung rekombinanter DNA-Vektoren oder codierender Sequenzen, die von der vorliegenden Offenbarung umfaßt sind, eignen würden. Darüber hinaus können rekombinante Mittel zur Modifikation der bereitgestellten DNA-Sequenzen beispielsweise stellengerichtete Deletion oder stellengerichtete Mutagenese umfassen. Diese Techniken sind dem Fachmann allgemein bekannt und brauchen hier nicht weiter erläutert zu werden. Dementsprechend liegt, wie hier verwendet, DNA die aus natürlichen Quellen isoliert, synthetisch oder halbsynthetisch hergestellt oder durch rekombinante DNA-Verfahren modifiziert wird, im Umfang der vorliegenden Offenbarung.
Gleichfalls erkennt der Fachmann, daß die Polypeptide der Offenbarung rekombinant exprimiert werden können. Als Alternative können diese Polypeptide entweder vollständig oder teilweise mit herkömmlichen bekannten nichtrekombinanten Techniken, beispielsweise Festpha sensynthese, synthetisiert werden. Somit sollte die vorliegende Offenbarung nicht so verstanden werden, daß sie notwendigerweise auf irgendwelche spezifischen Vektorkonstruktionen oder Mittel zur Herstellung der spezifischen Biosynthese-Cluster-Moleküle, einschließlich der beispielhaft dargestellten Polyketidsynthasemoleküle, beschränkt ist.
Das Lademodul der Borr-PKS existiert als eigenständiges Protein. Dies ist eher ungewöhnlich, da die Mehrzahl der Lademodule auf dem gleichen Protein wie das erste Verlängerungsmodul angetroffen werden. Zu Ausnahmen davon gehören beispielsweise die PKS für Nystatin (Brautaset et al., 2000) und Amphotericin (Caffrey et al., 2001). Das Lademodul, das aus einer AT-ACP-Doppeldomäne besteht, ähnelt dem Lademodul der Avermectin-PKS, das eine breite Spezifität aufweist und eine Reihe alternativer Startersäuren akzeptiert und bei der Zeugung von Bibliotheken neuartiger Polypeptide Verwendung findet (Marsden et al., 1998; Pacey et al., 1998). Die AT-Domäne des Borrelidin-PKS-Lademoduls weicht von der überwiegenden Mehrzahl der AT-Domänen dahingehend ab, das der Serinrest des aktiven Zentrums durch ein Cystein ersetzt ist, so daß das Motiv des aktiven Zentrums GXCXG (insbesondere GHCYG) lautet. In den meisten verfügbaren Typ-I-PKS-AT-Domänen-Sequenzen handelt es sich bei den konservierten Motiv des aktiven Zentrums um GXCXG; das gleiche Motiv wird in Lipasen, Fettsäurensynthasen und den meisten Thioesterasen beobachtet. Das nukleophile Serin wird durch Cystein in zwei NRPS-Thioesterasedomänen, insbesondere den für die Produktion von Mycobactin und Pyochelin verantwortlichen Synthetasen (Shaw-Reid et al., 1999), substituiert. Ein GXCXG-Motiv wird auch in einer Thioesterase ähnlichen Domäne des ORF1 im Bialaphos-Cluster beobachtet (Raibaud et al., 1991). Da es nicht möglich ist, zwischen den beiden Typen von Serincodons nur einen einzelnen Basenaustausch zu wechseln, wurde vorgeschlagen, das einen essentiellen Serinrest enthaltende aktive Zentren auf zwei Abstammungslinien von einem alten Vorgängerenzym liegen können, das anstatt eines Serins in seinem aktiven Zentrum ein Cystein aufwies (Brenner, 1988). Diese Ansicht könnte durch das Vorhandensein von Enzymen, die im aktiven Zentrum Cystein enthalten, unterstützt werden. Andererseits könnte es der Fall sein, daß Cystein in diesen aktiven Zentren auftritt, weil es möglich ist, von einem Typ von Serincodon auf den anderen über ein Cystein zu wechseln, das aktiv bleiben würde. Die AT-Domänen der PKS wählen eine bestimmte Carbonsäureeinheit als Substrat aus. Es konnte gezeigt werden, daß diese Selektivität mit bestimmten Motivsignaturen innerhalb der AT-Domäne korreliert (Reeves et al., 2001; WO 02/14482 ). Das AT-Domänenmotiv des Borrelidin-Lademoduls unterscheidet sich von allen bislang beschriebenen, was nicht überraschend ist, da es sich bei dieser AT-Domäne um die erste sequenzierte Domäne handelt, die eine alicyclische Dicarbonsäure auswählt. Die AT-Domänen für die Borrelidin-PKS-Verlängerungsmodule zeigen das erwartete Motiv GXSXG des aktiven Zentrums und enthalten ebenso jeweils die erwarteten Motive für die Auswahl von Malonyl-CoA bzw. Methylmalonyl-CoA (Reeves et al., 2001; WO 02/14482 ). Die malonyl-CoA-selektiven AT-Domänen (AT1, AT2 und AT6) zeigen eine sehr hohe Ähnlichkeit zueinander, und zwar sowohl auf der Protein- als auch der DNA-Ebene. Das gleiche gilt für die Methylmalonyl-CoA-selektiven AT-Domänen (AT3, AT4 und AT5); zwei dieser AT-Domänen (AT3 und AT4) weisen über den gesamten konservierten Bereich identische Aminosäuresequenzen auf. Die hohe Ähnlichkeit von AT5 zu AT3 bzw. AT4 stellt einen Beweis dafür dar, daß es sich bei der in Modul 5 ausgewählten Verlängerungseinheit um Methylmalonyl-CoA handelt und daß die so eingebaute Borrelidin-C12-Methylgruppe anschließend nach Einbau in die PKS zu einer Nitrilfunktion modifiziert wird.
Um zu demonstrieren, daß die PKS-abgeleitete Struktur von Borrelidin verändert werden kann, wird die AT- Domäne von Modul 4 (die von borA4 codierte AT-Domäne) durch die AT-Domäne von Modul 2 der Rapamycin-PKS (rapAT2) unter Verwendung einer Austauschstrategie ersetzt (siehe Beispiel 6). Dadurch erhält man den Stamm S. parvulus Tü4055/467. Nach Fermentation und LCMS-Analyse von Kulturextrakten dieser Mutante läßt sich feststellen, daß etwas Borrelidin produziert wird und ebenso eine neue, stärker polare Verbindung mit einem m/z-Wert, der 14 Einheiten unter dem von Borrelidin liegt, beobachtet wird. Dies stimmt mit dem Einbau einer Malonat- statt einer Methylmalonat-Verlängerungseinheit durch das Modul 4 der PKS überein, so daß 10-Desmethylborrelidin 3 produziert wird. Zusätzlich zur Produktion durch Domänenaustauscherverfahren wird 3 auch durch Einführen spezifischer Mutationen in das AT-Domänen-Selektivitätsmotiv des Modul 4 erzeugt (Reeves et al., 2001; WO 02/14482 )(siehe Beispiel 7). Eine solche Änderung wirkt sich auf die Selektivität der AT-Domäne dahingehend aus, daß sie vorzugsweise ein Substratmolekül von Malonyl-CoA gegenüber Methylmalonyl-CoA auswählt. So wird das Aminosäuremotiv YASH in Position 739 bis 742 der SEQ ID Nr.: 5 zu HAFH mutiert, so daß man den Stamm S. parvulus erhält. Bei der Fermentation und LCMS-Analyse von Kulturextrakten dieser Mutante wird festgestellt, daß neben Borrelidin eine neue, stärker polare Verbindung mit einem m/z-Wert, der 14 Einheiten unter dem von Borrelidin liegt, produziert wird. Diese neue Verbindung ist mit der oben beschriebenen identisch und ist somit mit dem Einbau einer Malonat- statt einer Methylmalonat-Verlängerungseinheit durch das Modul 4 der PKS unter Erhalt von 3 vereinbar.
Diese Ergebnisse weisen eindeutig darauf hin, daß die Borrelidin-PKS einer gentechnischen Manipulation sowie dem Austausch nativer Sequenz gegen die eines heterologen Stamms zugänglich ist. Der Fachmann ist sich dabei im Klaren darüber, daß die Biosynthesemanipulation der Borrelidin-PKS mit den oben beschriebenen Verfahren zur Produktion neuartiger borrelidinähnlicher Moleküle führt.
NICHT-PKS-GENE

Sowohl stromaufwärts als auch stromabwärts der für PKS codierenden Gene liegen andere offene Leseraster, die an der Biosynthese von Borrelidin beteiligt sind. Als offenes Leseraster wird eine Sequenz aus mindestens 100 zusammenhängenden Nukleotiden bezeichnet, die mit einem entsprechenden Startcodon beginnt und mit einem entsprechenden Stopcodon endet und die eine entsprechende Bevorzugung von Codons für proteincodierende Bereiche eines Organismus, dessen DNA reich an den Nukleotiden Guanin und Cytosin ist, aufweist. Sowohl in der stromaufwärts als auch in der stromabwärts der Borrelidin-PKS-Gene (borA1-borA6) liegenden DNA-Sequenz gibt es eine Reihe von offenen Leserastern, die durch Vergleich mit anderen Sequenzen in der NCBI-Datenbank identifiziert werden konnten (siehe 3). Die Einzelheiten der Nukleotidsequenzen dieser orfs sind in der nachfolgenden Tabelle 8 angegeben: Tabelle 8

Gen	Basen in SEQ ID Nr.: 1	Entsprechende Polypeptidsequenznummer
borB	7603-8397c	SEQ ID No. 8
borC	8397-9194c	SEQ ID No. 9
borD	9244-9996c	SEQ ID No. 10
borE	9993-11165c	SEQ ID No. 11
borF	11162-11980c	SEQ ID No. 12
borG	11992-13611c	SEQ ID No. 13

Gen	Basen in SEQ ID Nr.: 1	Entsprechende Polypeptidsequenznummer
borN	13608-15599c*	SEQ ID No. 14
borI	50739*-52019	SEQ ID No. 15
borJ	52113-53477	SEQ ID No. 16
borK	53486-54466	SEQ ID No. 17
borL	54506-56176	SEQ ID No. 18
borM	56181*-57098	SEQ ID No. 19
borN	57112-57858	SEQ ID No. 20
borO	57939-59966	SEQ ID No. 21
orfB1	2-313	SEQ ID No. 22
orfB2	501*-3107	SEQ ID No. 23
orfB3	3172-3810c	SEQ ID No. 24
orfB4	3935-4924c	SEQ ID No. 25
orfB5	5123-5953	SEQ ID No. 26
orfB6	5961-6518*c	SEQ ID No. 27
orfB7	6564*-7538	SEQ ID No. 28
orfB8	60153-60533c	SEQ ID No. 29
orfB9	60820-61003	SEQ ID No. 30
orfB10	61188*-61436	SEQ ID No. 31
orfB11	61526-61738	SEQ ID No. 32
orfB12	61767-62285c	SEQ ID No. 33
oriB13a	62750-63067c	SEQ ID No. 34
orfB13b	62586-62858c	SEQ ID No. 113
orfB14	63155-65071c	SEQ ID No. 35
orfB15	65374-65871	SEQ ID No. 36
orfB16	65942-68305c*	SEQ ID No. 37
orfB17	68290-68910c*	SEQ ID No. 38
orfB18	69681-70436	SEQ ID No. 39
orfB19	70445-71848	SEQ ID No. 40

Gen	Basen in SEQ ID Nr.: 1	Entsprechende Polypeptidsequenznummer
orfB20	71851-72957	SEQ ID No. 41
orfB21	73037-73942	SEQ ID No. 42
orfB22	73995-74534c	SEQ ID No. 43
[Anmerkung 1: c bedeutet, daß das Gen vom komplementären DNA-Strang codiert wird; Anmerkung 2: für die oben angegebenen offenen Leseraster ist jeweils das längste mögliche offene Leseraster beschrieben. Es kann manchmal passieren, daß mehr als ein potentielles Kandidaten-Startcodon identifiziert werden kann. Der Fachmann ist sich dessen bewußt und in der Lage, mögliche alternative Startcodons zu identifizieren. Diejenigen Gene, die mehr als ein mögliches Startcodon aufweisen, sind hier mit einem "*"-Symbol gekennzeichnet. Dabei wurde in allen Fällen das von uns angenommene Startcodon gekennzeichnet, doch ist dem Fachmann ersichtlich, daß es möglich sein kann, aktives Protein unter Verwendung eines alternativen Startcodons zu erzeugen, wobei unter Verwendung dieser alternativen Startcodons erzeugte Proteine auch als im Umfang der vorliegenden Offenbarung liegend angesehen werden. Anmerkung 3: Die SEQ ID Nr.: für ofrB13b wurde ursprünglich als SEQ ID Nr.: 34 bezeichnet, doch wurde zur besseren Klarheit eine separate Sequenz und SEQ ID Nr. zugeordnet.]

