JP4662635B2 - エポチロンおよびエポチロン誘導体を生成するための組換え方法および材料 - Google Patents
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Description
(政府資金に対する参考)
本発明は、SBIR助成金1R43−CA9228−01によって、一部支援された。合衆国政府は、本発明において特定の権利を有する。
【0002】
(発明の分野)
本発明は、エポチロン(epothilone)およびエポチロン誘導体を産生するための組換え方法および材料を提供する。本発明は、農学技術、化学技術、医化学技術、医学技術、分子生物学技術、および薬理学技術の分野に関する。
【0003】
(発明の背景)
エポチロンは、National Biotechnology Research Instituteで、最初にGerhard Hofleとその仲間たちによって、粘液細菌Sorangium cellulosumから抽出される抗真菌活性物として同定された(K.Gerthら、1996、J.Antibiotics49:560−563およびドイツ国特許DE41 38 042を参照のこと)。後にこのエポチロンは、抗癌剤を同定するためのチューブリン重合アッセイで活性を有することが見出され(D.Bollagら、1995、CancerRes.55:2325−2333を参照のこと)、よって、癌の処理のための強力な抗癌剤として広範に研究されている。
【0004】
Sorangium cellulosum株So ce 90によって産生されたエポチロンの化学構造が、Hlfleら、1996、Epothilone A and B−novel 16−membered macrolides with cytotoxic activity:isolation,crystal structure,and conformation in solution,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.35(13/14):1567−1569(本明細書中で参考として援用される)に記載された。この株は、以下に示されるような2種のエポチロン化合物(A(R=H)およびB(R=CH3)と命名される)を産生することが見出され、これらの化合物は、真核生物細胞に対して広範な細胞傷害活性、ならびに胸部および結腸の腫瘍細胞株にする顕著な活性および選択性を示す。
【0005】
【化3】
エポチロンAおよびBのデオキシ対応部分(counterpart)(エポチロンC(R=H)およびD(R=CH3)としても公知)は、低い細胞傷害性であることで公知であり、これらのエポチロンの構造を、以下に示す。
【0006】
【化4】
他の2種の天然に存在するエポチロンが記載される。これらは、エポチロンEおよびFであり、エポチロンAおよびBのチアゾール部分のメチル側鎖をヒドロキシル化して、エポチロンEおよびFをそれぞれ得た。
【0007】
抗癌剤としてのエポチロンの使用のための可能性のため、および天然のSo ce 90株によって産生される低レベルのエポチロンのために、長い研究期間、エポチロンを合成するために努力してエポチロンを合成した。この努力が効を奏した(Balogら、1996、Total synthesis of (−)−epothilone A,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.35(23/24):2801−2803;Suら、1997、Total synthesis of (−)−epothilone B:an extension of the Suzuki coupling method and insights into structure−activity relationships of the epothilones,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.36(7):757−759;Mengら、1997、Total syntheses of epothilones A and B,JACS 119(42):10073−10092;ならびにBalogら、1998、A novel aldol condensation with 2−methyl−4−pentenal and its application to an improved total synthesis of epothilone B,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.37(19):2675−2678(これらの各々は、本明細書中で参考として援用さえる)を参照のこと)。これらの努力の成功にもかかわらず、エポチロンの化学合成は、緩慢であり、時間がかかり、そして高価である。特にこの方法は、十分なスケールでのエポチロンの薬学的開発には実際的ではないものとして特徴付けられていた。
【0008】
多数のエポチロン誘導体ならびにエポチロンA〜Dが、インビトロおよびインビボで研究さている(Suら、1997、Structure−activity relationships of the epothilones and the first in vivo comparison with paclitaxel,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.36(19):2093−2096;ならびにChouら、Aug.1998,Desoxyepothilone B:an efficacious microtubule−targeted antitumor angent with a promising in vivo profile relative to epothilone B,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:9642−9647(これらの各々は、本明細書中で参考として援用される)を参照のこと)。さらなるエポチロン誘導体、ならびにエポチロンおよびエポチロン誘導体を合成する方法が、PCT特許出願第99/54330、99/54319、99/54318、99/43653、99/43320、99/42602、99/40047、99/27890、99/07692、99/02514、99/01124、98/25929、98/22461、98/08849、および97/19086;米国特許第5,969,145号;ならびにドイツ特許出願第DE4138042(これらの各々は、本明細書中で参考として援用される)に記載されている。
【0009】
天然に存在するエポチロンのみならずこれらの誘導体および前駆体、ならびに改良された特性を有する新規のエポチロン誘導体も産生するための経済的な手段の必要性が、依然として存在する。天然の産生株であるSorangium cellulosumより、操作および発酵することがより容易であるエポチロンまたはエポチロン誘導体を産生する宿主細胞の必要性が、依然として存在する。本発明は、これらの必要性および他の必要性を達成する。
【0010】
(発明の要旨)
1実施形態において、本発明は、エポチロンA、B、C、およびDを産生するために必要とされるタンパク質をコードする組換えDNA化合物を提供する。本発明はまた、これらのタンパク質の部分をコードする組換えDNA化合物を提供する。本発明はまた、ハイブリッドタンパク質をコードする組換えDNA化合物を提供し、このハイブリッドタンパク質は、エポチロンの生合成に関与するタンパク質の全てまたは一部、ならびに別のポリケチドまたは非リボソーム誘導ペプチドの生合成に関与するタンパク質またの全てまたは一部を含む。好ましい実施形態において、本発明の組換えDNA化合物は、コード配列の操作を容易にする組換えDNAクローニングベクターであるか、または組換え宿主細胞における、本発明の1つ以上のタンパク質の発現をコードする組換えDNA発現ベクターである。
【0011】
別の実施形態において、本発明は、所望のエポチロンまたはエポチロン誘導体を産生する組換え宿主細胞を提供する。1実施形態において、本発明は、エポチロンを産生する天然に存在する生物体において産生されるよりも高いレベルで、1つ以上のエポチロンまたはエポチロン誘導体を産生する宿主細胞を提供する。別の実施形態において、本発明は、天然に存在する宿主細胞によって産生される混合物よりも少ない複合体である、エポチロンの混合物を産生する宿主細胞を提供する。別の実施形態において、本発明は、エポチロンまたはエポチロン誘導体を産生する非Sorangium組換え宿主細胞を提供する。
【0012】
好ましい実施形態において、本発明の宿主細胞は、エポチロンを産生する天然に存在する細胞が産生するより少ない複合体混合物を産生する。代表的に、エポチロンを産生する天然に存在する細胞は、エポチロンA、B、C、D、E、およびFの混合物を産生する。以下の表に、本発明の異なる例示の宿主細胞で産生されるエポチロンの概要を述べる。
【0013】
【0014】
さらに、以下でさらに議論される新規に発見されたエポチロンGおよびHのみ、ならびにGおよびHの一方または他方、あるいはそれらの両方を、下流のエポチロンと組み合わせて、産生する細胞型が、構築され得る。従って、本発明に基づいて、天然に存在するエポチロンに関連する生合成経路は、それぞれ、G→C→A→EおよびH→D→B→Fであることが理解される。適切な酵素はまた、各経路のメンバーを、他の対応するメンバーに転換し得る。
【0015】
従って、本発明の組換え宿主細胞はまた、唯一1つの所望のエポチロンまたはエポチロン誘導体を産生する宿主細胞を含む。
【0016】
別の実施形態において、本発明は、遺伝的に改変されたSorangium宿主細胞を提供して、天然に存在する宿主細胞で観察されるレベルよりも高いレベルでエポチロンを産生するか、もしくは天然に存在する宿主細胞によって産生されるよりも少ないエポチロンの複合体混合物を産生するかのいずれか、または天然で産生されないエポチロン誘導体を産生する。好ましい実施形態において、この宿主細胞は、20mg/L以上のエポチロンを産生する。
【0017】
別の実施形態において、本発明の組換え宿主細胞は、エポチロンまたはエポチロン誘導体を産生するために、遺伝的に改変されたSorangium cellulosum以外の宿主細胞である。好ましい実施形態において、この宿主細胞は、20mg/L以上でエポチロンを産生する。より好ましい実施形態において、この組換え宿主細胞は、20mg/L以上でエポチロンまたはエポチロン誘導体を生成する、Myxococcus、Pseudomonas、またはStreptomyces宿主細胞である。別の実施形態において、本発明は、農学、獣医学、および医学において有用な新規の化合物を提供する。1実施形態において、この化合物は、殺菌剤として有用である。別の実施形態において、この化合物は、癌の化学療法において有用である。好ましい実施形態において、この化合物は、エポチロンBまたはCとして腫瘍細胞に対して少なくとも強力であるエポチロン誘導体である。別の実施形態において、この化合物は、免疫抑制剤として有用である。別の実施形態において、この化合物は、別の化合物を製造するのに有用である。好ましい実施形態において、この化合物は、ヒトまたは動物に対して投与するために、混合物または溶液で処方される。
【0018】
本発明のこれらの実施形態および他の実施形態は、以下の記述、実施例、および添付の特許請求の範囲により詳細に記載される。
【0019】
(発明の詳細な説明)
本発明は、組換え体および単離形態でSorangium cellulosumにおいてエポチロンを合成する遺伝子およびタンパク質を提供する。本明細書で使用される場合、用語「組換え体」は、ヒトの介入によって、典型的には遺伝子またはその一部の特異的かつ意図的(directed)操作によって、産生される化合物および組成物をいう。用語、単離されたとは、混入物質または所望でない物質を実質的に含まない、調製物中の化合物または組成物をいうか、または、天然に見られる化合物または組成物に関して、その天然状態で化合物または組成物が結合する物質を実質的に含まない、化合物または組成物のことをいう。エポチロン(エポチロンA、B、C、D、E、およびF)およびそれに構造的に関連する化合物(エポチロン誘導体)は、真核生物細胞に特異的な強力な細胞傷害性薬剤である。これらの化合物は、抗真菌剤、癌化学療法剤、および免疫抑制薬としての適用を有する。エポチロンは、その中においてエポチロンが同定された、天然に存在するSorangium cellulosum細胞において非常に低レベルで産生される。さらに、S.celluloumは、非常に成長が遅く、そしてS.cellulosum株の発酵は、困難であり、かつ時間を消費する。本発明によって与えられる1つの重大な利点は、非S.cellulosum宿主細胞においてエポチロンまたはエポチロン誘導体を容易に産生する能力である。本発明の別の利点は、本発明によって提供される組換え宿主細胞において、天然に存在するエポチロン産生細胞において可能であるよりも高いレベルかつ多い量のエポチロンを産生する能力である。なお別の利点は、組換え宿主細胞においてエポチロン誘導体を産生する能力である。
【0020】
エポチロン生合成遺伝子をコードする組換えDNAの単離は、Sorangium cellulosum SMP44 DNAのゲノムライブラリーのプロービングから生じた。以下の実施例1においてより完全に記載するように、このライブラリーを、S.cellulosumゲノムDNAを制限酵素SauIIIA1で部分的に消化し、そして産生したDNAフラグメントをBamHI消化したSupercosTMコスミドDNA(Stratagene)へ挿入することによって、調製した。エポチロン遺伝子配列を含むコスミドクローンを、PKS遺伝子由来の配列について特異的なDNAプローブでプロービングし、そして1次プローブで同定されたヌクレオチド配列を含む2次プローブで再プロービングすることによって、同定した。
【0021】
4つの重複するコスミドクローンを、この試みによって同定した。これら4つのコスミドを、ブタペスト条約の条件に基づいて、American Type Culture Collection(ATCC),Manassas,VA,USA,に寄託し、そしてATCC受託番号を割り当てられた。これらのクローン(および受託番号)は、コスミドpKOS35−70.1A2(ATCC 203782)、pKOS35−70.4(ATCC 203781)、pKOS35−70.8A3(ATCC 203783)、およびpKOS35−79.85(ATCC 203780)と名付けられた。これらのコスミドは、エポチロン遺伝子クラスターに完全にまたがるインサートDNAを含む。これらのコスミドの制限部位マップを、図1に示す。図1はまた、エポチロン遺伝子クラスターの機能マップを提供し、6個のエポチロンPKS遺伝子およびepoK P450エポキシダーゼ遺伝子の位置を示す。
【0022】
エポチロンPKS遺伝子は、他のPKS遺伝子と同様に、ローディングドメイン、多数のモジュール、およびチオエステラーゼドメインをコードするように組織化されたコード配列から構成される。以下でより詳細に記載するように、これらのドメインおよびモジュールの各々は、1以上の特定の機能を有するポリペプチドに対応する。一般的に、このローディングドメインは、ポリケチドを合成するために使用される第1構築ブロック(building block)を結合し、そしてそれを第1のモジュールへ転移させることを担う。複合体ポリケチドを形成するために使用される構築ブロックは、典型的には、アシルチオエステル、最も一般的には、アセチルCoA、プロピオニルCoA、マロニルCoA、メチルマロニルCoA、およびエチルマロニルCoAである。他の構築ブロックとしては、アミノ酸様アシルチオエステルが挙げられる。PKSは、アシルチオエステル構築ブロック間の脱カルボキシクライゼン縮合を繰り返すことによって、ポリケチドの生合成を触媒する。各モジュールは、構築ブロックを結合し、この構築ブロックにおける1以上の機能を実施し、そして得られる化合物を次のモジュールへ転移させることを担う。次に、この次のモジュールは、次の構築ブロックを結合し、そして合成が完全となるまで成長する化合物をその次のモジュールへ転移させることを担う。この点で、酵素チオエステラーゼ(TE)活性は、PKSからポリケチドを切断する。
