KR20030087037A - 부테닐-스피노신 살충제 생산을 위한 생합성 유전자 - Google Patents
부테닐-스피노신 살충제 생산을 위한 생합성 유전자 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20030087037A KR20030087037A KR10-2003-7012803A KR20037012803A KR20030087037A KR 20030087037 A KR20030087037 A KR 20030087037A KR 20037012803 A KR20037012803 A KR 20037012803A KR 20030087037 A KR20030087037 A KR 20030087037A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- spinosine
- seq
- butenyl
- amino acids
- dna
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 156
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 title claims abstract description 42
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 16
- 239000002917 insecticide Substances 0.000 title 1
- VAKIESMDOCVMDV-HNNXBMFYSA-N Spinosine Chemical compound C1C2=CC(O)=C(O)C=C2C[C@@H]2N1CCC1=C2C=C(OC)C(OC)=C1 VAKIESMDOCVMDV-HNNXBMFYSA-N 0.000 claims abstract description 51
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 30
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 25
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 24
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 98
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 62
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 53
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 50
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 24
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 24
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 22
- VGGSULWDCMWZPO-ODEMIOGVSA-N spinosin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1C1=C(O)C=2C(=O)C=C(OC=2C=C1OC)C=1C=CC(O)=CC=1)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O VGGSULWDCMWZPO-ODEMIOGVSA-N 0.000 claims description 21
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 17
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 16
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims description 14
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims description 12
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 11
- VGGSULWDCMWZPO-UHFFFAOYSA-N flavoayamenin Natural products COC1=CC=2OC(C=3C=CC(O)=CC=3)=CC(=O)C=2C(O)=C1C1OC(CO)C(O)C(O)C1OC1OC(CO)C(O)C(O)C1O VGGSULWDCMWZPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 9
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 claims description 9
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 8
- 229930185156 spinosyn Natural products 0.000 claims description 8
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 5
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 claims description 5
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 4
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 4
- 102100036426 Acid phosphatase type 7 Human genes 0.000 claims description 2
- 102100022734 Acyl carrier protein, mitochondrial Human genes 0.000 claims description 2
- 101000928881 Homo sapiens Acid phosphatase type 7 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000678845 Homo sapiens Acyl carrier protein, mitochondrial Proteins 0.000 claims description 2
- 101000611240 Homo sapiens Low molecular weight phosphotyrosine protein phosphatase Proteins 0.000 claims description 2
- 101000620894 Homo sapiens Lysophosphatidic acid phosphatase type 6 Proteins 0.000 claims description 2
- 101001001294 Homo sapiens Lysosomal acid phosphatase Proteins 0.000 claims description 2
- 101001001272 Homo sapiens Prostatic acid phosphatase Proteins 0.000 claims description 2
- 101000620880 Homo sapiens Tartrate-resistant acid phosphatase type 5 Proteins 0.000 claims description 2
- 101001122914 Homo sapiens Testicular acid phosphatase Proteins 0.000 claims description 2
- 102100022916 Lysophosphatidic acid phosphatase type 6 Human genes 0.000 claims description 2
- 102100035699 Lysosomal acid phosphatase Human genes 0.000 claims description 2
- 101100271175 Oryza sativa subsp. japonica AT10 gene Proteins 0.000 claims description 2
- 101100342486 Oryza sativa subsp. japonica KSL10 gene Proteins 0.000 claims description 2
- 102100035703 Prostatic acid phosphatase Human genes 0.000 claims description 2
- 102100022919 Tartrate-resistant acid phosphatase type 5 Human genes 0.000 claims description 2
- 102100028526 Testicular acid phosphatase Human genes 0.000 claims description 2
- 230000032823 cell division Effects 0.000 claims description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 claims description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 claims description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 2
- 239000003120 macrolide antibiotic agent Substances 0.000 abstract description 14
- 229940041033 macrolides Drugs 0.000 abstract description 5
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 abstract description 3
- 230000000749 insecticidal effect Effects 0.000 abstract description 2
- 108010030975 Polyketide Synthases Proteins 0.000 description 46
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 28
- 241000894007 species Species 0.000 description 28
- 239000000047 product Substances 0.000 description 23
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 23
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 22
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 22
- SHZGCJCMOBCMKK-JFNONXLTSA-N L-rhamnopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-JFNONXLTSA-N 0.000 description 21
- PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N L-rhamnose Natural products CC(O)C(O)C(O)C(O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 21
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 19
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 17
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 17
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 17
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 16
- ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N Erythromycin Chemical class O([C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@@H]([C@@]([C@H](O)[C@@H](C)C(=O)[C@H](C)C[C@@](C)(O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)O)[C@H]1C)(C)O)CC)[C@H]1C[C@@](C)(OC)[C@@H](O)[C@H](C)O1 ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N 0.000 description 15
- 230000006870 function Effects 0.000 description 15
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 14
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 14
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 13
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 12
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 12
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 12
- 150000002596 lactones Chemical class 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 10
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 10
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 10
- 101100366459 Saccharopolyspora spinosa spnS gene Proteins 0.000 description 9
- 102000057234 Acyl transferases Human genes 0.000 description 8
- 108700016155 Acyl transferases Proteins 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 229950006334 apramycin Drugs 0.000 description 8
- 229930001119 polyketide Natural products 0.000 description 8
- -1 spnP Proteins 0.000 description 8
- 101100311670 Bacillus subtilis (strain 168) cysS gene Proteins 0.000 description 7
- 101100310822 Dictyostelium discoideum spnA gene Proteins 0.000 description 7
- 241000868102 Saccharopolyspora spinosa Species 0.000 description 7
- 101100422142 Saccharopolyspora spinosa spnO gene Proteins 0.000 description 7
- XZNUGFQTQHRASN-XQENGBIVSA-N apramycin Chemical compound O([C@H]1O[C@@H]2[C@H](O)[C@@H]([C@H](O[C@H]2C[C@H]1N)O[C@@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@H](N)[C@@H](CO)O1)O)NC)[C@@H]1[C@@H](N)C[C@@H](N)[C@H](O)[C@H]1O XZNUGFQTQHRASN-XQENGBIVSA-N 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 229960003276 erythromycin Drugs 0.000 description 7
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 7
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 7
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 6
- 101100422141 Saccharopolyspora spinosa spnN gene Proteins 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 229940125904 compound 1 Drugs 0.000 description 6
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 6
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 6
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 6
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 6
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 6
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 6
- 150000008264 rhamnoses Chemical class 0.000 description 6
- TWCMVXMQHSVIOJ-UHFFFAOYSA-N Aglycone of yadanzioside D Natural products COC(=O)C12OCC34C(CC5C(=CC(O)C(O)C5(C)C3C(O)C1O)C)OC(=O)C(OC(=O)C)C24 TWCMVXMQHSVIOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- PLMKQQMDOMTZGG-UHFFFAOYSA-N Astrantiagenin E-methylester Natural products CC12CCC(O)C(C)(CO)C1CCC1(C)C2CC=C2C3CC(C)(C)CCC3(C(=O)OC)CCC21C PLMKQQMDOMTZGG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108090001042 Hydro-Lyases Proteins 0.000 description 5
- 102000004867 Hydro-Lyases Human genes 0.000 description 5
- 101001014220 Monascus pilosus Dehydrogenase mokE Proteins 0.000 description 5
- 101000573542 Penicillium citrinum Compactin nonaketide synthase, enoyl reductase component Proteins 0.000 description 5
- 101100422144 Saccharopolyspora spinosa spnR gene Proteins 0.000 description 5
- 241000569510 Spino Species 0.000 description 5
- 102000005488 Thioesterase Human genes 0.000 description 5
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- PFOARMALXZGCHY-UHFFFAOYSA-N homoegonol Natural products C1=C(OC)C(OC)=CC=C1C1=CC2=CC(CCCO)=CC(OC)=C2O1 PFOARMALXZGCHY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 150000003881 polyketide derivatives Chemical class 0.000 description 5
- 125000000830 polyketide group Chemical group 0.000 description 5
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 5
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 5
- 108020002982 thioesterase Proteins 0.000 description 5
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 4
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 4
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 4
- 101100422143 Saccharopolyspora spinosa spnQ gene Proteins 0.000 description 4
- 125000004369 butenyl group Chemical group C(=CCC)* 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- ZAHRKKWIAAJSAO-UHFFFAOYSA-N rapamycin Natural products COCC(O)C(=C/C(C)C(=O)CC(OC(=O)C1CCCCN1C(=O)C(=O)C2(O)OC(CC(OC)C(=CC=CC=CC(C)CC(C)C(=O)C)C)CCC2C)C(C)CC3CCC(O)C(C3)OC)C ZAHRKKWIAAJSAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 4
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 4
- QFJCIRLUMZQUOT-HPLJOQBZSA-N sirolimus Chemical compound C1C[C@@H](O)[C@H](OC)C[C@@H]1C[C@@H](C)[C@H]1OC(=O)[C@@H]2CCCCN2C(=O)C(=O)[C@](O)(O2)[C@H](C)CC[C@H]2C[C@H](OC)/C(C)=C/C=C/C=C/[C@@H](C)C[C@@H](C)C(=O)[C@H](OC)[C@H](O)/C(C)=C/[C@@H](C)C(=O)C1 QFJCIRLUMZQUOT-HPLJOQBZSA-N 0.000 description 4
- 229960002930 sirolimus Drugs 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 241000239223 Arachnida Species 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 102000051366 Glycosyltransferases Human genes 0.000 description 3
- 108700023372 Glycosyltransferases Proteins 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- 102000008109 Mixed Function Oxygenases Human genes 0.000 description 3
- 108010074633 Mixed Function Oxygenases Proteins 0.000 description 3
- 241000244206 Nematoda Species 0.000 description 3
- 241000187560 Saccharopolyspora Species 0.000 description 3
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 3
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 3
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 3
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 3
- 235000010633 broth Nutrition 0.000 description 3
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 3
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 3
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 3
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 3
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 3
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical group NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 3
- 108091008053 gene clusters Proteins 0.000 description 3
- 150000002337 glycosamines Chemical class 0.000 description 3
- 108700014210 glycosyltransferase activity proteins Proteins 0.000 description 3
- 230000033444 hydroxylation Effects 0.000 description 3
- 238000005805 hydroxylation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 3
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 3
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 3
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710146995 Acyl carrier protein Proteins 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical group [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710116650 FAD-dependent monooxygenase Proteins 0.000 description 2
- RRSNDVCODIMOFX-MPKOGUQCSA-N Fc1c(Cl)cccc1[C@H]1[C@@H](NC2(CCCCC2)[C@@]11C(=O)Nc2cc(Cl)ccc12)C(=O)Nc1ccc(cc1)C(=O)NCCCCCc1cccc2C(=O)N(Cc12)C1CCC(=O)NC1=O Chemical compound Fc1c(Cl)cccc1[C@H]1[C@@H](NC2(CCCCC2)[C@@]11C(=O)Nc2cc(Cl)ccc12)C(=O)Nc1ccc(cc1)C(=O)NCCCCCc1cccc2C(=O)N(Cc12)C1CCC(=O)NC1=O RRSNDVCODIMOFX-MPKOGUQCSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-M Glycolate Chemical compound OCC([O-])=O AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 description 2
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 description 2
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 description 2
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 102000016397 Methyltransferase Human genes 0.000 description 2
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 229940123379 Methyltransferase inhibitor Drugs 0.000 description 2
- 101710128228 O-methyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 102000055027 Protein Methyltransferases Human genes 0.000 description 2
- 108700040121 Protein Methyltransferases Proteins 0.000 description 2
- CVBNMWXECPZOLM-UHFFFAOYSA-N Rhamnetin Natural products COc1cc(O)c2C(=O)C(=C(Oc2c1)c3ccc(O)c(O)c3O)O CVBNMWXECPZOLM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101150039159 Spn gene Proteins 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 2
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011203 carbon fibre reinforced carbon Substances 0.000 description 2
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 2
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 2
- 239000013601 cosmid vector Substances 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 2
- 150000008266 deoxy sugars Chemical class 0.000 description 2
- 238000006392 deoxygenation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000009088 enzymatic function Effects 0.000 description 2
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 2
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 125000000404 glutamine group Chemical group N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 2
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 2
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 description 2
- MZFOKIKEPGUZEN-FBMOWMAESA-N methylmalonyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C(C(O)=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 MZFOKIKEPGUZEN-FBMOWMAESA-N 0.000 description 2
- 239000003697 methyltransferase inhibitor Substances 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 238000001821 nucleic acid purification Methods 0.000 description 2