Potentielle Funktionen der vorhergesagten Polypeptide (SEQ ID Nr.: 7 bis 43) wurden aus der NCBI-Datenbank unter Verwendung einer BLAST-Suche erhalten. Die mit diesem Suchen erhaltenen besten Übereinstimmungen sind in der nachfolgenden Tabelle 9 aufgeführt: Tabelle 9

Gen	Signifikante Protein-Übereinstimmung	Score	GenBank-Zugangsnummer	Vorgeschlagene Funktion
orfB1	hypothetisches Protein, keine Vollängen-Treffer, hohe GC-Codon-Präferenz			unbekannt
orfB2	SCM2.07, hypothetisches Protein (S. coelicolor)	998	NP_625154	unbekannt
orfB3	^SCF76 ^. ⁰⁷ ^, hypothetisches Protein (S. coelicolor)	359	NP_624786	unbekannt
orfB4	SCF76.06, araC-Familie-Trans kriptionsregulator (S. coelicolor)	412	NP_624785	unbekannt
orfB5	^SCF76 ^. ^05c ^, nicht-Häm-Chlorperoxidase (S. coelicolor)	495	NP_624784	Nicht-Häm-Chlorperoxidase
orfB6	SCF76.09, hypothetisches Protein (S. coelicolor)	159	NP_624788	unbekannt
orfB7	^SCF76 ^. ⁰⁸ ^, hypothetisches Protein (S. coelicolor)	473	NP_624787	unbekannt
borB	PteH, Polyenmacrolid-Thioesterase (S. avermitilis)	244	BAB69315	Typ-II-Thioesterase
borC	XF1726, 2,5-Dichlor-2,5-cyclohexandien-1,4,-dioldehydrogenase (Xylella festidiosa Stamm 9a5c)e	160	NP_299015	Dehydrogenase
borD	FabG, 3-Oxoacyl-ACP-Reduktase-Vorläufer, (Plasmodium falciparum)	124	AAK83686	3-Oxoacyl-ACP-Reduktase
borE	FN1586, O-Succinylbenzoyl-CoA-Synthase, (Fusobacterium nucleatum subsp. Nucleatum ATCC25586)	88	NP_602402	Cyclase (Mitglied der Enolase-Superfamilie)
borF	vermutliches Lysophospholipase-Homolog (Arabidopsis thaliana)	57	NP_565066	unbekannt
borG	MTH1444, Acetolactat-Synthase, große Untereinheit (Methanothermobacter thermautotrophicus)	120	NP_276558	unbekannt
borH	PA3592, konserviertes hypothetisches Protein (Pseudomonas aeruginosa)	116	NP_252282	unbekannt
borI	TylH1, Cyclochrom P450, (Streptomyces fradiae)	285	AAD12167	Cyclochrom-P450-Oxidase
borJ	BioA, DAPA Aminotransferase, (Kurthia sp. 538-KA26)	346	BAB39453	Aminotransferase
borK	Adh1, Alkoholdeydrogenase (Aquifex aeolicus)	191	NP_213938	NAD/Chinonoxidoreduktase
borL	vermutliches Auxinreguliertes Protein GH3 (Arabidopsis thaliana)	92	NP_176159	unbekannt
borM	SCL6.10, hypothetisches Protein, ähnlich zur vermuteten F420-abhängigen Dehydrogenase (S. coelicolor)	108	CAB76875	F420-abhängige Dehydrogenase
borN	SC1C2.27, hypothetisches Protein, 2-Hydroxyhepta-2,4-dien-1,7-dioat-Isomerase-Superfamilie (S. coelicolor)	215	NP_629680	2-Hydoxyhepta-2,4-dien-1,7-dioat-Isomerase
borO	ThrS, Threonyl-tRNA-Synthetase (Macobacterium leprae)	627	NP_301410	Threonyl-/RNA-Synthetase, Selbstresistenzgen
orfB8	konserviertes hypothetisches Protein (Methanosarcina acetivorans-Stamm C2A). (Pfam ergibt schwache MarR-Familie)	37	NP_617908	möglicher Regulator
orfB9	vermutlicher anti-sigma-Faktor-Antagonist (Strep coelicolor)	113	NP_631789	anti-sigma-Faktor-Antagonist
orfB10	Konserviertes hypothetisches Protein (S. coelicolor)	95	NP_631790	unbekannt
orfB11	Hypothetisches Protein, keine Vollängen-Treffer, hohe GC-Codon-Präferenz			unbekannt
orfB12	Vermutlicher Regulator (S coelicolor)	92	NP_631494	Regulator (eines Zweikomponentensystems, vielleicht Membransensor)
orfB13a	^vermutliche Acetyltransferase (S. coelicolor);	58	NP_625155	vorläufige Zuordnung von Acetyltransferase in zwei Leserastern,
orfB13b	Vermutliche Acetyltransferase (S. coelicolor)	100	NP_625155	oder Sequenzierfehler – sollte in einem einzigen Leseraster sein
orfB14	Vermutliches Lipoprotein (S. coelicolor)	286	NP_631245	unbekannt
orfB15	Hypothetisches Protein (S. coelicolor)	41	NP_631424	unbekannt
orfB16	vermutliche Formiatdehydrogenase (S. coelicolor) (Pfam ergibt Übereinstimmung mit Molybkopterin-Oxidoreduktase/Formiatdehydrogenase-alpha-Untereinheit)	915	NP_626265	Oxidoreduktase
orfB17	konserviertes hypothetisches Protein S. coelicolor SCBAC25F8.16	175	NP_631569	unbekannt
orfB18	Unbekanntes Produkt (Streptomyces aureofaciens)	396	AAD23399	unbekannt
orfB19	vermutliche Aldehyddehydrogenase (S. aureofaciens)	635	AAD23400	Aldehyddehydrogenase
orfB20	vermutliche Alkoholdehydrogenase (S. coelicolor)	450	NP_630527	Alkoholdehydrogenase
orfB21	hypothetisches Protein (S. coelicolor)	395	NP_630528	unbekannt
orfB22	vermutliches calciumbindendes Protein (S. coelicolor)	160	NP_631687	calciumbindendes Protein

Die Analyse der Funktionen der mutmaßlichen Genprodukte deutet darauf hin, daß die Gene borB bis borO höchstwahrscheinlich die Begrenzungen des Borrelidin-Biosynthese-Clusters bilden. Beweise zur Unterstützung dieser These ergaben sich aus der Unterbrechung von borB2, wodurch das Niveau der Borrelidinproduktion von der des Wildtyp-Ausgangsstamms ununterscheidbar waren.
Darüber hinaus gibt es Homologe zu borB3 bis borB7 im auf dem Cosmid SCF76 codierten Streptomyces coelicolor A3(2)-Genom; und zwar sind dabei die gleichen offenen Leseraster, allerdings in einer anderen Reihenfolge, vorhanden. Die offenen Leseraster borB8 bis borB10 sind in gleicher Weise wie Homologe im S. coelicolor A3(2)-Cosmid SC5E3 angeordnet. Die offenen Leseraster borB18 bis borB21 weisen Homologe auf, die auf ähnliche Weise im S. coelicolor A3(2)-Cosmid SC1A2 angeordnet sind. Das offene Leseraster borB13 enthält eine Rasterverschiebung, womit eventuell vorhandenes Genprodukt höchstwahrscheinlich inaktiv wäre. Darüber hinaus läßt sich keine Funktion für die Produkte dieser offenen Leseraster während der Borrelidin-Biosynthese unmittelbar ableiten.
Startereinheit-Biosynthesegene
Um die Gene zu identifizieren, die an der Biosynthese der trans-Cyclopentan-1,2-dicarbonsäure-Startereinheit beteiligt sind, wurde jedes der Gene borB bis borN unterbrochen (z.B. siehe Beispiele 8-11). Dies wurde so durchgeführt, daß dabei die Möglichkeit polarer Effekte minimiert wurde, was durch die erfolgreiche in-trans-Komplementation mit einer Vollängenkopie des unterbrochenen Gens unter der Kontrolle des ermE*-Promotors, wodurch jeweils wieder ungefähr WT-Niveaus der Borrelidinproduktion erzielt wurden, verifiziert wurde.

Die unterbrochenen Mutanten wurden jeweils in Dreifachbestimmung wie in Beispiel 1 beschrieben kultiviert und die Borrelidinproduktion beurteilt. Neben diesen Kulturen wurde jede Mutante in Dreifachbestimmung kultiviert und nach 24 Stunden mit exogener Startersäure bis zu einer Endkonzentration von 1 mM supplementiert und die Borrelidinproduktion beurteilt. Die Extraktion und Analyse auf Borrelidin ergab die Daten, die in der nachfolgenden Tabelle 10 beschrieben sind: Tabelle 10

unterbrochenes Borrelidin-Biosynthese-Gen	Borrelidinproduktion ohne Zufütterung (% relativ zu WT)	Borrelidinproduktion mit Zufütterung (% relativ zu nicht gefüttertem WT)
Wildtyp (Kontrolle	100 ± 16, (100 ± 2)	363 ± 65, (269 ± 49)
borB	75 ± 11,(43 ± 20)	172 ± 51
borC	0, (10 ± 3)	933 ± 42
borD	7 ± 1,(0)	75 ± 15
borE	2 ± 1	122 ± 23
borF	3 ± 2	201 ± 52
borG	11 ± 1, (32 ± 3)	1532 ± 142
borH	17 ± 2, (23 ± 13)	203 ± 40
borI	0, (0)	0, (0)
borJ	0, (0)	0, (0)
borK	0, (6 ± 1)	319 ± 54, (464 ± 18)
borL	0, (0)	408 ± 70, (399 ± 69)
borM	0, (6 ± 3)	461 ± 29, (553 ± 66)
borN	25 ± 9,(34 ± 3)	68 ± 12, (46 ± 9)
borO	N/A	N/A
[Anmerkung 1: Die Werte in Klammern deuten die wiederholte Durchführung einiger Experimente an; Anmerkung 2: N/A = nicht zutreffend]