【0023】
このようなモジュール機構は、複合体ポリケチドを合成するPKS酵素のクラスの特徴であり、そして当該分野で周知である。モジュールPKS遺伝子を操作するための組換え法は、米国特許第5,672,491号;同第5,712,146号;同第5,830,750号;および同第5,843,718号;ならびにPCT特許公開第98/49315および同第97/02358号に記載され、これらの各々が、参考として、本明細書中で援用される。6−デオキシエリスロノライド(deoxyerythronolide)B(6−dEB)として公知のポリケチドは、原型モジュールPKS酵素であるPKSによって合成される。6−dEBを合成するデオキシエリスロノライドBシンターゼすなわちDEBS(各々のサブユニットは、DEBS1、DBES2、またはDBES3として公知である)として公知のマルチサブユニットタンパク質をコードする、eryAI、eryAII、eryAIIIとして公知の遺伝子は、米国特許第5,712,146号および同第5,824,513号に記載され、これらは、本明細書中で参考として援用される。
【0024】
DEBS PKSのローディングドメインは、アシルトランスフェラーゼ(AT)およびアシルキャリアタンパク質(ACP)からなる。DEBSローディングドメインのATは、プロピオニルCoAを認識し(他のローディングドメインATは、アセチルCoA、マロニルCoA、メチルマロニルCoA、またはブチリルCoAのような他のアシル−CoAを認識し得る)、そしてそれをチオエステルとしてこのローディングドメインのACPへ運ぶ。同時に、6個のエクステンダーモジュールの各々上のATは、メチルマロニルCoA(他のエクステンダーモジュールATは、マロニルCoAまたはα−置換マロニルCoA(すなわち、マロニルCoA、エチルマロニルCoA、および2−ヒドロキシマロニルCoA)のような他のCoAを認識し得る)を認識し、そしてチオエステルを形成するためにそれをこのモジュールのACPへ運ぶ。DEBSを、アシル−ACPおよびメチルマロニル−ACPでプライムし、ローディングドメインのアシル基が移動して、第1モジュールのKSでチオエステルを形成し(トランス−エステル化);この段階で、モジュール1は、メチルマロニルACPに隣接するアシル−KSを保有する。DEBSローディングドメインから誘導されたアシル基は、次いで、同時の脱カルボキシル化によって駆動されて、エクステンダー基のα炭素へ共有結合され、炭素−炭素結合を形成し、そして、そのローディングユニットよりも2炭素だけ長い骨格を有する新しいアシル−ACPを産生する(延長または伸張)。この成長するポリケチド鎖は、このACPからDEBSの次のモジュールのKSへ運ばれ、そしてこのプロセスが継続する。
【0025】
このポリケチド鎖(DEBSの各モジュールについて2個の炭素だけ成長する)は、アセンブリーライン様プロセスにおいて、モジュールからモジュールへ共有結合されるチオエステルとして連続的に通過する。このプロセスのみによって産生される炭素鎖は、どの他の炭素原子にもケトンを保有し、ポリケトンを産生し、これから、名称ポリケチドが生じる。しかし、一般的に、さらなる酵素活性は、各2つの炭素ユニットのβケト基を、それが成長するポリケチド鎖へ付加された直後であるが、しかしそれが次のモジュールへ運ばれる前に、改変する。従って、炭素−炭素結合を形成するために必要なKS、AT、およびACPを含む最小モジュールに加えて、モジュールは、ケト基をアルコールに還元するケトレダクターゼ(KR)を含み得る。モジュールはまた、KPに、アルコールを二重結合へ脱水するデヒドラターゼ(DH)を加えて含み得る。モジュールはまた、KR、DH、およびメチレン基(function)としてβ炭素を使用して二重結合を飽和単結合へ変換するエノイルレダクターゼ(ER)を含み得る。DEBSモジュールは、KRドメインのみ、不活性KRドメインのみを有するもの、そして3つのKRドメイン、DHドメイン、およびERドメインの全てを有するモジュールが挙げられる。
【0026】
一旦ポリケチド鎖がPKSの最終モジュールを横断すると、それは、ほとんどのPKSのカルボキシル末端で見られる放出ドメインまたはチオエステラーゼに遭遇する。ここで、このポリケチドは、この酵素から切断され、そして、ほとんどだが全てではないポリケチドについて、環化される。このポリケチドは、修飾(tailoring)酵素または改変酵素によってさらに修飾され得;これらの酵素は、ポリケチドコア分子上に、炭水化物基またはメチル基を付加するか、あるいは他の改変(すなわち、酸化もしくは還元)をなす。例えば、6−dEBは、水酸化され、メチル化され、そしてグリコシル化され(グリコシド化され)て、Saccharopolyspora erythraea細胞において周知の抗生物質エリスロマイシンAを生成する(この細胞中でエリスロマイシンAは天然に生成される)。
【0027】
上記の説明は、一般的にモジュールPKS酵素にそして特にDEBSに適用されるが、現実には存在する多数の改変形が存在する。例えば、多くのPKS酵素は、DEBSのローディングドメインとは異なって、デカルボキシラーゼとして機能する「不活性」KSドメインを含むローディングドメインを含む。この不活性KSは、ほとんどの場合において、KSQと呼ばれ、ここで、この上付き文字は、ケトシンターゼ活性について必要とされる活性部位システインの代わりに存在するアミノ酸(グルタミン)についての1文字略語である。エポチロンPKSローディングドメインは、アミノ酸チロシンがシステインを置換したアミノ酸配列が現在利用可能である、他のPKS酵素に存在しないKSYドメインを含む。本発明は、この新規なKSドメインについての組換えDNAコード配列を提供する。
【0028】
PKS酵素における別の重要な改変は、組み込まれる構築ブロックのタイプに関連する。いくつかのポリケチド(エポチロンを含む)は、アミノ酸誘導化構築ブロックを組み込む。このようなポリケチドを作製するPKS酵素は、組み込みのための特定のモジュールを必要とする。このようなモジュールは、非リボソーム性ペプチドシンテターゼ(NRPS)モジュールと呼ばれる。エポチロンPKSは、例えば、NRPSモジュールを含む。改変の別の例は、モジュールにおけるさらなる活性に関連する。例えば、エポチロンPKSの1つのモジュールは、メチルトランスフェラーゼ(MT)ドメイン(モジュール型ポリケチドを作るPKS酵素の今までは未知のドメイン)を含む。
【0029】
エポチロンPKS遺伝子およびエポチロン修飾(tailoring)(改変(modification))酵素遺伝子のオープンリーディング(ORF)のコード配列の完全なヌクレオチド配列が、以下の実施例1に提供される。この配列情報は、この配列内の遺伝子のオープンリーディングフレームの位置に関する以下に提供される情報とともに、コードされるタンパク質のアミノ酸配列を提供する。当業者は、遺伝コードの縮重性質に起因して、それらのヌクレオチド配列が異なる種々のDNA化合物が、本発明の所定のアミノ酸配列をコードするために使用され得ることを認識する。Sorangium cellulosumのエポチロンPKSおよびエポチロン改変酵素をコードするネイティブDNA配列が、本発明の好ましい実施形態を例示するためにのみ、本明細書中で示される。本発明は、本発明のポリペプチドおよびタンパク質のアミノ酸配列をコードする任意の配列のDNA化合物を含む。同様の様式で、ポリペプチドは、典型的に、所望の活性の損失または実質的な損失なしに、そしていくつかの場合、所望の活性の改善さえ伴って、そのアミノ酸配列における、1以上のアミノ酸置換、欠失、および挿入を許容する。本発明は、代替的アミノ酸配列を有するこのようなポリペプチド、および本発明の好ましい実施形態を例示するためにのみ本明細書中に示されたアミノ酸配列を、包含する。
【0030】
本発明は、エポチロンの産生のための組換え遺伝子を提供する。本発明は、Sorangium cellulosum SMP44のエポチロンPKSおよび改変酵素のクローニング、特徴付け、および操作によって例証される。本発明の記載およびこの記載と組み合わせて堆積される組換えベクターは、エポチロンを産生する任意の天然に存在する宿主細胞由来のエポチロンPKSおよび改変酵素の同定、クローニング、および操作を可能にする。このような宿主細胞としては、他のS.cellulosum株(例えば、So ce90)、他のSorangium種、および非Sorangium細胞が挙げられる。このような同定、クローニング、および特徴付けは、相同なDNA配列を同定するため、および公知のタンパク質に類似の機能のタンパク質をコードする遺伝子を同定するための、標準的方法を使用して、本発明に従って、当業者によって実施され得る。その上、本発明は、新たに合成されるかまたは非エポチロンPKS遺伝子から構築される、組換えエポチロンPKS遺伝子および改変酵素遺伝子を提供し、エポチロンまたはエポチロン誘導体を産生するPKSを形成するように集まる1以上のタンパク質における、整然とした(an ordered array of)ドメインおよびモジュールを提供する。
【0031】
本発明の組換え核酸、タンパク質、およびペプチドは多く、そして多様である。本発明、ならびに本発明により提供される多様な化合物および方法の理解を容易にするために、以下の議論は、エポチロンPKSの種々の領域および対応するコード配列を記載する。この議論は、PKSをコードする遺伝子、これらの遺伝子における種々のドメインおよびモジュールの位置、これらのモジュールにおける種々のドメインの位置の一般的な議論から始まる。次いで、より詳細な議論が続き、まずこれらのローディングドメインに焦点を合わせ、続いてNPRSモジュール、次いでエポチロンPKSの残りの8個のモジュールに焦点を合わせる。
【0032】
6個のエポチロンPKS遺伝子が存在する。epoA遺伝子は、149kDaローディングドメイン(これはまた、ローディングモジュールとも呼ばれ得る)をコードする。epoB遺伝子は、モジュール1(158kDa NRPSモジュール)をコードする。epoC遺伝子は、193kαDaモジュール2をコードする。epoD遺伝子は、モジュール3〜6(両端を含む)までを含む765kDaタンパク質をコードする。epoE遺伝子は、モジュール7および8を含む405kDaタンパク質をコードする。epoF遺伝子は、モジュール9およびチオエステラーゼドメインを含む257kDaタンパク質をコードする。epoF遺伝子のすぐ下流は、epoK(47kDaタンパク質をコードするP450エポキシダーゼ遺伝子)続いて直後にepoL遺伝子(これは、24kDaデヒドラターゼをコードし得る)である。epoL遺伝子の後には、輸送および調節に関与するタンパク質をコードすると考えられる遺伝子を含む多数のORFが続く。
【0033】
これらの遺伝子の配列を、71,989ヌクレオチドの1つの連続する配列またはコンティングで実施例1に示す。このコンティングはまた、トランスポゾンから始まるようであり、そしてORF AおよびORF Bとして以下に同定される、2つの遺伝子を含む。これらの2つの遺伝子は、エポチロン生合成に関与しないと考えられるが、プロモーターまたはエンハンサーとして機能する配列をおそらく含み得る。このコンティングはまた、12個より多くのさらなるORFを含み、このうちの12個のみが、ORF2〜ORF12およびORF2相補体と命名され、以下に同定される。記述されるように、ORF2は、実際は、2つのORFである。なぜならば、示される鎖の相補体はまた、ORFを含むからである。これらのORFの対応する遺伝子産物の機能は、存在するとしても、未だ確立されていない。以下の表は、実施例1に示されるコンティング配列内の種々のオープンリーディングフレーム、モジュールコード配列、およびドメインコード配列の位置を提供する。当業者は、実施例1に示される配列を考慮すると、これらの遺伝子のいくつかの実際の開始位置が、この表に示される開始位置と異なり得ることを理解する。なぜならば、開始コドンとして示されるコドンと近接するメチオニンまたはバリンについてのフレームコドンが存在するためである。実際の開始コドンは、これらの遺伝子から発現されるタンパク質のアミノ酸配列決定によって、確認され得る。
【0034】
【表1】
エポチロン遺伝子クラスターの組織化および配列のこの概要により、本発明によって提供される多くの異なる組換えDNA化合物が、より良く理解され得る。
【0035】
エポチロンPKSは、epoA、epoB、epoC、epoD、epoEおよびepoF遺伝子の遺伝子産物からなる多タンパク質複合体である。エポチロンを宿主細胞に産生する能力を付与するために、宿主細胞に、本発明の組換えepoA、epoB、epoC、epoD、epoEおよびepoF遺伝子、および必要に応じて他の遺伝子(宿主細胞中で発現し得る)が提供される。当業者は、エポチロンおよび他のPKS酵素が本明細書中で単一の実体として言及され得る一方で、これらの酵素が代表的には多サブユニットタンパク質であることを、理解している。従って、誘導体PKS(欠失または変異によって、天然のPKSとは異なるPKS)またはハイブリッドPKS(2つの異なるPKS酵素の部分からなるPKS)が、PKSを構成する1つ以上の複数のタンパク質をコードする1つ以上の遺伝子を変化させることによって作製され得る。
【0036】
エポチロンのPKS後改変または変更は、複数の酵素によって媒介される複数の工程を包含する。これらの酵素は、本明細書中で、変更酵素または改変酵素として言及される。驚くべきことに、それらをコードする遺伝子の分析によって、機能性であると予測されるエポチロンPKSのドメインの産物は、以前に報告されていない化合物である。これらの化合物は、本明細書中で、エポチロンGおよびHとして言及される。エポチロンGおよびHは、エポチロンCおよびDのC−12−C−13π結合ならびにエポチロンAおよびBのC−12−C−13エポキシドを欠き、代りに、C−13に水素およびヒドロキシル基、C−12とC−13との間の単結合、ならびにC−12に水素およびHまたはメチル基を有する。これらの化合物は、エポチロンPKSから生じると予測される。なぜなら、エポチロンPKSのモジュール4に対するDNAおよび対応するアミノ酸配列は、DHドメインを含まないようであるからである。
【0037】
以下に記載されるように、しかし、epoKまたはepoLを発現しない特定の異種宿主細胞中でのエポチロンPKS遺伝子epoA、epoB、epoC、epoD、epoEおよびepoFの発現は、エポチロンCおよびDの産生を導き、これらはC−13ヒドロキシル基を欠き、そしてC−12とC−13との間に二重結合を有する。この二重結合の形成を媒介する脱水反応は、エポチロンPKSの未だ認識されていないドメインの作用(例えば、次のモジュールにおいて脱水が起こり得、このモジュールは活性DHドメインを有し、そしてERドメインによる脱水素の前に結合体化されたジエン前駆体を発生し得る)またはこの作用が観測される異種宿主細胞(Streptomyces coelicolor)中の内在性酵素に起因し得る。後者の場合において、エポチロンGおよびHは、Sorangiun cellulosumまたは他の宿主細胞において産生され得、そしてデヒドラターゼの作用によってエポチロンCおよびDに変換されるために、epoL遺伝子によってコードされ得る。いずれの場合においても、エポチロンCおよびDはepoK遺伝子によってコードされるエポキシダーゼによってエポチロンAおよびBに変換される。エポチロンAおよびBは、ヒドロキシラーゼ遺伝子によってエポチロンEおよびFに変換され、これは、上記に同定されるORFの1つ、またはSorangiun cellulosumに内在性の別の遺伝子によってコードされ得る。従って、宿主細胞に、本発明によって提供される組換え改変酵素遺伝子の1つ以上を提供することによって、あるいは改変酵素を天然に発現する(または発現しない)宿主細胞を利用することによって、宿主細胞中で所望のように改変されるエポチロンまたはエポチロン誘導体が産生され得る。従って、一般に、適切な宿主を利用することによって、そして所望するならば改変酵素の適切な不活性化によって、G→C→A→Eの進行または任意の所望の位置でエポチロンHの対応する下流処理が妨害され得る;メチル化を制御することによって、1つまたは両方の経路が選択され得る。