- 230000000361 pesticidal effect Effects 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 230000004850 protein–protein interaction Effects 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- LMXOHSDXUQEUSF-YECHIGJVSA-N sinefungin Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](C[C@H](CC[C@H](N)C(O)=O)N)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 LMXOHSDXUQEUSF-YECHIGJVSA-N 0.000 description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 231100000583 toxicological profile Toxicity 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QRAXLHLYZJCAKB-XZBKPIIZSA-N (2r,3s,4r,5r)-3,4,5,6-tetrahydroxy-2-methoxyhexanal Chemical compound CO[C@@H](C=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO QRAXLHLYZJCAKB-XZBKPIIZSA-N 0.000 description 1
- WWTBZEKOSBFBEM-SPWPXUSOSA-N (2s)-2-[[2-benzyl-3-[hydroxy-[(1r)-2-phenyl-1-(phenylmethoxycarbonylamino)ethyl]phosphoryl]propanoyl]amino]-3-(1h-indol-3-yl)propanoic acid Chemical compound N([C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)O)C(=O)C(CP(O)(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)OCC=1C=CC=CC=1)CC1=CC=CC=C1 WWTBZEKOSBFBEM-SPWPXUSOSA-N 0.000 description 1
- ZUGIGWIPEYNYJV-FZWPAWTOSA-N (3r,4s,5r,6s,7s,9r,11r,12r,13s,14r)-6-[(2s,3r,4s,6r)-4-(dimethylamino)-3-hydroxy-6-methyloxan-2-yl]oxy-14-ethyl-12,13-dihydroxy-4-[(2r,4r,5s,6s)-5-hydroxy-4-methoxy-4,6-dimethyloxan-2-yl]oxy-3,5,7,9,11,13-hexamethyl-oxacyclotetradecane-2,10-dione Chemical class O([C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@@H]([C@@]([C@H](O)[C@@H](C)C(=O)[C@H](C)C[C@H](C)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)O)[C@H]1C)(C)O)CC)[C@H]1C[C@@](C)(OC)[C@@H](O)[C@H](C)O1 ZUGIGWIPEYNYJV-FZWPAWTOSA-N 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- WSGYTJNNHPZFKR-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxypropanenitrile Chemical group OCCC#N WSGYTJNNHPZFKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- STQGQHZAVUOBTE-UHFFFAOYSA-N 7-Cyan-hept-2t-en-4,6-diinsaeure Natural products C1=2C(O)=C3C(=O)C=4C(OC)=CC=CC=4C(=O)C3=C(O)C=2CC(O)(C(C)=O)CC1OC1CC(N)C(O)C(C)O1 STQGQHZAVUOBTE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005660 Abamectin Substances 0.000 description 1
- 108700037654 Acyl carrier protein (ACP) Proteins 0.000 description 1
- 102000048456 Acyl carrier protein (ACP) Human genes 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 244000153158 Ammi visnaga Species 0.000 description 1
- 235000010585 Ammi visnaga Nutrition 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000222122 Candida albicans Species 0.000 description 1
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 102000004031 Carboxy-Lyases Human genes 0.000 description 1
- 108090000489 Carboxy-Lyases Proteins 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 description 1
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 1
- PNNNRSAQSRJVSB-JGWLITMVSA-N D-quinovose Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000238557 Decapoda Species 0.000 description 1
- 101100364969 Dictyostelium discoideum scai gene Proteins 0.000 description 1
- 241000255925 Diptera Species 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 241001524679 Escherichia virus M13 Species 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- 102100021181 Golgi phosphoprotein 3 Human genes 0.000 description 1
- 241000255777 Lepidoptera Species 0.000 description 1
- IEMDOFXTVAPVLX-YWQHLDGFSA-N Leucomycin A1 Chemical compound CO[C@H]1[C@H](O)CC(=O)O[C@H](C)C\C=C\C=C\[C@H](O)[C@H](C)C[C@H](CC=O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](N(C)C)[C@H](O[C@@H]2O[C@@H](C)[C@H](OC(=O)CC(C)C)[C@](C)(O)C2)[C@@H](C)O1 IEMDOFXTVAPVLX-YWQHLDGFSA-N 0.000 description 1
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 229940079131 Methylase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 101100364971 Mus musculus Scai gene Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 108010047753 NDP-4-keto-rhamnose 4'-ketoreductase Proteins 0.000 description 1
- 108010080992 NDP-glucose dehydratase Proteins 0.000 description 1
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 102000005877 Peptide Initiation Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010044843 Peptide Initiation Factors Proteins 0.000 description 1
- 101710083689 Probable capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 241000187559 Saccharopolyspora erythraea Species 0.000 description 1
- 241000797648 Saccharopolyspora spinosa NRRL 18395 Species 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical class O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000187438 Streptomyces fradiae Species 0.000 description 1
- 101100371347 Streptomyces fradiae tylE gene Proteins 0.000 description 1
- 101100371348 Streptomyces fradiae tylF gene Proteins 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- 102000003929 Transaminases Human genes 0.000 description 1
- 108090000340 Transaminases Proteins 0.000 description 1
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 1
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 241000607734 Yersinia <bacteria> Species 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- XXIHHRIZGBRENI-RITPCOANSA-N amicetose Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](O)CCC=O XXIHHRIZGBRENI-RITPCOANSA-N 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- KAVSBTFQEATLQG-UHFFFAOYSA-N azanium;acetonitrile;methanol;acetate Chemical compound N.OC.CC#N.CC(O)=O KAVSBTFQEATLQG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000013405 beer Nutrition 0.000 description 1
- KGNDCEVUMONOKF-UGPLYTSKSA-N benzyl n-[(2r)-1-[(2s,4r)-2-[[(2s)-6-amino-1-(1,3-benzoxazol-2-yl)-1,1-dihydroxyhexan-2-yl]carbamoyl]-4-[(4-methylphenyl)methoxy]pyrrolidin-1-yl]-1-oxo-4-phenylbutan-2-yl]carbamate Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1CO[C@H]1CN(C(=O)[C@@H](CCC=2C=CC=CC=2)NC(=O)OCC=2C=CC=CC=2)[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)(O)C=2OC3=CC=CC=C3N=2)C1 KGNDCEVUMONOKF-UGPLYTSKSA-N 0.000 description 1
- 230000036983 biotransformation Effects 0.000 description 1
- 238000006664 bond formation reaction Methods 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 229940095731 candida albicans Drugs 0.000 description 1
- 150000001721 carbon Chemical class 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- CREMABGTGYGIQB-UHFFFAOYSA-N carbon carbon Chemical compound C.C CREMABGTGYGIQB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001735 carboxylic acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- BKHZIBWEHPHYAI-UHFFFAOYSA-N chloroform;3-methylbutan-1-ol Chemical compound ClC(Cl)Cl.CC(C)CCO BKHZIBWEHPHYAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N chloroform;phenol Chemical compound ClC(Cl)Cl.OC1=CC=CC=C1 YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 229940126208 compound 22 Drugs 0.000 description 1
- 229940125833 compound 23 Drugs 0.000 description 1
- 108091036078 conserved sequence Proteins 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- 101710200786 dTDP-4-dehydro-6-deoxy-alpha-D-glucopyranose 2,3-dehydratase Proteins 0.000 description 1
- STQGQHZAVUOBTE-VGBVRHCVSA-N daunorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(C)=O)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 STQGQHZAVUOBTE-VGBVRHCVSA-N 0.000 description 1
- 229960000975 daunorubicin Drugs 0.000 description 1
- 238000006114 decarboxylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 229940075894 denatured ethanol Drugs 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 239000001177 diphosphate Substances 0.000 description 1
- XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J diphosphate(4-) Chemical compound [O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 235000011180 diphosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 230000009144 enzymatic modification Effects 0.000 description 1
- 238000006345 epimerization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 229960004198 guanidine Drugs 0.000 description 1
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 125000000468 ketone group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 230000001035 methylating effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- AICOOMRHRUFYCM-ZRRPKQBOSA-N oxazine, 1 Chemical compound C([C@@H]1[C@H](C(C[C@]2(C)[C@@H]([C@H](C)N(C)C)[C@H](O)C[C@]21C)=O)CC1=CC2)C[C@H]1[C@@]1(C)[C@H]2N=C(C(C)C)OC1 AICOOMRHRUFYCM-ZRRPKQBOSA-N 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000004853 protein function Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 229950008974 sinefungin Drugs 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- BFWPTYMTWQBGHH-RUDMXATFSA-N spinosin a Chemical compound COC1=C(O)C(OC)=CC(\C=C\C(=O)OCC2C(C(O)C(O)C(OC3C(OC(CO)C(O)C3O)C=3C(=C4C(=O)C=C(OC4=CC=3OC)C=3C=CC(O)=CC=3)O)O2)O)=C1 BFWPTYMTWQBGHH-RUDMXATFSA-N 0.000 description 1
- SRJQTHAZUNRMPR-UHFFFAOYSA-N spinosyn A Natural products CC1C(=O)C2=CC3C4CC(OC5C(C(OC)C(OC)C(C)O5)OC)CC4C=CC3C2CC(=O)OC(CC)CCCC1OC1CCC(N(C)C)C(C)O1 SRJQTHAZUNRMPR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SRJQTHAZUNRMPR-UYQKXTDMSA-N spinosyn A Chemical compound O([C@H]1CCC[C@@H](OC(=O)C[C@H]2[C@@H]3C=C[C@@H]4C[C@H](C[C@H]4[C@@H]3C=C2C(=O)[C@@H]1C)O[C@H]1[C@@H]([C@H](OC)[C@@H](OC)[C@H](C)O1)OC)CC)[C@H]1CC[C@H](N(C)C)[C@@H](C)O1 SRJQTHAZUNRMPR-UYQKXTDMSA-N 0.000 description 1
- 101150059163 spnA gene Proteins 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 239000001974 tryptic soy broth Substances 0.000 description 1
- 108010050327 trypticase-soy broth Proteins 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 229960004441 tyrosine Drugs 0.000 description 1
- 238000000825 ultraviolet detection Methods 0.000 description 1
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
- C12P19/60—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen of the saccharide radical directly bound to a non-saccharide heterocyclic ring or a condensed ring system containing a non-saccharide heterocyclic ring, e.g. coumermycin, novobiocin
- C12P19/62—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen of the saccharide radical directly bound to a non-saccharide heterocyclic ring or a condensed ring system containing a non-saccharide heterocyclic ring, e.g. coumermycin, novobiocin the hetero ring having eight or more ring members and only oxygen as ring hetero atoms, e.g. erythromycin, spiramycin, nystatin
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
- Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
- Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
본 발명은 부테닐-스피노신 생합성 유전자, 상기 생합성 유전자로 형질전환되어 스피노신을 생산하는 미생물, 상기 생합성 유전자를 사용하여 부테닐-스피노신 살충 마크롤리드의 생산을 증가시키는 방법 및 상기 유전자 또는 그의 단편을 사용하여 스피노신을 생산하는 미생물이 생산하는 생산물을 변화시키는 방법에 관한 것이다.
Description
발명의 요약
본 발명은 신규한 부테닐-스피노신 생합성 유전자, 상기 생합성 유전자를 혼입한 벡터, 상기 생합성 유전자로 형질전환된 사카로폴리스포라 (Saccharopolyspora) 균주, 이들 유전자를 사용하여 스피노신-유사 살충 마크롤리드의 생산을 증가시키는 방법 및 상기 유전자 또는 그의 단편을 사용하여 사카로폴리스포라 종의 스피노신을 생산하는 균주가 생성하는 대사물질을 변화시키는 방법을 제공한다.
천연적으로 생산된 스피노신 화합물은 12-원 마크로시클릭 락톤, 중성 당 (람노스) 및 아미노 당 (포로스아민)에 융합된 5,6,5-트리시클릭 고리 시스템으로 구성된다 (문헌 [Kirst et al., 1991] 참조). 아미노 당이 존재하지 않을 경우의 상기 화합물은 슈도아글리콘 (pseudoaglycone)이라 일컫고, 중성 당이 존재하지 않는 경우의 상기 화합물을 역 (reverse)-슈도아글리콘이라 일컫는다.
A83543 스피노신은 사카로폴리스포라 스피노사 (Saccharopolyspora spinosa) 균주 NRRL18395 및 그의 유도체에 의해 생산된다. A83543 스피노신 족의 공지된구성원 및 이들을 생산하는 균주는 미국 특허 제5,362,634호, 동 제5,202,242호, 동 제5,840,861호, 동 제5,539,089호 및 동 제5,767,253호에 개시되어 있다. 상기 화합물들은 스피노신 A, B 등과 같은 문자 기호로 구별된다 (문헌 [Kirst et al., 1991] 참조). A83543 스피노신 A의 구조를 하기 표 1에 나타내었다. A83543 스피노신 화합물은 거미류, 선충류 및 곤충류, 특히 레피돕테라 (Lepidoptera) 및 딥테라 (Diptera) 종의 방제에 유용하며, 환경 친화적이고 독물학적 프로파일에 있어서 유리하다.
A83543 스피노신의 생합성을 지시하는 효소를 코딩하는 유전자의 DNA 서열이 미국 특허 제6,143,526호에 개시되어 있다. 클로닝된 유전자 및 오픈 리딩 프레임을 spnA, spnB, spnC, spnD, spnE, spnF, spnG, spnH, spnI, spnJ, spnK, spnL, spnM, spnN, spnO, spnP, spnQ, spnR, spnS, 사카로폴리스포라 스피노사 gtt, 사카로폴리스포라 스피노사 gdh, 사카로폴리스포라 스피노사 epi 및 사카로폴리스포라 스피노사 kre라고 지칭한다.
람노스 생합성 이외의 스피노신 생합성 유전자들, 구체적으로는 유전자 spnA, spnB, spnC, spnD, spnE, spnF, spnG, spnH, spnI, spnJ, spnK, spnL, spnM, spnN, spnO, spnP, spnO, spnR 및 spnS는 사카로폴리스포라 스피노사 염색체의 대략 74 kb 영역상에서 인접하여 위치한다. spnA, spnB, spnC, spnD 및 spnE 유전자는 폴리케티드 생합성을 초래하는 유전자와 유사한 것으로 밝혀졌고, spnA, spnD 또는 spnE를 파괴하면 모든 스피노신이 생산되지 않았다. 또한, A83543 스피노신 합성은 락톤 핵의 가교에도 관여하는데, 이는 마크롤리드 생산자에게는 드문 활성이다: spnF, spnJ, spnL 및 spnM 유전자들이 이러한 생합성 단계에 관여하는 것으로 여겨진다. spnG, spnH, spnI 및 spnK 유전자는 람노스 부가 및 변형에 관여한다고 보고되었고, spnN, spnO, spnP, spnQ, spnR 및 spnS 유전자는 포로스아민 당의 생합성 및 부가에 관여한다고 보고되었다. 람노스 생합성에 필요한 유전자는 A83543 스피노신 생합성 유전자의 나머지에 인접하게 위치하고 있지 않았다. 사카로폴리스포라 스피노사 gtt 및 사카로폴리스포라 스피노사 kre가 별개의 단편에 클로닝되었고, 사카로폴리스포라 스피노사 gdh 및 사카로폴리스포라 스피노사 epi가 다른 별개의 단편에 클로닝되었다.
최근, 신규 유기체인 사카로폴리스포라 종 LW107129 (NRRL 30141) 또는 그의 유도체가 생산한 제2 클래스의 스피노신인 부테닐-스피노신은 WO 01/19840에 상응하는 미국 출원 제09/661,065호 및 미국 특허 출원 제60/277,601호에 개시되어 있다. 상기 화학물질 족에 속하는 40여종의 구성원이 전술한 출원 문헌에서 정의된 바 있다. 사카로폴리스포라 종 LW107129 (NRRL 30141)이 생산한 부테닐-스피노신 화합물은 A83543 스피노신 계열의 화합물과 상이하다. 이들 2가지 클래스 스피노신의 주요 차이점은 C-21에서 마크로시클릭 고리에 부착된 탄소 테일 (tail)의 치환이다. 천연 부테닐-스피노신은 C-21에서 3 내지 4개 탄소의 쇄, 바람직하게 부테닐로 치환되지만, 천연 A83543 스피노신은 C-21에서 1 내지 2개 탄소의 쇄, 바람직하게 에틸로 치환된다.
2001년 3월 21자로 출원된 미국 가출원 제60/277,546호 (발명의 영문 명칭: "Synthetic Derivatives of 21-Butenyl and Related Spinosyns")에 개시된 바와 같이, 부테닐-스피노신 화합물은 합성하여 변형시킨 스피노소이드 화합물 생산시의 반응물로서 유용하다. 더욱 바람직하게, 부테닐-스피노신 화합물 및 그들의 합성 유도체는 거미류, 선충류 및 곤충류, 특히 레피돕테라 및 딥테라 종의 방제에 유용하다.
부테닐-스피노신은 C-21에서의 부테닐기 뿐 아니라, A83543 스피노신 계열과 차이가 매우 많이 난다. A83543 스피노신에 대한 상이성이 입증된 부테닐-스피노신 화합물 및 인자의 서브세트를 표 1에 요약하였다. 부테닐-스피노신을 표 1에 명명하였고, 이후에는 구조적 두문자어(頭文字語) "for-rham-I", "for-rham-II", "for-rham-III" 및 그의 유도체로 표현한다. 이 경우에서, I, II 및 III은 적당하게 치환된 마크롤리드 구조 (I: R4= R5= H; II: R5= CH3, R4= H 또는 OH; III: R5= H, R4= OH)를 일컫고, 'for'는 C-17에서의 당 (for = 포로스아민)을 나타내며, 'rham'은 C-9에서의 당을 나타낸다 (rham = 트리-O-메틸람노스). 균주 NRRL 30141이 생산하는 두번째 유형의 마크롤리드 구조를 14-원 마크롤리드 고리를 보유한 일반식 (2)로 나타내었으며, 이후에는 이를 IV로 일컬으며, 완전히 글리코실화된 화합물을 "for-rham-IV"로 일컫는다. 화학식 (1) 및 화학식 (2)의 부테닐-스피노신 화합물은 거미류, 선충류 및 곤충류, 특히 레피돕테라 및 딥테라 종의 방제에 유용하며, 매우 환경 친화적이며 독물학적 프로파일에 있어서 유리하다.
이러한 차이는 C-21 위치에서의 광범위한 변형, C-8 위치에서의 히드록실화 및 C-17에서 포로스아민에 대해 중성 당을 비롯하여 교대 (alternate) 당의 치환을포함한다. 또한, C-17 및 C-9에 각각 포로스아민 및 람노스가 부착된 14-원 마크로시클릭 고리에 융합된 5,6,5-트리시클릭 고리 시스템을 보유하는 화합물은 전술한 출원 문헌에 이미 개시되어 있다.
*R3은 하기 화학식 (3a) 내지 화학식 (3c) 중 하나를 보유한 기이다:
**R9는 하기 화학식 (9a) 내지 화학식 (9i) 중 하나를 보유한 기이다:
표 1의 화합물 1 내지 화합물 21은 사카로폴리스포라 종 LW107129 (NRRL 30141)에 의해 생산되며, WO 01/19840에 상응하는 미국 특허 출원 제09/661,065호에 개시되어 있다. 화합물 22 및 화합물 23은 2001년 3월 21자로 출원된 미국 가출원 제60/277,601호 (발명의 영문 명칭: "Pesticidal Macrolides")에 개시되어 있다.
부테닐-스피노신과 A83543 스피노신은 구조면에서 차이가 있으나, 생합성 유전자의 일부는 유사할 것이라 추론할 수 있다. 그러나, 상술한 바와 같이, 사카로폴리스포라 종 LW107129 (NRRL 30141)는 광범위한 범위의 독특한 부테닐-스피노신 인자 및 화합물을 생산하지만, A83543 스피노신의 경우에는 관찰된 바 없다. 따라서, 이 유기체는 사카로폴리스포라 스피노사의 A83543 스피노신 생합성 효소와는 상이한 신규 생합성 효소도 보유하는 것이 명백하다. 구체적으로, 사카로폴리스포라 종 LW107129 (NRRL 30141)의 부테닐-스피노신 생합성 효소는 A83543 스피노신에 비해 상기 폴리케티드 쇄를 2개 탄소 만큼 연장 (이로 인해 C-21에서 에틸이 아니라 부테닐이 생성됨)시킬 수 있어야 한다. 또한, 이들은 C-17에 교대 아미노 당 및 중성 당을 합성 및 부착시키고, C-8 및 C-24에서 히드록실화시킬 수 있어야 한다. 또한, 사카로폴리스포라 종 LW107129 (NRRL 30141)과 사카로폴리스포라 스피노사에서는 람노스 메틸화가 상이해야 한다. A83543 스피노신의 람노스 메틸화가 변경된 사카로폴리스포라 스피노사의 차단 돌연변이체 (미국 특허 제5,202,242호 및 동 제5,840,861호에 개시됨)는 전형적으로 A83543 스피노신의 모노-데스메틸화된 람노스 유도체를 생산한다. A83543 스피노신의 디-데스메틸 람노스 유도체는시네푼긴 (sinefungin) 등과 같은 메틸라제 억제제의 존재하에서만 검출되었다. 람노스 메틸화가 변경된 사카로폴리스포라 종 LW107129 (NRRL 30141)의 돌연변이체는 메틸라제 억제제의 부재하에서 부테닐-스피노신의 디- 및 트리-데스메틸 람노스 유도체를 다량으로 생산했다.