Aufgrund der Daten in Tabelle 10 ist dem Fachmann ersichtlich, daß die Genprodukte borC-F und K-M für die Biosynthese von trans-Cyclopentan-1,2-dicarbonsäure essentiell bzw. sehr wichtig sind, da diese Mutanten ohne die Zugabe exogener Startersäure keine oder nur sehr geringe Niveaus an Borrelidin produzierten, wobei sie bei Zugabe exogener Startersäure Borrelidin auf Niveaus produzierten, die die des WT-Organismus erreichten oder darüber hinaus gingen. Darüber hinaus scheinen die Genprodukte BorG, H und N an der Biosynthese der Startereinheit beteiligt, jedoch nicht essentiell dafür zu sein, da sie signifikant geringere Niveaus an Borreli din produzierten, außer wenn exogene Startersäure zugegeben wurde, wonach sie Borrelidin auf Niveaus produzierten, die die des WT-Organismus erreichten oder darüber hinaus gingen; dies war insbesondere im Fall der borG-Mutante zu beobachten.
Die normale Stoffwechselfunktion von borN-Homologen besteht in der Produktion von 2-Oxohepta-3-en-1,7-diaot 10, einem Schlüsselschritt im Katabolismus von Thyrosin über 4-Hydroxyphenylessigsäure 9 (9) (Prieto et al., 1998). Daher kann es sich bei 10 um eine Zwischenstufe im Biosyntheseweg zu trans-Cyclopentan-1,2-dicarbonsäure handeln. Die Fähigkeit der in borN unterbrochenen Mutante zur Produktion von Borrelidin, wenn auch auf einem reduzierten Niveau, liegt höchstwahrscheinlich im Vorhandensein eines Homologs an anderer Stelle im Genom, das im Katabolismus von Thyrosin während des Primärstoffwechsels genutzt wird.
Die Zwischenstufe 10 enthält die gesamte benötigte Funktionalität für die letztendliche Bildung von trans-Cyclopentan-1,2-dicarbonsäure. Der wahrscheinlichste nächste Schritt der Biosynthese besteht in der Reduktion der 3-En-Position in einer ähnlichen Reaktion wie die, die durch eine Enoylreduktase katalysiert wird. Für diesen Schritt verantwortliche Enzyme sind möglicherweise BorC, BorD, BorK oder BorM; diese Enzyme sind alle an der Borrelidinstartereinheit-Biosynthese beteiligt, wie anhand der Daten in Tabelle 10 zu sehen ist. Das entstandene 2-Oxohepta-1,7-dioat 11 ist ein mögliches Substrat für die Cyclisierung über die Bildung einer neuen C-C-Bindung zwischen C6 und C2. Ein weiteres mögliches Substrat für diese Cyclisierung wäre 2-Hydroxyhepta-1,7-dioat 12 oder irgendeine aktivierte Form davon. Diese würde vermutlich aus 11 durch die Wirkung einer Oxidoreduktase, wie beispielsweise BorC, BorD oder BorM, gebildet.
Der Schlüsselcyclisierungsschritt wird höchstwahrscheinlich von BorE katalysiert, das Ähnlichkeit mit O-Succinylbenzoyl-CoA-Synthase sowie Chlormuconat-Cycloisomerase zeigt. Diese Enzyme gehören zur Enolase-Superfamilie, deren Mitglieder die gemeinsame Fähigkeit teilen, die Ausbildung eines Anions am Kohlenstoffatom neben einer Carboxylatgruppe zu stabilisieren (Schmidt et al., 2001). Ferner ist zu bemerken, daß es sich bei dem Substrat für Muconat-Cycloisomerase um ein Hexa-1,6-dioat handelt, dessen Gesamtstruktur Ähnlichkeit zu 11 und 12 aufweist. Die Abspaltung eines Protons und Ausbildung eines Anionenäquivalenz an C6 von 11 oder 12 (oder einer aktivierten Form davon, z.B. 13) mit anschließender Cyclisierung zu C2 liefert die korrekt substituierte Cyclopentanringstruktur, obwohl die Zwischenschaltung von 11 als Substrat eine gewisse weitere Prozessierung des substituierten Cyclopentans, höchstwahrscheinlich über die Eliminierung von Wasser unter Erhalt der symmetrischen Cyclopent-1-en-1,2-dicarbonsäure, oder möglicherweise der Δ¹-ungesättigten Verbindung, Cyclopent-1-en-1,2-dicarbonsäure, erfordern würde. Allerdings führte das Zufüttern von Cyclopent-1-en-1,2-dicarbonsäure oder Ethylestern davon an S. parvulus Tü4055-Stämme mit Unterbrechung eines der Gene borC-E oder an WT-Stämme zu keiner Borrelidinproduktion oder zu keiner erhöhten Borrelidinproduktion im Vergleich mit den nicht gefütterten Kontrollen. Diese Daten deuten darauf hin, daß es sich bei dieser Verbindung wahrscheinlich nicht um eine Zwischenstufe bei der Startereinheitbiosynthese handelt und daß das Substrat für BorE möglicherweise das 2-Hydroxyhepta-1,7-dioa 12 oder eine aktivierte Form davon ist (z.B. 13). Ein mutmaßlicher Weg für den Biosyntheseweg zu trans-Cyclopentan-1,2-dicarbonsäure ist in 4 dargestellt.
Die für die Biosyntheseschritte zu trans-Cyclopentan-1,2-dicarbonsäure benötigte Kombination spezifischer Gene ist nicht klar, doch werden diese Gene wahrscheinlich durch eine bestimmte Kombination von borC-H, borK, borM und borN codiert. Das Fehlen bestimmter Homologe von Genen, die am Katabolismus von 4-Hydroxyphenylessigsäure 9 beteiligt sind und die im Weg vor BorN wirken würden, ist höchstwahrscheinlich ein Anzeichen dafür, daß diese Aufgaben von primären Stoffwechselgenen durchgeführt werden. Die Zugabe exogener trans-Cyclopentan-1,2-dicarbonsäure an S. parvulus Tü4055 und verwandte Stämme erhöht den Titer von Borrelidin unter unseren Bedingungen um etwa das 2- bis 3fache, was darauf hindeutet, daß die Biosynthese der Startersäure einen limitierenden Faktor in der Borrelidin-Biosynthese darstellt. Diese Daten sind mit dem primären metabolischen Abbau von Thyrosin als Quelle für trans-Cyclopentan-1,2-dicarbonsäure vereinbar.
In einem Versuch zur weiteren Klärung davon, welche Gene für die Biosynthese der Startereinheit besonders verantwortlich sein können, wurde ein Reihe von Cokulturexperimenten mit Kombinationen der verschiedenen Mutanten durchgeführt – wobei man wissen muß, daß die Genprodukte von borI und borJ spezifisch an der Bildung der C12-Nitrilgruppierung beteiligt sind, was durch die im folgenden Abschnitt unten angegebenen Daten in Kombination mit den Daten aus Tabelle 10 aufgeklärt wird. Zusammenfassend ist die Cokultur der Mutanten borE & borD sowie borE & borM nicht im Stande, Borrelidin in irgend einer Form zu produzieren, wohingegen die Cokultur der Mutanten borM & borI und borM & borK Borrelidin auf ungefährem WT-Niveau produzierte. Diese Daten zeigen zusammen mit denen in Tabelle 10 sowie unten eindeutig, daß borD, borE und borM an der Startereinheitbiosynthese beteiligt sind, wohingegen borI und möglicherweise borK an der Bildung der Nitrilgruppierung am C12 von Borrelidin beteiligt sind.
Aus den Daten in Tabelle 10 wird deutlich, daß die exogene Zugabe von trans-Cyclopentan-1,2-dicarbonsäure ausreicht, um die Borrelidinproduktion in Mutanten, bei denen an der Startereinheitbiosynthese beteiligte Gene unterbrochen wurden, ungefähr auf oder besser als das WT-Niveau wieder herzustellen. Diese Daten deuten darauf hin, daß die aktive Aufnahme zugesetzter Carbonsäure durch S. parvulus Tü4055 kein Problem darstellt und das eine Aktivität vorliegt, die zur Umwandlung der Carbonsäure zu einem CoA-Thioester-Äquivalent fähig ist. Somit ist es für den Fachmann mit dem Wissen um die Technologien der Mutasynthese offensichtlich, daß die Zugabe von exogenen Carbonsäuren zu einer der oben erwähnten Mutanten, beispielsweise dem in Beispiel 8 beschriebenen borE Stamm S. parvulus Tü4055/borE:aac3(IV), zur Produktion von Borrelidinanalogen führen kann, bei denen die Startereinheit-Carbonsäuregruppierung durch eine von der exogen zugesetzten Carbonsäure abgeleitete Gruppierung ersetzt ist.
Zur Untersuchung dieser Möglichkeit wurde dem Stamm S. parvulus eine trans-Cyclobutan-1,2-dicarbonsäure gemäß der in Beispiel 1 beschriebenen Vorschrift zugefüttert und der Stamm anschließend wie in Beispiel 4 beschrieben analysiert. Die Struktur 18, beschrieben in 10, zeigt die vom Zufüttern dieser Carbonsäure erhaltene neue Borrelidinstruktur; diese Verbindung 18 zeigte den erwarteten UV-Chromophor für Borrelidin, eluierte jedoch bei einer früheren Retentionszeit und zeigte die erwartete Masse bei LCMS (m/z = 474,3 [M – H]^–). Die Verifizierung dieser Methodik erfolgte anhand der Herstellung, Isolierung und Charakterisierung von 18 (Beispiel 16). Dem Fachmann ist ersichtlich, daß auch andere Carbonsäuren in ähnlichen Zufütterungsexperimenten verwendet werden könnten, um weitere neue Borrelidinanaloge bereitzustellen. Zwar besteht die Möglichkeit, daß nicht alle Carbonsäuren unter Verwendung der genau gleichen hier beschriebenen Methodik eingebaut würden, doch sind dem Fachmann eine Reihe verfügbarer Verfahren bekannt, um den Einbau von zugefütterten Startereinheiten zu verbessern.

Zusätzlich zur Verwendung des in borE deletierten Stamms wurde beobachtet (siehe Tabelle 10), daß der Stamm S. parvulus tü4055/borG:aac3(IV), in dem borG unterbrochen wurde, bei Zufüttern der natürlichen Startereinheit der bor-PKS, trans-Cyclopentan-1,2-dicarbonsäure, Borrelidin mit Titern produzierte, die signifikant höher waren als die beim gefütterten (4facher Anstieg) oder nicht gefütterte (15facher Anstieg) beobachteten Titer. Um dies weiter zu untersuchen, wurde dieses Experiment unter Verwendung sowohl der natürlichen als auch einer nicht natürlichen Startersäure als exogene Substrate, die jeweils parallel dem Wildtyp, der borE-Mutante und der borG-Mutante zugefüttert wurden, wiederholt. Die erhaltenen Daten sind in Tabelle 11 beschrieben. Tabelle 11

	nicht gefüttert	gefüttert mit 1 mM Cyclopentan-trans-1,2-dicarbonsäure	gefüttert mit 1 mM Cyclobutan-trans-1,2-dicarbonsäure
S. parvulus Tü4055	2,3 mg/l	6,6 mg/l	-
S. parvulus	0	4,7 mg/l	2,2 mg/l
Tü4055/borE:acc3(IV)
S. parvulus	0	88,9 mg/l	43,0 mg/l
Tü4055/borG:aac(IV)