【0038】
従って、本発明は、天然に存在するエポチロンA、B、CおよびDならびにそれらの誘導体を発現するための広範な種々の組換えDNA化合物および宿主を提供する。本発明はまた、組換え宿主細胞、特にエポチロンEおよびFと類似する様式で改変されるエポチロン誘導体を産生するSorangium cellulosum宿主細胞を提供する。さらに、本発明は、以前までは未知のエポチロンGおよびHを、エポチロンGおよびHをエポチロンCおよびDに変換するデヒドラターゼを発現しない宿主細胞中でのエポチロンPKS遺伝子の発現によって、またはデヒドラターゼ機能を無効にするために、PKSを変異させるかもしくは変更させる(エポチロンPKSに存在する場合)かによってのいずれかで、産生し得る宿主細胞を提供する。
【0039】
PKSクラスターの産物であるマクロライド化合物は、従って、種々の方法で改変され得る。上記の改変に加えて、PKS産物は、適切な酵素を使用して、グリコシル化、ヒドロキシル化、脱ヒドロキシル化、酸化、メチル化および脱メチル化され得る。従って、PKS中に含まれるモジュールの数、機能性、または特異性を変更することによってPKSクラスターの産物を改変することに加えて、本発明の範囲内のさらなる化合物が、ポリケチドシンターゼが産生される宿主細胞によって提供されるか、またはさらなる酵素を含むためにこれらの細胞を改変することによるか、または精製された酵素もしくは粗抽出物を使用するさらなるインビトロ改変によるか、または実際には化学改変のいずれかによる、さらなる酵素触媒活性によって産生され得る。
【0040】
本発明はまた、エポチロン誘導体を作り出す広範な種々の組換えDNA化合物および宿主細胞を提供する。本明細書中で使用される場合、句「エポチロン誘導体」とは少なくとも1つのドメインが、不活性にされたか、その触媒活性を変更するために変異されたか、または異なる機能を有するドメインによって置き換えられたか、あるいはドメインが挿入された、組換えエポチロンPKSによって産生される化合物をいう。いずれの場合においても、「エポチロン誘導体PKS」は、天然に存在するエポチロンとは構造が異なるが、その環バックボーン構造を保持する化合物を産生するために機能し、そして「エポチロン誘導体」と呼ばれる。本発明によって提供される組換えDNA化合物および宿主細胞のより良い理解を容易にするために、ローディングドメインおよびエポチロンPKSのモジュールの各々、ならびにそれらの新規な組換え誘導体の詳細な議論が以下に提供される。
【0041】
エポチロンPKSのローディングドメインは、不活性KSドメイン、KSY、マロニルCoAに対して特異的なATドメイン(これは、アセチル基を得るためにKSYドメインによって脱カルボキシル化されると考えられる)、およびACPドメインを含む。本発明は、エポチロンローディングドメインをコードする組換えDNA化合物を提供する。配列をコードするこのローディングドメインは、コスミドpKOS35−70.8A3の約8.3kb EcoRI制限フラグメント内に含まれる。このKSドメインは、不活性といわれる。なぜならば、ローディングドメインのKSドメインの活性部位領域「TAYSSSL」は、ケトシンターゼ活性に対して要求されるシステインの代りにY残基を有する:このドメインは、デカルボキシラーゼ活性を有する。Witkowskiら、1999年9月7日、Biochem.38(36):11643−11650(これは、本明細書中で参考として援用される)を参照のこと。
【0042】
Q残基の代りのY残基の存在(これは、典型的に、不活性ローディングドメインKSにおいて起こる)は、KSドメインを脱カルボキシル化において効率を低くし得る。本発明は、ローディングドメインのコード配列におけるコドンを変化させることによってY残基がQ残基に変化された、エポチロンPKSをローディングドメインをコードする組換えエポチロンPKSローディングドメインおよび対応するDNA配列を提供する。本発明はまた、このようなローディングドメインを含む組換えPKS酵素ならびにこのような酵素を産生する宿主細胞およびそれによって産生されたポリケチドを提供する。これらの組換えローディングドメインは、Y残基が変化され、Yドメインを取り囲み、そしてYドメインを含むアミノ酸が変化された、そして完全なKSYドメインが完全なKSQドメインによって置き換えられたものを含む。後者の実施形態は、限定されないが、KSYドメインがオレアンドライドPKSまたはナルボノライドPKSのKSQドメインによって置き換えられた組換えエポチロンローディングドメインを含む(オレアンドマイシン、ナルボマイシン、およびピクロマイシンPKSならびに改変酵素に関連して以下に列挙された引用文献を参照のこと)。
【0043】
エポチロンローディングドメインはまた、マロニルCoAを結合すると考えられるATドメインを含む。TAドメイン中の配列「QTAFTQPALFTFEYALAALW...GHSIG」は、マロニルCoA特異性と一貫している
。上記のように、マロニルCoAは、アセチルCoAを生じるためにKSYドメインによって脱カルボキシル化されると考えられている。本発明は、マロニル特異性ATドメインまたはそのコード化配列が、別の特異性(例えば、メチルマロニルCoA、エチルマロニルCoA、および2−ヒドロキシマロニルCoA)に変化された、組換えエポチロン誘導体ローディングドメインまたはそれらのコード化DNA配列を提供する。エポチロンPKSの他のタンパク質と共に発現される場合、このようなローディングドメインは、エポチロンのチアゾール環のメチル置換基が、それぞれ、エチル、プロピル、およびヒドロキシメチルと置き換えられるエポチロンの産生に導く。本発明は、このようなローディングドメインを含む組換えPKS酵素およびこのような酵素を産生する宿主細胞およびそれによって産生されたポリケチドを提供する。
【0044】
当業者は、2−ヒドロキシマロニルCoAに特異的なATドメインが、ポリケチドが産生された対応する位置でヒドロキシル基を有するポリケチドを生じること、およびこのヒドロキシル基が、ポリケチド改変酵素によってメトキシ基を産生するようにメチル化され得ることをを認識する。例えば、以下の表中にFK−520 PKSと関係して挙げられる特許出願を参照のこと。したがって、本明細書中の2−ヒドロキシマロニル特異的ATドメインを有するPKSの言及は、同様に、ポリケチド中の対応する位置でヒドロキシル基またはメトキシル基のいずれかを有するそのPKSによって産生されるポリケチドを同様にいう。
【0045】
エポチロンPKSのローディングドメインはまた、ERドメインを含む。一方、このERドメインは、(その通常の反応の逆において)エポチロン中のチアゾール部位に2本鎖の1つを形成することを関与し得るか、または、非機能性であり得る。いずれかの事象において、本発明は、ER領域を伴うか伴わないエポチロンPKSローディングドメイン、およびエポチロンローディングドメインのERドメインの代わりに別のPKS(活性または不活性のいずれか、KRドメインおよびDHドメインを伴うか伴わないか)由来のERドメインを含むハイブリッドローディングドメインをコードする、組換えDNA化合物を提供する。本発明はまた、このようなローディングドメインを含む組換えPKS酵素およびこのような酵素を産生するための宿主細胞およびそれによって産生されるポリケチドを提供する。
【0046】
エポチロンPKSのローディングドメインをコードする本発明の組換え核酸化合物およびそれによってコードされる対応するポリペプチドは、種々の適用に有用である。1つの実施形態において、エポチロンローディングドメインをコードする配列を含むDNA化合物は、異種PKSのタンパク質と同時発現される。本明細書中で用いられる場合、異種モジュール型PKS(またはそのコード配列)の言及は、エポチロンまたはエポチロン誘導体以外のポリケチドを合成する、そのPKSを構成する多数のタンパク質の各々を含む、PKSの全てまたは一部(またはそのコード配列)をいう。この同時発現は、2つの形態のうちの1つであり得る。エポチロンローディングドメインは、異種PKSの他のタンパク質とともに別々のタンパク質として、またはローディングドメインが異種PKSの1つ以上のモジュールと融合される融合タンパク質として同時発現され得る。いずれかの事象において、異種PKSのローディングドメインがエポチロンローディングドメインによって置換される場合に形成されるハイブリッドPKSは、新規のPKSを提供する。本発明のこのようなハイブリッドPKS酵素を調製するために用いられ得る異種PKSの例は、以下を含むがこれらに限定されない:DEBSそしてピクロマイシン(ナルボノライド(narbonolide))のPKS酵素、オレアンドライド(oleandolide)のPKS酵素、ラパマイシンのPKS酵素、FK−506のPKS酵素、FK−520のPKS酵素、リファマイシンのPKS酵素、およびアベルメクチン(avermectin)のPKS酵素ならびにこれらに対応するコード配列。
【0047】
別の実施形態において、エポチロンローディングドメインをコードする配列を含む核酸化合物は、エポチロンPKS(すなわち、epoB遺伝子産物、epoC遺伝子産物、epoD遺伝子産物、epoE遺伝子産物、およびepoF遺伝子産物)の残余またはepoB遺伝子、epoC遺伝子、epoD遺伝子、epoE遺伝子、およびepoF遺伝子の1つ以上における変化もしくは変異のためにエポチロン誘導体を産生する組換えエポチロンPKSを構成するタンパク質と同時発現される。本明細書中で用いられる場合、エポチロン誘導体を産生するエポチロンまたはPKS(またはそのコード配列)の言及は、PKSを含むタンパク質の全てまたは任意の1つ(またはそのコード配列)をいう。
【0048】
別の実施形態において、本発明は、エポチロンローディングドメインの一部および異種PKSの一部から構成されるローディングドメインをコードする、組換え核酸化合物を提供する。この実施形態において、本発明は、例えば、マロニルCoA特異的ATを、メチルマロニルCoA特異的AT、エチルマロニルCoA特異的ATまたは2−ヒドロキシマロニルCoA特異的ATのいずれかに置換することを提供する。本明細書中に記載される他と同様に、この置換は、代表的には、そのコード配列の置換によって媒介されて、本発明の組換えDNA化合物を提供する;組換えDNAは、対応するタンパク質を調製するために用いられる。このような変化(置換のみではなく欠失および挿入をも含む)は、本明細書中でDNAレベルまたはタンパク質レベルのいずれかで言及され得る。
【0049】
本発明の化合物はまた、エポチロンローディングドメインのKSYドメインおよびATドメインの両方が置換されているが、エポチロンローディングドメインのACPおよび/またはリンカー領域がインタクトに残っている化合物を含む。リンカー領域は、タンパク質の三次構造を形成するのを援助し、そしてPKSのドメインの正確な整列および位置決めに関与する、ローディングドメイン中のドメインとPKSのモジュールとの間のアミノ酸のセグメントである。これらの化合物は、例えば、組換えローディングドメインコード配列を含む。ここで、エポチロンPKSのKSYドメインコード配列およびATドメインコード配列が、例えば、オレアンドライドPKSまたはナルボノライドPKSのKSQドメインおよびATドメインをコードする配列によって置換されている。KSQドメインを利用せずに、代わりに単にアセチルCoA、プロピオニルCoA、もしくはブチリルCoA(DEBSローディングドメイン)またはイソブチリルCoA(アベルメクチンローディングドメイン)に結合するATドメインを利用する、PKS酵素もまた存在する。したがって、本発明の化合物もまた、例えば、エポチロンPKSのKSYドメインコード配列およびATドメインコード配列がDEBSまたはアベルメクチンPKSのATドメインによって置換されている、組換えローディングドメインコード配列を含む。本発明はまた、ACPドメインまたはエポチロンローディングドメインの任意のリンカー領域が別のACPまたはリンカー領域によって置換されている、ローディングドメインをコードする組換えDNA化合物を提供する。
【0050】
任意の上記のローディングドメインコード配列を、エポチロン、エポチロン誘導体、または別のポリケチドを合成するPKSを構成する、他のタンパク質と同時発現されて、本発明のPKSを提供する。所望の産物がエポチロンまたはエポチロン誘導体である場合、ローディングドメインコード配列は、代表的に、別々のタンパク質として発現され、同様に天然に存在するエポチロンPKS中のローディングドメインも発現される。所望の産物が本発明のローディングドメインおよび1つ以上の非エポチロンPKS酵素由来のタンパク質によって産生される場合、ローディングドメインは、別々のタンパク質としてか、または異種PKSのモジュールの1つ以上との融合タンパク質としてかのいずれかで、発現される。
【0051】
本発明はまた、ハイブリッドPKS酵素を提供する。ここで、エポチロンローディングドメインは、その全体において、改変されたかまたは改変されていないエポチロンPKSタンパク質によって提供されるPKSタンパク質の残余を有する、異種PKS由来のローディングドメインによって置換されている。本発明はまた、このような酵素およびそれによって産生されるポリケチドを産生するための組換え発現ベクターおよび宿主細胞を提供する。1つの実施形態において、異種ローディングドメインは、epoB遺伝子産物、epoC遺伝子産物、epoD遺伝子産物、epoE遺伝子産物、およびepoF遺伝子産物を発現する宿主細胞中で、別々のタンパク質として発現される。別の実施形態において、異種ローディングドメインは、epoC遺伝子産物、epoD遺伝子産物、epoE遺伝子産物、およびepoF遺伝子産物を発現する宿主細胞中で、epoB遺伝子産物との融合タンパク質として発現される。関連する実施形態において、本発明は、ローディングドメインが欠失おり、そしてNRPSモジュールによって置換されている組換えエポチロンPKS酵素ならびに対応する組換えDNA化合物および発現ベクターを提供する。したがって、この実施形態において、組換えPKS酵素は、化合物レイナマイシン(leinamycin)のようなジペプチド部分を含むエポチロン誘導体を産生する。本発明は、エポチロンPKSの残余がネイティブなエポチロンPKSとして機能的に同定され、そして残余が本発明のエポチロン誘導体を産生する組換えPKSである、このような酵素を提供する。
【0052】
本発明はまた、Sorangium cellulosumのような宿主細胞の染色体由来のローディングドメインコード配列またはその任意の部位を検出する際に、あるいはこれらの配列またはその任意の部位を組換えローディングドメインをコードする配列と置換する際に有用な試薬および方法を提供する。Sorangium染色体中のローディングドメインコード配列を含むDNAおよび/または隣接するDNAに相補的なDNAを含む組換えベクターを用いて、ネイティブなローディングドメインコード配列を組換えローディングドメインコード配列と置換するか、または配列全体を欠失するために、ベクターおよび同種組換えが利用され得る。