부테닐-스피노신 화합물의 생산에 대한 연구는 부테닐-스피노신을 매우 소량으로 생산하는데 필요한 발효 부피가 매우 크다는 사실에서 비롯되었다. 부테닐-스피노신 생합성 효소에 대한 유전자를 1개 또는 복수개 함유하는 DNA의 클로닝된 단편은 유전자를 복제 (duplicate)하여 수율을 증가시킬 수 있다. 스트렙토마이세스 프라디애 (Streptomyces fradiae)의 발효물에서 이러한 유형의 수율 증가는 마크로신을 틸로신으로 전화시키는 속도 제한 메틸트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자를 복제 [Baltz et al., 1997]하고, 사카로폴리스포라 스피노사의 경우에는 gtt 및 gdh 유전자를 복제 [Baltz et al., 2000]함으로써 달성되었다.
또한, 클로닝된 부테닐-스피노신 생합성 유전자는 살충 활성 스펙트럼이 상이한 부테닐-스피노신의 신규 유도체 생산 방법도 제공한다. 재조합 DNA 방법을 사용하여 부테닐-스피노신 생합성 효소를 코딩하는 특정 유전자를 파괴시킨 사카로폴리스포라 종 LW107129 (NRRL 30141)의 돌연변이체 균주는 특정 중간체 (또는 이들의 천연 유도체)를 합성할 수 있다. 이러한 전략은 신규 6-데옥시에리트로마이신 유도체를 생산하는 사카로폴리스포라 에리트래아 (Saccharopolyspora erythraea) 균주 생성에 효과적으로 이용되었다 [Weber ＆ McAlpine, 1992]. 또한, 부테닐-스피노신 생합성 유전자는 다른 유기체, 예를 들어 사카로폴리스포라스피노사에서도 발현되어, 유사한 화합물을 생산할 수 있다. 천연 부테닐-스피노신 프로모터 또는 이종 프로모터로부터 발현되는 경우, 이들 유전자는 스피노신 및 부테닐-스피노신 모두의 독특한 구조적 특성 중 일부를 갖는 신규 하이브리드 분자를 생산한다.
신규 중간체는 부테닐-스피노신 생합성 효소를 코딩하는 특정 유전자의 일부가 시험관내에서 특이적으로 돌연변이된 동일 유전자의 일부에 의해 대체되거나, 다른 유기체 유전자의 상응하는 일부로 대체된, 사카로폴리스포라 종 LW107129 (NRRL 30141) 또는 사카로폴리스포라 스피노사의 돌연변이체 균주에 의해 합성될 수도 있다. 하이브리드 유전자는 기능이 변경되어 활성이 결핍되거나 새로운 효소적 변형을 수행하는 단백질을 생산할 것이다. 돌연변이체 균주의 발효시에는 신규한 화학적 물질이 축적된다. 이러한 전략을 사용하여 신규 무수에리트로마이신 유도체를 생산하는 사카로폴리스포라 에리트래아 균주를 생성했다 [Donadio et al., 1993].
부테닐-스피노신의 생합성은 2- 및 3-탄소 카르복실산 전구체의 단계별 축합 및 변형을 통해 진행되어 선형 폴리케티드를 생성 (도 1A)하고, 이것이 고리화되고 가교되어 테트라시클릭 아글리콘을 생산한다 (도 1B). 이어서, 슈도아글리콘 (트리-O-메틸화된 람노스를 함유)이 형성된 후에 디-N-메틸화된 포로스아민 또는 교대 당이 부가되어 생합성이 완료된다 (도 1B). 다른 마크롤리드, 예를 들어 항생제 에리트로마이신, 구충 활성의 아베르멕틴 및 면역저해성 라파마이신은 유사한 방식으로 합성된다. 이들 화합물을 생산하는 박테리아에서, 항생제 생합성은 제I형 폴리케티드 신타제 (PKS)의 여러가지 매우 대형의 다기능적 단백질에 의해 촉매된다 ([Donadio et al., 1991], [Ikeda et al., 1999], [Schwecke et al., 1995]). 폴리펩티드들이 개시자 모듈 (module) 및 여러가지 연장자 모듈로 구성된 복합체를 형성하고, 이들 각각은 특이적 아실-CoA 전구체를 부가하여 폴리케티드 쇄를 연장시키고 특이적 방식으로 β-케토기를 변형시킨다 (도 1A). 따라서, 폴리케티드의 구조는 PKS 내 모듈의 조성 및 순서에 따라 결정된다. 모듈은 여러가지 도메인을 포함하며, 이들 각각은 특이적 기능을 수행한다. 개시자 모듈은 전구체로부터의 아실기를 아실 운반자 단백질 (ACP) 도메인에 부가하는 아실 트랜스퍼라제 (AT) 도메인으로 구성된다. 또한, 개시자 모듈은 β-케토신타제 (KS) 도메인과 매우 유사한 KSQ 도메인을 함유할 수도 있으나, 필수적인 활성 부위 시스테인이 글루타민으로 대체된 KSQ [Bisang, et al., 1999]는 더이상 축합 활성을 보유하지 않게 된다. KSQ 도메인은 데카르복실라제 활성을 보유하고, 개시 모듈의 전구체 특이성을 결정짓는다. 연장자 모듈은 AT 및 ACP 도메인과 함께 탈카르복실화 축합을 통하여 기존의 폴리케티드 쇄를 새로운 아실-ACP에 부가하는 무손상 β-케토신타제 (KS) 도메인을 함유한다. 각 연장자 모듈에는 다음과 같은 추가의 도메인이 존재하여 특이적인 β-케토 변형을 수행할 수도 있다: β-케토기를 히드록실기로 환원시키는 β-케토리덕타제 (KR) 도메인, 히드록실기를 제거하며 이중 결합을 생성하는 데히드라타제 (DH) 도메인 및 이중 결합을 환원시켜 포화 탄소를 생성하는 에노일 리덕타제 (ER) 도메인. 마지막 연장자 모듈은 PKS 효소로부터의 폴리케티드를 마크로시클릭 락톤 형태로 유리시키는 티오에스테라제 (TE) 도메인으로 종결된다. 일반적으로, 폴리케티드 신타제 효소는 3 내지 7개의 대형 오픈 리딩 프레임에 의해 코딩된다 ([Donadio et al., 1991], [Ikeda et al., 1999], [Schwecke et al., 1995]). 기능적 폴리케티드 신타제의 조립에는 이들 단백질 사이의 특이적인 단백질-단백질 상호작용이 요구된다.
활성 마크롤리드 항생제는 마크로시클릭 락톤에서의 추가의 변형, 예를 들어 메틸화 및 환원 상태의 변화 및 특정 당의 부가에 의해 유도된다. 이러한 변형 및 당의 합성과 부착에 필요한 유전자 대부분이 PKS 유전자 주변에 클러스터되어 있다. 데옥시당 생합성 효소를 코딩하는 유전자는 마크롤리드 항생제, 예를 들어 에리트로마이신 및 틸로신의 생산자에서 유사 ([Donadio et al., 1993], [Merson-Davies ＆ Cundliffe, 1994])하고, 세포외 다당류, 예를 들어 살모넬라 (Salmonella) 및 예르시니아 (Yersinia)의 O-항원의 생산자에서 유사 ([Jiang et al., 1991], [Trefzer et al., 1999])하다. 이들 합성 모두가 뉴클레오티드 디포스페이트의 부가에 의한 글루코스의 활성화 후의 탈수, 환원 및(또는) 에피머화를 포함한다. 생성되는 데옥시당에서는 하나 이상의 추가의 변형, 예를 들어 탈산소화, 아미노기전달 및 메틸화가 일어날 수 있다. 당은 특이적 글리코실트랜스퍼라제의 작용을 통해 마크롤리드에 혼입된다. 당의 합성과 부착에 관여하는 유전자는 치밀하게 클러스터되어 있거나 (단일 오페론으로서 전사되는 경우일지라도 이러함), 또는 분산되어 있을 수 있다 ([Ikeda et al., 1999], [Shen et al., 2000], [Aguirrezabalaga et al., 1998]).
본원에서는 하기 정의된 바와 같은 용어를 사용한다:
a.a. - 아미노산.
AmR - 아프라마이신 내성-부여 유전자.
ACP - 아실 운반자 단백질 도메인.
AT - 아실트랜스퍼라제 도메인.
차단 돌연변이체 - 생합성 경로의 특이적 효소의 기능을 차단하는 돌연변이를 보유하여 전구체 또는 션트 (shunt) 생산물을 생산하는 돌연변이체 균주.
bp - 염기쌍.
bus - 부테닐-스피노신 생합성 유전자.
부테닐-스피노신 - A83543 스피노신과는 구조적으로 상이한 발효 생산물 (표 1)로서 미국 출원 제09/661,065호 및 미국 가출원 제60/277,601호에 개시되어 있음, 또는 부테닐-스피노신 유전자 전부 또는 대부분을 사용하는 미생물이 생산하는 유사한 마크로시클릭 락톤 발효 생산물.
부테닐-스피노신 유전자 - 부테닐-스피노신 생합성에 필요한 생산물을 코딩하는 DNA 서열로서, 더욱 구체적으로는 이후에 기재한 바와 같은 유전자 busA, busB, busC, busD, busE, busF, busG, busH, busI, busJ, busK, busL, busM, busN, busO, busP, busQ, busR 및 busS 또는 이들의 기능적 등가물.
클로닝 - DNA 절편을 재조합 DNA 클로닝 벡터에 혼입시키고 이러한 재조합 DNA를 사용하여 숙주 세포를 형질전환시키는 방법.
코돈 바이어스 (codon bias) - 특정 코돈을 사용하여 특이적 아미노산을 구체화하는 성향. 사카로폴리스포라 종 LW107129 (NRRL 30141)의 경우, 이러한 성향은 세번째 염기가 시토신 또는 구아닌인 코돈을 사용하는 것임.
상보성 (complementation) - 돌연변이체 균주가 클로닝된 유전자에 의해 그의 정상적인 표현형으로 회복됨.
접합 - 어떤 박테리아 세포의 유전 물질을 다른 세포에 전달하는 과정.
cos - 박테리오파지 람다의 점착 말단 서열.
코스미드 - 숙주 세포 내에서 플라스미드와 동일한 방식으로 복제할 수 있을 뿐 아니라 파지 헤드로 패키징 (packaging)될 수도 있는 플라스미드인 재조합 DNA 클로닝 벡터.
DH - 데히드라타제 도메인.
ER - 에노일 리덕타제 도메인.
유전자 - 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열.
게놈 라이브러리 - 특정 유기체의 실질적으로 모든 DNA 서열을 대표하는 DNA 절편들이 클로닝된 재조합 DNA 클로닝 벡터 세트.
상동성 - 서열들 사이의 유사성 정도.
혼성화 - 2개의 단일 가닥 DNA 분자들을 어닐링시켜 이중 가닥 DNA 분자를 형성하는 과정으로서, 염기쌍이 완전하게 형성될 수도 있고 그렇지 않을 수도 있음.
시험관내 패키징 - 코트 단백질 내로 DNA를 시험관내 캡슐화시켜, 상기 DNA를 감염을 통해 숙주 세포에 도입할 수 있는 바이러스-유사 입자를 생산하는 과정.
kb - 킬로 염기쌍.
KR - β-케토 리덕타제 도메인.
KS - 케토신타제 도메인.
돌연변이유발 - DNA 서열 내 변화의 생성. 이는 무작위적이거나 표적화되어 생체내 또는 시험관내 생성될 수 있다. 돌연변이는 침묵일 수도 있고, 또는 번역 생산물의 아미노산 서열 변화를 야기하여 단백질의 성질 및 돌연변이체 표현형을 변경시킬 수도 있다.
ORF - 오픈 리딩 프레임.
ori - 플라스미드 복제 기점 (oriR) 또는 전달 기점 (oriT).
동일성(％) - BLAST 프로그램으로 2개의 서열을 비교하여 얻은 동일성 백분율 값.
유사성(％) - BLAST 프로그램으로 2개의 서열을 비교하여 얻은 유사성 백분율 값.
PCR - 중합효소 연쇄 반응 - DNA의 어떤 영역을 특이적으로 증폭시키는 방법.
PKS - 폴리케티드 신타제.
프로모터 - 전사 개시를 지시하는 DNA 서열.
재조합 DNA 클로닝 벡터 - 임의의 자율 복제제 또는 임의의 자율 통합제로서, 하나 이상의 추가의 DNA 분자가 부가될 수 있거나 부가된 DNA 분자를 포함하는 플라스미드 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
재조합 DNA 방법 - 재조합 DNA 벡터에 클로닝된 DNA 절편의 생성, 특징규명및 변형에 사용하는 기술.
제한 단편 - 하나 이상의 제한 효소의 작용으로 생성된 임의의 선형 DNA 분자.
스피노신 - A83543으로도 공지된 발효 생산물로서, 전형적으로는 C-21에서 1 내지 2개 탄소의 쇄를 보유한 12-원 마크로시클릭 락톤, 중성 당 (람노스) 및 아미노 당 (포로스아민)에 융합된 5,6,5-트리시클릭 고리 시스템을 특징으로 하거나, 또는 A83543 스피노신 유전자 모두 또는 그의 대부분을 이용하는 미생물이 생산한 유사한 마크로시클릭 락톤 발효 생산물.
스피노신 유전자 - A83543 스피노신 생합성에 필요한 생산물을 코딩하는 DNA 서열로서, 더욱 구체적으로는 이후에 기재한 바와 같은 유전자 spnA, spnB, spnC, spnD, spnE, spnF, spnG, spnH, spnI, spnJ, spnK, spnL, spnM, spnN, spnO, spnP, spnQ, spnR, spnS, 사카로폴리스포라 스피노사 gtt, 사카로폴리스포라 스피노사 gdh, 사카로폴리스포라 스피노사 epi 및 사카로폴리스포라 스피노사 kre 또는 이들의 기능적 등가물.
spn - A83543 스피노신 생합성 유전자.
서브클론 - 동일 크기 또는 더욱 대형의 다른 DNA로부터 유래한 인서트 (insert) DNA를 보유하는 클로닝 벡터.
TE - 티오에스테라제 도메인.
트랜스접합 - 접합 교배로 유도한 재조합 균주.
도 1A 및 도 1B는 부테닐-스피노신 생합성 경로를 예시하는 도식도이다.
도 2는 사카로폴리스포라 종 LW107129 (NRRL 30141) DNA의 클로닝된 영역에서 HindIII, EcoRV 및 ScaI 단편 및 오픈 리딩 프레임의 배열 및 클로닝된 DNA에서 부테닐-스피노신 유전자의 위치를 예시하는 맵이다.
도 3은 코스미드 pOJ436의 제한 부위 및 기능적 맵이다.
도 4는 17-(4"-0-메틸올레안드로스)-부테닐-스피노신 [표 1; 화합물 (11)]의 생합성 경로를 예시하는 도식도이다.
발명의 간단한 설명
부테닐-스피노신 생합성 유전자 및 관련 ORF를 클로닝하여, 각각의 DNA 서열을 결정하였다. 클로닝된 유전자 및 ORF는 이하에서 busA, busB, busC, busD, busE, busF, busG, busH, busI, busJ, busK, busL, busM, busN, busO, busP, busQ, busR, busS, ORF LI, ORF LII, ORF LIII, ORF LIV, ORF LVI, ORF LVII, ORF LVIII, ORF LIX, ORF RI, ORF RII 및 ORF RIII으로 지칭한다. 스피노신 생합성에 있어서 클로닝된 유전자들의 기능에 대한 제안은 도 1 및 하기 논의에 기재되어 있다.
본 발명의 한 측면에서, 본 발명은 서열 3 내지 7 및 서열 8 내지 29로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 의해 정의되거나; 코딩된 효소의 기능적 특성에 영향을 미치지 않으면서 하나 이상의 아미노산이 치환된, 상기 아미노산 서열들 중 하나에 의해 정의되는 부테닐-스피노신 생합성 효소를 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 단리된 DNA 분자를 제공한다. 바람직한 실시양태에서, 상기 DNA 서열은 busA, busB, busC, busD, busE, ORF RI, ORF RII, ORF RIII, busF, busG, busH,busI, busJ, busK, busL, busM, busN, busO, busP, busQ, busR, busS, ORF LI, ORF LII, ORF LIII, ORF LIV, ORF LVI, ORF LVII, ORF LVIII 및 ORF LIX로 구성된 유전자 군으로부터 선택되며, 상기 유전자들은 각각 서열 1의 염기 1-13032, 13059-19505, 19553-29053, 29092-43890, 43945-60636, 62090-63937, 65229-66602 및 68762-69676 및 서열 2의 염기 114-938, 1389-2558, 2601-3350, 3362-4546, 4684-6300, 6317-7507, 7555-8403, 8640-9569, 9671-10666, 10678-12135, 12867-14177, 14627-15967, 16008-17141, 17168-17914, 18523-19932, 19982-20488, 20539-21033, 21179-21922, 22674-23453, 23690-24886, 26180-26923 및 27646-28473으로 기재되어 있다.