Wie man anhand der Tabelle 11 erkennen kann, führt die Verwendung von S. parvulus Tü4055/borG:aac3(IV) anstelle von S. parvulus Tü4055/borE:acc3(IV) bei der Mutasynthese zu einem ungefähr 19fachen Anstieg des Titers, und zwar produziert mit der natürlichen Startersäure gefütterter S. parvulus Tü4055/borG:aac(IV) 38mal mehr Borrelidin A als der Wildtyp allein bzw. 13mal mehr Borrelidin A als der mit der gleichen Menge an Cyclopentan-trans-1,2-dicarbonsäure gefütterte Wildtypstamm.
Diese Daten weisen eindeutig darauf hin, daß die Verwendung des Stamms S. parvulus Tü4055/borG:aac(IV) für Mutasyntheseexperimente sich günstig auf die Produktion verbesserter Titer von Borrelidinanalogen auswirkt. Dieses Verfahren kann allgemein sowohl für die Produktion von Borrelidin als auch von Borrelidinanalogen angewandt werden.
Auf der Grundlage dieser Erkenntnis wurden die Zufütterungsexperimente mit alternativen Carbonsäuren in S. parvulus Tü4055/borG:aac(IV) wiederholt und unter Einschluß von 2,3-Dimethylbernsteinsäure und 2-Methylbernsteinsäure erweitert; die aus dem Einbau dieser alternativen Startereinheiten abgeleiteten neuen Verbindungen, 19 bzw. 20, sind in 10 beschrieben.
Bildung der Nitrilgruppierung an C12
Die Sequenzanalyse der AT-Domäne des Borrelidin-PKS-Moduls 3 deutet darauf hin, daß es sich bei dem für die dritte Runde der Kettenverlängerung verwendeten Substrat um Methylmalonyl-CoA handelt. Somit geht das Kohlenstoffatom der Nitrilgruppierung höchstwahrscheinlich aus der Methylgruppe des Methylmalonyl-CoA hervor. Dies wurde durch Zufütterungsexperimente mindestens teilweise stabilen Isotopen verifiziert. Die Zufütterung von [2,3-¹³C₂]-Natriumpropionat zu S. parvulus Tü113 ergab Borrelidin, das eine intakte Markierung der Kohlenstoffatome an C4-C24, C6-C25, C8-C26, C10-C27 und C12-C28 und identische spezifische Einbauten (wie im Rahmen unserer experimentellen Verfahren bestimmt) zeigte, wie erwartet (2). Diese Daten deuten an, daß die Umwandlung der C12-Methylgruppe entweder während des Kettenzusammenbaus beim oder nach dem Einbau der dritten Verlängerungseinheit erfolgt oder nach dem Zusammenbau der Polyketidkette und der Freisetzung von der PKS stattfindet.
Diese Daten weisen eindeutig darauf hin, daß die Ver wendung des Stamms S. parvulus Tü4055/borG:aac(IV) für Mutasyntheseexperimente sich günstig auf die Produktion verbesserter Titer von Borrelidinanalogen auswirkt. Dieses Verfahren kann allgemein sowohl für die Produktion von Borrelidin als auch von Borrelidinanalogen angewandt werden.
Auf der Grundlage dieser Erkenntnis wurden die Zufütterungsexperimente mit alternativen Carbonsäuren in S. parvulus Tü4055/borG:aac(IV) wiederholt und unter Einschluß von 2,3-Dimethylbernsteinsäure und 2-Methylbernsteinsäure erweitert; die aus dem Einbau dieser alternativen Startereinheiten abgeleiteten neuen Verbindungen, 19 bzw. 20, sind in 10 beschrieben.
Bildung der Nitrilgruppierung an C12
Die Sequenzanalyse der AT-Domäne des Borrelidin-PKS-Moduls 3 deutet darauf hin, daß es sich bei dem für die dritte Runde der Kettenverlängerung verwendeten Substrat um Methylmalonyl-CoA handelt. Somit geht das Kohlenstoffatom der Nitrilgruppierung höchstwahrscheinlich aus der Methylgruppe des Methylmalonyl-CoA hervor. Dies wurde durch Zufütterungsexperimente mindestens teilweise stabilen Isotopen verifiziert. Die Zufütterung von [2,3-¹³C₂]-Natriumpropionat zu S. parvulus Tü113 ergab Borrelidin, das eine intakte Markierung der Kohlenstoffatome an C4-C24, C6-C25, C8-C26, C10-C27 und C12-C28 und identische spezifische Einbauten (wie im Rahmen unserer experimentellen Verfahren bestimmt) zeigte, wie erwartet (2). Diese Daten deuten an, daß die Umwandlung der C12-Methylgruppe entweder während des Kettenzusammenbaus beim oder nach dem Einbau der dritten Verlängerungseinheit erfolgt oder nach dem Zusammenbau der Polyketidkette und der Freisetzung von der PKS stattfindet. Aufgrund den Borrelidin-Biosynthese-Genen zugewiesenen funktionalen Zuordnungen in Verbindung mit den in der Tabelle 10 beschriebenen Genunterbrechungsdaten werden sowohl borI und borJ eindeutig mit der Bildung der Nitrilgruppierung an C12 in Zusammenhang gebracht, während dies bei anderen Genen, wie beispielsweise borK, ebenso der Fall sein könnte.
Die Cytochrom-P450-Hydroxylase BorI besitzt die größte Ähnlichkeit mit TylHI, das die Hydroxylierung einer exocyclischen Methylgruppe des Thylosin-Macrolactons vor der Addition einer Desoxyhexosegruppierung katalysiert (Fouces et al., 1999). Man nimmt daher an, daß BorI die Oxidation der C12-Methylgruppe während der Borrelidin-Biosynthese katalysiert. In Übereinstimmung damit ist die bolI^–-Mutante S. parvulus Tü4055/borI::aac3(IV) nicht in der Lage, Borrelidin zu produzieren, reichert jedoch ein neues Produkt 14 (6) an, das weniger polar als Borrelidin ist. 14 wird schnell zu Borrelidin transformiert, wenn es der borE^–Mutante S. parvulus Tü4055/borE::acc3(IV) zugefüttert wird, der die Fähigkeit zur Synthese der PKS-Startereinheit fehlt, deren restliche Borrelidin-Biosynthesegene jedoch intakt sind. Die Fermentation von S. parvulus Tü4055/borI::acc3(IV) mit anschließender Extraktion und Isolierung ergab ~30 mg 14 (Beispiel 14). Die Analyse der vollständigen Struktur von 14 führte zur Identifizierung als 12-Desnitril-12-methylborrelidin (prä-Borrelidin). Dies ist mit der vorgeschlagenen Rolle von BorI bei der Borrelidin-Biosynthese vereinbar und öffnet einen Weg zu neuen Borrelidinanalogen, bei denen am C12 des Macrolactonrings eine Methylgruppe gebunden ist.
Man nimmt an, daß die mutmaßliche PLP-abhängige Aminotransferase BorJ die Einführung eines Stickstoffatoms in Borrelidin an der aktivierten C28-Stellung, wahrscheinlich über eine C12-Formylgruppierung, katalysiert. In Übereinstimmung damit produziert die borJ Mutante S. parvulus Tü4055/borJ::aac3(IV) kein Borrelidin und reichert eine neue Verbindung an, die stärker polar als Borrelidin ist. Diese neue Verbindung wird nicht zu Borrelidin transformiert, wenn sie der Mutante S. parvulus Tü4055/borJ::aac3(IV) zugefüttert wird, was darauf hindeutet, daß es sich wahrscheinlich um einen Shunt-Metaboliten statt eine Zwischenstufe der Borrelidin-Biosynthese handelt. Die Fermentation von S. parvulus Tü4055/borJ::aac3(IV) gestattete die Isolierung von 17 mg der angereicherten Verbindung (Beispiel 15). Die ausführliche Strukturanalyse identifizierte die angereicherte Substanz als 12-Desnitril-12-carboxylborrelidin 2.
Zusätzlich zu den über die Mutation der Borrelidin-Biosynthesegene isolierten Verbindungen wird 12-Desnitril-12-formyl 15 aus dem Fermentationsüberstand von S. parvulus Tü4055 isoliert. Die für diese Experimente verwendeten Fermentationsmedien und Bedingungen unterscheiden sich von den bislang hier beschriebenen, sind jedoch zur Maximierung der Borrelidinproduktion vorgesehen. Wir schlagen vor, daß dieses veränderte Medium zusammen mit einem Abfall der Konzentration an gelöstem Sauerstoff, der während dieser spezifischen Fermentation beobachtet wird, die Anreicherung von 15 förderte. 15 wird schnell zu Borrelidin transformiert, wenn es der Mutante S. parvulus Tü4055/borE::aac3(IV) zugefüttert wird, der die Fähigkeit zur Synthese der PKS-Startereinheit fehlt, in der jedoch die restlichen Borrelidin-Biosynthesegene in intakter Form erhalten sind.
Die obigen Daten veranlaßten uns, einen Biosyntheseweg zur Nitrilgruppierung des Borrelidin vorzuschlagen, wie er in 6 dargestellt ist. Dabei wird der C12-Methylkohlenstoff von prä-Borrelidin 14 zunächst durch borI oxidiert, um eine allylische Hydroxylgruppe am C28 einzuführen (16). Diese Hydroxylgruppe wird dann zur an C12 gebundenen Formylgruppierung umgewandelt (15), wobei ein aus der folgenden Gruppe ausgewähltes Verfahren verwendet wird: spontane Oxidation (einschließlich durch etwas Hintergrundenzym vermittelte Oxidation), die Wirkung eines spezifischen Gen des Borrelidin- Biosynthese-Genclusters; Genproduktkandidaten sind somit BorI selbst, das in einer multifunktionellen Weise wirkt und über die Bildung einer gem-Diol-Struktur an C12 mit anschließender Dehydratisierung wirkt; oder als Alternative über eines der für die Oxidoreduktase codierenden Gene, wie z.B. borC oder borK. Es wird angenommen, daß es sich beim nächsten Schritt um die BorJ-katalysierte Transaminierung von 15 handelt, um eine Stickstoffatom an C28 in Form eines Amins einzuführen, und zwar über einen durch Pyridoxaminphosphat vermittelten Vorgang. Anschließend durchläuft das mutmaßliche Produktamin 17 eine Oxidation, und zwar möglicherweise spontan, jedoch höchstwahrscheinlich über eine Enzymaktivität, wie z.B. borI (gewisse Parallelen lassen sich zur Biosynthese von Nitrilen in Pflanzen ziehen (Celenza, 2001; Hahn et al., 1999; Nielson und Møller, 1999)), oder über die Produkte eines der für die Oxidoreduktase codierenden Gene, z.B. borC oder borK, oder über eine allgemeine Oxidoreduktase innerhalb des Proteons.
Um diesen vorgeschlagenen Weg genauer zu untersuchen, wurden eine Reihe von Biotransformationsexperimenten durchgeführt, wobei prä-Borrelidin 14 als Substrat zur Untersuchung der Wirkung von borI-K einzeln und in Kombination sowie pEM4 als Vektor und S. albus J1074 (Chater & Wilde, 1980) als Expressionsstamm verwendet wurden. Die individuelle Expression von borI oder borJ ergab keine Borrelidinproduktion bei Zugabe von 14. Das zugegebene 14 wurde lediglich während der Biotransformation mit borI (und in keinem der Kontrollexperimente) verbraucht; es wurde nachgewiesen, daß das zugesetzte 14 zum Shunt-Metaboliten 2 umgewandelt wurde. Allerdings wurde das zugesetzte 14 durch die Coexpression von borI & borJ zu Borrelidin umgewandelt. Somit sind anscheindend entweder BorI oder allgemeine Proteomaktivitäten in S. albus in der Lage, die vorgeschlagene Aminzwischenstufe 17 im Borrelidin-Biosyntheseweg zu oxidieren. Zusätzlich zur Zufütterung von prä-Borrelidin 14 wurde den drei oben beschriebenen Stämmen auch 12-Desnitril-12-carboxylborrelidin 2 zugefüttert. Dabei wurde in keinem dieser Experimente eine Umwandlung von 2 zu Borrelidin beobachtet, was die Idee, daß es sich bei 2 um einen Shunt-Metaboliten handelt, bekräftigt.
Eine ausführliche Untersuchung genomischer DNA aus drei borrelidinproduzierenden Stämmen, S. rochei ATCC23956, S. parvulus Tu113 und S. parvulus Tü4055, mit zahlreichen Restriktionsverdauungen und anschließender Southern-Blot-Analyse deutet darauf hin, daß die Borrelidin-Biosynthese-Gencluster dieser drei Organismen sehr eng konserviert sind. Anscheinend sind sich daher die Borrelidin-Biosynthesewege dieser Stämme sehr ähnlich. Diese Annahme gestattet uns, die Anwendbarkeit der obigen Daten, die aus unterschiedlichen Stämmen erhalten werden, auf einen einzigen Biosyntheseweg in Betracht zu ziehen.
Dem Fachmann ist ersichtlich, daß die Manipulation der an der Bildung der C12-Nitrilgruppierung des Borrelidin beteiligten Gene, beispielsweise borI oder borJ, allgemein ein geeignetes Verfahren zur Herstellung neuartiger mit Borrelidin verwandter Moleküle und Borrelidinderivate mit veränderter Funktionalität an C12 darstellt. Darüber hinaus kann die Übertragung dieser Gene auf andere Organismen, die andere natürliche oder gentechnisch konstruierte Polyketidprodukte produzieren, den Einbau von Nitrilgruppierungen in derartige Verbindungen gestatten.
Als Erweiterung der vorliegenden Arbeit werden im Stamm S. parvulus Tü4055/borG::aac3(IV) Unterbrechungen in borI und borJ separat durchgeführt, so daß die doppelt mutierten Stämme S. parvulus Tü4055/borG::aac3(IV)/borI::hyg bzw. S. parvulus Tü4055/borG::aac3(IV)/borJ::hyg (Beispiel 12 bzw. 13) erhalten werden. Diesen Stämmen werden alternative Carbonsäuren, trans-Cyclopentan-1,2-dicarbonsäure, 2,3-Di methylbernsteinsäure und 2-Methylbernsteinsäure, zugeführt (wie oben beschrieben), wobei sich herausstellt, daß diese Stämme die mutasynthetischen Borrelidinanalogen produzieren, die anstelle der Nitrilgruppe entweder eine Methyl-(21, 22 bzw. 23) oder eine Carboxylfunktion am C12 (24, 25 bzw. 26) tragen und ebenso von alternativen Startereinheiten, die den exogen zugeführten Carbonsäuren entsprechen, abgeleitet sind. Diese orthogonale Bibliothek neuer Verbindungen ist in 11 beschrieben, wobei die beobachteten UV-Chromophoren und die Massenspektrumdaten für jede Verbindung dargestellt sind.
BEISPIELE
Allgemeine Verfahren
Restriktionsenzyme, andere molekularbiologische Reagenzien, Antibiotika und Chemikalien wurden aus handelsüblichen Quellen bezogen. Die Restriktionsendonukleaseverdauung und Ligation wurden nach Standardverfahren durchgeführt (Sambrook, J. et al., 1989).
Beispiel 1: Fermentation von S. parvulus-Stämmen
Das folgende Verfahren eignet sich allgemein zur Kultivierung von S. parvulus zur Herstellung von Borrelidin und/oder Borrelidinanalogen:
Ein Vorkulturkolben mit NYG-Medium (30 ml in einem 250-ml-Erlenmeyerkolben) wurde mit einer Arbeitsstammlösung (0,5 ml) angeimpft. Das NYG-Medium enthält in entionisiertem Wasser: Fleischextrakt (0,3%), Bacto-Pepton (0,5%), Glukose (1%) und Hefeextrakt (0,5%). Nach 2tägigem Schütteln in einem Rotationsinkubator (Radius: 2 inch; 30°C; 250 UpM) wurde die erhaltene Creme-Kultur zur Animpfung von PYDG-Produktionsmedium (30 ml in einem 250-ml-Erlenmeyerkolben; 10% Animpfkultur) verwendet. Das PYDG-Medium enthält pro Liter ent ionisiertem Wasser: peptonisierten Milchnährstoff (1,5%), Hefeautolysat (0,15%), Dextrin (4,5%) und Glukose (0,5%), eingestellt auf pH 7,0. Nach 7 Tagen Schütteln auf einem Rotationsinkubator (Radius: 2 inch; 30°C; 250 UpM) wurde die Kultur zur Analyse, wie in Beispiel 4 beschrieben, oder für Isolierungszwecke je nach Bedarf geerntet. Zur quantitativen Analyse wurden diese Experimente in Dreifachbestimmung durchgeführt.
Das folgende Verfahren eignet sich zur Zufütterung exogener Carbonsäuren an S. parvulus-Stämme:
Der S. parvulus-Stamm wurde wie oben beschrieben kultiviert. Nach 24stündigem Wachstum in PYDG-Produktionsmedium wurde die gewählte Carbonsäure in Form einer einmaligen Zugabe von 50 μl (0,6 M Lösung in 70% Methanol nach Neutralisierung mit 5 N NaOH) zugegeben. Die erhaltene Kultur wurde nach insgesamt 5 Tagen Fermentation geerntet und wie in Beispiel 4 beschrieben analysiert. Für quantitative Untersuchungen wurden diese Experimente in Dreifachbestimmung durchgeführt, wobei die äquivalenten gefütterten und nicht gefütterten WT-Stämme als Kontrollen dienten.
Beispiel 2: Cryokonservierung von S. parvulus-Stämmen
Arbeitsstammlösungen
Arbeitsstammlösungen vegetativer Mycele wurden durch Mischen einer 2 Tage alten in NGY-Medium angezogenen Vorkultur (0,5 ml) mit Cryokonservierungsstoff (0,5 ml) hergestellt. Der Cryokonservierungsstoff besteht aus 20% Glycerin und 10% Lactose in entionisiertem Wasser.
Sporenstammlösungen
Stämme von S. parvulus wurden auf HA-Agarplatten bei 30°C inkubiert. Nach 14 Tagen wurden die erhaltenen Sporen von einer einzelnen Platte geerntet und in 1 ml Cryokonservierungsstoff suspendiert. HA-Agar enthält in entionisisertem Wasser: 0,4% Hefeestrakt, 1% Malzextrakt, 0,4% Dextrose und 1,5% Agar, eingestellt auf pH 7,3.
Beispiel 3: Klonierung des Borrelidin-Biosynthese-Genclusters und Unterbrechung von borA2 & borA3
Erzeugung der Cosmidbibliothek
Eine Cosmidbibliothek wurde im Cosmidvektor pWE15 unter Verwendung des Gigapack^® III-Kits nach dem Handbuch des Herstellers (Stratagene) konstruiert. Dabei wurde chromosomale DNA aus S. parvulus Tü4055 nach Standardvorschriften (Kieser et al., 2000) extrahiert und vor der Klonierung in pWE15 mit Sau3AI behandelt. Eine Reihe der erhaltenen E. coli-Transfomanten (3300) wurden aufgenommen und in 96-Loch-Mikrotiterplatten mit Luria Broth (LB)-Medium (0,1 ml pro Loch) mit Ampicillin (100 μg/ml) überführt. Die erhaltenen Klone wurden auf Luria-Agar (LA)-Platten mit Ampicillin (100 μg/ml) Replika plattiert. Nach Inkubation über Nacht bei 37°C wurden Kolonien auf Nylonmembranfilter zur in-situ-Koloniehybridisierungsanalyse nach veröffentlichten Vorschriften überführt (Sambrook et al., 1989).
Absuchen der Bibliothek
Die Cosmidbibliothek wurde unter Verwendung einer Sonde, die mit dem DIG-DNA-Markierungs- und Nachweiskit (Roche) nach den Anweisungen des Herstellers erzeugt wurde, abgesucht. Bei der verwendeten Sonde handelte es sich um ein 1,7 kbp großes BglII-BamHI-Fragment, das dem Gen entnommen wurde und das für das Modul 6 der dritten Untereinheit der Oleandomycin-PKS aus Streptomyces antibioticus codiert (Swan et al., 1994).
Unterbrechung des Borrelidin-Biosynthese-Genclusters
Cosmide, die beim wie oben beschriebenen Absuchen eine positive Reaktion ergaben, wurden mit BamHI verdaut, und Fragmente von weniger als 3 kbp wurden in pOJ260 (Bierman et al., 1992) subkloniert. Diese wurden anschließend zur Transformation von Protoplasten von S. parvulus Tü4055, wie in Beispiel 5 beschrieben, verwendet. Die erhaltenen Transformanten wurden anschließend auf ihre Fähigkeit zur Produktion von Borrelidin beurteilt. Dabei waren zwei Klone Borrelidin-Nichtproduzenten; beide wurden von coeBor32A2 erhalten und enthalten eine für eine modulare PKS typische Sequenz. Die restlichen Cosmide wurden dann unter Verwendung von aus den beiden BamHI-Fragmenten erhaltenen Sonden abgesucht, was zur Identifizierung des überlappenden Cosmids cosBor19B9 führte, das den Rest des Borrelidin-Biosynthese-Clusters enthielt.
Sequenzierung von cosBor32A2 und cosBor19B9
Die Cosmide cosBor32A2 und cosBor19B9 wurden in E. coli DH10B transformiert und die erhaltenen Klone bei 37°C in 2 × TY-Medium (30 ml) mit Ampicillin kultiviert. Nach 15 Stunden wurden die Zelle geerntet und unter Verwendung von Qiagen-Tip 100-Kits Cosmid-DNA präpariert. Ungefähr 5 μg der Cosmid-DNA wurde mit Sau3A1 (1 U) verdaut. Im Abstand von 2, 4, 6, 8 & 10 Minuten nach Zugabe des Enzyms wurden Proben entnommen und im gleichen Volumen eiskaltes 0,5 M EDTA gequencht. Die Proben wurden gemischt und anschließend durch Gelelektrophoräse analysiert, wobei die Fragmente mit einer Größe von 1,5-2,0 kbp aus dem Gel isoliert wurden. Die Fragmente wurden in linearisierten und dephosphorylierten pHSG397 (Takeshita et al., 1987) kloniert und in E. coli DH10B transformiert. Die erhaltenen Klone mit Insertion wurden in x TY-Medium (2 ml) mit Chloramphenicol (30 μg/ml) kultiviert und unter Verwendung von Wizard-Kits (Promega) aufgereinigt.
Die DNA-Sequenzierung wurde unter Verwendung eines Ap plied Biosystems 800 Molecular Biology CATALYST-Roboters zur Durchführung der Didesoxyterminatorreaktionen durchgeführt, und die Reaktionsansätze wurden anschließend in das automatische Sequenziergerät ABI Prism 3700 (Applied Biosystems) geladen. Die rohren Sequenzdaten wurden mit dem Staden-Softwarepaket prozessiert. Der Zusammenbau und das Editieren der Contigs wurden unter Verwendung von GAB (Genome Assembly Program) Version 4.2 (Bonfield et al., 1995) durchgeführt. Für die Sequenzanalyse wurde das GCG-Paket Devereux et al., 1984), Version 10.0 verwendet.
Beispiel 4: Chemische Analyse von S. parvulus-Stämmen