【0053】
さらに、上記の考察は、エポチロンローディングドメインコード配列を欠失または置換することに焦点を置くが、当業者は、本発明がエポチロンPKS遺伝子またはエポチロン改変酵素遺伝子の全てまたは任意の部分を欠失または置換する際に有用な組換えDNA化合物、ベクター、および方法を提供することを認識する。このような方法および材料は、種々の目的に有用である。1つの目的は、天然に存在するエポチロンまたはエポチロン誘導体を作製しない宿主細胞を構築することである。例えば、天然に存在するエポチロンを産生しないように改変されている宿主細胞は、エポチロン誘導体または任意の天然に存在するエポチロンを有さない他のポリケチドを作製するために、特に好ましくあり得る。別の目的は、欠失した遺伝子を、異なる産物を提供するようにかまたは1つの産物を他より多く産生するように改変されている遺伝子と置換することである。
【0054】
Sorangium cellulosum宿主細胞において、エポチロンローディングドメインコード配列が欠失されているかあるいは非機能的にされている場合、生じる宿主細胞は、非機能的エポチロンPKSを産生する。このPKSは、まだエクステンダーユニットを結合し得、そしてプロセシングし得るが、エポチロンのチアゾール部分を形成せず、新規のエポチロン誘導体の産生を導く。この誘導体が遊離アミノ基を予測可能に含むので、たかだか低量で産生される。しかし、上記するように、宿主細胞への異種組換えローディングドメインまたは他の組換えローディングドメインの供給は、供給されたローディングドメインによって決定される構造を有するエポチロン誘導体の産生を生じる。
【0055】
エポチロンPKSのローディングドメインは、システインに特異的なNRPSモジュールであるPKSの最初のモジュールが続く。このNRPSモジュールは、別々のタンパク質であるepoB遺伝子の産物として天然に発現される。本発明は、epoB遺伝子を組換え型で提供する。エポチロンPKSのNRPSモジュールをコードする本発明の組換え核酸化合物およびそれによってコードされる対応するポリペプチドは、種々の適用に有用である。1つの実施形態において、エポチロンNRPSモジュールをコードする配列を含む核酸化合物は、1つ以上の異種PKSタンパク質をコードする遺伝子と同時発現される。NRPSモジュールは、別々のタンパク質としてか、または異種PKSのタンパク質の1つとの融合タンパク質として発現され得る。少なくとも異種PKSのモジュールがエポチロンNRPSモジュールによって置換されているか、またはNRPSモジュールが実際にモジュールとして異種PKSに加えられている場合、得られたPKSは、新規のPKSを提供する。別の実施形態において、エポチロンNRPSモジュールをコードする配列を含むDNA化合物は、他のエポチロンPKSタンパク質またはその改変されたバージョンと同時発現されて、エポチロンまたはエポチロン誘導体を産生する組換えエポチロンPKSを提供する。
【0056】
本発明によって提供される2つのハイブリッドPKS酵素は、この局面を例示する。ハイブリッドPKS酵素の両方は、DEBSおよびエポチロンNRPSモジュールのハイブリッドである。第一のハイブリッドPKSは、4つのタンパク質から構成される:(i)DEBS1;(ii)DEBSのモジュール3のKSドメイン、およびエポチロンPKSのローディングドメインのKSドメイン以外全てから構成される融合タンパク質;(iii)エポチロンNRPSモジュール;ならびに(iv)DEBSのモジュール5のATドメインおよびDEBS3の残りと融合する、エポチロンPKSのモジュール2のKSドメインを構成する融合タンパク質。このハイブリッドPKSは、マクロラクトン環に組み込まれるチオゾール部分およびStreptomyces coelicolorに発現される場合に413.53の分子量を有する新規のポリケチドを産生する。グリコシル化誘導体、ヒドロキシル化誘導体、およびメチル化誘導体は、Saccharopolyspora erythraea中のハイブリッドPKSの発現によって産生され得る。
【0057】
線図で、この構築物を示す:
【0058】
【化5】
この産物の構造は、以下である。:
【0059】
【化6】
本発明のこの局面を例示する第2のハイブリッドPKSは、5つのタンパク質から構成される:(i)DEBS1;(ii)DEBSのモジュール3のKSドメイン、およびエポチロンPKSのローディングドメインのKSドメイン以外全てから構成される融合タンパク質;(iii)エポチロンNRPSモジュール;および(iv)DEBSのモジュール4のATドメインおよびDEBS2の残りと融合する、エポチロンPKSのモジュール2のKSドメインを構成する融合タンパク質;ならびに(v)DEBS3。このハイブリッドPKSは、マクロラクトン環に組み込まれるチオゾール部分およびStreptomyces coelicolorに発現される場合に455.61の分子量を有する新規のポリケチドを産生する。グリコシル化誘導体、ヒドロキシル化誘導体、およびメチル化誘導体は、Saccharopolyspora erythraea中のハイブリッドPKSの発現によって産生され得る。
【0060】
線図で、この構築物を示す:
【0061】
【化7】
この産物の構造は:
【0062】
【化8】
別の実施形態において、NRPSモジュールコード配列の部分は、異種コード配列と合わせて利用される。この実施形態において、本発明は、例えば、エポチロンPKSのNRPSモジュールの特異性の、システインから別のアミノ酸への変化を提供する。この変化は、エポチロンPKS NRPSモジュールコード配列の全体または一部が、異なる特異性のNRPSモジュールをコードする配列によって置換されているコード配列の構築によって達成される。1つの例示的実施形態において、エポチロンNRPSモジュールの特異性は、システインからセリンまたはスレオニンに変化される。したがって、改変されたNRPSモジュールがエポチロンPKSの他のタンパク質と発現される場合、組換えPKSは、エポチロンのチアゾール部分(またはエポチロン誘導体)がそれぞれオキサゾールまたは5−メチルオキサゾール部分に変化されているエポチロン誘導体を産生する。あるいは、本発明は、異種PKS由来のNRPSモジュールを有さないかまたはNRPSモジュールを有する、epoA、epoC、epoD、epoE、およびepoF遺伝子(またはその改変されたバージョン)の産物から構成される組換えPKS酵素を提供する。異種NRPSモジュールは、別々のタンパク質としてかまたはepoA遺伝子もしくはepoC遺伝子のいずれかを有する融合タンパク質として発現され得る。
【0063】
本発明はまた、異種NRPSモジュールの特異性を別のアミノ酸からシステインに変える際に有用な方法および試薬を提供する。この変化は、異種NRPSモジュールの特異性を決定する配列が、エポチロンNRPSモジュールコード配列に由来するシステインを特定する配列によって置換されているコード配列を構築することにより達成される。生じた異種NRPSモジュールは、代表的にエポチロンまたはエポチロン誘導体以外のポリケチドを合成する異種PKSを構成するタンパク質と共に同時発現されるが、エポチロンまたはエポチロン誘導体を産生するために、異種NRPSモジュールがまた使用され得る。
【0064】
別の実施形態において、本発明は、組換えエポチロンPKS酵素および対応すする組換え核酸化合物ならびにNRPSモジュールが不活性化されているか、または欠失されているベクターを提供する。そのような酵素、化合物、およびベクターは、エポチロンPKSまたは上記の改変酵素遺伝子を欠失するか、もしくは不活性化するための教示にしたがって一般的に構築される。従って、本発明によって提供される不活性NRPSモジュールタンパク質およびそのコード配列は、ペプチジルキャリアタンパク質(PCP)ドメインが、全体もしくは部分的に欠失されているか、さもなくば活性部位のセリン(ホスホパンテテニル化(phosphopantetheinylation)のための部位)を別のアミノ酸(例えば、アラニン)変えることにより不活性化されているか、またはアデニル化ドメインが、欠失されているか、さもなくば不活性化されている不活性NRPSモジュールタンパク質およびそのコード配列を含む。1つの実施形態において、ローディング(loading)ドメインおよびNRPSの両方が欠失されているか、または不活性化されている。いずれにしても、エポチロンPKSもしくはエポチロン誘導体に対するPKSのモジュール2(または後のモジュール)のKSドメインに結合する基質が提供された場合のみ、生じたエポチロンPKSは、次いで機能し得る。本発明によって提供された方法において、次いで、このように改変された細胞には、好ましくは第2の(しかし、潜在的に任意の後の)モジュールによって結合され、そして新規なエポチロン誘導体にプロセスされた活性化アシルチオエステルが与えられる。
【0065】
従って、1つの実施形態において、本発明は、不活性NRPSとともにエポチロンPKS(または、エポチロン誘導体を産生するPKS)を発現するSorangium宿主細胞および非Sorangium宿主細胞を提供する。この宿主細胞には、本発明の新規なエポチロン誘導体を産生するように活性化されたアシルチオエステルが与えられる。PKSを発現している宿主細胞または、細胞のないPKSを含む抽出物には、エポチロン誘導体を調製するために、新規な前駆体分子のN−アシルシステアミンチオエステル(NACS)を与えられ得るか、または供給され得る。米国特許出願第60/117,384号(1999年1月27日出願)およびPCT特許公開第US99/03986号(これらの両方は、本明細書中に参考として援用される)ならびに以下の実施例6を参照のこと。
【0066】
エポチロンPKSの第2(第1非NRPS)モジュールは、KS、メチルマロニルCoAに対して特異的なAT、DH、KRおよびACPを含む。このモジュールは、コスミドpKOS35−70.8A3の約13.1kbのEcoRI−NsiI制限フラグメント内の配列によってコードされる。
【0067】
エポチロンPKSの第2モジュールをコードする本発明の組換え核酸化合物およびそれらによりコードされる対応するポリペプチドは、種々の適用に対して有用である。エポチロンPKSの第2モジュールは、epoC遺伝子によって別個のタンパク質として産生される。本発明は、組換え形態においてepoC遺伝子を提供する。1つの実施形態において、エポチロン第2モジュールをコードする配列を含むDNA化合物は、別個のタンパク質、または異種PKSの1つ以上のモジュールを有する融合タンパク質のいずれかとして異種PKSを構成するタンパク質とともに同時発現される。生じたPKS(異種PKSのモジュールが、エポチロンPKSの第2モジュールにより置換されているか、もしくは後者が、単に異種PKSのモジュールに加えられている)は、新規なPKSを提供する。別の実施形態において、エポチロンPKSの第2モジュールをコードする配列を含むDNA化合物は、エポチロンPKSまたはエポチロン誘導体を産生する組換えエポチロンPKSを構成する他のタンパク質とともに同時発現される。
【0068】
別の実施形態において、配列をコードする第2モジュールのすべてまた一部だけが、ハイブリッドモジュールを作製するために、他のPKSコード配列とともに利用され得る。この実施形態において、本発明は、例えば、メチルマロニルCoA特異的ATを、マロニルCoA、エチルマロニルCoA、または2−ヒドロキシマロニルCoA特異的ATのいずれかを用いて置換する工程、DHもしくはKRのいずれか、または両方を欠失する工程、DHもしくはKRまたは両方を、異なる立体化学を特定するDHもしくはKRを用いて置換する工程、および/またはERを挿入する工程を提供する。一般的に、PKS KR、DH、および/またはERを挿入すること、もしくは置換することに対する本明細書中のすべての言及は、代表的に、挿入されたドメインまたは置換したドメインが得られるモジュールに由来する対応したドメインと、そのモジュール内の関連するKRドメイン、DHドメイン、またはERドメインとの置換を含む。さらに、KSおよび/またはACPは、別のKSおよび/またはACPを用いて置換され得る。これらの置換または挿入の各々において、異種KS、AT、DH、KR、ER、またはACPコード配列は、エポチロンPKSの別のモジュールについてのコード配列から生じ得るか、エポチロンとは異なるポリケチドを産生するPKSについての遺伝子から生じ得るか、または化学合成から生じ得る。生じた異種第2モジュールコード配列は、エポチロン、エポチロン誘導体または別のポリケチドを合成するPKSを構成する他のタンパク質とともに同時発現され得る。あるいは、エポチロンPKSの第2モジュールを欠失し得るか、異種PKSに由来するモジュールを用いてまたは置換し得、これは別個のタンパク質としてか、またはepoBもしくはepoD遺伝子産物のいずれかと融合された融合タンパク質として発現され得る。
【0069】
本発明の例示的な組換えPKS遺伝子は、エポチロンPKSの第2モジュールについてのATドメインコード配列が、変更されるか、または置換されて、それにより、コードされるATドメインを、メチルマロニル特異的ATからマロニル特異的ATに変える組換えPKS遺伝子を含む。そのようなマロニル特異的ATドメインコード核酸が、例えば、制限を伴わずに、ナルボノライド(narbonolide)PKS、ラパマイシンPKS(すなわち、モジュール2および12)およびFK−520PKS(すなわち、モジュール3、7および8)から単離され得る。そのようなハイブリッド第2モジュールは、エポチロンPKSを構成する他のタンパク質とともに同時発現され得、産生された生じたエポチロン誘導体は、16−デスメチルエポチロン誘導体である。
【0070】
さらに、本発明は、組換えエポチロンPKS酵素および対応する組換えタンパク質をコードするDNA化合物およびベクターを提供し、ここでは、第2(すなわち、次の)モジュールのKSドメインが不活性化されているか、または欠失されている。好ましい実施形態において、この不活性化は、活性部位システインに対するコドンをアラニンコドンに変えることにより達成される。NRPSモジュールについて上記に記載される対応する改変体についてと同様に、生じた組換えエポチロンPKS酵素は、組換えPKS酵素の残りのドメインおよびモジュールによって結合されて、そして伸長され得る前駆体が供給されないかぎり、エポチロンまたはエポチロン誘導体を産生し得ない。例示的なジケチドが、以下の実施例6において記載される。
【0071】
エポチロンPKSの第3のモジュールは、KS、マロニルCoAに対して特異的なAT、KR、およびACPを含む。このモジュールは、コスミドpKOS35−70.8A3の約8kbのBglII−NsiI制限フラグメント内の配列によってコードされる。
【0072】
エポチロンPKSの第3モジュールをコードする本発明の組換えDNA化合物およびそれによりコードされる対応するポリペプチドは、種々の適用について有用である。エポチロンPKSの第3モジュールは、タンパク質において発現され(epoD遺伝子の産物)、これはまた、モジュール4、5および6を含む。本発明は、epoD遺伝子を組換え形態において提供する。本発明はまた、他のエポチロンモジュールに対するコード配列を伴わない別個のコード配列としてエポチロンPKSモジュール3、4、5、および6の各々をコードする組換えDNA化合物を提供する。1つの実施形態において、エポチロン第3モジュールをコードする配列を含むDNA化合物は、異種PKSを構成するタンパク質とともに同時発現される。エポチロンPKSの第3モジュールは、別個のタンパク質または異種PKSの1つ以上のモジュールと融合された融合タンパク質のいずれかとして発現され得る。生じたPKSは、(ここで異種PKSのモジュールが、エポチロンPKSの第3モジュールについてのモジュールにより置換されるか、または後者が単に異種PKSのモジュールに付加されているかのいずれかである)新規なPKSを提供する。別の実施形態において、エポチロンPKSの第三モジュールをコードする配列を含むDNA化合物は、エポチロンPKSの残りまたはエポチロン誘導体を産生する組換えエポチロンPKSを含むタンパク質(代表的に、第3モジュールだけでなく、第4モジュール、第5モジュール、および第6モジュールも含むタンパク質として)とともに同時発現される。