본 발명의 다른 측면에서, 본 발명은 KSi, ATi, ACPi, KSb, ATb, KRb, DHb, ACPb, KS1, AT1, KR1 및 ACP1로부터 선택된 부테닐-스피노신 PKS 도메인을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 단리된 DNA 분자를 제공하며, 상기 도메인들은 각각 서열 3의 아미노산 6-423, 528-853, 895-977, 998-1413, 1495-1836, 1846-2028, 2306-2518, 2621-2710, 2735-3160, 3241-3604, 3907-4086 및 4181-4262로 기재되어 있다. 바람직한 실시양태에서, 상기 DNA 서열은 서열 1의 염기 16-1269, 1582-2559, 2683-2931, 2992-4239, 4483-5508, 5538-6084, 6916-7554, 7861-8130, 8203-9480, 9721-10812, 11719-12258 및 12541-12786으로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명의 다른 측면에서, 본 발명은 KS2, AT2, DH2, ER2, KR2 및 ACP2로부터 선택된 스피노신 PKS 도메인을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 단리된 DNA 분자를 제공하며, 상기 도메인들은 각각 서열 4의 아미노산 1-421, 534-964, 990-1075,1336-1681, 1685-1864 및 1953-2031로 기재되어 있다. 바람직한 실시양태에서, 상기 DNA 서열은 서열 1의 염기 13059-14321, 14658-15900, 16026-16283, 17064-18100, 18111-18650 및 18915-19151로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명의 다른 측면에서, 본 발명은 KS3, AT3, KR3, ACP3, KS4, AT4, KR4 및 ACP4로부터 선택된 스피노신 PKS 도메인을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 단리된 DNA 분자를 제공하며, 상기 도메인들은 각각 서열 5의 아미노산 1-421, 528-814, 1157-1335, 1422-1503, 1526-1949, 2063-2393, 2697-2877 및 2969-3049로 기재되어 있다. 바람직한 실시양태에서, 상기 DNA 서열은 서열 1의 염기 19553-20815, 21143-22000, 23021-23557, 23816-24061, 24128-25399, 25739-26731, 27641-28183 및 28457-28699로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명의 다른 측면에서, 본 발명은 KS5, AT5, DH5, KR5, ACP5, KS6, AT6, KR6, ACP6, KS7, AT7, KR7 및 ACP7로부터 선택된 스피노신 PKS 도메인을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 단리된 DNA 분자를 제공하며, 상기 도메인들은 각각 서열 6의 아미노산 1-422, 537-864, 891-1076, 1382-1563, 1643-1724, 1746-2170, 2281-2611, 2914-3093, 3186-3267, 3289-3711, 3823-4151, 4342-4636 및 4723-4804로 기재되어 있다. 바람직한 실시양태에서, 상기 DNA 서열은 서열 1의 염기 29092-30357, 30700-31683, 31762-32319, 33235-33780, 34018-34263, 34327-35601, 35932-36924, 37831-38370, 38647-38892, 38956-40224, 40560-41544, 42115-42999 및 43258-43503으로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명의 다른 측면에서, 본 발명은 KS8, AT8, DH8, KR8, ACP8, KS9, AT9,DH9, KR9, ACP9, KS10, AT10, DH10, KR10, ACP10 및 TE10으로부터 선택된 스피노신 PKS 도메인을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 단리된 DNA 분자를 제공하며, 상기 도메인들은 각각 서열 7의 아미노산 1-424, 530-848, 885-1072, 1371-1554, 1650-1728, 1751-2175, 2289-2616, 2642-2775, 3131-3315, 3396-3474, 3508-3921, 4036-4366, 4389-4569, 4876-5054, 5148-5229 및 5278-5531로 기재되어 있다. 바람직한 실시양태에서, 상기 DNA 서열은 서열 1의 염기 43945-45216, 45532-46488, 46597-47160, 48055-48606, 48892-49083, 49195-50469, 50809-51792, 51868-52269, 53335-53889, 54130-54366, 54466-55707, 56050-57042, 57109-57651, 58570-59106, 59386-59631 및 59776-60537로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명의 다른 측면에서, 본 발명은 서열 3의 아미노산 6-977, 서열 3의 아미노산 998-2710, 서열 3의 아미노산 2735-4262, 서열 4의 아미노산 1-2031, 서열 5의 아미노산 1-1503, 서열 5의 아미노산 1526-3049, 서열 6의 아미노산 1-1724, 서열 6의 아미노산 1746-3267, 서열 6의 아미노산 3289-4804, 서열 7의 아미노산 1-1728, 서열 7의 아미노산 1751-3474 및 서열 7의 아미노산 3508-5531로 구성된 군으로부터 선택된 스피노신 PKS 모듈을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 단리된 DNA 분자를 제공한다. 바람직한 실시양태에서, 상기 DNA 서열은 서열 1의 염기 16-2931, 2992-8130, 8203-12786, 13059-19151, 19553-24061, 24128-28699, 29092-34263, 34327-38892, 38956-43503, 43945-49083, 49195-54366 및 54466-60537로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명의 다른 측면에서, 본 발명은 상기 기재된 바와 같은 본 발명의 DNA서열을 포함하는 재조합 DNA 벡터를 제공한다.
본 발명의 다른 측면에서, 본 발명은 상기 기재된 바와 같은 본 발명의 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공한다.
본 발명의 다른 측면에서, 본 발명은
1) 부테닐-스피노신 또는 부테닐-스피노신 전구체를 생산하는 생합성 경로에서 속도 제한 활성의 발현을 코딩하는 상기한 본 발명의 DNA 서열을 포함하는 재조합 DNA 벡터 또는 그의 일부를 사용하여, 생합성 경로에 의해 부테닐-스피노신 또는 부테닐-스피노신 전구체를 생산하는 미생물을 형질전환시키는 단계 및
2) 상기 벡터로 형질전환된 미생물을 세포 성장 및 세포 분열, 상기 DNA 서열의 발현 및 스피노신의 생산에 적합한 조건하에서 배양하는 단계
를 포함하는, 스피노신을 생산하는 미생물의 스피노신 생산력을 증가시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 측면에서, 본 발명은 작동되는 부테닐-스피노신 생합성 유전자를 보유하며, 부테닐-스피노신 생합성 유전자 busA, busB, busC, busD, busE, busF, busG, busH, busI, busJ, busK, busL, busM, busN, busO, busP, busQ, busR 및 busS 중 하나 이상이 복제되어 있는 스피노신-생산 미생물을 제공한다.
본 발명의 다른 측면에서, 본 발명은 게놈 내에 부테닐-스피노신 생합성 유전자를 보유하며, 상기 유전자들 중 하나 이상이 불활성화되어 있고 나머지 유전자들은 작동하여, 파괴된 유전자가 작동할 경우에 생산되는 것을 제외한 부테닐-스피노신을 생산하는 부테닐-스피노신-생산 미생물을 제공한다. 상기 미생물은 사카로폴리스포라 종 LW107129 (NRRL 30141) 또는 사카로폴리스포라 스피노사 돌연변이체인 것이 바람직하다. 미생물이 사카로폴리스포라 종 LW107129 (NRRL 30141) 돌연변이체인 것이 더욱 바람직하다.
또한, 본 발명은 정상적으로는 부테닐-스피노신을 생산하지 않는 유기체에서의 부테닐-스피노신 생합성 유전자의 발현을 제공한다. 상기 유전자는 천연 bus 유전자 프로모터 하에서 발현될 수도 있고, 또는 수용 균주와 상용성이 있는 이종 프로모터로부터 발현될 수도 있다. 상기 유기체는 스피노신-유사 화합물을 생산할 수 있는 것이 바람직하다. 미생물이 사카로폴리스포라 스피노사 또는 그의 유도체인 것이 더욱 바람직하다.
또한, 본 발명은 게놈 내에 작동되는 부테닐-스피노신 생합성 유전자를 보유하며, 상기 유전자가 a) 적어도 하나 이상의 작동되는 PKS 모듈을 서열 1에 제시된 것보다 더 많이 또는 더 적게 포함하거나, 또는 b) KR, DH 또는 ER 도메인의 결실, 불활성화 또는 부가에 의하거나 AT 도메인의 치환에 의해 서열 1에 기재된 상응하는 모듈과는 다른 PKS 모듈을 포함하는 부테닐-스피노신-생산 미생물을 제공한다. 상기 미생물은 사카로폴리스포라 종 LW107129 (NRRL 30141) 돌연변이체인 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 본 발명의 신규 미생물을 배양하여 생산된 부테닐-스피노신을 제공한다.
본 발명의 다른 측면에서, 본 발명은 부테닐-스피노신을 생산하는 미생물의 게놈 라이브러리를 생성하는 단계, 길이가 염기 20개 이상인 서열 1 또는 서열 2의표지된 단편을 혼성화 프로브로서 사용하는 단계를 포함하는, 부테닐-스피노신 생합성 유전자의 단리 방법을 제공한다.
당업자는 단백질 기능을 실질적으로 변화시키지 않고도 청구된 아미노산 서열을 치환시킬 수 있음을 이해할 것이다. 본 발명은 그러한 변이체 아미노산 서열 및 그 변이체를 코딩하는 DNA 서열을 포함한다. 바람직한 아미노산 서열은 천연 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 기능을 보유하며, 천연 아미노산 서열과 98％ 이상 동일한 것이다.
부테닐-스피노신 유전자의 특징을 규명하고, 이를 이용하기 위한 필요 조건으로서, 이러한 곤충 방제제의 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자를 단리하여 특징을 규명하는 것이 필수적이다. 하기 실시예 1에 기재된 방법은 게놈 코스미드 라이브러리의 제조 및 그 이후의 DNA-혼성화를 통한 스크리닝을 포함한다.
실시예 1
a. 사카로폴리스포라 종 LW107129 (NRRL 30141)로부터의 전체 세포 DNA 단리
사카로폴리스포라 종 LW107129 (NRRL 30141)를 500 mL 에를렌마이어 (Erlenmeyer) 플라스크 중의 100 mL 생장 배지 (vegetative media) (9.0 g/L 덱스트로스, 30 g/L 트립티카제 대두 브로쓰, 3.0 g/L 효모 추출물, 2.0 g/L 황산마그네슘ㆍ7H2O)에 접종하여, 30℃에서 150 rpm으로 72시간 동안 진탕시키며 인큐베이션했다. 이 배양액을 4℃에서 3,000 rpm으로 10분 동안 원심분리하여 세포를 펠렛화했다. 상층액을 제거하고, 세포 펠렛을 TE 완충액 (10 mM Tris/HCl pH 8.0; 1 mM EDTA pH 8.0) 20 mL로 세척하였다. 세포를 3,000 rpm으로 다시 원심분리하고, 전체 세포 DNA의 단리를 위해 해동할 때까지 -20℃에 냉동시켰다.
게놈 DNA 정제 키트 (미국 캘리포니아주 발렌시아에 소재하는 퀴아젠 인크. (Qiagen Inc.) 제품)를 이용하여, 사카로폴리스포라 종 LW107129 (NRRL 30141)로부터 전체 세포 DNA를 단리하였다. 배양액 100 mL로부터의 냉동된 박테리아 세포 펠렛을, 퀴아젠 (Qiagen) Rnase A 용액 (100 mg/mL) 11 ㎕를 함유하는 B1 완충액 (50 mM Tris/HCl, pH 8.0; 50 mM EDTA, pH 8.0; 0.5％ 트윈 (Tween) 20, 0.5％ 트리톤 (Triton) X-100) 11 mL 중에서 볼텍싱하여 재현탁하였다. 이 현탁액에 리소자임 스톡 용액 (100 mg/mL; 미국 미주리주 세인트루이스에 소재하는 시그마 케미칼 컴파니 (Sigma Chemical Co.) 제품) 300 ㎕ 및 프로테이나제 K 스톡 용액 (50 mg/mL; 시그마 케미칼 컴파니 제품) 500 ㎕를 첨가하였다. 이 현탁액을 볼텍싱하여 혼합하고, 37℃에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. B2 완충액 (3 M 구아니딘 HCl; 20％ 트윈 20) 4 mL을 박테리아 용균물에 첨가하고, 튜브를 서서히 뒤집어서 용액 내로 혼합하였다. 박테리아 용균물을 50℃에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. 퀴아젠 게놈-팁 500/G 팁 (Qiagen Genomic-tip 500/G tip)을 제조업자의 지침에 따라 사용하여 전체 세포 DNA를 박테리아 용균물로부터 단리하였다. 결과의 정제된 DNA를 TE 완충액 5 mL에 용해시키고, 4℃에 보관하였다.
b. 게놈 코스미드 라이브러리의 제조
사카로폴리스포라 종 LW107129 (NRRL 30141)로부터 단리된 전체 세포 DNA를 문헌 [Ausubel, et al. (Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., New York, NY)]의 섹션 3.1.3에 기초하여 Sau3AⅠ으로 부분적으로 소화하였다. 소규모 (80 ㎕의 반응 부피 중 전체 세포 DNA 40 ㎍) 반응을 수행하여, 25 내지 50 kb 크기 범위의 부분-소화된 DNA 단편이 최대 농도가 되게하는 효소 대 전체 세포 DNA의 적당한 비율을 결정하였다. 반응물을 65℃에서 15분 동안 가열하여 Sau3AⅠ 효소를 불활성화시키고, 반응물의 분취액을 0.3％ 아가로스 겔에서의 전기영동으로 분석하여 원하는 크기 범위로 부분-소화된 DNA 단편의 상대적 풍부도를 결정하였다. 효소 대 전체 세포 DNA의 최적 비율이 관찰되면, 반응 부피를 증가시켜 코스미드 라이브러리의 제조에 인서트 DNA로서 사용하기 위한 충분량의 부분-소화된 전체 세포 DNA를 수득하였다. 전형적인 규모의 반응은 사카로폴리스포라 종 LW107129 (NRRL 30141)의 전체 세포 DNA 400 ㎍을 9 유닛의 Sau3AⅠ (미국 메릴랜드주 게이더스버그에 소재하는 깁코 비알엘 (Gibco BRL) 제품)과 함께 1X 반응 4 완충액 (제조업자에 의해 10X 농도로 공급됨) 800 ㎕의 총 부피로 37℃에서 15분 동안 인큐베이션시키는 것이다. 반응물을 65℃에서 20분 동안 가열하여 효소를 불활성화시켰다. 부분-소화된 게놈 DNA를 동일한 부피의 평형화된 페놀-클로로포름 (50:50; v/v) 용액과 혼합하고, 서서히 뒤집어서 혼합하였다. 14,000 × g로 15분 동안 원심분리한 후, 수성상을 분리하여 동일 부피의 클로로포름-이소아밀 알콜 (24:1; v/v) 용액과 혼합하였다. 서서히 뒤집어서 2개의 상을 혼합한 후, 용액을 14,000 × g로 15분 동안 원심분리하였다. 수성상을 새로운 튜브에 옮기고, 3M 아세트산나트륨 (pH 5.2) 0.1배 부피를 첨가하였다. 2배 부피의 빙냉 100％ 에탄올을 첨가하고, 뒤집어서 용액을 혼합하였다. DNA 침전을 보조하기 위해, 샘플을 -70℃에 밤새 방치하였다. 침전된 DNA를 14,000 × g로 20분 동안 원심분리하여 펠렛화했다. DNA 펠렛을 2차 증류수 50 ㎕에 재현탁하여 -20℃에 보관하였다.