Das folgende Verfahren eignet sich zur Analyse von Fermentationen (siehe Beispiel 1) zur Herstellung natürlicher Borrelidine und gentechnisch konstruierter Borrelidinanalage:
In einem 2-ml-Eppendorfröhrchen wurde eine Portion einer 5 Tage alten Fermentationsbrühe (1 ml) durch Zugabe von 90% Ameisensäure (ca. 20 μl) auf pH 3 eingestellt. Die Probe wurde mit Essigester (1 ml) versetzt und 10 min. am Vibrationsschüttler kräftig gemischt. Das Gemisch wurde durch Zentrifugation in einer Mikrozentrifuge getrennt und die obere Phase abgenommen und in eine sauberes 2-ml-Eppendorfröhrchen überführt. Der Essigester wurde durch Verdampfen unter Verwendung eines Speed-Vac-Geräts abgezogen. Die Rückstände wurden in Methanol (250 μl) gelöst und mittels einer Mikrozentrifuge geklärt. Die Analyse wurde mit dem HPLC-System Agilent HP1100 wie unten beschrieben durchgeführt:

Injektionsvolumen:	50 μl
Stationäre Säulenphase:	150 × 4,6 mm große Säule, basendeaktiviertes Umkehrphasen-Kieselgel, Teilchengröße: 3 μm (Hypersil C₁₈-BDS)
Mobile Phase A:	10% Acetonitril: 90% Wasser mit 10 mM Ammoniumacetat und 0,1% TFA
Mobile Phase B	90% Acetonitril: 10% Wasser mit 10 mM Ammoniumacetat und 0,1% TFA
Mobile-Phase-Gradient:	T = 0 min., 25%B; T = 15, 100%B; T = 19, 100%B; T = 19,5, 25%B; T = 25, 25%B
Fließgeschwindigkeit:	1 ml/min.
Nachweis:	UV bei 258 nm (DAD-Aufnahme über 190-600 nm); MS-Nachweis durch Elektrospray-Ionisation über m/z-Bereich 100-1000 amu, mit +/–ve Ionenmoduswechsel.