【0073】
別の実施形態において、すべてまたは一部の第3モジュールコード配列が、ハイブリッドモジュールを作製するために、他のPKSコード配列とともに利用される。この実施形態において、本発明は、例えば、マロニル特異的ATをメチルマロニルCoA、エチルマロニルCoA、または2−ヒドロキシマロニルCoA特異的ATを用いて置換する工程;KRを欠失する工程;このKRを異なる立体化学を特定するKRを用いて置換する工程、ならびに/またはDHもしくはDHとERを挿入する工程を提供する。上記のように、DH、またはDHとERを挿入する工程に対する言及は、DHとKR、またはERとDHとKRを用いるKRの置換を含む。さらに、KSおよび/またはACPは、別のKSおよび/またはACPを用いて置換され得る。これらの置換または挿入の各々において、異種KS、AT、DH、KR、ER、またはACPコード配列は、エポチロンPKSの別のモジュールについてのコード配列から生じ得るか、エポチロンとは異なるポリケチドを産生するPKSについてのコード配列から生じ得るか、あるいは化学合成から生じ得る。生じた異種第3モジュールコード配列は、エポチロン、エポチロン誘導体、または別のポリケチドを合成するPKSについてのコード配列とともに利用され得る。
【0074】
本発明の例示的な組換えPKS遺伝子は、エポチロンPKSの第3モジュールについてのATドメインコード配列が、変更されるか、または置換されて、それにより、コードされるATドメインをマロニル特異的ATからメチルマロニル特異的ATに変える組換えPKS遺伝子を含む。そのようなメチルマロニル特異的ATドメインコード核酸が、例えば、制限を伴わずに、DEBSをコードするPKS遺伝子、ナルボノライドPKS、ラパマイシンPKSおよびFK−520PKSから単離され得る。エポチロンPKSの残りのモジュールおよびタンパク質またはエポチロンPKS誘導体とともに同時発現される場合、組換えPKSは、本発明の14−メチルエポチロン誘導体を産生する。
【0075】
当業者は、PKSの第3モジュールのKRドメインが、エポチロンの環化に関与する水酸基を形成する原因であることを認識する。結果的に、第3モジュールのKRドメインを無効にすること、またはDHおよびERドメインを付加することにより、環化が妨害され、直線分子またはエポチロンとは異なる位置で環化された分子へ導く。
【0076】
エポチロンPKSの第4モジュールは、KS、マロニルCoAまたはメチルマロニルCoAのいずれかと結合し得るAT、KRおよびACPを含む。このモジュールは、コスミドpKOS35−70.1A2の約10kbのNsiI−HindIII制限フラグメント内の配列によってコードされる。
【0077】
エポチロンPKSの第4モジュールをコードする本発明の組換えDNA化合物およびそれによりコードされる対応するポリペプチドは、種々の適用について有用である。1つの実施形態において、エポチロン第4モジュールをコードする配列を含むDNA化合物は、異種PKSの1つ以上のモジュールについてのコード配列を含むDNA化合物に挿入される。生じた構築物は、異種PKSのモジュールが、エポチロンPKSの第4モジュールについてのモジュールにより置換されるか、または後者が単に異種PKSのモジュールに付加されているかのいずれかであるタンパク質をコードする。異種PKSを構成する他のタンパク質とともに、このタンパク質は、新規なPKSを提供する。別の実施形態において、エポチロンPKSの第4モジュールをコードする配列を含むDNA化合物は、エポチロンPKSの残りのモジュールおよびタンパク質またはエポチロン誘導体を産生する組換えエポチロンPKSをまた発現する宿主細胞内で発現される。エポチロンまたはエポチロン誘導体を作製するために、組換え第4モジュールは、通常、エポチロン第3モジュール、第4モジュール、および第6モジュールまたはその改変バージョンをもまた含むタンパク質において発現される。
【0078】
別の実施形態において、すべてまたは一部の第4モジュールコード配列が、ハイブリッドモジュールを作製するために、他のPKSコード配列とともに利用される。この実施形態において、本発明は、例えば、マロニルCoAおよびメチルマロニル特異的ATを、マロニルCoA、メチルマロニルCoA、エチルマロニルCoA、または2−ヒドロキシマロニルCoA特異的ATを用いて置換する工程;KRを欠失する工程;および/またはKRを置換する工程(必要に応じて、異なる立体化学を特定することを含む)、および/またはDH、もしくはDHとERを挿入する工程を提供する。さらに、KSおよび/またはACPは、別のKSおよび/またはACPを用いて置換され得る。これらの置換または挿入の各々において、異種KS、AT、DH、KR、ER、またはACPコード配列は、エポチロンPKSの別のモジュールについてのコード配列から生じ得るか、エポチロンとは異なるポリケチドを産生するPKSについての遺伝子から生じ得るか、または化学合成から生じ得る。生じた異種第4モジュールコード配列は、エポチロン、エポチロン誘導体、または別のポリケチドを合成する組換えPKSのタンパク質サブユニット内へ組み込まれる。所望されるポリケチドが、エポチロンまたはエポチロン誘導体である場合、組換え第4モジュールは、エポチロンPKSの第3、第5、および第6モジュールまたはその改変バージョンをもまた含むタンパク質として代表的に発現される。あるいは、本発明は、エポチロンおよびエポチロン誘導体に対する組換えPKS酵素を提供し、ここで第4モジュール全体は、欠失されているか、または異種PKSに由来するモジュールによって置換されている。
【0079】
好ましい実施形態において、本発明は、メチルマロニルCoAとは結合するが、マロニルCoAとは結合しないATをコードするように改変されたエポチロンPKSの第4モジュールについてのコード配列を含む組換えDNA化合物を提供する。これらの組換え分子を使用して、改変された第4モジュールならびに第3モジュール、第5モジュール、および第6モジュールを含むepoDタンパク質の組換え誘導体であるタンパク質を発現させ、これらのモジュールのうちのいずれか1つ以上が、必要に応じて、エポチロンPKSの誘導体形態になり得る。別の好ましい実施形態において、本発明は、マロニルCoAとは結合するが、メチルマロニルCoAとは結合しないATをコードするように改変されたエポチロンPKSの第4モジュールについてのコード配列を含む組換えDNA化合物を提供する。これらの組換え分子を使用して、改変された第4モジュールならびに第3モジュール、第5モジュール、および第6モジュールを含むepoDタンパク質の組換え誘導体であるタンパク質を発現させ、これらのうちのいずれか1つ以上が、必要に応じて、エポチロンPKSの誘導体形態になり得る。
【0080】
本発明の前に、Sorangium cellulosumは、エポチロンA、B、C、D、E、およびFを産生し、そしてエポチロンA、CおよびEがC−12にて水素を有するが、エポチロンB、DおよびFはこの位置にメチル基を有することが公知であった。本発明の前は、これらの化合物が、S.cellulosmにおいて合成される順序およびいくつかの化合物がC−12において水素を有するが、他の化合物はこの位置にメチル基を有するメカニズムの真価が認められていなかった。本開示は、epoK遺伝子産物の作用によって、エポチロンAおよびBが、エポチロンCおよびDから誘導されること、およびC−12における水素部分またはメチル部分の存在が、エポチロンPKSのモジュール4のATドメインに起因することを示す。このドメインは、マロニルCoAまたはメチルマロニルCoAのいずれかと結合し得、このドメインがメチルマロニル特異的ATドメインに対する類似性よりもマロニル特異的ATドメインに対してより大きな類似性を有することと一致し、メチルマロニルCoAよりも頻繁にマロニルCoAと結合する。
【0081】
従って、本発明は、メチルマロニル特異的ATを含むハイブリッドの第4のモジュールが組み込まれた、組換えDNA化合物および発現ベクター、ならびに対応する組換えPKSを提供する。メチルマロニル特異的ATコード配列は、例えば、そして限定されないが、オレアンドライドPKS、DEBS、ナルボノライドPKS、ラマパイシンPKS,またはメチルマロニル特異的ATドメインを含む他の任意のPKSのコード配列から生じ得る。本発明に従って、このコード遺伝子から発現されるハイブリッドの第4のモジュールは、代表的には、誘導体epoD遺伝子産物として、エポチロンPKS(またはエポチロン誘導体のPKS)に組み込まれる。生じた組換えエポチロンPKSは、C−12〜C−13のアルケンを形成するデヒドラターゼ活性が存在しない場合、C−12のメチル部分を有するエポチロン(すなわち、エポチロンD(またはエポチロンH誘導体))を生じ;デヒドラターゼ活性が存在するが、エポキシダーゼ活性がしない場合、エポチロンD(またはエポチロンH誘導体)を生じ;デヒドラターゼ活性およびエポキシダーゼ活性の両方が存在するが、ヒドロキシラーゼ活性が存在しない場合、エポチロンB(またはエポチロンB誘導体)を生じ;そしてデヒドラターゼ活性、エポキシダーゼ活性およびヒドロキシラーゼ活性の3つ全てが存在する場合、エポチロンF(またはエポチロンF誘導体)を生じる。上記に括弧内に示されるように、細胞は、エポチロンPKSに対する他の変化が存在する場合に、その対応するエポチロン誘導体を産生する。
【0082】
このハイブリッドのメチルマロニル特異的な第4のモジュールを含む組換えPKSが、例えば、Sorangium cellulosumにおいて発現される場合、適切な改変酵素が存在し(これらが、本明細書中に記載の方法に従って不活性にされていない限り)、そしてエポチロンD、Bおよび/またはFが産生される。このような産生は、代表的に、本発明によって提供される組換えS.cellulosumにおいて行われ、ここで、ネイティブなエポチロンPKSは、全く機能し得ないか、または組換えの第4モジュールの提供との組み合わせた場合を除き、機能し得ない。例示的な例において、当業者は、本発明の方法および試薬を使用して、ネイティブ宿主におけるepoD遺伝子を不活性にし得る。従って、当業者は、ハイブリッドの第4モジュールをコードする配列を含む組換えepoD遺伝子を含むベクターで、宿主を形質転換し得る。この組換えベクターは、染色体外エレメントとして、または宿主細胞染色体内に組み込まれたDNAのセグメントとして存在し得る。後者の実施形態において、本発明は、当業者が、ネイティブepoD遺伝子を用いる相同組換えによって、野生型S.cellulosum内に組換えメチルマロニル特異的モジュール4のコード配列を単に組み込んで、所望のエポチロンのみが産生されることを確実にし得ることを、提供する。本発明は、S,cellulosum宿主が、デヒドラターゼ、エポキシダーゼおよび/またはオキシダーゼ遺伝子産物を発現し得るか、または発現し得ないか(それらのネイティブ遺伝子の変異または相同組換えによって)のいずれかであり得、従って、実施者が選択するように、対応するエポチロンD、BおよびFの化合物を形成するか、または形成し得ないことを、提供する。
【0083】
上記のように改変されたSorangium cellulosumは、本発明によって提供される組換え宿主細胞のただ1つである。好ましい実施形態において、この組換えメチルマロニル特異的エポチロンの第4モジュールコード配列を、本発明の方法に従って使用して、異種宿主細胞においてエポチロンD、BおよびF(またはそれらの対応する誘導体)を産生する。従って、本発明は、エポチロンまたはエポチロン誘導体PKS、ならびにエポチロンデヒドラターゼ、エポキシダーゼおよびヒドロキシラーゼ遺伝子、ならびにそれらの組み合わせを、異種宿主細胞に導入するための試薬および方法を提供する。
【0084】
本発明によって提供された組換えメチルマロニル特異的エポチロンの第4モジュールコード配列は、宿主細胞において所望のエポチロン化合物を産生するための重要な代替的方法を与える。従って、本発明は、ハイブリッドの第4モジュールコード配列を提供し、このコード配列において、メチルマロニルCoAに特異的なATのコード配列での、内因性ATコード配列の置換に加えて、例えば、そして限定されない、ラパマイシンPKSのモジュール10またはFK−520 PKSのモジュール1または5についてのDHおよびKRのコード配列が、内因性KRコード配列を置換している。遺伝子産物のコード配列によってコードされた、ハイブリッドの第4モジュールおよびエポチロンPKSモジュール3、5および6(またはそれらの誘導体)を含む、その遺伝子産物が、宿主細胞において産生された、他のエポチロンPKSタンパク質(または、それらの誘導体)を含むPKSに組み込まれる場合、その細胞は、エポチロンDmatahasのトランス立体異性体(または、それらの誘導体)のいずれかを、その挿入されたDHおよびKRドメインの立体化学特異性に依存して作製する。
【0085】
同様に、そして上記のように、本発明は、マロニルCoAを結合し、メチルマロニルCoAを結合しないATをコードするように改変された、エポチロンPKSの第4モジュールのコード配列を含む組換えDNA化合物を提供する。本発明は、ハイブリッドの第4モジュールが誘導体epoD遺伝子産物に組み込まれた、組換えDNA化合物およびベクター、ならびに対応する組換えPKSを提供する。エポチロンPKS(またはエポチロン誘導体のPKS)に組み込まれた場合、生じる組換えエポチロンPKSは、再度、エポチロン改変酵素が存在するか否かに依存して、エポチロンC、AおよびEを生成する。上記のように、宿主、この第4モジュールがKRおよびDHドメインを含むか否か、ならびにデヒドラターゼ、エポキシダーゼおよびオキシダーゼ活性が存在する否かおよびどれが存在するかに依存して、本発明の実施者は、本発明の化合物、宿主細胞および方法を使用して、エポチロンG、C、AおよびE化合物、ならびにそれらの誘導体の1以上を生成し得る。
【0086】
エポチロンPKSの第5のモジュールは、KS、マロニルCoAに結合するAT、DH、ER、KRおよびACPを含む。このモジュールは、コスミドpKOS35−70.1A2の約12.4kb NsiI−NotI制限フラグメント内の配列によってコードされる。
【0087】
エポチロンPKSの第5モジュールをコードする本発明の組換えDNA化合物およびそれによってコードされる対応するポリペプチドが、種々の適用に有用である。1つの実施形態において、エポチロンの第5モジュールをコードする配列を含むDNA化合物は、異種PKSの1以上のモジュールのコード配列を含むDNA化合物内に挿入される。異種PKSのモジュールのコード配列がエポチロンPKSの第5モジュールのコード配列によって置換されるか、あるいは、後者が異種PKSのモジュールのコード配列に単に付加されているかのいずれかである、この得られた構築物は、発現ベクター内に組み込まれ得、そしてそれによってコードされる組換えタンパク質を産生するために使用される。組換えタンパク質が、異種PKSの他のタンパク質と組み合わせられる場合、新規PKSが生成される。別の実施形態において、エポチロンPKSの第5モジュールをコードする配列を含むDNA化合物が、エポチロンPKSのコード配列を含むDNA化合物またはエポチロン誘導体を生成する組換えエポチロンPKS内に挿入される。後者の構築物において、このエポチロンの第5モジュールは、代表的に、エポチロンPKSの第3、第4、および第6のモジュール、あるいは、それらの誘導体を含むタンパク質として発現される。