코스미드 라이브러리의 제조에 사용된 벡터는, 선별을 위한 아프라마이신 내성 유전자를 함유하는 pOJ436 (도 3)이었다. 코스미드 벡터 DNA가 자신에게 다시 라이게이션되는 것을 최소화하기 위해, BamHⅠ-소화된 pOJ436 DNA를 20 유닛의 새우 알칼리성 포스파타제 (미국 인디애나주 인디애나폴리스에 소재하는 로쉐/뵈링거 만하임 (Roche/Boehringer Mannheim) 제품)와 함께 1X SAP 완충액 (제조업자에 의해 10X 농도로 공급됨) 1.2 mL의 총 부피로 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션시켜 탈인산화하였다. Sau3AⅠ-소화된 게놈 DNA를 pOJ436의 탈인산화된 BamHⅠ 부위에, 부분-소화된 인서트 대 벡터 DNA의 비율 5:1로 라이게이션시켰다. 이러한 반응을 위해, 인서트 DNA 및 벡터 DNA를 20 유닛의 T4 DNA 리가제 (미국 메사추세츠주 비버리에 소재하는 뉴 잉글랜드 바이오랩스 인크. (New England BioLabs Inc.) 제품)와 함께 1X T4 DNA 리가제 완충액 (제조업자에 의해 10X 농도로 공급됨) 중에 16℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 라이게이션 혼합물을 제조업자의 지침에 따라 기가팩 Ⅲ 골드 패키징 익스트렉트 (Gigapack Ⅲ Gold Packaging Extract; 미국 캘리포니아주 라 졸라에 소재하는 스트라타진 (Stratagene) 제품)를 이용하여 패키징시키고, 대장균 균주 DH5α-MRC+세포 (깁코 비알엘 제품)를 사용하여 재조합 파지의 역가를 결정하였다. 재조합 파지의 분취액 (20 내지 40 ㎕) 및 숙주 세포 배양액을, 아프라마이신 (100 mg/L; 시그마 케미칼 컴파니 제품)을 함유하는 LB 아가 (10 g/L 박토-트립톤, 10 g/L NaCl, 5 g/L 박토-효모 추출물, 15 g/L 박토 아가; 디프코 레버러토리즈 (Difco Laboratories) 제품) 상에 도말하여 37℃에서 인큐베이션시켰다. 냉동 보관용 코스미드 라이브러리의 마스터 플레이트를 제조하기 위해, 단일 콜로니를 멸균 이쑤시개로 찍어, 100 mg/L 아프라마이신이 보충된 테리픽 브로쓰 (Terrific Broth; TB 배지: 12 g/L 박토-트립톤, 24 g/L 박토-효모 추출물, 0.4 v/v％ 글리세롤, 17 mM KH2PO4, 72 mM K2HPO4) 250 ㎕가 들어있는 멸균 96-웰 마이크로웰 플레이트의 각 웰에 접종한 후, 진탕하지 않은 채로 37℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 마스터 플레이트로부터 카피 플레이트를 생성하기 위해, 96-웰 마이크로플레이트 레플리케이터 (replicator) (미국 캘리포니아주 샌디에고에 소재하는 브이 앤 피 사이언티픽, 인크. (V ＆ P Scientific, Inc.) 제품)를 사용하여 100 mg/L 아프라마이신을 함유하는 TB 배지 250 ㎕가 들어있는 멸균 96-웰 마이크로웰 플레이트에 접종하였다. 카피 플레이트를 진탕하지 않은 채로 37℃에서 밤새 인큐베이션시켰다.
마스터 플레이트 및 카피 플레이트에 있어, 7 ％(v/v) 디메틸술폭시드 용액을 플레이트 및 배양액에 첨가하고, 다중 채널 피펫을 이용하여 혼합하였다. 플레이트들을 -70℃에 넣어 보관하였다.
뉴클레오스핀 핵산 정제 키트 (NucleoSpin Nucleic Acid Purification Kit;미국 캘리포니아주 팔로 알토에 소재하는 클론텍 레버러토리즈, 인크. (CLONTECH Laboratories, Inc) 제품)를 이용하여 코스미드 DNA를 단리하고, 회수된 DNA를 20 유닛의 제한효소 EcoRI (뉴 잉글랜드 바이오랩스 제품)으로 37℃에서 1시간 동안 소화함으로써, 선별된 재조합 코스미드의 평균 인서트 크기를 측정하였다. 제한효소 처리된 DNA를 1.0％ 아가로스겔에서 전기영동하여 분석하였다. DNA 단편을 0.5％ 에티듐 브로마이드 (시그마 케미칼 컴파니 제품)로 염색한 후에 UV 광으로 가시화하고, 단편의 상대적인 크기를 1 kb DNA 래더 (DNA ladder; 깁코 비알엘 제품)와 비교하여 평가하였다. 제조된 코스미드 라이브러리의 인서트 크기는 20 kb 내지 40 kb의 범위였다.
c. 코스미드 라이브러리의 스크리닝 및 부테닐-스피노신 생합성 유전자를 함유하는 코스미드의 확인
각 대장균 코드미드의 대표적인 클론을, 96-웰 아미크로플레이트 레플리케이터 (브이 앤 피 사이언티픽, 인크. 제품)를 이용하여 하이본드 N+ (Hybond N+; 미국 뉴저지주 피스캐터웨이에 소재하는 아머샴 파마시아 바이오텍 (Amersham Pharmacia Biotech) 제품) 핵산 결합 막 상에 2배수로 접종하였다. 100 mg/L 아프라마이신이 보충된 LB 아가 플레이트 상에 막을 고정시키고, 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 제조업자의 프로토콜에 따라 막을 가공하였다. 접종된 막을 1분 동안 0.5 N NaOH로 포화된 3MM-여과지 (미국 뉴저지주 클립톤에 소재하는 와트만 (Whatman) 제품) 상에 콜로니가 위로 오도록 놓았다. 필터를 1분 동안 1 M Tris-HCl, pH 7.6으로 포화된 3MM-여과지에 옮겨 DNA를 변성시켰다. 1분 동안 1 MTris-HCl, pH 7.6/1.5 M NaCl로 포화된 3MM-여과지에 막을 옮겨 중화시켰다. 최종 세척은 1 M Tris-HCl, pH 7.6/1.5 M NaCl의 용액에서 수행하였으며, 남아있는 콜로니 파편은 막에서 제거하였다. UV 스트라타링커 1800 (Stratalinker 1800; 스트라타진 제품)을 이용하여 1200 μJ로 DNA를 막에 가교시켰다.
이와 같이 제조된 재조합 박테리아의 라이브러리를 사용하여, 사카로폴리스포라 스피노사로부터의 spn 유전자에 기초한 3개의 방사성표지된 DNA 프로브 중 임의의 프로브에 대한 상동성에 관해 스크리닝하였다 [Baltz et al., 2000; 표 2]. 올리고뉴클레오티드 쌍을 사용하여 중합효소 연쇄 반응 (PCR)을 통해 spn 생합성 유전자 클러스터에 특이적인 뉴클레오티드 영역을 증폭시켰다. 올리고뉴클레오티드 프라이머는 394 DNA/RNA 합성기 (미국 캘리포니아주 포스터 시티에 소재하는 어플라이드 바이오시스템즈/퍼킨엘머 (Applied Biosystems/PerkinElmer) 제품)를 이용하여 합성하였으며, 이는 표 2에 기재되어 있다. PCR 반응은 앰플리택 (AmpliTaq) (등록상표) DNA 중합효소 키트 (미국 뉴저지주 브랜치버그에 소재하는 퍼킨 엘머/로쉐 (Perkin Elmer/Roche) 제품)를 제조업자의 프로토콜에 따라 사용하여 수행하였다. 하기의 사이클 조건하에 48-샘플 DNA 써말 싸이클러 (48-sample DNA Thermal Cycler; 퍼킨 엘머 세투스 (Perkin Elmer Cetus) 제품)에서 DNA 단편을 증폭하였다: 1) 94℃ 1분, 55℃ 2분, 72℃ 3분; 25 사이클; 2) 72℃ 10분; 1 사이클. 증폭된 생성물을 0.1％ 아가로스겔 전기영동으로 분석하고, 퀴아젠 Ⅱ 겔 추출 키트 (퀴아젠 인크. 제품)를 사용하여 제조업자의 지시에 따라 적당한 크기에 상응하는 밴드를 겔-추출하였다.
막을 65℃에서 3시간 동안 인큐베이션한 다음, 6X SSC (52.59 g/L NaCl, 24.66 g/L 시트르산나트륨, 10 N NaOH를 사용하여 pH를 7.0으로 조정), 0.1％ 나트륨 도데실 술페이트 (SDS), 10X 덴하르트 용액 (50 mg/L 피콜 (Ficoll) [제400형, 파마시아 (Pharmacia) 제품], 5.0 mg/L 폴리비닐피롤리돈, 5.0 mg/L 소 혈청 알부민), 100 ㎍/mL 변성 연어 정액으로 구성된 예비-혼성화 용액 300 mL 중 방사성표지된 프로브를 첨가하였다.
DNA 단편의 농도를 모든 프로브에 대하여 25 ng으로 조정하고, 비등수조에서 10분 동안 변성시키고, 제조업자의 프로토콜에 따라 하이 프라임 (High Prime) 반응 혼합물 (뵈링거 만하임 제품) 4 ㎕를 사용하여 50 μCi[α32P]dCTP, 3000 Ci/mMol로 무작위-프라임 표지하였다. 방사성표지된 DNA 프로브로부터 혼입되지 않은 뉴클레오티드의 분리는 누크트랩 푸쉬 컬럼 (NucTrap Push Column) (스트라타진 제품)을 사용하여 수행하고, 비등수조에서 10분 동안 변성시킨 다음, 예비-혼성화 막에 첨가하였다. 모든 DNA 혼성화를 위해 대략 2.0 × 107cpm을 막에 가하였다. 모든 프로브에 대한 혼성화 조건은 65℃의 진탕 수조에 16시간 동안 두는 것이었다.
방사성표지된 프로브 spnF, spnS 및 spnE (TE)를 함유하는 혼성화 용액을 기울여 따라내고, 막의 각 세트를 다음과 같은 배지 엄격 조건하에 세척하였다: 1) 15분, 실온, 300 mL 3X SSC/0.5％ SDS 중; 2) 30분, 65℃, 300 mL 신선한 3X SSC/0.5％ SDS 중 진탕; 3) 30분, 실온, 300 mL 1X SSC/0.5％ SDS 중. 사카로폴리스포라 종 LW107129 (NRRL 30141) 코스미드 9D3 서열로부터 유도된 방사성표지된 프로브로 스크리닝한 막을 다음과 같은 엄격 조건하에 세척하였다: 1) 30분, 65℃, 300 mL 신선한 1X SSC/0.5％ SDS 중 진탕; 2) 30분, 65℃, 300 mL 신선한 0.33X SSC/0.5％ SDS 중 진탕; 3) 30분, 65℃, 300 mL 신선한 0.1X SSC/0.5％ SDS 중 진탕. 소형 가이거 뮐러 (Geiger Mueller) 카운터를 사용하여 필터를 모니터링함으로써 배경 동위원소 검출이 최소인지를 결정하였다. 막을 3MM 여과지 상에 올려 놓고, 플라스틱 포장으로 덮어 x-선 필름에 노출시켰다. 막은 필름이 -70℃에서 24 내지 72시간 동안 노출된 후 현상되도록 하였다.
코스미드 벡터로부터의 제한 엔도뉴클레아제 소화 분석 및 말단-서열분석을 통해 추정상의 양성 코스미드 클론을 추가로 특징규명하였다. 뉴클레오스핀 핵산 정제 키트 (미국 캘리포니아주 팔로 알토에 소재하는 클론텍 레버러토리즈, 인크. 제품)를 사용하여 코스미드 DNA를 단리하고, 37℃에서 1시간 동안 20 유닛의 제한 효소 EcoRI (뉴 잉글랜드 바이오랩스 제품)으로 소화시켰다. 제한효소 처리된 DNA를 1.0％ 아가로스 겔에서 전기영동하였다. DNA 단편을 0.5％ 에티듐 브로마이드로 염색한 후에 UV 광으로 가시화하고, 단편의 상대적인 크기를 1 kb DNA 래더와 비교하여 평가하였다. 또한, 코스미드/벡터 접합체로부터의 사카로폴리스포라 종LW107129 (NRRL 30141) 뉴클레오티드 서열을 문헌 [Burgett and Rosteck (1994)]의 방법에 따른 형광 사이클 서열분석에 의해 얻었다. 서열분석 반응은 열 사이클러 조건 (96℃, 30초; 50℃, 15초; 60℃, 4분)하에 3 ㎕ (2 ㎍ 정제된 코스미드 DNA) 템플레이트, 1 ㎕ 만능 (universal) 프라이머 (4 pmol) 또는 역방향 프라이머 (4 pmol), 8 ㎕ 빅 다이 (Big Dye) (등록상표) 반응 혼합물, 1 ㎕ DMSO, 7 mL H2O로 구성되었으며, 377 ABI Prism 서열분석기 (어플라이드 바이오시스템즈, 인크. (Applied Biosystems, Inc.) 제품)로 25 사이클로 수행하였다.
사카로폴리스포라 스피노사 프로브 spnS, spnF 및 spnE (TE)에 혼성화하는 8가지 코스미드 클론을 양성으로 확인하였다. 코스미드 8H3는 spnS 및 spnF 프로브 모두에 혼성화된 2가지 클론 중 하나였다. 코스미드 9D3는 spnF 프로브에만 혼성화된 3가지 클론 중 하나였다. 코스미드 10C1은 spnE (TE) 프로브에만 혼성화된 3가지 클론 중 하나였다. 코스미드 9F4는 코스미드 9D3 (서열 1의 염기 297477-30163)으로부터의 코스미드/벡터 말단의 뉴클레오티드 서열분석을 통해 밝혀진 사카로폴리스포라 종 LW107129 (NRRL 30141)의 서열에서 직접 유래된 방사성표지된 PCR-단편에 혼성화됨으로써 게놈 라이브러리로부터 확인되었다. 2가지 프라이머를 코스미드 9D3 DNA 서열을 기초로 하여 합성하였다 (서열 39 및 서열 40). 상기한 혼성화용 프라이머를 사용하여, 사카로폴리스포라 종 LW107129 (NRRL 30141) 게놈 DNA로부터 416 bp DNA 단편을 증폭시켰다.
코스미드 8H3, 9D3,9F4 및 10C1의 완전 서열을 파지 M13 (미국 텍사스주 휴스턴에 소재한 세크라이트 (SeqWright) 제품)에 클로닝된 무작위 DNA 단편의 형광 사이클 서열분석 방법으로 결정하였다. 코스미드 8H3 및 9D3내의 인서트가 중첩되었고, 코스미드 9D3 및 9F4내의 인서트가 중첩되었으며, 코스미드 9F4 및 10C1내의 인서트가 중첩되었다. 도 2를 참조한다. 이를 종합하면, 4가지 코스미드 인서트는 독특한 서열 (서열 1 및 서열 2)의 약 111 kb에 걸쳐 있었다. 서열 1은 busA의 출발 코돈 및 그의 3'에 대한 모든 DNA를 포함한다 (도 2 참조). 서열 2는 busA 출발 코돈 앞쪽의 염기로 시작하여 이 염기의 5'쪽에 대한 모든 DNA를 포함한다. 하기의 표 3은 4가지 인서트 각각에 포함된 서열 1 및 서열 2의 일부를 확인한다.
도 2는 4가지 인서트와 110 kb 서열의 관계를 그래프로 나타낸다.