Beispiel 5: Protoplastentransformationsvorschrift für S. parvulus Tü4055
Ein Vorkulturkolben mit TSB-Medium (Trypton Soy Broth) (10 ml in einem 100-ml-Erlenmeyerkolben) wurde von einer Arbeitsstammlösung (0,15 ml) angeimpft. Nach 3 Tagen Schütteln auf einem Rotationsinkubator (30°C, 250 UpM) wurden 5 ml der Kultur zum Animpfen von R5-Medium (Kieser et al., 2000) (50 ml in einem 250-ml-Erlenmeyerkolben) verwendet, das dann 24 Stunden auf einem Rotationsinkubator (30°C, 250 UpM) geschüttelt wurde. Die PEG-vermittelte Transformation der Protoplasten wurde dann nach veröffentlichten Standardvorschriften durchgeführt (Kieser et al., 2000).
Beispiel 6: Ersetzen von borAT4 mit rapAT2 – Produktion von C₁₀-Desmethylborrelidin
Die Borrelidin-PKS-AT4-Domäne wird durch die AT2-Domäne der Rapamycin-Polyketidsynthase wie folgt ersetzt:
CosBor32A2 wird mit EcoR1 verdaut und die 5429 bp große Bande isoliert. Diese wird als Matrize für die PCR unter Verwendung der Oligos CM410 (5'-AAAATGCATTCGGCCTGAACGGCCCCGCTGTCA-3') (SEQ ID Nr.: 44) und CM411 (5'-AAATGGCCAGCGAACACCAACACCACACCACCA-3') (SEQ ID Nr.: 45) verwendet. Dabei wird durch CM410 eine NsiI-Restriktionsstelle für Klonierungszwecke und durch CM411 eine MscI-Stelle zur Verwendung bei der Einführung eines heterologen AT eingeführt. Das ~1,1 kbp große Produkt wird in mit SmaI verdauten und dephosphorylierten pUC18 kloniert. Dabei kann die Insertion in zwei Orientierungen ligieren, wobei mittels Restriktionsenzymanalyse nach der Rückwärtsorientierung gesucht wird und die Insertion sequenziert wird. Eines der korrekten Plasmide wird mit pCJM462 bezeichnet. Methylierungsmangel-DNA (spezifisch dcm^–) von pCJM462 und pCJR26 (Rowe et al., 1996) wird durch Passagieren der Plasmide durch E. coli ET12567 isoliert. Die Plasmide werden anschließend jeweils mit MscI und XbaI verdaut, und das ~7,8 kbp große Fragment aus pCJR26, das das Rapamycin-AT2 und stromabwärts liegende Sequenzen in pCJR26 enthält, wird mit dem durch Verdauung von pCJM462 erzeugten ~3,8 kbp großen Rückrad ligiert. Das Plasmid pCJM63 wird durch Restriktionsanalyse identifiziert.
CosBor32A2 wird mit EcoRI und EcoRV verdaut und die 2871 bp große Bande isoliert. Diese wird als Matrize für die PCR unter Verwendung der Oligos CM412 (5'-AAAGTCCTAGGCGGCGGCCGGCGGGTCGACCT-3') (SEQ ID Nr.: 46) und CM413 (5'-TTTAGATCTCGCGACGTCGCACGCGCCGAACGTCA-3') (SEQ ID Nr.: 47) verwendet. Dabei wird durch CM412 eine AvrII-Restriktionsstelle, durch die die stromabwärts liegende Borrelidinhomologie mit dem heterologen AT im gleichen Leseraster verbunden wird, und durch CM413 eine BglII-Stelle für Klonierungszwecke eingeführt. Das ~1,1 kbp große Produkt wird in mit SmaI verdauten und dephosphorylierten pUC18 kloniert. Dabei kann die Insertion in zwei Orientierungen ligieren, wobei nach der Rückwärtsorientierung mittels Restriktionsenzymanalyse gesucht und die Insertion sequenziert wird. Eines der korrekten Plasmide ist mit pCJM464 bezeichnet.
Die Plasmide pCJM463 und pCJM464 werden mit AvrII und XbaI verdaut, und das ~1,1 kbp große Fragment aus pCJM464 wird in das ~4,7 kbp große Grundgerüst von pCJM463 ligiert, so daß man pCJM465 erhält, das durch Restriktionsenzymanalyse identifiziert wird. pCJM465 enthält das Hybrid-Rapamycin-At2 mit flankierenden Bereichen der Borrelidinsequenz, die für die Homologie bei der Integration und sekundären Rekombination sorgen.
Das Plasmid pCJM465 wird mit NsiI und BglII verdaut und das ~3 kbp große Fragment in das zuvor mit NsiI und BamHI verdaute pSL1180 unter Erhalt von pCJM466 kloniert. Das Plasmid pCJM466 wird anschließend mit NsiI verdaut und die Apramycinkassette auf einem PstI-Fragment aus pEFBA (Lozano et al., 2000) eingebaut, so daß man den Ersatzvektor pCJM467 erhält. pCJM467 wird durch Protoplastentransformation, wie in Beispiel 5 beschrieben, in S. parvulus Tü4055 eingeführt. Gegenüber Apramycin (25 μg/ml) resistente Kolonien werden zunächst identifiziert und anschließend mehrere Male durch MA-Medien ohne antiobiotische Selektion passagiert, um die zweite Rekombination zu fördern (Fernandez et al., 1998). Mehrere Apramycin-empfindliche Kolonien werden isoliert und mittels PCR und Southern-Blot analysiert. Die neue Mutante wird S. parvulus Tü4055/467 genannt.
S. parvulus Tü4055/467 wird wie in Beispiel 1 beschrieben analysiert, wobei gezeigt wird, daß diese Mutante ein Verbindungsgemisch mit dem korrekten UV-Spektrum produziert. Dabei weist eine der neuen Hauptkomponenten, die stärker polar als Borrelidin ist, die korrekte Retentionszeit für 10-Desmethylborrelidin 3 auf. Die LCMS-Analyse deutet auf ein m/z-Verhältnis für eine Verbindung hin, das wie erwartet 14 Masseneinheiten geringer ist als Borrelidin und ein entsprechendes Massenfragmentierungsmuster besitzt. Borrelidin selbst wird ebenso produziert, jedoch auf einem geringeren Niveau als beim WT-Organismus.
Beispiel 7: Mutation des Methylmalonyl-CoA-selektionsmotivs von borAT4 zu Erzeugung von 10-Desmethylborrelidin
Zur Veränderung der Spezifität einer AT kann auch die stellengerichtete Mutagenese von Acyltransferasedomänen verwendet werden. In diesem Beispiel wird die Spezifität von borAT4 von Methylmalonyl-CoA auf Malonyl-CoA gelenkt. Es wurde ein Aminosäuremotiv identifiziert (Reeves et al., 2001; WO 02/14482 ), das die Spezifität einer AT steuert. Das Motiv YASH, wie es in borAT4 beobachtet wird, findet sich in Methylmalonyl-CoA-spezifischen ATs und wird im vorliegenden Beispiel zu HAFH geändert, welches sich in Malonyl-CoA-spezifischen ATs findet.
cosBor32A2 wird mit NcoI verdaut und die 5167 bp große Bande isoliert. Diese wird als Matrize für die PCR unter Verwendung der Primer CM414 (5'-AAACTGCAGAGTCGAACATCGGTCACACGCAGGC-3') (SEQ ID Nr.: 48) und CM415 (5'-AAAATGCATGATCCACATCGATACGACGCGCCCGA-3') (SEQ ID Nr.: 49) verwendet. Durch CM414 wird eine PstI-Restriktionsstelle für Klonierungszwecke eingeführt, und bei CM415 handelt es sich um einen mutagenen Primer, der den für das Motiv codierenden Bereich der AT abdeckt und die Aminosäureänderungen bewirkt, sowie eine NsiI-Stelle für Klonierungszwecke enthält. Das ~1,1 kbp große Fragment wird in mit SmaI verdautes und dephosphoryliertes pUC18 kloniert. Dabei kann die Insertion in beiden Orientierungen ligieren, wobei nach der Vorwärtsorientierung mittels Restriktionsenzymanalyse gesucht und die Insertion sequenziert wird. Eines der korrekten Plasmide ist als pCJM468 bezeichnet.
Eine zweite PCR-Reaktion wird unter Verwendung des 5167 bp großen NcoI-Fragments von CosBor32A2 sowie der Primer CM416 (5'-TAAATGCATTCCATTCGGTGCAGGTGGAGTTGATCC-3') (SEQ ID Nr.: 50) und CM417 (5'- ATAGGATCCCCTCCGGGTGCTCCAGACCGGCCACCC-3') (SEQ ID Nr.: 51) durchgeführt. Durch CM416 wird eine NsiI-Restriktionsstelle eingeführt, wobei es sich bei CM416 auch um einen mutagenen Primer handelt, der den für das Motiv codierenden Bereich der AT abdeckt, und durch CM417 wird eine BamHI-Stelle für Klonierungszwecke eingeführt. Das ~1,1 kbp große Fragment wird in zuvor mit SmaI verdautes und dephosphoryliertes pUC18 kloniert. Die Insertion kann dabei in zwei Orientierungen ligieren, wobei mittels Restriktionsenzymanalyse nach der Vorwärtsorientierung gesucht und die Insertion sequenziert wird. Eines der korrekten Plasmide ist mit pCJM469 bezeichnet.
Die Plasmide pCJM468 und pCJM469 werden mit NsiI und XbaI verdaut, und das ~1,1 kbp große Fragment aus pCJM468 wird in das ~3,8 kbp große Grundgerüst von pCJM469 ligiert, so daß man pCJM470 erhält, das durch Restriktionsenzymanalyse identifiziert wird. pCJM470 enthält das mutierte Motiv von borAT4 zusammen mit ~1,1 kbp homologer DNA auf beiden Seiten, die für die Homologie zur Integration und sekundären Rekombination sorgen.
Das Plasmid pCJM470 wird mit PstI und BamHI verdaut und das ~2,2 kbp große Fragment in das zuvor mit PstI und BamHI verdaute pSL1180 (Amersham Bioscience) unter Erhalt von pCJM471 kloniert. Das Plasmid pCJM471 wird anschließend mit PstI verdaut und die Apramycinkassette auf einem PstI-Fragment aus pEFBA (Lozano et al., 2000) eingebaut, so daß der Ersatzvektor pCJM472 bereitgestellt wird.
Der Ersatzvektor pCJM472 wird durch Protoplastentransformation, wie in Beispiel 5 beschrieben, in S. parvulus Tü4055 eingeführt. Gegenüber apramycinresistent Kolonien werden zunächst identifiziert und anschließende mehrere Male durch MA-Medien ohne antibiotische Selektion passagiert, um die zweite Rekombination zu fördern Fernandez et al., 1998). Mehrere apramycinemfindliche Kolonien werden isoliert und durch PCR und Southern-Blot analysiert, wobei eine Kolonie ausgewählt wird, die die neue AT4-Sequenz mit dem mutierten Motiv und der NsiI-Stelle enthält. Die neue Mutante wird S. parvulus Tü4055/472 genannt.
S. parvulus Tü4055/472 wird kultiviert und wie in Beispiel 1 beschrieben analysiert, wobei gezeigt wird, daß diese Mutante ein Verbindungsgemisch mit dem korrekten UV-Profil für Borrelidin zeigt. Eine der neuen Hauptkomponenten, die stärker polar als Borrelidin ist, weist die korrekte Retentionszeit für authentisches 3 auf. Die LCMS-Analyse deutet auf ein m/z-Verhältnis für eine Verbindung hin, das wie erwartet 14 Masseneinheiten geringer ist als Borrelidin und ein entsprechendes Massenfragmentierungsmuster besitzt. Borrelidin selbst wird ebenso produziert, jedoch auf einem geringeren Niveau als beim WT-Organismus.
Beispiel 8: Unterbrechung von borE (S. parvulus Tü4055/borE::aac3(IV)
Zur Unterbrechung von borE wurde ein internes 761 bp großes Fragment des Gens mittels PCR unter Verwendung der Primer B25A (5'-TTCTGCAGCCGCGGCCTTCG-3') (SEQ ID Nr.: 81) und B25B (5'-AGAATTCGCCGGCGCCGCTG-3') (SEQ ID Nr.: 82) sowie von cosBor32A2 als Matrize amplifiziert. Das Produkt wurde aufgereinigt, mit PstI und EcoRI verdaut und in pOJ560ermE* kloniert, das bereits auf ähnliche Weise verdaut worden war, so daß pOJEd1 erhalten wurde. Dieser Ansatz wurde verwendet, um mögliche polare Effekte zu vermeiden. Der Vektor pOJEd1 wurde durch Protoplastentransformation, wie in Beispiel 5 beschrieben, in S. parvulus Tü4055 eingeführt, und Kolonien wurden hinsichtlich Apramycinresistenz auf R⁵ und dann auf MA-Agar selektioniert. Die Unterbrechung wurde mittels Southern-Hybridisierung verifiziert und die neue Mutante S. parvulus Tü4055/borE::aac3(IV) genannt. Der Stamm S. parvulus Tü4055/borE::aac3(IV) wurde kultiviert, extrahiert und wie in Beispiel 1 beschrieben analysiert. Es wurde keine Borrelidinproduktion beobachtet, wohingegen eine Wildtypkontrolle Borrelidin wie erwartet produzierte.
Um zu verifizieren, daß keine polaren Effekte eingeführt wurden, wurde eine Vollängenkopie von borE unter der Kontrolle des ermE*-Promotors in trans zur unterbrochenen Mutante eingeführt. Das Vollängen-borE wurde mittels PCR unter Verwendung der Primer B7T1 (5'-GGCTGCAGACGCGGCTGAAG-3') (SEQ ID Nr.: 83) und B7T2 (5'-CCGGATCCCAGAGCCACGTC-3') (SEQ ID Nr.: 84) sowie von cosBor32A2 als Matrize amplifiziert. Das 1216 bp große Produkt wurde aufgereinigt, mit PstI und BamHI verdaut und in den mit PstI und XbaI verdauten Vektor plJ2925 (Janssen & Bibb, 1993) zusammen mit einem mit BamHI und SpeI verdauten, die Hygromycinresistens-Kassette enthaltenden Fragment aus pLHyg kloniert, so daß pIJEH erzeugt wurde. Ein 2,8 kbp großes BamHI-Fragment wurde aus pIJEH ausgeschnitten und in pEM4 (Quiros et al., 1998) kloniert, das auf ähnliche Weise verdaut worden war, so daß pborEH erhalten wurde (bei dem das borE-Gen in der korrekten Orientierung für die Genexpression kloniert wurde). pborEH und das Kontrollplasmid pEM4 wurden in S. parvulus Tü4055/borE::aac3(IV) durch Protoplastentransformation, wie in Beispiel 5 beschrieben, eingeführt. Der erhaltene Stamm S. parvulus Tü4055/borE::aac3(IV)pborEH wurde wie in Beispiel 1 beschrieben analysiert, wobei gezeigt wurde, daß er Borrelidin mit einem ähnlichen Titer wie eine WT-Kontrolle produziert; der Kontrollstamm S. parvulus Tü4055/borE::aac3(IV)pEM4 produzierte kein Borrelidin.
Die chemische Komplementierung von S. parvulus Tü4055/borE::aac3(IV) mit trans-Dicyclopentandicarbonsäure nach der in Beispiel 1 beschriebenen Vorschrift zeigte, daß der auf diese Weise kultivierte Stamm zu einer Borrelidinproduktion von 122 ± 23% der WT- Ausgangskontrolle fähig war. Somit wird borE für die Biosynthese von trans-Cyclopentan-1,2-dicarbonsäure benötigt.
Beispiel 9: Unterbrechung von borG (S. parvulus Tü4055/borG::aac3(IV))
Zur Unterbrechung von borG wurde ein interner Bereich von 885 bp mittels PCR unter Verwendung der Primer B23A (5'-ATCTGCAGCGGCATCGGTGT-3') (SEQ ID Nr.: 105) und B23B (5'-AGAATTOTCCACTGCGGTCG-3') (SEQ ID Nr.: 106) sowie des Cosmids Bor32A2 als Matrize amplifiziert. Das erhaltene Produkt wurde aufgereinigt und anschließend an den flankierenden Stellen PstI-EcoRI verdaut und danach in pOJ260P stromabwärts des Promotors ermE* subkloniert, so daß pOJGd1 erzeugt wurde.
Der Vektor pOJGd1 wurde in S. parvulus Tü4055 durch Protoplastentransformation, wie in Beispiel 5 beschrieben, eingeführt. Gegenüber Apramycin resistente Kolonien wurden auf MA-Agar selektioniert. Die Unterbrechung wurde mittels Southern-Hybridisierung verifiziert und die neue Mutante S. parvulus Tü4055/borG::aac3(IV) genannt. Der Stamm S. parvulus Tü4055/borG::aac3(IV) wurde kultiviert, extrahiert und wie in Beispiel 1 beschrieben analysiert. Die Borrelidinproduktion wurde mit einer Wildtypkontrolle verglichen. Darüber hinaus wurde S. parvulus Tü4055/borG::aac3(IV) mit trans-1,2-Dicyclopentandicarbonsäure nach der in Beispiel 1 beschriebenen Vorschrift komplementiert.
Beispiel 10: Unterbrechung von borI (S. parvulus Tü4055/borI::aac3(IV))
Das Gen borI und die umgebende DNA wurde aus cosBor19B9 unter Verwendung der PCR-Primer BP4501 (5'-CGTATGCATGGCGCCATGGA-3') (SEQ ID Nr.: 85) und BP4502 (5'-AGCCAATTGGTGCACTCCAG-3') (SEQ ID Nr.: 86) amplifiziert. Das 2,32 kbp große Produkt wurde aufgereinigt, mit NsiI und MfeI verdaut und in mit NsiI und EcoRI verdautes pSL1180 kloniert, so daß das Plasmid pSLI erhalten wurde. Die Apramycinresistenz-Kassette wurde aus pEFBA in Form eines EcoRI-Fragments ausgeschnitten und in mit EcoRI verdautes pSLI kloniert, so daß das Plasmid pSLIA erhalten wurde. Schließlich wurde die Hygromycinresistenz-Kassette mit SpeI und PstI aus pLHyg ausgeschnitten und in pSLIA kloniert, das mit NsiI und SpeI verdaut worden war, so daß das Plasmid pSLIr1 erhalten wurde.
Der Ersatzvektor pSLIr1 wurde durch Protoplastentransformation, wie in Beispiel 5 beschrieben, in S. parvulus Tü4055 eingeführt. Gegenüber Apramycin (25 μg/ml) resistente Kolonien wurden selektioniert und dann mehrere Male durch MA-Medien ohne Selektion passagiert. Der Austausch wurde durch Southern-Hybridisierung verifiziert und die neue Mutante S. parvulus Tü4055/borI::aac3(IV) genannt.
S. parvulus Tü4055/borI::aac3(IV) wurde kultiviert und wie in Beispiel 1 beschrieben analysiert. Es wurde keine Borrelidinproduktion beobachtet, wohingegen mehrere neue Verbindungen mit signifikant geringeren Niveaus beobachtet wurden. Eine der weniger polaren Verbindungen zeigte ein UV-Absorbtionsmaximum von 240 nm, und die LCMS-Analyse deutete auf ein m/z-Verhältnis hin, das 11 Masseneinheiten unterhalb dem für Borrelidin lag, was mit dem Vorliegen einer Methyl- statt einer Nitrilgruppe an C12 vereinbar ist.
Um zu verifizieren, daß keine polaren Effekte eingeführt wurden, wurde eine Vollängenkopie von borI unter der Kontrolle des ermE*-Promotors in trans zur unterbrochenen Mutante eingeführt. Ein 2,1 kb großes NsiI-AvrII-Fragment mit borI wurde aus pSLI isoliert und in die PstI-XbaI-Stellen von pEM4 zusammen mit dem das hyg-Gen enthaltenden NheI-SpeI-Fragment aus pLHyg subkloniert. Dabei wurden beide Fragmente in der glei chen Orientierung subkloniert, wobei pborIH erzeugt wurde. Das Plasmid pborIH und das Kontrollplasmid pEM4 wurden durch Protoplastentransformation, wie in Beispiel 5 beschrieben, in S. parvulus Tü4055/borI::aac(3)IV eingeführt. Der erhaltene Stamm S. parvulus Tü4055/borI::aac(3)IVpborIH wurde wie in Beispielen 1 + 4 beschrieben analysiert, wobei gezeigt wurde, daß er Borrelidin mit einem ähnlichen Titer wie eine WT-Kontrolle produziert
Beispiel 11: Unterbrechung von borJ (S. parvulus Tü4055/borJ::aac3(IV))
Das Gen borJ und die umgebende DNA wurde aus cosBor19B9 unter Verwendung der PCR-Primer BNHT1 (5'-GTCATGCATCAGCGCACCCG-3') (SEQ ID Nr.: 87) und BNHT2 (5'-GTGCAATTGCCCTGGTAGTC-3') (SEQ ID Nr.: 88) amplifiziert. Das 2,75 kbp große Produkt wurde aufgereinigt, mit NsiI und MfeI verdaut und in pSL1180, das mit NsiI und EcoRI verdaut worden war, kloniert, so daß das Plasmid pSL erhalten wurde. Die Hygromycinresistenz-Kassette wurde aus pLHyg in Form eines PstI-SpeI-Fragments ausgeschnitten und in mit NsiI und SpeI verdautes pSL kloniert, so daß pSLJH erhalten wurde. Schließlich wurde die Apramycinresistenz-Kassette aus pEFBA mit SpeI und BamHI ausgeschnitten und in pSLJH kloniert, das zuvor mit AvrII und BglII verdaut worden war, um ein 453 bp großes Fragment aus borJ zu entfernen, so daß das Plasmid pLSJr1 erhalten wurde.
Der Ersatzvektor pSLJr1 wurde durch Protoplastentransformation, wie in Beispiel 5 beschrieben, in S. parvulus Tü4055 eingeführt. Gegenüber Apramycin (25 μg/ml) resistente Kolonien wurden selektioniert und dann mehrere Male durch MA-Medien ohne Selektion passagiert. Der Austausch wurde durch Southern-Hybridisierung verifiziert. Die neue Mutante wurde S. parvulus Tü4055/borJ::aac3(IV) genannt.
S. parvulus Tü4055/borJ::aac3(IV) wurde kultiviert und wie in Beispiel 1 beschrieben analysiert. Es wurde keine Borrelidinproduktion beobachtet, wohingegen eine neue Verbindung, die stärker polar war als Borrelidin, mit einem UV-Maximum bei 262 nm beobachtet wurde. Die LCMS-Analyse deutete auf eine Ausgangsverbindung von 508 amu hin, was mit einer Carbonsäure- statt einer Nitrilfunktion am C12 vereinbar ist.
Um zu verifizieren, daß keine polaren Effekte eingeführt wurden, wurde eine Vollängenkopie von borJ unter der Kontrolle des ermE*-Promotors in trans zur unterbrochenen Mutante eingeführt. Ein 2,4 kb großes NsiI-SphI-Fragment aus pSLJ mit borJ wurde in die PstI-XbaI-Stellen von pEM4 zusammen mit dem hyg-Gen in Form eines SphI-SpeI-Fragments aus pLHyg subkloniert; dabei wurden beide Fragmente in der gleichen Orientierung wie die Transkription der Gene subkloniert. Das endgültige Konstrukt wurde mit pborJH bezeichnet. Das Plasmid pborJH sowie das Kontrollplasmid pEM4 wurden in S. parvulus Tü4055/borJ::aac(3)IV durch Protoplastentransformation eingeführt, wie in Beispiel 5 beschrieben. Der erhaltene Stamm S. parvulus Tü4055/borJ::aac(3)IV/pborJH wurde wie in Beispielen 1 + 4 beschrieben analysiert, wobei gezeigt wurde, daß er Borrelidin mit einem ähnlichen Titer wie eine WT-Kontrolle produziert.
Beispiel 12: Unterbrechung von borG und borI (S. parvulus Tü4055/borG::aac3(IV)/borI::hyg
Das hyg-Gen wird aus pLHyg in Form eines EcoRV-Fragments isoliert und in mit EcoRI verdautes und mit Klenow-Fragment behandeltes pSLI (Beispiel 10) kloniert, so daß pSLIH erhalten wird; das hyg-Gen wird in der gleiche Orientierungen wie borI kloniert. pSLIH wird durch Protoplastentransformation, wie in Beispiel 5 beschrieben, in S. parvulus Tü4055/borG::aac3(IV) eingeführt und sowohl auf Apramycin- als auch Hygromycinresistenz selektioniert und da nach mehrere Male durch MA-Medien ohne Selektion passagiert, um die doppelte Rekombination zu fördern. apramycin- und hygromycinresistente Kolonien werden durch Souther-Hybridisierung und PCR analysiert, um den Austausch zu verifizieren.
Beispiel 13: Unterbrechung von borG und borJ (S. parvulus Tü4055/borG::aac3(IV)/borJ::hyg)
Das hyg-Gen wird aus pLHyg in Form eines EcoRV-Fragments isoliert und in mit AcrII-BglII verdautes und mit Klenow-Fragment behandeltes pSLJ (Beispiel 11) kloniert, so daß pSLJH erhalten wird; das hyg-Gen wird in der gleiche Orientierungen wie borI kloniert. pSLJH wird durch Protoplastentransformation, wie in Beispiel 5 beschrieben, in S. parvulus Tü4055/borG::aac3(IV) eingeführt und sowohl auf Apramycin- als auch Hygromycinresistenz selektioniert und danach mehrere Male durch MA-Medien ohne Selektion passagiert, um die doppelte Rekombination zu fördern. apramycin- und hygromycinresistente Kolonien werden durch Souther-Hybridisierung und PCR analysiert, um den Austausch zu verifizieren.
Beispiel 14: Produktion von 12-Desnitril-12-methylborrelidin 14 (prä-Borrelidin)
Arbeitsstammlösungen von S. parvulus Tü4055/borI::aac3(IV) (0,5 ml) wurden zur Animpfung in primäre vegetative Vorkulturen von NYG, wie in Beispiel 1 beschrieben, eingeführt. Sekundäre Vorkulturen wurden hergestellt (wie Beispiel 1, jedoch mit 250 ml NYG in 2-l-Erlenmeyerkolben). Wie in Beispiel 1 hergestelltes PYDG-Produktionsmedium (4 l) mit 0,01% Plutronic L0101 zur Schaumkontrolle wurde mit der sekundären Vorkultur angeimpft (12,5% Animpfkultur). Ein zweiter Fermenter mit „Centre-Point"-Medium (4 l) und 0,01% Plutronic L0101 zur Kontrolle der Schaumbildung wurde parallel aufgebaut und ebenso mit sekundärer Vorkultur angeimpft (12,5% Animpfkultur). Das „Centre-Point"-Produktionsmedium enthält pro Liter entionisiertes Wasser: Magermilchpulver (Tesco's 1,5%), Avidex W-80 (4,5%), Glukose (0,5%) und Hefeautolysat (0,15%), eingestellt auf pH 7,5 mit 5 M NaOH.
Man ließ diese Ansätze jeweils 6,5 Tage bei 30°C in einem 7-L-Applikon-Fermenter fermentieren. Der Luftstrom wurde auf 0,75 vvm (Volumen pro Volumen pro Minute) eingestellt, wobei die Schikanen geneigt waren und die Treibergeschwindigkeit zwischen 400 und 800 UpM gesteuert wurde, so daß die gelöste Sauerstoffspannung bei oder oberhalb von 30% Luftsättigung gehalten wurde. Es wurde kein weiteres Antischaummittel zugesetzt. Nach 22 Stunden Fermentation wurde die Startersäure trans-Cyclopentan-1,2-dicarbonsäure als neutralisierte Lösung von 1:1 MeOH/5 M NaOH über einen in-line-Filter (0,22 μm) zugesetzt. Die Endkonzentration an exogener Startersäure im Fermentergefäß betrug 0,5 mM.