【0088】
別の実施形態において、第5モジュールのコード配列の部分は、他のPKSコード配列と組み合わせて利用され、ハイブリッドモジュールコード配列およびそれにコードされるハイブリッドモジュールを作製する。この実施形態において、本発明は、例えば、マロニルCoA特異的ATのメチルマロニルCoA、エチルマロニルCoAまたは2−ヒドロキシマロニルCoA特異的ATでの置換;ER、DHおよびKRのいずれか1つ、2つまたは3つ全ての欠失;ならびに/またはER、DHおよびKRのいずれか1つ、2つまたは3つ全ての、KR、DHおよびKR、またはKR、DHおよびERのいずれかでの置換(必要に応じて、異なる立体化学を特定化することを含む)を提供する。さらに、KSおよび/またはACPは、別のKSおよび/またはACPで置換され得る。これらの置換または挿入の各々において、異種KS、AT、DH、KR、ERまたはACPコード配列は、エポチロンPKSの別のモジュールのコード配列から、エポチロン以外のポリケチドを産生するPKSのコード配列から、または化学合成から生じ得る。生じたハイブリッドの第5モジュールをコードする配列は、エポチロン、エポチロン誘導体または別のポリケチドを合成するPKSのコード配列と組み合わせて利用され得る。あるいは、エポチロンPKSの第5モジュールが、欠失または異種PKSのモジュールによってその全体において置換され、エポチロンPKSまたはエポチロン誘導体を生成するPKSを構成するその誘導体の他のタンパク質との組み合わせたタンパク質を産生し得る。
【0089】
本発明の例示的組換えPKS遺伝子は、エポチロンPKSの第5モジュールのATドメインコード配列が、改変または置換されて、それによってコードされるATドメインを、マロニル特異的ATからメチルマロニル特異的ATに変化されている、組換えepoD遺伝子誘導体を含む。このようなメチルマロニル特異的ATドメインをコードする核酸は、例えば、そして以下に限定されないが、DEBS、ナルボノライドPKS、ラパマイシンPKSおよびFK−520 PKSをコードするPKS遺伝子から単離され得る。このような組換えepoD遺伝子誘導体が、epoA、epoB、epoC、epoEおよびepoF遺伝子(または、それらの誘導体)と共に同時発現される場合、それらから作製されるPKSは、10−メチルエポチロンまたはその誘導体を生成する。本発明によって提供される別の組換えepoD遺伝子誘導体は、この改変されたモジュール5コード配列のみならず、メチルマロニルCoAにのみに結合するATドメインをコードするモジュール4コード配列を含む。PKSに、epoA、epoB、epoC、epoEおよびepoF遺伝子が組み込まれた場合、この組換えepoD遺伝子誘導体産物は、10−メチルエポチロンBおよび/またはDの誘導体の生成を導く。
【0090】
本発明の他の例示的な組換えepoD遺伝子誘導体は、エポチロンPKSの第5モジュールのER、DHおよびKRドメインのコード配列が、(i)KRおよびDHドメイン;(ii)KRドメイン;ならびに(iii)不活性KRドメインをコードする配列で置換されている、誘導体を含む。本発明のこれらの組換えepoD遺伝子誘導体は、epoA、epoB、epoC、epoEおよびepoF遺伝子と共に同時発現され、その対応する(i)C−11アルケン、(ii)C−11ヒドロキシおよび(iii)C−11ケトのエポチロン誘導体を作製する組換えPKSを産生する。これらの組換えepoD遺伝子誘導体はまた、他の改変を含む組換えepo遺伝子と共に同時発現され得るか、またはそれら自体がさらに改変されて、対応するC−11エポチロン誘導体を作製するPKSを産生し得る。例えば、本発明によって提供される1つの組換えepoD遺伝子誘導体はまた、メチルマロニルCoAにのみに結合するATドメインをコードする、モジュール4コード配列を含む。PKSに、epoA、epoB、epoC、epoEおよびepoF遺伝子が組み込まれた場合、この組換えepoD遺伝子誘導体産物は、対応するC−11エポチロンBおよび/またはDの誘導体の産生を導く。
【0091】
エポチロンC−11誘導体を産生するための機能的に類似のepoD遺伝子はもまた、エポチロンの第5モジュールのER、DHおよびKRドメインの1つ、2つまたは3つ全ての不活性化によって作製され得る。しかし、任意のモジュールにおいてこのようなドメインを改変するための好ましい形態は、同じまたは異種のPKSコード配列の別のモジュールから取得した所望のドメインの完全なセットでの置換による。この様式において、PKSの天然の構造は、保存される。また、ネイティブPKSにおいて共に機能する、既存のKRおよびDH、またはKR、DHおよびERのドメインは、組換えPKSにおいて好ましく使用される。上記の置換についての例示的な置換ドメインとしては、例えば、そして以下に限定されずに、ケトンを形成するためのラパマイシンPKSモジュール3由来の不活性KRドメイン、アルコールを形成するためのラパマイシンPKSモジュール5由来のKRドメイン、およびアルケンを形成するためのラパマイシンPKSモジュール4由来のKRおよびDHドメインが挙げられる。他のこのような、不活性KR、活性KRならびに活性KRおよびDHのドメインをコードする核酸は、例えば、そして以下に限定されないが、DEBS、ナルボノライドPKS、およびFK−520 PKSをコードするPKS遺伝子から単離され得る。生じるPKS酵素の各々は、C−11位で官能基を含むポリケチド化合物を生成し、この化合物は、標準的な化学方法論によってインビトロでさらに誘導体化され、本発明の半合成エポチロン誘導体を生じ得る。
【0092】
エポチロンPKSの第6モジュールは、KS、メチルマロニルCoAに結合するAT、DH、ER、KRおよびACPを含む。このモジュールは、コスミドpKOS35−70.1A2の約14.5kb HindIII−NsiI制限フラグメント内の配列によってコードされる。
【0093】
エポチロンPKSの第6モジュールをコードする本発明の組換えDNA化合物およびそれによってコードされる対応するポリペプチドが、種々の適用に有用である。1つの実施形態において、エポチロンの第6モジュールをコードする配列を含むDNA化合物は、異種PKSの1以上のモジュールのコード配列を含むDNA化合物内に挿入される。異種PKSのモジュールのコード配列がエポチロンPKSの第6モジュールのコード配列によって置換されるか、あるいは、後者が異種PKSのモジュールのコード配列に単に付加されているかのいずれかである、この構築物によってコードされる得られたタンパク質は、PKSを含む他のタンパク質と同時発現された場合に、新規PKSを産生する。別の実施形態において、エポチロンPKSの第6モジュールをコードする配列を含むDNA化合物が、エポチロンPKSのモジュール3、4および5のコード配列を含むDNA化合物またはエポチロン誘導体を生成する組換えエポチロンPKS内に挿入され、そしてエポチロンPKSまたはエポチロン誘導体PKSの他のタンパク質と同時発現されて、宿主細胞においてエポチロンまたはエポチロン誘導体を作製するPKSを産生する。
【0094】
別の実施形態において、第6モジュールのコード配列の部分は、他のPKSコード配列と組み合わせて利用され、ハイブリッドモジュールを作製する。この実施形態において、本発明は、例えば、マロニルCoA特異的ATのメチルマロニルCoA、エチルマロニルCoAまたは2−ヒドロキシマロニルCoA特異的ATでの置換;ER、DHおよびKRのいずれか1つ、2つまたは3つ全ての欠失;ならびに/またはER、DHおよびKRのいずれか1つ、2つまたは3つ全ての、KR、DHおよびKR、またはKR、DHおよびERのいずれかでの置換(必要に応じて、異なる立体化学を特定化することを含む)を提供する。さらに、KSおよび/またはACPは、別のKSおよび/またはACPで置換され得る。これらの置換または挿入の各々において、異種KS、AT、DH、KR、ERまたはACPコード配列は、エポチロンPKSの別のモジュールのコード配列から、エポチロン以外のポリケチドを産生するPKSのコード配列から、または化学合成から生じ得る。生じた異種の第6モジュールをコードする配列は、エポチロン、エポチロン誘導体または別のポリケチドを合成するタンパク質サブユニットのコード配列と組み合わせて利用され得る。PKSが、エポチロンまたはエポチロン誘導体を作製する場合、ハイブリッドの第6モジュールは、代表的に、エポチロンPKSのモジュール3、4および5またはそれらの誘導体を含むタンパク質として発現される。あるいは、エポチロンPKSの第6モジュールが、欠失または異種PKS由来のモジュールによってその全体において置換され、エポチロン誘導体についてのPKSを産生し得る。
【0095】
本発明の例示的な組換えPKS遺伝子は、エポチロンPKSの第6モジュールのATドメインコード配列が変更または置換されて、そのコード配列によってコードされたATドメインをメチルマロニル特異的ATからマロニル特異的ATに変化している遺伝子を、含む。このようなマロニル特異的ATドメインコード核酸は、例えば、および制限されることなく、ナルボノライド(narbonolide)PKS、ラパマイシンPKSおよびFK−520 PKSをコードするPKS遺伝子から、単離され得る。このようなハイブリッドモジュール6をコードする本発明の組換えepoD遺伝子が、他のエポチロンPKS遺伝子とともに同時発現される場合、組換えPKSは、8−デスメチルエポチロン誘導体を作製する。この組換えepoD遺伝子誘導体はまた、他の変更を含む組換えepo遺伝子誘導体とともに同時発現され得るか、またはそれ自体がさらに変更されて、対応する8−デスメチルエポチロン誘導体を作製するPKSを産生し得る。例えば、本発明によって提供される1つの組換えepoD遺伝子はまた、モジュール4コード配列を含み、このモジュール4コード配列は、メチルマロニルCoAのみを結合するATドメインをコードする。epoA遺伝子、epoB遺伝子、epoC遺伝子、epoE遺伝子、およびepoF遺伝子とともにPKSに組み込まれる場合、この組換えepoD遺伝子産物は、エポチロンBおよびエポチロンDの8−デスメチル誘導体の産生を誘導する。
【0096】
本発明の他の例示的な組換えepoD遺伝子誘導体は、エポチロンPKSの第6モジュールのERドメインコード配列、DHドメインコード配列およびKRドメインコード配列が、以下をコードする配列で置換されている誘導体を含む:(i)KRドメインおよびDHドメイン;(ii)KRドメイン;および(iii)不活性KRドメイン。本発明のこれらの組換えepoD遺伝子誘導体は、他のエポチロンPKS遺伝子と同時発現される場合、対応する以下を作製する:(i)C−9アルケンエポチロン誘導体、(ii)C−9ヒドロキシエポチロン誘導体、および(iii)C−9ケトエポチロン誘導体。これらの組換えepoD遺伝子誘導体はまた、他の変更を含む他の組換えepo遺伝子誘導体とともに同時発現され得るか、またはそれら自体がさらに変更されて、対応するC−9エポチロン誘導体を作製するPKSを産生し得る。例えば、本発明によって提供される1つの組換えepoD遺伝子誘導体はまた、モジュール4 コード配列を含み、このモジュール4 コード配列は、メチルマロニルCoAのみを結合するATドメインをコードする。epoA遺伝子、epoB遺伝子、epoC遺伝子、epoE遺伝子、およびepoF遺伝子とともにPKSに組み込まれる場合、この組換えepoD遺伝子産物は、エポチロンBおよびエポチロンDのC−9誘導体の産生を誘導する。
【0097】
機能的に等価な第6モジュールはまた、このエポチロン第6モジュールのERドメイン、DHドメインおよびKRドメインの、1つ、2つ、または3つすべての不活性化によって作製され得る。任意のモジュールにおいてこのようなドメインを変更するための好ましい様式は、同じまたは異種のPKSコード配列の別のモジュールから得られた所望のドメインの完全なセットでの置換による。上記に記載される置換のための例示的な置換ドメインとしては、ケトンを形成するためにラパマイシンPKSモジュール3からの不活性KRドメイン、アルコールを形成するためにラパマイシンPKSモジュール5からのKRドメイン、ならびにアルケンを形成するためにラパマイシンPKSモジュール4からのKRドメインおよびDHドメインが挙げられるが、これらに限定されない。他のこのような不活性KRドメインコード核酸、活性KRドメインコード核酸、ならびに活性KRおよびDHドメインコード核酸は、例えば、および制限されることなく、DEBSをコードするPKS遺伝子、ナルボノライドPKS、およびFK−520PKSから単離され得る。得られたPKSの各々は、そのC−9位で官能基を含むポリケチド化合物を産生し、これはさらに、標準的な化学方法論によってインビトロで誘導体化されて、本発明の半合成エポチロン誘導体を生じ得る。
【0098】
エポチロンPKSの第7モジュールは、KS、メチルマロニルCoAに特異的なAT、KR、およびACPを含む。このモジュールは、コスミドpKOS35−70.4からの約8.7kbのBglII制限フラグメント内の配列によってコードされる。
【0099】
エポチロンPKSの第7モジュールをコードする本発明の組換えDNA化合物およびそれによってコードされる対応するポリペプチドは、種々の適用のために有用である。エポチロンPKSの第7モジュールは、epoE遺伝子の遺伝子産物中に含まれ、これはまた、第8モジュールを含む。本発明は、組換え形態においてepoE遺伝子を提供するが、第8モジュールのコード配列を有さない第7モジュールをコードするDNA化合物ならびに第7モジュールのコード配列を有さない第8モジュールをコードするDNA化合物もまた提供する。1つの実施形態において、エポチロン第7モジュールをコードする配列を含むDNA化合物は、異種PKSの1つ以上のモジュールのコード配列を含むDNA化合物に挿入される。得られた構築物(異種PKSのモジュールのコード配列が、エポチロンPKSの第7モジュールのコード配列によって置換されているか、または後者が、異種PKSのモジュールのコード配列に単に付加されているかのいずれかである)は、新規なPKSコード配列を提供し、この配列は、宿主細胞中で発現され得る。あるいは、エポチロン第7モジュールは、別個のタンパク質として発現され得る。別の実施形態において、エポチロンPKSの第7モジュールをコードする配列を含むDNA化合物は、タンパク質を形成するように発現され、このタンパク質は、他のタンパク質とともに、エポチロンPKSまたはエポチロン誘導体を産生するPKSを構成する。これらの実施形態において、第7モジュールは、代表的に、エポチロンPKSまたはその誘導体の第8モジュールを含むタンパク質として発現され、そしてepoA遺伝子、epoB遺伝子、epoC遺伝子、epoD遺伝子、およびepoF遺伝子、またはそれらの誘導体とともに同時発現されて、PKSを構成する。
【0100】