PKS 유전자
서열 1은 공지된 마크롤리드 생산자의 폴리케티드 신타제를 코딩하는 DNA에 현저한 상동성을 보유하는 약 60 kb의 중심 영역을 포함한다 ([Donadio et al., 1991], [McDaniel ＆ Katz., 2001] 및 [Dehoffet al., 1997]). 부테닐-스피노신 PKS DNA 영역은 다른 마크롤리드-생산 박테리아의 PKS ORF에 유사한 ACP 도메인의 말단에서 인-프레임 (in-frame) 종결 코돈을 보유하는 5개의 ORF로 구성된다. 5가지 부테닐-스피노신 PKS 유전자는 에리트로마이신 PKS 유전자 AI 및 AII [Donadio et al., 1993] 사이에 존재하는 삽입 요소 등과 같은 임의의 개재성 비-PKS 기능들 없이 헤드-대-테일 (도 2 참조)로 배열된다. PKS 유전자는 busA, busB, busC, busD 및 busE로 지칭된다. 5가지 스피노신 PKS 유전자 각각에 대한 뉴클레오티드 서열 및 상응하는 폴리펩티드는 하기의 표 4에서 확인된다:
busA는 개시자 모듈 (서열 1, 염기 1-2931), 연장자 모듈 b (서열 1, 염기 2992-8130) 및 연장자 모듈 1 (서열 1, 염기 8205-13032)을 코딩한다. 개시자 모듈 및 연장자 모듈 b 및 1 내의 기능적 도메인 각각에 대한 뉴클레오티드 서열 및 상응하는 아미노산 서열은 하기의 표 5에서 확인된다:
busB는 연장자 모듈 2 (서열 1, 염기 13059-19505)를 코딩한다. 연장자 모듈 2 내의 기능적 도메인 각각에 대한 뉴클레오티드 서열 및 상응하는 아미노산 서열은 하기의 표 6에서 확인된다:
busC는 연장자 모듈 3 (서열 1, 염기 19553-24061) 및 연장자 모듈 4 (서열 1, 염기 24128-29053)를 코딩한다. 연장자 모듈 3 및 4 내의 기능적 도메인 각각에 대한 뉴클레오티드 서열 및 상응하는 아미노산 서열은 하기의 표 7에서 확인된다:
busD는 연장자 모듈 5 (서열 1, 염기 29092-34263), 연장자 모듈 6 (서열 1, 염기 34327-38892) 및 연장자 모듈 7 (서열 1, 염기 38956-43503)을 코딩한다. 연장자 모듈 5, 6 및 7 내의 기능적 도메인 각각에 대한 뉴클레오티드 서열 및 상응하는 아미노산 서열은 하기의 표 8에서 확인된다:
spnE는 연장자 모듈 8 (서열 1, 염기 43945-49083), 연장자 모듈 9 (서열 1, 염기 49195-54366) 및 연장자 모듈 10 (서열 1, 염기 54466-60707)을 코딩한다. 연장자 모듈 8, 9 및 10 내의 기능적 도메인 각각에 대한 뉴클레오티드 서열 및 상응하는 아미노산 서열은 하기의 표 9에서 확인된다:
상기 표 7 내지 11에서 확인된 55가지 도메인의 경계 및 기능은 다른 폴리케티드 신타제, 특히 에리트로마이신 폴리케티드 신타제 내 도메인의 보존된 아미노산 서열에 대한 유사성을 기초로 하여 예측된다 [Donadio et al., 1992]. A83543 스피노신 PKS와 유사하게, bus PKS는 개시자 모듈의 아미노 말단에 KSQ 도메인을 보유한다. 이 KSQ 도메인은 아미노산 172에서 β-케토신타제 활성에 필요한 시스테인 대신 글루타민 잔기를 함유하기 때문에 β-케토신타제로서 기능할 수 없다 [Siggard-Andersen, 1993]. KSQ 도메인은 말로닐-ACP를 탈카르복실화하는 기능을 하며 쇄 개시 인자인 것으로 보고되었다 [Bisang, et al., 1999]. 다른 부테닐-스피노신 PKS 도메인은 기능적이다. 이들 중 어떤 것도 에리트로마이신 및 라파마이신 PKS 유전자에 존재하는 불활성 도메인의 서열 특징을 보유하지 않는다 [Donadioet al., 1991; Aparicio et al., 1996].
busB 내지 busE의 크기는 spnB 내지 spnE와 필적하지만, busA는 spnA보다 5,244 bp 만큼 더 크다. busA의 처음 4,245 bp 및 마지막 3,486 bp는 spnA에 대해 높은 유사성을 보유한다. 그러나, 염기 4246-9548은 spnA 유전자에 대한 대응부를 보유하지 않는다. 이러한 5 kb 영역은 5가지 기능적 도메인 KSb, ATb, DHb, KRb 및 ACPb를 보유하는 추가의 모듈을 코딩한다. 이들 기능은 상기 개시 도메인과 함께, A83543 스피노신에 비해 부테닐-스피노신의 특징인 부테닐 측쇄의 생합성을 초래한다. 클로닝된 bus PKS 유전자 busB, busC, busD 및 busE는 동족체 A83543 스피노신 PKS 유전자 spnB, spnC, spnD 및 spnE (표 10)[Baltz et al., 2000]와 유사한 것으로 나타났다.
스피노신의 생합성에서 유사한 반응을 수행하는 단백질들은 87 내지 93％의 아미노산 동일성을 공유하며, 유전자들은 93 내지 94％의 DNA 서열 동일성 범위에있다. spn PKS 효소 SpnB-E 및 유사한 bus PKS 효소 BusB-E는 이들 효소에 의해 수행되는 반응이 동일함에도 불구하고 기질 폴리케티드가 상이하기 때문에 별개의 기질 특이성을 유지한다는 것을 주목해야 한다. 또한, 5 PKS 효소가 기능적 PKS로의 모이는 데에는 특이적인 단백질-단백질 상호작용이 필요하다. 이러한 서브유닛 사이의 분자 인식에 관여하는 잔기는 알려져 있지 않으며, 사카로폴리스포라 스피노사 및 사카로폴리스포라 종 LW107129 (NRRL 30141) 사이에서 보존될 수 없다.
추가의 변형을 초래하는 PKS에 인접한 유전자
PKS 유전자 (코스미드 8H3내에 클로닝됨)의 상류 DNA에서, 22개의 오픈 리딩 프레임 (ORF)이 존재하였으며, 각각은 100개 이상의 코돈으로 구성되고, ATG 또는 GTG로 시작하여 TAA, TAG 또는 TGA로 종결하며, DNA가 높은 비율의 구아닌 및 시토신 잔기를 함유하는 유기체에서 단백질 코딩 영역에 대해 예측되는 코돈 바이어스를 보유한다 [Bibb et al., 1984]. 이들 22개의 ORF를 도 2에 그래프로 나타내었다. 하기 논의될 증거를 기초로, 14개의 ORF가 부테닐-스피노신 생합성 유전자로서, 즉 busF, busG, busH, busI, busJ, busK, busL, busM, busN, busO, busP, busQ, busR 및 busS (도 2에서 표지된 F 내지 S)로서 지칭되었다. 하기의 표 11에서, 상응하는 폴리펩티드에 대한 DNA 서열 및 아미노산 서열이 이들 유전자 각각 뿐만 아니라, spnS의 인접 하류에 존재하는 ORF (코스미드 8H3에서 ORF LI, ORF LII, ORF LIII, ORF LIV, ORF LVI, ORF LVII, ORF LVIII 및 ORF LIX)에 대하여 확인된다. 또한, 표 11에서 PKS 유전자 (코스미드 2C10에서) 하류의 ORF RI, ORF RII 및 ORF RIII에 대한 뉴클레오티드 서열 및 이에 상응하는 아미노산 서열이 확인된다.
(C)는 서열 목록에 주어진 상보적 가닥을 지시한다.
표 11에 확인된 폴리펩티드에 대한 기능을 배정하기 위해, 4가지 방면의 증거를 이용하였다: 공지된 기능의 서열에 대한 유사성, A83543 스피노신 생합성 유전자에 대한 유사성, 표적화된 유전자 파괴 실험의 결과 및 생물전환 실험의 결과.
예측된 폴리펩티드의 아미노산 서열을 BLAST 알고리즘을 이용하여 미국립 생물공학 정보 센터 (National Center for Biotechnology Information) (NCBI, 미국워싱톤 DC 소재)의 데이타베이스에 기탁된 서열과 비교하였으며, 상기 아미노산 서열이 공지된 단백질과 얼마나 많은 관련이 있는지를 결정하였다. 또한, NCBI 데이타베이스의 BLAST 검색을 주기적으로 반복하여 추가의 상동성으로부터 새로운 사실을 알아냈다. 표 12는 2001년 2월 18일에 수행된 기초 BLAST 검색으로부터의 유의한 매치를 제공한다:
* 유사성이 클 수록 BLAST 스코어가 높다 [Altschul et al., 1990].
bus 오픈 리딩 프레임을 A83543 스피노신 생합성 유전자 (기탁 번호 AY007564)의 서열과 직접 비교하였다. DNA 서열 및 단백질 서열 모두에서 유사성정도가 높다는 것은, 상기 유전자들이 스피노신 생합성에서 유사한 기능을 수행함을 지시한다. 표 13은 bus 및 spn 유전자 사이의 유사성 비교를 제공한다.
몇몇 bus 및 spn 유전자들 사이에서 DNA 및 아미노산의 유사성이 높긴 하지만, bus 유전자 생산물 중 일부는 부테닐-스피노신의 생합성에서 A83543 스피노신과는 현저하게 상이한 반응을 촉매한다는 것을 주목해야 한다. 이러한 차이는 사카로폴리스포라 종 LW107129 (NRRL 30141)로부터 단리된 별개의 부테닐-스피노신화합물에서 나타난다. 개시된 모든 천연 A83543 스피노신은 포로스아민 또는 특이적 포로스아민 이성질체로 치환된다 [Kirst, et al., 1992]. 한편, 부테닐-스피노신은 또한 C-17에서 광범위한 포로스아민 이성질체뿐만 아니라, 중성 당 유사 아미세토스, O-메틸-글루코스 및 O-메틸올레안드로스로 치환된다. A83543 스피노신과 비교하여 이러한 C-17 글리코실화 다양성에는 당을 제조하기 위한 생합성 효소 및 이들 글리코실화를 촉매할 수 있는 글리코실트랜스퍼라제가 필요하다. 이들 당은 염색체 내에서 bus 유전자 근처 또는 다른 곳에 위치하는 특이적 신타제 유전자에 의해 합성되거나, 기재된 부테닐-스피노신 유전자의 별법의 기질 특이성에 의해 합성될 수 있다. 아미세토스는 bus 유전자 클러스터 외부의 유전자에 의해 생산될 수도 있고, 또는 포로스아민 생합성의 중간체일 수도 있다 (도 4). 메틸올레안드로스는 포로스아민 생합성 및 람노스 O-메틸트랜스퍼라제의 부산물 (busH, busI 및 busK)로서 생산될 수 있다. 이러한 당은 포로스아민의 생합성에서 중간체인 NDP-4-케토-2,6-데옥시-D-글루코스로부터 합성될 수 있다. 따라서, 개시된 유전자 및 다른 사카로폴리스포라 종 LW107129 (NRRL 30141) 유전자에 의한 상기 전구체의 케토환원 및 O-메틸화는 메틸올레안드로스를 함유하는 스피노신 유도체의 생합성을 유도할 수 있다 (도 4).
또한, 표 13에 기재된 9가지 유전자는 부테닐-스피노신 아글리콘 또는 PSA (busF, busG, busH, busI, busJ, busK, busL, busM 및 busP)와 직접적으로 상호작용한다. 이들 유전자에 대한 아글리콘 및 PSA 기질은 A83543 스피노신 아글리콘 및 PSA와는 별개이다. 따라서, 이들 유전자는 표 13에 기재된 spn 대응부와 비교하여 별개의 기질 특이성을 보유한다.
사카로폴리스포라 종 LW107129 (NRRL 30141)에 의해 생산된 여러가지 부테닐-스피노신 동족체 (표 2)는 C-8 또는 C-24에서 히드록실화되어 있다. 마크롤리드는 에리트로마이신 생합성에 있어서 C-6에서의 히드록실화에서와 같이 P-450 모노옥시게나제에 의한 합성 후 히드록실화시킬 수 있다 [Weber ＆ McAlpine, 1992]. ORF LVII는 P-450 모노옥시게나제와 매우 유사하고, 상기 효소 또는 사카로폴리스포라 종 LW107129 (NRRL 30141) 염색체상의 다른 부위에서 코딩된 모노옥시게나제는 부테닐-스피노신의 C-8 또는 C-24에서의 히드록실화를 초래할 수 있다. 별법으로, 히드록실화 전구체, 예를 들어 글리코실레이트 또는 글리세롤을 류코마이신에서와 같이 폴리케티드 합성 동안 혼입시킬 수 있다 [Omura et al., 1983]. 니다마이신 생산자 (nid AT6)에서 글리콜레이트의 부가에 특이적인 AT 도메인은 에리트로마이신 및 라파마이신 PKS 유전자의 메틸-말로닐-CoA 특이적 AT 도메인과 유사한 것으로 보고되었다 [Katz et al., 2000]. PKS 모듈 7은 부테닐-스피노신 폴리케티드의 탄소 8 및 9의 부가를 초래하나, bus AT7 도메인은 nid AT6과 동일한 메틸-말로닐-CoA 특이적 서열을 보유하지 않는다. 글리콜레이트 특이성을 초래할 수 있는 다른 AT 도메인 및 nid AT6과 비교하여, bus AT7에는 독특한 서열이 존재한다. 이들 변형을 초래하는 부테닐-스피노신 생합성 유전자는 상기 히드록실화 스피노신이 사카로폴리스포라 스피노사에 의해 생산되지 않기 때문에 A83543 스피노신과 비교하여 독특하다.
또한, 사카로폴리스포라 종 LW107129 (NRRL 30141)에서는 람노스 메틸화의특이성이 사카로폴리스포라 스피노사에서와 다르게 변경된다. 미국 특허 제5,202,242호 및 동 제5,840,861호에 개시된 바와 같이, A83543 스피노신상에서의 람노스 메틸화가 변경된 사카로폴리스포라 스피노사의 돌연변이체는 전형적으로 A83543 스피노신의 모노-데스메틸화된 람노스 유도체를 생산한다. A83543 스피노신의 디-데스메틸 람노스 유도체는 시네푼긴 등과 같은 메틸트랜스퍼라제 억제제의 존재하에서만 검출되었다. 람노스 메틸화가 변경된 사카로폴리스포라 종 LW107129 (NRRL 30141)의 돌연변이체 [Hahn et al., 2001]는 메틸트랜스퍼라제 억제제의 부재하에서 부테닐-스피노신의 디- 및 트리-데스메틸 람노스 유도체를 다량으로 생산했다.
상보성 연구의 경우에, 사카로폴리스포라 종 LW107129 (NRRL 30141) bus DNA를 함유하는 코스미드를 부테닐-스피노신 합성이 변경된 사카로폴리스포라 종 LW107129 (NRRL 30141) 돌연변이체 균주에 접합시켰다 (상세한 설명은 하기의 실시예 4에 제시되어 있음). 이어서, 상기 트랜스접합체에 대하여 차단 돌연변이체의 생성물을 다른 스피노신으로 전환시키는 능력을 시험하였다. 사용된 돌연변이체는 3'-O-데스메틸람노스-부테닐-스피노신 (3-ODM) 및 관련된 인자를 생산하는 30141.8이었다. 30141.8/8H3 트랜스접합체는 3-ODM 대신에 부테닐-스피노신을 생산하므로, 람노스의 3' 위치에서의 메틸화를 초래하는 유전자는 코스미드 8H3상에 존재하여야 한다.
표적화된 유전자 파괴에서, 코스미드 DNA로부터의 PCR 증폭을 통해 내부 단편을 생성하여 플라스미드로 클로닝시켰다. 이어서, 생성된 플라스미드를 사카로폴리스포라 종 LW107129 (NRRL 30141)에 접합시키고, 아프라마이신-내성 트랜스접합체를 단리하여 발효시켰다. 파괴 실험의 원리는, 내부 유전자 단편을 보유하는 플라스미드가 통합되는 경우에 생합성 유전자의 2개의 불완전 카피가 생성되고, 이에 의해 효소 기능을 제거한다는 것이다. 발효 생산물을 분석하여 부테닐-스피노신의 축적 여부를 결정하였다. busO 유전자의 파괴는 부테닐-스피노신 PSA의 축적을 유도하며, 이는 busO가 포로스아민의 합성 또는 부가에 필요하다는 것을 제시한다 (실시예 5 참조). 합성되지 않은, C-17에서 당을 함유하는 화합물도 포로스아민 생합성 유전자를 사용하여 busO 돌연변이체에 축적시킬 수 있다.
이하에서는, BLAST 검색, 유전자 파괴 실험 및 생물전환 연구로부터 도출된 결론을 유전자별로 더욱 상세하게 논의할 것이다.