Nach 6,5 Tagen Fermentation wurden die Brühen kombiniert und mit konzentrierter HCl (~6 ml) auf pH 3,5 angesäuert, und danach durch 10minütige Zentrifugation bei 3500 UpM geklärt. Der Überstand wurde in Essigester (3 × 1 Volumenäquivalent, jeweils 4 Stunden) extrahiert und das Zellsediment in Methanol (2 × 1,5 Liter, jeweils 4 Stunden) einweichen gelassen. Die organischen Phasen wurden kombiniert und unter reduziertem Druck abgezogen, so daß ein teerartiger Gummi erhalten wurde. Der Gummi wurde in 0,1 M Boraxpuffer (500 ml bei pH 9,4) resuspendiert und mit Hexanen (500 ml) und Essigester (500 ml) gewaschen. Die wäßrige Schicht wurde danach mit konzentrierter HCl auf pH 3,5 angesäuert und mit Essigester (3 × 500 ml) extrahiert, wonach die Phasen vereinigt und zur Trockne eingeengt wurden. Der erhaltene Gummi wurde in Methanol (15 ml) gelöst, mit Wasser (285 ml) verdünnt und mit Schwerkraft auf eine C₁₈-Umkehrphasen-Kassette (50 g, hergestellt in 5%igem wäßrigem Methanol) aufgetragen. Die Kassette wurde mit 20% und 50%igen wäßrigem Methanol (jeweils 300 ml) gewaschen und mit 100% Methanol (500 ml) eluiert. Diese letzte Fraktion wurde unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt, so daß ein schwarzes Gummi-Öl (600 mg) erhalten wurde, das in Methanol aufgenommen wurde. Dieser Rückstand wurde schließlich durch sequenzielle präparative Umkehrphasen-HPLC aufgereinigt (eluiert mit den in Beispiel 4 verwendeten mobilen Phasen, ohne Zusatz von TFA, unter isokratischen Bedingungen bei 40% B). Die aktiven Fraktionen wurden vereinigt und auf einer C₁₈-Kassette (1 g) entsalzen, so daß 28 mg eines dunklen Öls (3,5 mg/l isolierte Ausbeute) erhalten wurden. In Tabelle 12 sind die chemischen Verschiebungsdaten der ¹H- und ¹³C-NMR für 12-Desnitril-12-methylborrelidin 14 in CDCl₃ zusammengefaßt. Tabelle 12

Position	δ_H (ppm)	Multiplizität	Kopplung (Hz)	δ_C (ppm)
¹	-	-	-	174,5
2a	2,29	m	-	37,8
2b	2,26	m	-	-
3	3,85	dt	9,0, 3,0	71,9
4	1,83	m	-	35,1
5a	1,19	bt	13,5	43,6
5b	0,91	m	-	-
6	1,75	m	-	27,0
7a	1,08	m	-	49,2
7b	0,88	m	-	-
8	1,69	m	-	26,5
9a	0,97	m	-	38,3
9b	0,45	t	12,5	-
10	1,62	m	-	34,1
11	3,53	d	9,0	85,7
12	-	-	-	138,4
13	5,84	d	11,0	127,7
14	6,28	ddd	14,5, 11,0,	129,6
			1,0
15	5,48	ddd	14,5, 10,5, 3,5	129,9
16a	2,53	m	-	39,1
16b	2,22	m		-
17	5,07	ddd	11,0, 8,0, 3,0	76,5
18	2,52	m	-	48,0
19a	1,92	m	-	30,4
19b	1,32	m	-	-
20a	1,74	m	-	26,2
20b	1,71	m	-	-
21a	1,96	m	-	32,0
21b	1,84	m	-	-
22	2,45	m	8,0	49,3
23	-	-	-	182,3
4-CH₃	0,78	d	6,5	18,5
6-CH₃	0,77	d	6,5	18,8
8-CH₃	0,75	d	6,5	20,6
10-CH₃	0,94	d	6,5	16,3
12-CH₃	1,64	s	-	11,4
Chemische Verschiebungen sind auf CDCl₃ bezogen (für ¹H bei 7,26 ppm und für ¹³C bei 77,0 ppm)

Beispiel 15: Produktion von 12-Desnitril-12-carboxyborrelidin 2
Arbeitsstammlösungen von
Arbeitsstammlösungen von S. parvulus Tü4055/borJ::aac3(IV) (0,5 ml) wurden zur Animpfung in primäre vegetative Vorkulturen von NYG, wie in Beispiel 1 beschrieben, eingeführt. Sekundäre Vorkulturen wurden hergestellt (wie Beispiel 1, jedoch mit 250 ml NYG in 2-l-Erlenmeyerkolben). PYDG-Produktionsmedium (4 l), hergestellt wie in Beispiel 1 und mit 0,01% Plutronic L0101 zur Schaumkontrolle, wurde mit der sekundären Vorkultur angeimpft (10% Animpfkultur). Man ließ diese Kultur in einem 7-L-Applikon-Fermenter 6 Tage bei 30°C fermentieren. Der Luftstrom wurde auf 0,75 vvm eingestellt, wobei die Schikanen geneigt waren und die Treibergeschwindigkeit zwischen 250 und 600 UpM gesteuert wurde, so daß eine gelöste Sauerstoffspannung bei oder oberhalb von 30% Luftsättigung gehalten wurde. Es wurde kein weiteres Antischaummittel zugegeben. Eine zweite Fermentation wurde genau wie oben durchgeführt, wurde jedoch ab 60 Stunden nach der Animpfung alle 12 Stunden jeweils mit einer einmaligen Zugabe von 0,2 mol Glukose in Form einer wäßrigen Lösung versetzt.