別の実施形態において、第7モジュールコード配列の一部またはすべては、他のPKSコード配列と合わせて利用されて、ハイブリッドモジュールを作製する。この実施形態において、本発明は、例えば、メチルマロニルCoA特異的ATをマロニルCoA特異的AT、エチルマロニルCoA特異的AT、または2−ヒドロキシマロニルCoA特異的ATに置換すること;KRを欠失すること;KRを異なる立体化学を特定するKRに置換すること;ならびに/あるいはDHもしくはDHおよびERを挿入することを提供する。さらに、KSおよび/またはACPは、別のKSおよび/またはACPに置換され得る。これらの置換または挿入の各々において、異種のKS、AT、DH、KR、ERまたはACPのコード配列は、エポチロンPKSの別のモジュールのコード配列から、エポチロン以外のポリケチドを産生するPKSのコード配列から、または化学的合成から生じ得る。得られた異種の第7モジュールコード配列は、必要に応じて、他のコード配列と合わせて利用されてタンパク質を発現し、このタンパク質は、他のタンパク質とともに、エポチロン、エポチロン誘導体または別のポリケチドを合成するPKSを構成する。エポチロンまたはエポチロン誘導体を調製するために使用される場合、第7モジュールは、代表的に、第8モジュールまたはその誘導体を含むタンパク質として発現され、そしてepoA遺伝子、epoB遺伝子、epoC遺伝子、epoD遺伝子およびepoF遺伝子、またはそれらの誘導体とともに同時発現されて、PKSを構成する。あるいは、epoE遺伝子中の第7モジュールのコード配列は、異種モジュールのコード配列によって欠失されるかまたは置換されて、組換えepoE遺伝子誘導体を調製し得、この組換えepoE遺伝子誘導体は、epoA遺伝子、epoB遺伝子、epoC遺伝子、epoD遺伝子およびepoF遺伝子とともに発現されて、エポチロン誘導体のPKSを作製し得る。
【0101】
本発明の例示的な組換えepoE遺伝子誘導体は、エポチロンPKSの第7モジュールのATドメインコード配列が変更または置換されて、そのコード配列によってコードされたATドメインをメチルマロニル特異的ATからマロニル特異的ATに変化している遺伝子を、含む。このようなマロニル特異的ATドメインコード核酸は、例えば、および制限されることなく、ナルボノライドPKS、ラパマイシンPKSおよびFK−520 PKSをコードするPKS遺伝子から、単離され得る。他のエポチロンPKS遺伝子、epoA、epoB、epoC、epoDおよびepoF、またはそれらの誘導体とともに同時発現される場合、C−6メチルの代わりにC−6水素を有するエポチロン誘導体のPKSが、産生される。従って、この遺伝子が他の変更を含まない場合、産生される化合物は、6−デスメチルエポチロンである。
【0102】
エポチロンPKSの第8モジュールは、KSドメイン、メチルマロニルCoAに特異的なATドメイン、不活性なKRドメインおよびDHドメイン、メチルトランスフェラーゼ(MT)ドメイン、ならびにACPを含む。このモジュールは、コスミドpKOS35−79.85の約10kbのNotI制限フラグメント内の配列によってコードされる。
【0103】
エポチロンPKSの第8モジュールをコードする本発明の組換えDNA化合物およびそれによってコードされる対応するポリペプチドは、種々の適用のために有用である。1つの実施形態において、エポチロン第8モジュールをコードする配列を含むDNA化合物は、異種PKSの1つ以上のモジュールのコード配列を含むDNA化合物へ挿入される。得られた構築物(異種PKSのモジュールのコード配列が、エポチロンPKSの第8モジュールのコード配列によって置換されているか、または後者が、異種PKSのモジュールのコード配列に単に付加されているかのいずれかである)は、新規なPKSコード遺伝子を提供し、これは、PKSを構成する他のタンパク質とともに発現されて、新規なPKSを提供する。あるいは、第8モジュールは、別個のタンパク質として発現され得、このタンパク質は、他のPKSタンパク質と会合して新規なPKSを構成し得る。別の実施形態において、エポチロンPKSの第8モジュールをコードする配列を含むDNA化合物は、エポチロンPKSまたはエポチロン誘導体を産生するPKSを構成する他のタンパク質とともに、同時発現される。これらの実施形態において、第8モジュールは、代表的に、第7モジュールまたはその誘導体を含むタンパク質として発現される。
【0104】
別の実施形態において,第8モジュール コード配列の一部またはすべては、他のPKSコード配列と合わせて利用されて、ハイブリッドモジュールを作製する。この実施形態において、本発明は、例えば、メチルマロニルCoA特異的ATをマロニルCoA特異的AT、エチルマロニルCoA特異的AT、または2−ヒドロキシマロニルCoA特異的ATに置換すること;不活性KRおよび/または不活性DHを欠失すること;不活性なKRおよび/またはDHを活性なKRおよび/またはDHに置換すること;ならびに/あるいはERを挿入することを提供する。さらに、KSおよび/またはACPは、別のKSおよび/またはACPに置換され得る。これらの置換または挿入の各々において、異種のKS、AT、DH、KR、ERまたはACPのコード配列は、エポチロンPKSの別のモジュールのコード配列から、エポチロン以外のポリケチドを産生するPKSのコード配列から、または化学的合成から生じ得る。得られた異種第8モジュール コード配列は、タンパク質として発現され、このタンパク質は、エポチロン、エポチロン誘導体または別のポリケチドを合成するPKSを構成する、他のタンパク質と合わせて利用される。エポチロンまたはエポチロン誘導体を調製するために使用される場合、異種第8モジュールまたはハイブリッド第8モジュールは、代表的に、組換えepoE遺伝子産物として発現され、この組換えepoE遺伝子産物はまた、第7モジュールを含む。あるいは、epoE遺伝子中の第8モジュールのコード配列は、異種モジュールのコード配列によって欠失されるかまたは置換されて、組換えepoE遺伝子を調製し得、この組換えepoE遺伝子は、epoA遺伝子、epoB遺伝子、epoC遺伝子、epoD遺伝子およびepoF遺伝子とともに発現されて、エポチロン誘導体のPKSを作製し得る。
【0105】
エポチロンPKSの第8モジュールはまた、エポチロン前駆体をメチル化する活性を有する、メチル化またはメチルトランスフェラーゼ(MT)ドメインを含む。この機能は、本発明の組換えepoD遺伝子誘導体を産生するために欠失され得、この誘導体は、他のエポチロンPKS遺伝子またはその誘導体とともに発現され得、第8モジュールのATドメインが、そのエポチロン分子の対応するC−4位でマロニル特異的ATドメインに変更されているか否かに依存して、1つまたは両方のメチル基を欠失するエポチロン誘導体を作製する。別の重要な実施形態において、本発明は、このメチル化ドメインおよび活性ならびに種々の組換えPKSコード配列(このポリペプチドを組み込む組換えPKS酵素をコードする)を有するポリペプチドをコードする組換えDNA化合物を提供する。このMTドメインおよびそれのコード配列の利用性は、少なくともさらなるメチル基の存在によって、公知のポリケチドとは異なる、有意な数の新たなポリケチドを提供する。本発明のMTドメインは、実際において、任意のPKSモジュールに付加されて、PKSによって産生されるポリケチド中の対応する位置でメチル化を指向し得る。しかし1つの例示的な例のように、本発明は、このMT活性のコード配列を、DEBS酵素の6つのモジュールのいずれか1つ以上のコード配列に挿入することから生じる組換え核酸化合物を提供して、C−2位、C−4位、C−6位、C−8位、C−10位および/またはC−12位で1つ以上のさらなるメチル基を含む6−デオキシエリスロノライド(deoxyerythronolide)B誘導体を合成する組換えDEBSを産生する。このような構築物において、このMTドメインは、ATまたはACPに隣接して挿入され得る。
【0106】
エポチロンPKSの第9モジュールは、KS、マロニルCoAに特異的なAT、KR、不活性DH、およびACPを含む。このモジュールは、コスミドpKOS35−79.85の約14.7kbのHindIII−BglII制限フラグメント内の配列によってコードされる。
【0107】
エポチロンPKSの第9モジュールをコードする本発明の組換えDNA化合物およびそれによってコードされる対応するポリペプチドは、種々の適用のために有用である。エポチロンPKSの第9モジュールは、タンパク質(epoF遺伝子の産物)として発現され、これはまた、エポチロンPKSのTEドメインを含む。本発明は、組換え形態においてepoF遺伝子、ならびにTEドメインのコード配列を有さない第9モジュールをコードするDNA化合物および第9モジュールのコード配列を有さないTEドメインをコードするDNA化合物を、提供する。1つの実施形態において、エポチロン第9モジュールをコードする配列を含むDNA化合物は、異種PKSの1つ以上のモジュールのコード配列を含むDNA化合物に挿入される。得られた構築物(異種PKSのモジュールのコード配列が、エポチロンPKSの第9モジュールのコード配列によって置換されているか、または後者が、異種PKSのモジュールのコード配列に単に付加されているかのいずれかである)は、新規なPKSタンパク質コード配列を提供し、これは、PKSを構成するほかのタンパク質とともに同時発現される場合、新規なPKSを提供する。第9モジュールコード配列はまた、付着されたTEドメインを有するかまたは有さない、別個のタンパク質として発現され得る。別の実施形態において、エポチロンPKSの第9モジュールをコードする配列を含むDNA化合物は、他のタンパク質とともにタンパク質として発現されて、エポチロンPKSまたはエポチロン誘導体を産生するPKSを構成する。これらの実施形態において、第9モジュールは、代表的に、タンパク質として発現され、このタンパク質はまた、エポチロンPKSまたは異種PKSのいずれかのTEドメインを含む。
【0108】
別の実施形態において、第9モジュール コード配列の一部またはすべては、他のPKSコード配列と合わせて利用されて、ハイブリッドモジュールを作製する。この実施形態において、本発明は、例えば、マロニルCoA特異的ATをメチルマロニルCoA特異的AT、エチルマロニルCoA特異的AT、または2−ヒドロキシマロニルCoA特異的ATに置換すること;KRを欠失すること;KRを異なる立体化学を特定するKRに置換すること;および/あるいはDHまたはDHおよびERを挿入することを提供する。さらに、KSおよび/またはACPは、別のKSおよび/またはACPに置換され得る。これらの置換または挿入の各々において、異種のKS、AT、DH、KR、ERまたはACPのコード配列は、エポチロンPKSの別のモジュールのコード配列から、エポチロン以外のポリケチドを産生するPKSのコード配列から、または化学的合成から生じ得る。得られた異種の第9モジュール コード配列は、他のタンパク質とともに同時発現され、この他のタンパク質は、エポチロン、エポチロン誘導体または別のポリケチドを合成するPKSを構成する。あるいは、本発明は、エポチロンまたはエポチロン誘導体のためのPKSを提供し、ここで、第9モジュールは、異種PKSからのモジュールによって置換されているか、あるいはその全体において欠失されている。後者の実施形態の場合、TEドメインは、別個のタンパク質として発現されるか、または第8モジュールに融合される。
【0109】
エポチロンPKSの第9モジュールには、チオエステラーゼドメインが続く。このドメインは、第9モジュール コード配列を含む約14.7kbのHindIII−BglII制限物にコードされる。本発明は、エポチロンPKSの第9モジュールが異種チオエステラーゼに融合されているか、または異種PKSの1以上のモジュールがエポチロンPKSチオエステラーゼに融合されている、ハイブリッドPKS酵素をコードする組換えDNA化合物を提供する。従って、例えば、別のPKS由来のチオエステラーゼドメインコード配列が、本発明の組換えDNA化合物における第9モジュール ACPコード配列の末端に挿入され得る。それゆえ、このチオエステラーゼドメインをコードする組換えDNA化合物は、エポチロンPKS、エポチロン誘導体を生成するPKS、およびエポチロンまたはエポチロン誘導体以外のポリケチドを生成するPKSのタンパク質をコードする、DNA化合物を構築する際に有用である。
【0110】
1つの重要な実施形態では、従って、本発明は、ハイブリッドPKS、およびこれらのハイブリッドPKS酵素を構築するタンパク質をコードする対応する組換えDNA化合物を提供する。本発明の目的のためには、ハイブリッドPKSは、第1のPKSの1以上のモジュール、ローディングドメインおよびチオエステラーゼ/シクラーゼドメインの全てまたは一部、ならびに第2のPKSの1以上のモジュール、ローディングドメイン、およびチオエステラーゼ/シクラーゼドメインの全てまたは一部を含む、組換えPKSである。1つの好ましい実施形態では、第1のPKSは、エポチロンPKSの大部分だが全てではなく、そして第2のPKSは、非エポチロンPKSのほんの一部または全てである。このようなハイブリッドPKSの例示的な例としては、天然のローディングドメインが別のPKSのローディングドメインで置換されたエポチロンPKSが挙げられる。このようなハイブリッドPKSの別の例は、第4モジュールのATドメインが、メチルマロニルCoAにのみ結合する異種PKS由来のATドメインで置換されたエポチロンPKSである。別の好ましい実施形態では、第1のPKSは、非エポチロンPKSの大部分だが全てではなく、そして第2のPKSは、このエポチロンPKSのほんの一部または全てである。このようなハイブリッドPKSの例示的な例としては、メチルマロニルCoAに特異的なATがマロニルCoAに特異的なエポチロンPKS由来のATで置換されたエリスロマイシンPKSが挙げられる。別の例は、エポチロンPKSのMTドメインを含むエリスロマイシンPKSである。
【0111】
当業者は、本発明のハイブリッドPKSにおける第1または第2のいずれかのPKSの全てまたは一部が、天然に存在する供給源から単離される必要があるわけではないことを認識する。例えば、ATドメインのほんの一部分が、その特異性を決定する。米国特許出願第09/346,860号およびPCT特許出願第WO US99/15047(これらの各々は、本明細書中で参考として援用される)を参照のこと。DNA合成における当該分野の状態は、当業者がPKSモジュールまたはドメインの有用な部分を構築するために充分なサイズの新規なDNA化合物を構築することを可能にする。本発明の目的のために、このような合成DNA化合物は、PKSの一部であるとみなされる。
【0112】
以下の表は、組換えPKSおよび本発明の組換えPKSをコードする対応するDNA化合物の構築に利用され得る例示的なPKS遺伝子および対応する酵素を記載する参考文献を列挙する。ポリケチド調製ならびに本発明の組換えDNA化合物を作製するために用いられ得る改変酵素および対応する遺伝子を記載する種々の参考文献もまた提示する。
【0113】
(アベルメクチン(Avermectin))
Merckに対する米国特許第5,252,474号。
【0114】
MacNeilら,1993,Industrial Microorganisms:Basic and Applied Molecular Genetics,Baltz,HegemanおよびSkatrud編(ASM),245−256頁,A Comparison of the Genes Encoding the Polyketide Synthases for Avermectin,Erythromycin,and Nemadectin。
【0115】
MacNeilら,1992,Gene 115:119−125,Complex Organization of the Streptomyces avermitilis genes encoding the avermectin polyketide synthase。
【0116】
IkedaおよびOmura,1997,Chem.Res.97:2599−2609,Avermectin biosynthesis。
【0117】
(カンジシジン(FR008))
Huら,1994,Mol.Microbiol.14:163−172。
【0118】
(エリスロマイシン)
Abbottに対するPCT公開第93/13663号。
【0119】
Abbottに対する米国特許第5,824,513号。
【0120】
Donadioら,1991,Science 252:675−9。
【0121】