PKS의 14개 유전자 상류가 부테닐-스피노신 생합성에 관여하는 것으로 결정되었으며, 이는 사카로폴리스포라 스피노사의 spnF-S 유전자 (표 13)에 대한 그들의 높은 유사성 및 이들 유전자가 부테닐-스피노신의 생합성에 필요한 기능을 코딩하는 것으로 공지된 효소에 대한 현저한 유사성을 보유한다는 것을 밝혀낸 BLAST 검색으로 인한 것이다.
busF, bus3, busL, busM
유전자 busF, busJ, busL 및 busM은 spnF, spnJ, spnL 및 spnM에 대해 높은 유사성을 나타낸다. 이들 A83543 스피노신 유전자는 PKS 유전자의 추정상의 모노시클릭 락톤 생산물로부터의 아글리콘의 생성에 관여하는 것으로 보고되었다. busF 유전자 생산물은 spnF와 91％의 아미노산 동일성을 보유하고, 마찬가지로busL 유전자 생산물은 spnL과 94％의 아미노산 동일성을 보유한다. spnF 및 spnL 유전자 생산물 모두가 메틸트랜스퍼라제이며 모든 4가지 단백질이 탄소-탄소 결합 형성에 관여하는 것으로 공지되어 있는 스트렙토마이세스 유래의 효소와 높은 유사성을 보유한다. busJ 단백질은 옥시도리덕타제로 보고된 spnJ와 83％의 아미노산 동일성을 보유한다. bus 및 spnJ 둘 다는 다우노루비신의 생합성에서 C-C 결합 형성에 관여하는 것으로 공지되어 있는 dnrW와 매우 유사하다. busM 유전자 생산물은 spnM과 96％ 동일하였다. busM 및 spnM 둘 다의 유전자 생산물은 칸디다 알비칸스 (Candida albicans)로부터 분비된 신규 클래스의 리파제와 매우 유사하다. 메틸트랜스퍼라제로서의 busF 및 busL, 옥시다제로서의 busJ 및 리파제로서의 busM의 역할은 탄소-탄소 가교 형성에서의 spnF, spnL, spnJ 및 spnM 유전자의 역할과 일치한다.
busG, busH, busI, busK
busG, busH, busI 및 busK는 사카로폴리스포라 스피노사의 spnG, spnH, spnI 및 spnK 유전자와의 유사성이 높았다. 이들 유전자는 A83543 스피노신 아글리콘에의 람노스 부가 및 후속적인 메틸화에 관여하는 것으로 보고되었다. busG 유전자는 spnG와 90％의 유사성을 보유하고, 폴리케티드 유도된 항생제에 관여하는 여러가지 유전자 (표 11)와 매우 유사하였다. busH, busI 및 busK 유전자 생산물은 스피노신 생합성에서 람노스의 메틸화에 관여하는 것으로 보고된 spnH (97％), spnI (92％) 및 spnK (88％) 유전자 생산물 각각과 높은 아미노산 유사성을 나타내었다. 모든 3가지 유전자는 마카로신-O-메틸트랜스퍼라제인 것으로 실험적으로 제시된 스트렙토마이세스 프라디애 유래의 tylE (busI 및 busK) 및 tylF (busH) 유전자와의 아미노산 유사성이 높았다 [Bate ＆ Cundliffe, 1999].
busN, busO, busP, busQ, busR, busS
spnN, spnO, busP, busQ, busR 및 busS는 사카로폴리스포라 스피노사의 spnN, spnO, spnP, spnQ, spnR 및 spnS 유전자 (표 12)와의 유사성이 높았다. 이들 유전자는 포로스아민 당의 생합성 또는 부가에 관여하는 것으로 보고되었다. busP와 다른 글리코실 트랜스퍼라제 (표 11)와의 유사성은 busP가 부테닐-스피노신 포로스아밀 트랜스퍼라제를 코딩하는 것을 지시한다. busO 및 urdS 2,3 데히드라타제 (표 11, [Hoffineister et al., 2000]) 사이의 높은 유사성은 busO가 포로스아민 합성의 2'-탈산소화 단계에 관여하는 것을 지시한다. busQ 유전자 생산물 및 urdQ 3,4-데히드라타제 (스트렙토마이세스 프라디애, [Hoffmeister et al., 2000]) 사이의 유사성은 busQ가 포로스아민 합성의 3'-탈수 단계에 관여하는 것을 지시한다. busR은 데옥시당 트랜스아미나제로서 작용하는 것으로 제안된 단백질 군 [Thorson et al., 1993]과 40％ 정도의 동일성을 보유하였으며, 이는 busR이 포로스아민 합성의 4'-아미노화 단계에 관여하는 것을 지시한다. 마지막으로, busS는 아미노 메틸라제 군과 매우 유사하였으며, 이는 busS가 포로스아민의 4'-아미노기의 메틸화에 관여하는 것을 제시한다. 따라서, busN, busO, busP, busQ, busR 및 busS는 부테닐-스피노신의 포로스아민 잔기의 생산에 관여한다.
이와 같이, 사카로폴리스포라 종 LW107129 (NRRL 30141)의 19가지 유전자는 부테닐-스피노신 생합성에서의 역할이 배정될 수 있다: 5가지 PKS 유전자는 마크로시클릭 락톤을 생산하는 역할에 배정되고, 4가지 유전자는 이를 아글리콘으로 변형시키는 역할에 배정되고, 4가지 유전자는 람노스를 부가하고 메틸화시키는 역할에 배정되며, 6가지 유전자는 포로스아민을 합성하고 부가하는 역할에 배정될 수 있다. 가설적인 생합성 경로는도 1A 및 1B에 요약되어 있다.
유용성
클로닝된 사카로폴리스포라 종 부테닐-스피노신 DNA에는 여러가지 용도가 존재한다. 클로닝된 상기 유전자를 사용하여, 부테닐-스피노신의 수율을 향상시키고 신규한 부테닐-스피노신을 생산할 수 있다. 수율 향상은 특정 부테닐-스피노신을 생산하는 균주의 게놈에 하나 이상의 부테닐-스피노신 생합성 유전자의 복제 카피를 통합시킴으로써 달성할 수 있다. 필요한 효소의 결핍으로 인해 특정 돌연변이체 균주에서 생합성 경로가 차단되는 극단적인 경우에, 원하는 스피노신의 생산은 필요한 유전자 카피의 통합을 통해 회복될 수 있다.
신규 화합물은 부테닐-스피노신 생합성에서의 단계를 파괴하는 클로닝된 DNA의 단편을 사용하여 생산할 수 있다. 이러한 파괴는 전구체 또는 "션트" 생산물 (전구체가 천연적으로 프로세싱된 유도체)의 축적을 유도할 수 있다. 유전자 파괴에 의해 생산된 변형된 스피노신은 그 자체가 곤충 방제제이거나, 이것이 추가의 화학적 변형에 대한 기질로서 작용하여, 독특한 특성 및 활성 스펙트럼을 갖는 신규 반합성 스피노신을 생성할 수 있다. busO 유전자를 파괴하면 부테닐-스피노신 PSA가 축적된다. 부테닐-스피노신 PSA는 C-17에 신규한 기를 함유하는 스피노신 동족체의 합성에 대한 출발 물질로서 유용하다.
또한, 신규 부테닐-스피노신은 하나 이상의 클로닝된 bus 유전자 또는 그의 일부를 이종 숙주에 전달함으로써 제조될 수도 있다. 이들 유전자는 수용 숙주에 존재하지 않는 효소 기능을 제공할 수 있다. 이러한 유전자는 교대 당을 제공하거나, 기존의 당 또는 아글리콘 탄소를 변형시키거나, 교대 당을 아글리콘에 부착시키거나, 아글리콘 자체의 염기 구조를 변경시킬 수 있다. 이종 숙주에 클로닝된 유전자에 의해 생산된 화합물은 그 자체로서 곤충 방제제이거나, 추가의 화학적 변형에 대한 기질로서 작용하여, 독특한 특성 및 활성 스펙트럼을 갖는 신규 반합성 스피노신을 생성할 수 있다. 코스미드 8H3 및 9D3 유래의 사카로폴리스포라 종 LW107129 (NRRL 30141) DNA는 A83543 스피노신의 생산자인 사카로폴리스포라 스피노사에 전달할 수 있으며, 트랜스접합체는 신규 스피노신을 생산한다.
신규 부테닐-스피노신은 부테닐-스피노신-생산 유기체에서 클로닝된 유전자의 돌연변이유발 및 돌연변이된 유전자로 그들의 돌연변이되지 않은 대응부를 치환하여 생산할 수도 있다. 돌연변이유발은, 예를 들어 다음을 포함할 수 있다: 1) KR, DH 또는 ER 도메인을 불활성화시켜 상기 기능 중 하나 이상이 차단되고 균주가 스피노신 A의 핵에 존재하지 않는 이중 결합, 히드록실기 또는 케토기를 갖는 락톤 핵을 보유하는 스피노신을 생산하도록 함 (문헌 [Donadio et al., 1993] 참조); 2) 상이한 카르복실산이 락톤 핵에 혼입되도록 AT 도메인을 대체시킴 (문헌 [Ruan et al., 1997] 참조); 3) KR, DH 또는 ER 도메인을 기존의 PKS 모듈에 부가하여, 균주가 스피노신 A의 핵에 존재하지 않는 포화 결합, 히드록실기 또는 이중 결합을 갖는 락톤 핵을 보유하는 스피노신을 생산하도록 함 [MacDaniel ＆ Katz, 2001]; 또는 4) 완전 PKS 모듈을 부가 또는 제거하여 시클릭 락톤 핵이 탄소 원자를 더 많이 또는 더 적게 보유하도록 함.
부테닐-스피노신 유전자 클러스터 영역으로부터의 DNA를 혼성화 프로브로서 사용하여, 상동성 서열을 확인할 수 있다. 이와 같이, 본원에서 클로닝된 DNA를 사용하여, 본원에 기재된 영역과 중첩되지만 또한 사카로폴리스포라 종 LW107129 (NRRL 30141)의 게놈에서 인접한 영역으로부터의, 이전에는 클로닝되지 않은 DNA를 함유하는 사카로폴리스포라 종 LW107129 (NRRL 30141) 유전자 라이브러리로부터의 추가의 플라스미드를 위치시킬 수 있다. 또한, 사카로폴리스포라 종 LW107129 (NRRL 30141) bus 유전자와 사카로폴리스포라 스피노사 spn 유전자의 비교는 에리트로마이신, 라파마이신, 틸로신 및 다른 것에 대한 생합성 유전자와 같은 비-스피노신-생산 생합성 유전자와 별개인 보존된 서열의 영역의 확인을 유도한다. 이들 스피노신-특이적 유전자 프로브뿐만 아니라 본원에서 클로닝된 영역의 모든 DNA는, 다른 유기체 내에서 동일하지는 않지만 유사한 서열을 확인하는데 사용될 수 있다. 혼성화 프로브는 통상적으로 길이가 염기 약 20개 이상이고, 검출가능하도록 표지되어 있다.
미국 특허 제5,362,634호 또는 2001년 3월 21일자로 출원된 미국 가출원 제60/277,601호 (발명의 영문 명칭: "Pesticidal Macrolides")에 개시된 것과 같은 통상의 프로토콜을 이용하여, 본 발명에 의해 제공된 변형된 균주를 배양시켜 스피노신을 제공할 수 있다. 상기 실시예는 비제한적이며, 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예 2
부테닐-스피노신 대사물질에 대한 발효 브로쓰의 분석을 위한 LC/MS 방법
하기의 방법은 화학식 1 및 다른 성분을 생산하기 위해 발효물을 모니터링하기 위한, 전기분무 (ESI) 질량 분광계를 사용한 HPLC 분리를 이용한다. 이러한 시스템은 또한 전기분무 부가 이온으로부터의 제거에 의해 정제된 인자의 분자량을 측정하는데 사용되었다. 이들 데이타는 표 15에 요약되어 있다.
발효 브로쓰와 동등한 부피의 변성된 에탄올을 첨가하였다. 혼합물을 1시간 동안 진탕한 후에 원심분리하고 여과하여 (0.22 ㎛ 공극 크기), 벌크 세포 파편을 제거하였다. 1 mL 분취액을 미세원심분리한 다음, 하기의 LC-MS 시스템에 의해 청정화된 추출물을 분석하였다:
HPLC 시스템: 컬럼 정지상: 250 × 4.6-mm 컬럼, 염기-불활성화 실리카겔, 5 ㎛ C8 (하이퍼실 (Hypersil)-C8-BDS). 이동상: 하기에 요약된 10 mM 아세트산암모늄-메탄올-아세토니트릴 선형 구배:
용매 A는 10 mM 아세트산암모늄이고, 용매 B는 메탄올-아세토니트릴 (1:1)임.
유속: 1 mL/분; MS:폐기물 비율이 약 5:95가 되도록 UV 검출 후에 분할함.
검출: 고 콘 전압 (cone voltage) 및 저 콘 전압 모드에서 획득된 양성 ESI.
특징적 LC 체류 시간 및 질량 분광계: 하기 표 15에 요약된 바와 같음:
a+ESI 모드, 저 콘 전압하에 관찰된 모체 이온에 대한 m/z
b+ESI 모드, 고 콘 전압하에 관찰된 가장 풍부한 단편 또는 부가 이온에 대한 m/z
실시예 3
발효를 통한 부테닐-스피노신 대사물질의 제조
하기의 균주 NRRL 30141, NRRL 30421 및 그의 유도체 중 하나로부터 선택된 사카로폴리스포라의 원하는 균주를 하기한 바와 같은 발효 배지 내에서 배양시킴으로써 화학식 1의 대사물질을 생산하였다. 1.8 mL 냉동 생장 배지를 해동시키고, 125 mL 용량의 (baffled) 에를렌마이어 플라스크 내의 25 mL 생장 배지에 접종시키고, 150 rpm에서 72 내지 96시간 동안 30℃에서 성장시켰다.
진탕 플라스크 발효
성숙한 제1기 종균 12 밀리리터를 사용하여 500 mL 용량의 에를렌마이어 발효 플라스크 내의 50 mL 발효 배지를 접종시켰다.
발효를 30℃, 200 rpm (50 mm 스트로크)에서 7 내지 12일 동안 유지시켰다. 실시예 1에 개시된 바와 같이, 성숙 발효 맥주를 적합한 용매 및 크로마토그래피 분리에 의해 회수된 대사물질로 추출할 수 있다.
실시예 4
코스미드 8H3에 의한 균주 NRRL 30421 중 람노스 메틸화 결핍의 상보성
균주 NRRL 30421은 부테닐-스피노신상에서 람노스를 완전히 메틸화시키지 못하는 사카로폴리스포라 종 NRRL 30141의 돌연변이체이다. 균주 NRRL 30421은 화합물 4 및 람노스의 3' 위치에서 O-메틸화되지 않은 부테닐-스피노신 (3'-ODM)을 축적시켰다. 이들 메틸화 결핍은 busH, busI 또는 busK 유전자에 의해 코딩되는 O-메틸트랜스퍼라제 중 하나에서의 돌연변이에 의한 것이라 추정된다. 코스미드 8H3에는 이들 유전자 모두가 존재한다 (도 2).
코스미드 8H3 (도 3)을 접합 전달을 통해 대장균 ATCC 47055로부터 균주 NRRL 30421에 전달시켰다 [Matsushima et al., (1994)]. 코스미드 8H3으로 형질전환된 2가지 독립적인 단리물을 실시예 2에서와 같이 발효시키고, 실시예 1에 예시된 바와 같은 화합물 1 및 화합물 4의 생산에 대해 분석하였다.
*= 3' 위치에서 람노스의 메틸화를 억제하는 돌연변이
NRRL 30421은 우세하게 화합물 4를 생산하는 반면, 코스미드 8H3을 함유하는 NRRL 30421의 균주는 주로 화합물 1을 생산하였다 (표 18). 코스미드 8H3을 함유하는 NRRL 30421에서 화합물 1 및 화합물 4의 생산량은 비-돌연변이체 배양물 NRRL 30141에서와 유사하다 (표 18). 따라서, 코스미드 8H3으로의 형질전환이 균주 NRRL 30421에서의 메틸화 결핍을 극복하여 화합물 1의 생산 증강을 회복할 수 있는 것으로 입증되었다.
실시예 5
busO의 파괴에 의해 야기되는 부테닐-스피노신 전구체 및 션트 생산물의 축적
busO 유전자의 클로닝된 내부 단편 통합을 통해, busO 유전자를 불활성화시켰다. 올리고뉴클레오티드 쌍 (서열 2의 염기 11882-11861에 상응하는 제1 올리고뉴클레오티드 및 서열 2의 염기 10970-10993에 상응하는 제2 올리고뉴클레오티드)을 사용하여, 서열 2의 염기 10970-11882에 상응하는, 1,457 bp busO 유전자에 대한 내부 912 bp 영역을 증폭시켰다. 상기 단편을 함유하는 플라스미드를 사용한 사카로폴리스포라 종 LW107129 (NRRL 30141)의 형질전환은 busO 유전자의 부분 복제를 유발하여, 플라스미드를 플랭킹하는 유전자 및 항생제 내성 유전자의 2개의 절단형 카피를 수득할 수 있었다.
페일세이프 (FailSafe) (등록상표) PCR (에핀센터 (Epicenter) 제품)를 사용하여, 프라이머 서열 33 및 서열 34로 912 bp의 내부 busO PCR 단편을 생성하고, 제조업자 (인비트로겐 (Invitrogen))의 지침에 따라 pCRII로 클로닝시켰다. 생성된 플라스미드를 EcoRI로 소화시키고, busO 단편을 pOJ260의 EcoRI 부위에 클로닝시켰다 (도 3). 생성된 플라스미드를 접합 전달을 통해 대장균 ATCC 47055로부터 사카로폴리스포라 종 NRRL 30121의 유도체에 접합시켰다 [Matsushima et al., (1994)]. 6개의 독립적인 아프라마이신 내성 엑손 접합체를 실시예 2에서와 같이 발효시키고, 실시예 1에서와 같이 화합물 1 및 다른 다른 스피노신 유도체의 생산에 대해 분석하였다.
모체 균주, NRRL 30141은 화합물 1을 높은 수준으로 생산하였고, 슈도아글리콘 (PSA; 화합물 13)을 낮은 수준으로 생산하였다. 이는 또한 화합물 9도 소량으로 생산하였다 (표 19). 화합물 1은 6개의 busO 돌연변이체 중 어떠한 것에서도 검출할 수 없었으며, 이는 busO가 완전한 부테닐-스피노신 생합성에 필요함을 지시한다. 또한, 포로스아민 공급 결핍으로부터 예측할 수 있는 바와 같이, PSA의 수준은 모든 6개의 busO 돌연변이체에서 증가하였다. 또한, busO 돌연변이체에서는 C17에서 포로스아민이 아닌 당을 보유하는 화합물 9의 수준도 증가하였다.