Nach 6 Tagen wurden die Fermentationen geerntet und vereinigt. Die Brühe wurde durch Zentrifugation (3500 UpM, 10 Minuten) geklärt und der erhaltene Überstand mit 10 M HCl (aq) auf pH ~3,5 angesäuert. Diese Lösung wurde dann in Essigester unter Rühren extrahiert (3 × 1 Volumenäquivalent, jeweils 4 Stunden). Das Zellsediment wurde zweimal durch Einweichen der Zellen in 1:1 Methanol/Essigester (500 ml) extrahiert. Alle organischen Phasen wurden vereinigt und unter vermindertem Druck unter Erhalt einer wäßrigen Aufschlämmung abgezogen. Die Aufschlämmung wurde mit Wasser auf 500 ml verdünnt, mit 10 M HCl auf pH ~3,5 angesäuert und in Essigester (3 × 300 ml) extrahiert. Die organischen Phasen wurden unter vermindertem Druck auf ~300 ml eingeengt und mit 0,1 M Borax (3 × 150 ml, pH 9,4) extrahiert. Die vereinigten Boraxlösungen wurden mit 10 M HCl auf pH ~3,5 angesäuert und mit 6 × 300 ml Essigester extrahiert. Die analytische HPLC zeigte, daß einige der angereicherten Stoffe noch in der Boraxlösung vorhanden waren, so daß diese mit Schwerkraft auf eine C₁₈-Umkehrphasen-Kassette (50 g) aufgetragen wurde. Diese Kassette wurde mit Wasser gewaschen und die angereicherten Stoffe in 100% Methanol eluiert. Die die angereicherten Stoffe enthaltenden organischen Phasen wurden vereinigt und auf eine methanolische Lösung von 40 ml eingeengt. Letztere wurde auf eine Sephadex LH-20-Säule (70 g), über Nacht in Methanol gequollen, Säu lengröße: 60 cm × 2,5 cm) aufgetragen, die mit 100% Methanol entwickelt wurde; die aktiven Fraktionen wurden vereinigt und zur Trockne eingeengt. Anschließend wurde das Material weiter durch präparative Umkehrphasen-HPLC aufgearbeitet (eluiert mit den in Beispiel 4 verwendeten Phasen, ohne Zusatz von TFA, unter isokratischen Bedingungen bei 40% B). Die vereinigten aktiven Fraktionen wurden zur Trockne eingeengt, in Methanol (4 ml) gelöst und mit Wasser (200 ml) verdünnt. Dieses Gemisch wurde in zwei gleiche Fraktionen aufgeteilt, die jeweils mit Schwerkraft auf eine Klassenhierarchie, eine Klasse, ein Klassifikationsschema, eine Kategorie und/oder ein Kategorieschema unter Verwendung mindestens bestimmter Rechteverwaltungsinformationen erzeugen C₁₈-Umkehrphasen-Kassette (20 g) aufgetragen wurde. Die Säulen wurden anschließend mit 3 Säulenvolumen 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 75%, 90% und 100% wäßrigem Methanol eluiert. Der angereicherte Stoff eluierte in allen Fraktionen von 60% bis 100% Methanol, die darauf hin vereinigt und zur Trockne eingeengt wurden. Der angereicherte Stoff (gelöst in DMSO) wurde dann schließlich durch sequenzielle präparative Umkehrphasen-HPLC aufgereinigt (eluiert mit den in Beispiel 4 verwendeten mobilen Phasen, ohne Zusatz von TFA, unter isokratischen Bedingungen bei 40% B). Aktive Fraktionen wurden vereinigt und an einer C₁₈-Kassette (1 g) entsalzt, so daß 17 mg eines braunen Öls (2,1 mg/l isolierte Ausbeute) erhalten wurden. In Tabelle 13 sind die chemischen Verschiebungsdaten von ¹H- und ¹³C-NMR für 12-Desnitril-12-carboxyborrelidin 2 in d₄-Methanol zusammengefaßt. Tabelle 13

Position	δ_H (ppm)	Multiplizität	Kopplung (Hz)	δ_C (ppm)
1	-	-	-	173,27
2a	2,40	dd	15,8, 4,1	39,31
2b	2,29	dd	15,8, 8,2
3	3,87	m		71,64
4	1,80	m		36,51
5a	1,29	m		44,24
5b	0,90	m
6	1,59	m		27,48
7a	1,09	m
7b	1,03	m
8	1,72	m		28,17
9a	1,12	m		38,42
9b	0,79	m
10	2,03	m		36,43
11	3,90	m		81,95
12	-	-	-	132,35
13	6,43	d	11,0	140,83
14	6,96	dd	14,5, 11,5	130,91
15	5,91	ddd	15,0, 9,5, 5,0	138,93
16a	2,61	m	15,0	38,57
16b	2,36	m
17	5,04	m		77,40
18	2,50	m		49,80
19a	1,90	m		30,59
19b	1,32	m
20a	1,85	m		26,34
20b	1,41	m
21a	1,97	m		32,40
21b	1,75	m
22	2,52	m		48,0*
23		-	-	180,27
4-CH₃	0,83	d	7,0	18,76
6-CH₃	0,80	d	6,0	17,06
8-CH₃	0,81	d	6,5	20,60
10-CH₃	0,93	d	6,5	16,61
12-CH₃	-	-	-	170,49
Chemische Verschiebungen sind auf Methanol bezogen (für ¹H bei 3,35 ppm (Quintett) und für ¹³C bei 49,0 ppm (Septett)); * Verdeckt durch Lösungsmittelsignal, d₄-Methanol

Beispiel 16: Produktion von 17-des-(Cyclopentan-2'-carbonsäure)-17-(cyclobutan-2'-carbonsäure)-Borrelidin 18 durch Mutasynthese
Arbeitsstammlösungen von S. parvulus Tü4055/borE::aac3(IV) (0,5 ml) wurden zur Animpfung in primäre vegetative Vorkulturen von NYG, wie in Beispiel 1 beschrieben, eingetragen. Sekundäre Vorkulturen wurden hergestellt (wie Beispiel 1, jedoch mit 250 ml NYG in 2-l-Erlenmeyerkolben). PYDG-Produktionsmedium (4 l), hergestellt wie in Beispiel 1 und mit 0,01% Plutronic L0101 zur Schaumkontrolle, wurde mit sekundärer Vorkultur angeimpft (12,5% Animpfkultur). Zwei weitere Bioreaktoren wurden in der gleichen Weise aufgebaut. Man ließ diese Ansätze jeweils in einem 7-l-Applikon-Fermenter 5 Tage bei 30°C fermentieren. Der Luftstrom wurde auf 0,75 vvm (Volumen pro Volumen pro Minute) eingestellt, wobei die Schikanen geneigt waren und die Treibergeschwindigkeit zwischen 400 und 700 UpM gesteuert wurde, so daß eine gelöste Sauerstoffspannung bei oder oberhalb von 30% Luftsättigung aufrecht erhalten wurde. Es wurde kein weiteres Antischaummittel zugesetzt. Nach 22 Stunden Fermentation wurde die Startersäure trans-Cyclopentan-1,2-dicarbonsäure zugegeben, und zwar in Form einer neutralisierten Lösung von 1:1 MeOH/5 M NaOH. Die Endkonzentration an exogener Startersäure im Fermentergefäß betrug 0,5 mM.

Nach 5 Tagen Fermentation wurden die Brühen vereinigt und mit konzentrierter HCl auf pH 4,5 angesäuert und anschließend durch 10minütige Zentrifugation bei 3500 UpM geklärt. Der Überstand wurde an „diaion" HP-20SS-Harz (1 l), das mit Methanol (2 l) und anschließend mit 5% wäßrigem Methanol (2 l) vorbehandelt worden war, durch Filtration bei einer Geschwindigkeit von ungefähr 100 ml/min. absorbiert. Anschließen wurde das Harz mit 20% wäßrigem Methanol (2,5 l) und anschließend mit 80% wäßrigem Aceton (4,5 l) eluiert. Das organische Lösungsmittel wurde vom wäßrigen Aceton abgetrennt und die erhaltene wäßrige Aufschlämmung (1 Liter) in Essigester (3 × 1 l) extrahiert. Die organischen Phasen wurden vereinigt und im Vakuum unter Erhalt eines gelben/braunen Öls (1,7 g) eingeengt. Inzwischen ließ man das Zellsediment in Methanol-Essigester, 1:1 (3 × 1 l, jeweils 4 Stunden), einweichen, und die erhaltenen organischen Überstände wurden im Vakuum unter Erhalt einer wäßrigen Aufschlämmung (400 ml) eingeengt. Das teilchenförmige Material wurde in Methanol (50 ml) gelöst und zurück in die wäßrige Aufschlämmung gegeben, die dann mit Wasser auf 500 ml aufgefüllt wurde. Die Aufschlämmung wurde an diaion-HP-20SS-Harz (300 ml) absorbiert, das mit Methanol (500 ml) und danach 5% wäßrigem Methanol (500 ml) vorbehandelt worden war. Das Harz wurde anschließend mit 20%igem wäßrigem Methanol (1 l) und danach 80%igem wäßrigem Aceton (1,5 l) eluiert. Das organische Lösungsmittel wurde von dem wäßrigem Aceton abgetrennt und die erhaltene wäßrige Aufschlämmung (aufgefüllt auf 750 ml) in Essigester (3 × 750 ml) extrahiert. Die organischen Phasen wurden vereinigt und im Vakuum unter Erhalt eines gelben/braunen Öls (1,7 g) eingeengt. Die Rohextrakte wurden vereinigt (3,4 g), in Essigester (10 ml) gelöst, anschließend an einer Kieselgelsäule (5 cm ID × 10 cm, behandelt mit EtOAc) absorbiert und mit EtOAc eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden vereinigt und das Lösungsmittel im Vakuum unter Erhalt eines braunen Gummis (1,08 g) abgezogen. Dieser Rückstand wurde schließlich durch sequenzielle präparative Umkehrphasen-HPLC aufgereinigt (eluiert mit den in Beispiel 4 verwendeten mobilen Phasen, ohne Zusatz von TFA, gefahren mit einem linearen Gradienten von 25% B bis 75% B über 25 Minuten). Aktive Fraktionen wurden vereinigt und an einer C₁₈-Kassette (5 g) entsalzen, so daß 83,9 mg (bzw. 7,0 mg/l isolierte Ausbeute) erhalten wurden. Das ¹³C-NMR-Spektrum von 18 ist in Tabelle 14 dargestellt. Tabelle 14

δ_C (ppm)	Position	δ_C (ppm)	Position
177,1	COOH (C22)	37,3	9
172,2	1	35,7	4
144,0	13	35,1	10
138,7	15	34,4	16
126,9	14	30,9	18
118,3	12	27,3	6
115,8	CN	26,2	8
75,5	17	21,7	20
73,1	11	21,0	21
69,7	3	20,1	8-Me
47,6	5	18,1	6-Me
43,1	7	16,9	4-Me
40,1	19	14,9	10-Me
40,0	2
¹³C-NMR-Zuordnung für 18, in CDCl₃, unter Verwendung dieses Kohlenstoffsignals als Referenz bei δ_C = 77,7 ppm

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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verbindung der Formel 1 oder pharmazeutisch unbedenkliches Salz davon, wobei:
R₁ für eine wie nachfolgend gezeigt substituierte Cycloalkylgruppe steht,
wobei R₁ gegebenenfalls auch mit einem oder mehreren Halogenatomen oder einer oder mehreren C₁- bis C₃-Alkylgruppen substituiert sein kann; R₂ _, R₃ _, R₆ oder R₁₁ jeweils unabhängig für H, OCH₃, CH₃ oder CH₂CH₃ stehen; und R₄ für CN, CO2H oder CH₃ steht.
Verbindung oder Salz nach Anspruch 1, wobei R₄ für CH₃ oder COOH steht.
Verbindung oder Salz nach Anspruch 1, wobei R₄ für CN steht.
Verbindung oder Salz nach Anspruch 1, wobei R₁ für Cyclobutan-1'-carboxylat steht.
Verbindung oder Salz nach Anspruch 4, wobei R₄ für CH₃ oder COOH steht.
Verbindung oder Salz nach Anspruch 1, wobei R₆ für CH₃ steht, R₂ und R₁₁ für H stehen und R₁ für Cyclobutan-1'-carboxylat steht.
Verbindung oder Salz davon nach Anspruch 1, wobei die Verbindung ausgewählt ist aus der Liste bestehend aus:
Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 7 bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung mikrobieller Erkrankungen, einschließlich Malaria, zur Hemmung der Angiogenese, zur Behandlung proliferativer Störungen oder zur Behandlung von durch ungünstige Vaskularisierung gekennzeichneten Leiden.
Verwendung nach Anspruch 8, wobei es sich bei dem Arzneimittel um ein Antikrebsmittel handelt.
Verwendung nach Anspruch 8, wobei es sich bei der proliferativen Störung um Psoriasis handelt.
Verwendung nach Anspruch 8, wobei das durch ungünstige Vaskularisierung gekennzeichnete Leiden ausgewählt ist aus der Gruppe Psoriasis, rheumatoide Arthritis, Atherosklerose und diabetische Retinopathie.
Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 7 bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Hemmung der Angiogenese.
Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 7 zur Verwendung als Arzneimittel.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 7 im Gemisch mit einem pharmazeutisch unbedenklichen Hilfsstoff, Trägerstoff, Puffer oder Stabilisator.
Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 7 zur Verwendung als Arzneimittel zur Behandlung mikrobieller Erkrankungen, einschließlich Malaria, zur Hemmung der Angiogenese, zur Behandlung proliferativer Störungen oder zur Behandlung von durch ungünstige Vaskularisierung gekennzeichneten Leiden.