*보고된 양은 NRRL 30141 내의 화합물 13에 대한 값이다; nd = 검출되지 않음.
참고문헌
Claims (22)
- 서열 3 내지 7 및 서열 8 내지 29로 구성된 군으로부터 선택된 서열과 98％ 이상 동일한 아미노산 서열로 이루어진 부테닐-스피노신 생합성 효소를 코딩하며, 상기 아미노산 서열이 선택된 서열에 100％ 미만으로 동일한 경우에는 이러한 차이가 코딩된 효소의 기능적 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 것인 DNA 서열을 포함하는 단리된 DNA 분자.
- 제1항에 있어서, 상기 DNA 서열이 각각 서열 1의 염기 1-13032, 13059-19505, 19553-29053, 29092-43890, 43945-60636, 62090-63937, 65229-66602 및 68762-69676 및 서열 2의 염기 114-938, 1389-2558, 2601-3350, 3362-4546, 4684-6300, 6317-7507, 7555-8403, 8640-9569, 9671-10666, 10678-12135, 12867-14177, 14627-15967, 16008-17141, 17168-17914, 18523-19932, 19982-20488, 20539-21033, 21179-21922, 22674-23453, 23690-24886, 26180-26923 및 27646-28473으로 기재된 busA, busB, busC, busD, busE, ORF RI, ORF RII, ORF RIII, busF, busG, busH, busI, busJ, busK, busL, busM, busN, busO, busP, busQ, busR, busS, ORF LI, ORF LII, ORF LIII, ORF LIV, ORF LVI, ORF LVII, ORF LVIII 및 ORF LIX로 구성된 유전자 군으로부터 선택된 것인 단리된 DNA 분자.
- 각각 서열 3의 아미노산 7-423, 528-853, 895-977, 998-1413, 1495-1836,1846-2028, 2306-2518, 2621-2710, 2735-3160, 3241-3604, 3907-4086 및 4181-4262로 기재된 KSi, ATi, ACPi, KSb, ATb, KRb, DHb, ACPb, KS1, AT1, KR1 및 ACP1로부터 선택된 부테닐-스피노신 PKS 도메인을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 단리된 DNA 분자.
- 제3항에 있어서, 상기 DNA 서열이 서열 1의 염기 16-1269, 1582-2559, 2683-2931, 2992-4239, 4483-5508, 5538-6084, 6916-7554, 7861-8130, 8203-9480, 9721-10812, 11719-12258 및 12541-12786으로 구성된 군으로부터 선택된 것인 단리된 DNA 분자.
- 각각 서열 4의 아미노산 1-421, 534-964, 990-1075, 1336-1681, 1685-1864 및 1953-2031로 기재된 KS2, AT2, DH2, ER2, KR2 및 ACP2로부터 선택된 스피노신 PKS 도메인을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 단리된 DNA 분자.
- 제5항에 있어서, 상기 DNA 서열이 서열 1의 염기 13059-14321, 14658-15900, 16026-16283, 17064-18100, 18111-18650 및 18915-19151로 구성된 군으로부터 선택된 것인 단리된 DNA 분자.
- 각각 서열 5의 아미노산 1-421, 528-814, 1157-1335, 1422-1503, 1526-1949, 2063-2393, 2697-2875 및 2969-3049로 기재된 KS3, AT3, KR3, ACP3, KS4, AT4, KR4및 ACP4로부터 선택된 스피노신 PKS 도메인을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 단리된 DNA 분자.
- 제7항에 있어서, 상기 DNA 서열이 서열 1의 염기 19553-20815, 21143-22000, 23021-23557, 23816-24061, 24128-25399, 25739-26731, 27641-28183 및 28457-28699로 구성된 군으로부터 선택된 것인 단리된 DNA 분자.
- 각각 서열 6의 아미노산 1-422, 537-864, 891-1076, 1382-1563, 1643-1724, 1746-2170, 2281-2611, 2914-3093, 3186-3267, 3289-3711, 3823-4151, 4342-4636 및 4723-4804로 기재된 KS5, AT5, DH5, KR5, ACP5, KS6, AT6, KR6, ACP6, KS7, AT7, KR7 및 ACP7로부터 선택된 스피노신 PKS 도메인을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 단리된 DNA 분자.
- 제9항에 있어서, 상기 DNA 서열이 서열 1의 염기 29092-30357, 30700-31683, 31762-32319, 33235-33780, 34018-34263, 34327-35601, 35932-36924, 37831-38370, 38647-38892, 38956-40224, 40560-41544, 42115-42999 및 43258-43503으로 구성된 군으로부터 선택된 것인 단리된 DNA 분자.
- 각각 서열 7의 아미노산 1-424, 530-848, 885-1072, 1371-1554, 1650-1728, 1751-2175, 2289-2616, 2642-2775, 3131-3315, 3396-3474, 3508-3921, 4036-4366,4389-4569, 4876-5054, 5148-5229 및 5278-5531로 기재된 KS8, AT8, DH8, KR8, ACP8, KS9, AT9, DH9, KR9, ACP9, KS10, AT10, DH10, KR10, ACP10 및 TE10으로부터 선택된 스피노신 PKS 도메인을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 단리된 DNA 분자.
- 제11항에 있어서, 상기 DNA 서열이 서열 1의 염기 43945-45216, 45532-46488, 46597-47160, 48055-48606, 48892-49083, 49195-50469, 50809-51792, 51868-52269, 53335-53889, 54130-54366, 54466-55707, 56050-57042, 57109-57651, 58570-59106, 59386-59631 및 59776-60537로 구성된 군으로부터 선택된 것인 단리된 DNA 분자.
- 서열 3의 아미노산 6-977, 서열 3의 아미노산 998-2710, 서열 3의 아미노산 2735-4262, 서열 4의 아미노산 1-2031, 서열 5의 아미노산 1-1503, 서열 5의 아미노산 1526-3049, 서열 6의 아미노산 1-1724, 서열 6의 아미노산 1746-3267, 서열 6의 아미노산 3289-4804, 서열 7의 아미노산 1-1728, 서열 7의 아미노산 1751-3474 및 서열 7의 아미노산 3508-5531로 구성된 군으로부터 선택된 스피노신 PKS 모듈 (module)을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 단리된 DNA 분자.
- 제13항에 있어서, 상기 DNA 서열이 서열 1의 염기 16-2931, 2992-8130, 8203-12786, 13059-19151, 19553-24061, 24128-28699, 29092-34263, 34327-38892, 38956-43503, 43945-49083, 49195-54366 및 54466-60537로 구성된 군으로부터 선택된 것인 단리된 DNA 분자.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 DNA 서열을 포함하는 재조합 DNA 벡터.
- 제15항의 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포.
- 1) 부테닐-스피노신 또는 부테닐-스피노신 전구체를 생산하는 생합성 경로에서 속도 제한 활성의 발현을 코딩하는 상기한 본 발명의 DNA 서열을 포함하는 재조합 DNA 벡터 또는 그의 일부를 사용하여, 생합성 경로에 의해 부테닐-스피노신 또는 부테닐-스피노신 전구체를 생산하는 미생물을 형질전환시키는 단계 및2) 상기 벡터로 형질전환된 미생물을 세포 성장 및 세포 분열, 상기 DNA 서열의 발현 및 스피노신의 생산에 적합한 조건하에서 배양하는 단계를 포함하는, 스피노신을 생산하는 미생물의 스피노신 생산력을 증가시키는 방법.
- 게놈 내에 작동되는 부테닐-스피노신 생합성 유전자를 보유하는 미생물의 게놈을 변형시켜 부테닐-스피노신 생합성 유전자 busA, busB, busC, busD, busE, busF, busG, busH, busI, busJ, busK, busL, busM, busN, busO, busP, busQ, busR 및 busS 중 하나 이상의 복제 (duplicate) 카피가 존재하는 미생물을 배양하는 단계를 포함하는, 부테닐-스피노신의 제조 방법.
- 게놈 내에 부테닐-스피노신 생합성 유전자를 보유하며, 상기 유전자들 중 하나 이상이 불활성화되어 있고, 나머지 유전자들은 작동하여, 파괴된 유전자가 작동할 경우에 생산되는 것을 제외한 부테닐-스피노신을 생산하는 미생물을 배양하는 단계를 포함하는, 부테닐-스피노신의 제조 방법.
- 형질전환되어 게놈 내에 작동되는 부테닐-스피노신 생합성 유전자를 함유하는 이종 미생물을 배양하는 단계를 포함하는, 부테닐-스피노신의 제조 방법.
- 게놈 내에 작동되는 부테닐-스피노신 생합성 유전자를 보유하며, 상기 유전자가 a) 적어도 하나 이상의 작동되는 PKS 모듈을 서열 1에 제시된 것보다 더 많이 또는 더 적게 포함하거나, 또는 b) KR, DH 또는 ER 도메인의 결실, 불활성화 또는 부가에 의하거나 AT 도메인의 치환에 의해 서열 1에 기재된 상응하는 모듈과는 다른 PKS 모듈을 포함하는 것인 미생물을 배양하는 단계를 포함하는, 부테닐-스피노신의 제조 방법.
- 부테닐-스피노신을 생산하는 미생물의 게놈 라이브러리를 생성하는 단계, 길이가 염기 20개 이상인 서열 1 또는 서열 2의 표지된 단편을 혼성화 프로브로서 사용하는 단계를 포함하는, 부테닐-스피노신 생합성 유전자의 단리 방법.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US28017501P | 2001-03-30 | 2001-03-30 | |
| US60/280,175 | 2001-03-30 | ||
| PCT/US2002/009968 WO2002079477A2 (en) | 2001-03-30 | 2002-03-28 | Biosynthetic genes for butenyl-spinosyn insecticide production |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20030087037A true KR20030087037A (ko) | 2003-11-12 |
| KR100882692B1 KR100882692B1 (ko) | 2009-02-06 |
Family
ID=23071997
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020037012803A KR100882692B1 (ko) | 2001-03-30 | 2002-03-28 | 부테닐-스피노신 살충제 생산을 위한 생합성 유전자 |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1414969B1 (ko) |
| JP (2) | JP2005512506A (ko) |
| KR (1) | KR100882692B1 (ko) |
| CN (1) | CN1507493A (ko) |
| AR (1) | AR033022A1 (ko) |
| DE (1) | DE60236511D1 (ko) |
| DK (1) | DK1414969T3 (ko) |
| ES (1) | ES2346412T3 (ko) |
| IL (2) | IL158095A0 (ko) |
| MX (1) | MXPA03008906A (ko) |
| TW (1) | TWI328610B (ko) |
| WO (1) | WO2002079477A2 (ko) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6143526A (en) * | 1998-03-09 | 2000-11-07 | Baltz; Richard H. | Biosynthetic genes for spinosyn insecticide production |
| CN101629203B (zh) * | 2008-12-09 | 2010-08-11 | 湖南师范大学 | 一种多杀菌素制备工艺 |
| BR112012028860A2 (pt) * | 2010-05-11 | 2020-09-01 | Dow Agrosciences Llc | cepas spnk. |
| HUE034838T2 (en) * | 2011-05-03 | 2018-03-28 | Dow Agrosciences Llc | Integration of genes into chromosome of saccharopolyspora spinosa |
| CA2969847A1 (en) | 2014-12-10 | 2016-06-16 | Regents Of The University Of Minnesota | Genetically modified cells, tissues, and organs for treating disease |
| CN110776536B (zh) * | 2019-09-20 | 2021-06-25 | 国家粮食和物资储备局科学研究院 | 一种从须糖多孢菌发酵液中提取丁烯基多杀菌素的工艺 |
Family Cites Families (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5362634A (en) | 1989-10-30 | 1994-11-08 | Dowelanco | Process for producing A83543 compounds |
| US5141926A (en) | 1990-04-18 | 1992-08-25 | Abbott Laboratories | Erythromycin derivatives |
| US6060234A (en) | 1991-01-17 | 2000-05-09 | Abbott Laboratories | Polyketide derivatives and recombinant methods for making same |
| US5202242A (en) | 1991-11-08 | 1993-04-13 | Dowelanco | A83543 compounds and processes for production thereof |
| US5539089A (en) | 1991-11-08 | 1996-07-23 | Dowelanco | A83543 aglycones and pseudoglycones |
| US5591606A (en) | 1992-11-06 | 1997-01-07 | Dowelanco | Process for the production of A83543 compounds with Saccharopolyspora spinosa |
| CA2156194C (en) | 1993-03-12 | 2008-01-08 | Jon S. Mynderse | New a83543 compounds and process for production thereof |
| CA2197524A1 (en) | 1996-02-22 | 1997-08-22 | Bradley Stuart Dehoff | Polyketide synthase genes |
| US6143526A (en) * | 1998-03-09 | 2000-11-07 | Baltz; Richard H. | Biosynthetic genes for spinosyn insecticide production |
| WO2000040596A1 (en) | 1999-01-06 | 2000-07-13 | The Regents Of The University Of California | Gene cluster for production of the enediyne antitumor antibiotic c-1027 |
| WO2001016303A2 (de) * | 1999-08-27 | 2001-03-08 | Bayer Aktiengesellschaft | Nucleinsäuren, die für enzymaktivitäten der spinosyn-biosynthese codieren |
| JP4666861B2 (ja) * | 1999-09-13 | 2011-04-06 | ダウ・アグロサイエンス・エル・エル・シー | 有害生物防除性マクロライド |
| TWI275592B (en) * | 2001-03-21 | 2007-03-11 | Dow Agrosciences Llc | Synthetic derivatives of 21-butenyl and related spinosyns |
-
2002
- 2002-03-27 AR ARP020101132A patent/AR033022A1/es not_active Application Discontinuation
- 2002-03-28 IL IL15809502A patent/IL158095A0/xx unknown
- 2002-03-28 EP EP02733919A patent/EP1414969B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-03-28 MX MXPA03008906A patent/MXPA03008906A/es active IP Right Grant
- 2002-03-28 CN CNA028090802A patent/CN1507493A/zh active Pending
- 2002-03-28 JP JP2002578479A patent/JP2005512506A/ja active Pending
- 2002-03-28 WO PCT/US2002/009968 patent/WO2002079477A2/en active Application Filing
- 2002-03-28 ES ES02733919T patent/ES2346412T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2002-03-28 KR KR1020037012803A patent/KR100882692B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2002-03-28 DK DK02733919.1T patent/DK1414969T3/da active
- 2002-03-28 DE DE60236511T patent/DE60236511D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2002-03-29 TW TW091106395A patent/TWI328610B/zh not_active IP Right Cessation
-
2003
- 2003-09-24 IL IL158095A patent/IL158095A/en not_active IP Right Cessation
-
2008
- 2008-07-08 JP JP2008178171A patent/JP2008278895A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2346412T3 (es) | 2010-10-15 |
| WO2002079477A3 (en) | 2004-03-04 |
| MXPA03008906A (es) | 2004-06-30 |
| IL158095A0 (en) | 2004-03-28 |
| KR100882692B1 (ko) | 2009-02-06 |
| EP1414969A2 (en) | 2004-05-06 |
| IL158095A (en) | 2013-10-31 |
| TWI328610B (en) | 2010-08-11 |
| DE60236511D1 (de) | 2010-07-08 |
| JP2005512506A (ja) | 2005-05-12 |
| DK1414969T3 (da) | 2010-09-06 |
| WO2002079477A2 (en) | 2002-10-10 |
| AR033022A1 (es) | 2003-12-03 |
| EP1414969B1 (en) | 2010-05-26 |
| CN1507493A (zh) | 2004-06-23 |
| JP2008278895A (ja) | 2008-11-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CA2322449C (en) | Biosynthetic genes for spinosyn insecticide production | |
| EP0910633B1 (en) | Hybrid polyketide synthase I gene | |
| AU758421B2 (en) | Recombinant oleandolide polyketide synthase | |
| JP2002519032A (ja) | ポリケチドとその合成 | |
| JP2008278895A (ja) | ブテニル−スピノシン殺虫剤生産のための生合成遺伝子 | |
| CA2463167A1 (en) | Production, detection and use of transformant cells | |
| AU2008201937B2 (en) | Biosynthetic genes for butenyl-spinosyn insecticide production | |
| US7807418B2 (en) | Method for producing hybrid polyketide synthases | |
| US20040219645A1 (en) | Polyketides and their synthesis | |
| AU2002305118A1 (en) | Biosynthetic genes for butenyl-spinosyn insecticide production | |
| JP2009213479A (ja) | ポリケチド類及びそれらの合成 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant | ||
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20130117 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20140121 Year of fee payment: 6 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20141230 Year of fee payment: 7 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20160104 Year of fee payment: 8 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20170102 Year of fee payment: 9 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20180103 Year of fee payment: 10 |
|
| LAPS | Lapse due to unpaid annual fee |