Cortesら,1990年11月8日,Nature 348:176−8,An unusually large multifunctional polypeptide in the erythromycin producing polyketide synthase of Saccharopolyspora erythraea。
【0122】
(グリコシル化酵素)
Abbottに対するPCT特許出願公開第97/23630号。
【0123】
(FK−506)
Motamediら,1998,The biosynthetic gene cluster for the macrolactone ring of the immunosuppressant FK−506,Eur.J.Biochem.256:528−534。
【0124】
Motamediら,1997,Structural organization of a multifunctional polyketide synthase involved in the biosynthesis of the macrolide immunosuppressant FK−506,Eur.J.Biochem.244:74−80。
【0125】
(メチルトランスフェラーゼ)
1993年11月23日に発行された米国特許第5,264,355号,Methylating enzyme from Streptomyces MA6858.31−O−desmethyl−FK−506 methyltransferase。
【0126】
Motamediら,1996,Characterization of methyltransferase and hydroxylase genes involved in the biosynthesis of the immunosuppressants FK−506 and FK−520,J.Bacteriol.178:5243−5248。
【0127】
(FK−520)
1998年9月16日に出願された米国特許出願第09/154,083号。
【0128】
1999年10月1日に出願された米国特許出願第09/410,551号。
【0129】
Nielsenら,1991,Biochem.30:5789−96。
【0130】
(ロバスタチン)
Merckに対する米国特許第5,744,350号。
【0131】
(ナルボマイシン(Narbomycin))
1998年11月5日に出願された米国特許出願第60/107,093号。
【0132】
(ネマデクチン)
MacNeilら,1993,前出。
【0133】
(ニダマイシン(Niddamycin))
Kakavasら,1997,Identification and characterization of the niddamycin polyketide synthase genes from Streptomyces caelestis,J.Bacteriol.179:7515−7522。
【0134】
(オレアンドマイシン)
Swanら,1994,Characterisation of a Streptomyces antibioticus gene encoding a type I polyketide synthase which has an unusual coding sequence,Mol.Gen.Genet.242:358−362。
【0135】
発明者ら(S.Shah,M.Betlach,R.McDanielおよびL.Tang)による、1999年2月16日に出願された米国特許出願第60/120,254号、これに対する優先権を主張する、1999年10月28日に出願された出願第09/ 号(代理人整理番号30063−20029.00)。
【0136】
Olanoら,1998,Analysis of a Streptomyces antibioticus chromosomal region involved in oleandomycin biosynthesis,which encodes two glycosyltransferases responsible for glycosylation of the macrolactone ring,Mol.Gen.Genet.259(3):299−308。
【0137】
(ピクロマイシン(Picromycin))
1999年5月28日に出願されたPCT特許出願第WO US99/11814号。
【0138】
1999年5月27日に出願された米国特許出願第09/320,878号。
【0139】
1998年8月28日に出願された米国特許出願第09/141,908号。
【0140】
Xueら,1998,Hydroxylation of macrolactones YC−17 and narbomycin is mediated by the pikC−encoded cytochrome P450 in Streptomyces venezuelae,Chemistry & Biology 5(11):661−667。
【0141】
Xueら,1998年10月,A gene cluster for macrolide antibiotic biosynthesis in Streptomyces venezuelae:Architecture of metabolic diversity,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:12111−12116。
【0142】
(プラテノライド(Platenolide))
Lillyに対するEP特許出願公開第791,656号。
【0143】
(プラジマイシン(Pradimicin))
Bristol−Myers Squibbに対するPCT特許公開第WO 98/11230号。
【0144】
(ラパマイシン(Rapamycin))
Schweckeら,1995年8月,The biosynthetic gene cluster for the polyketide rapamycin,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:7839−7843。
【0145】
Aparicioら,1996,Organization of the biosynthetic gene cluster for rapamycin in Streptomyces hygroscopicus:analysis of the enzymatic domains in the modular polyketide synthase,Gene 169:9−16。
【0146】
(リファマイシン)
Novartisに対するPCT特許公開第WO 98/07868号。
【0147】
Augustら,1998年2月13日,Biosynthesis of the ansamycin antibiotic rifamycin:deductions from the molecular analysis of the rif biosynthetic gene cluster of Amycolatopsis mediterranei S669,Chemistry & Biology,5(2):69−79。
【0148】
(ソランジウム(Sorangium)PKS)
1998年8月31日に出願した米国特許出願第09/144,085。
【0149】
(ソラフェン(Soraphen))
Novartisに対する米国特許第5,716,849号。
【0150】
Schuppら,1995,J.Bacteriology 177:3673−3679.A Sorangium cellulosum(Myxobacterium)Gene Cluster for the Biosynthesis of the Macrolide Antibiotic Soraphen A:Cloning,Characterization,and Homology to Polyketide Synthase Genes from Actinomycetes。
【0151】
(スピラマイシン)
Lillyに対する米国特許第5,098,837号。
【0152】
(アクチベーター遺伝子)
Lillyに対する米国特許第5,514,544号。
【0153】
(チロシン(Tylosin))
Lillyに対する米国特許第5,876,991号。
【0154】
Lillyに対するEP公開第791,655号。
【0155】
Kuhstossら,1996,Gene 183:231−6.,Production of a novel polyketide through the construction of a hybrid polyketide synthase。
【0156】
(修飾酵素(Tailoring enzymes))
Merson−DaviesおよびCundliffe,1994,Mol.Microbiol.13:349−355.Analysis of five tylosin biosynthetic genes from the tylBA region of the Streptomyces fradiae genome。
【0157】
上記の表が例示するように、ハイブリッドPKSをコードする本発明のDNA化合物を構築する際に使用するためのDNAおよび配列情報の容易に利用可能な供給源として作用する、広範な種々のPKS遺伝子が存在する。ハイブリッドPKSをコードするDNA化合物を構築するための方法は、米国特許第5,672,491号および同第5,712,146号、ならびに1998年5月6日に出願された米国特許出願第09/073,538号および1998年8月28日に出願された米国特許第09/141,908号(これらの各々は、本明細書中に参考として援用される)におけるエポチロンPKSを参照することなく記載される。本発明のハイブリッドPKS酵素を構築するための異種PKSドメインコード配列を単離する目的で好ましいPKS酵素およびPKS酵素を構成するタンパク質についてのコード配列は、上記の表においてソラフェン(soraphen)PKSおよびソランジウム(Sorangium)PKSとして記載されるPKSである。
【0158】
(実施例1においてクローニングおよび配列決定された遺伝子の機能をまとめること:)
【0159】
【表2】
本発明のハイブリッドPKSコードDNA化合物は、2より多くのPKS遺伝子のハイブリッドであり得、そしてしばしば、2より多くのPKS遺伝子のハイブリッドである。2つの遺伝子しか用いられない場合でさえ、しばしば、ハイブリッド遺伝子において2以上のモジュールが存在し、ここで、このモジュールの全てまたは一部が、第2の(または第3の)PKS遺伝子に由来する。ハイブリッドモジュール(エポチロンPKSと同じ特異性を有する他方のモジュール)の特異性を列挙することにより同定される、本発明の組換えエポチロン誘導体PKS遺伝子の代表例としては、以下が挙げられる:
(a)メチルマロニル特異的AT(mm AT)およびKRを有するモジュール4、ならびにマロニル特異的AT(m AT)およびKRを有するモジュール2;
(b)mM ATおよびKRを有するモジュール4、ならびにmM ATおよびKRを有するモジュール3;
(c)mM ATおよびKRを有するモジュール4、ならびにmM ATおよびER、DH、およびKRを有するモジュール5;
(d)mM ATおよびKRを有するモジュール4、ならびにmM ATおよびDHおよびKRを有するモジュール5;
(e)mM ATおよびKRを有するモジュール4、ならびにmM ATおよびKRを有するモジュール5;
(f)mM ATおよびKRを有するモジュール4、ならびにmM ATおよび不活性なKRを有するモジュール5;
(g)mM ATおよびKRを有するモジュール4、ならびにATおよびER、DHおよびKRを有するモジュール6;
(h)mM ATおよびKRを有するモジュール4、ならびにATおよびDHおよびKRを有するモジュール6;
(i)mM ATおよびKRを有するモジュール4、ならびにATおよびKRを有するモジュール6;
(j)mM ATおよびKRを有するモジュール4、ならびにm ATおよび不活性なKRを有するモジュール6;
(k)mM ATおよびKRを有するモジュール4、ならびにm ATを有するモジュール7;
(1)モジュール5がm ATを有することを除く、ハイブリッド(c)〜(f);
(m)モジュール6がmM ATを有することを除く、ハイブリッド(g)〜(j);ならびに
(n)モジュール4がm ATを有することを除く、ハイブリッド(a)〜(m)。
【0160】
上記のリストは、例示のみであり、そして本発明を限定すると解釈されるべきでない。本発明は、示した以外の2ハイブリッドモジュールを有するだけでなく、3以上のハイブリッドモジュールをも有する、他の組換えエポチロンPKS遺伝子および酵素を含む。
【0161】
当業者は、本発明のハイブリッドPKSが以下の型のいずれかのPKSを含むがこれらに限定されないことを理解する:(i)ドメインの少なくとも1つが異種モジュール由来であるモジュールを含む、エポチロンまたはエポチロン誘導体PKS;(ii)異種PKS由来のモジュールを含む、エポチロンまたはエポチロン誘導体PKS;(iii)異種PKS由来のタンパク質を含む、エポチロンまたはエポチロン誘導体PKS;および(iv)上記の組み合わせ。
【0162】
本発明の重要な実施形態がハイブリッドPKS遺伝子に関する一方で、本発明はまた、第2のPKS遺伝子配列は存在しないが、1つ以上の欠失によってエポチロンPKS遺伝子とは異なる組換えエポチロンPKS遺伝子を提供する。この欠失は1つ以上のモジュールを含み得、そして/または1つ以上のモジュール内の部分欠失に限定され得る。欠失がNRPSモジュール以外のモジュール全体を含む場合、得られるエポチロン誘導体は、欠失されたバージョンを誘導したPKSから産生された化合物より少なくとも2つの炭素分短い。この欠失はまた、上記のようなNRPSモジュールおよび/またはローディングドメインを含み得る。欠失がモジュール内にある場合、この欠失は代表的にKR、DH、もしくはERドメイン、またはDHおよびERドメインの両方、またはKRおよびDHドメインの両方、またはKR、DH、およびERドメインの3つ全てを含む。
【0163】
エポチロンPKSおよびエポチロン改変酵素のドメインおよびモジュールのの触媒特性はまた、対応する遺伝子のランダム変異誘発または部位特異的変異誘発によって変更され得る。広範囲の種々の変異誘発剤および方法は、当該分野において公知であり、この目的に適している。DNAシャッフリングとして公知の技術もまた用いられ得る。例えば、米国特許第5,830,721号;同第5,811,238号;および同第5,605,793号;および本明細書中で引用された参考文献(これらの各々は本明細書中において参考として援用される)を参照のこと。
【0164】
(組換え操作)
本発明のハイブリッドPKSまたはエポチロン誘導体PKS遺伝子を構築するために、または非改変エポチロン生合成遺伝子を単純に発現するために、PCT公開番号98/27203号および1997年12月11日出願の米国特許出願第08/989,332号、および1999年4月16日出願の同第60/129,731号に記載される技術を用い得、これらの各々は参考として本明細書中に援用され、ここで、PKSの種々の遺伝子は2つ以上、しばしば3つのセグメントに分割され、そして各セグメントは別の発現ベクターに配置される。この方法で、遺伝子の完全な相補体を構築し得、そして異種発現のためにより容易に操作し得、そしてこの遺伝子のセグメントの各々が変更され得、そして種々の変更されたセグメントは単一の宿主細胞内に合わせられ得、本発明の組換えPKSを提供する。この技術は、組換えPKS遺伝子の大きなライブラリー、それらの遺伝子を発現するベクター、およびそれらのベクターを含む宿主細胞の構築をより効率的にする。この文脈および他の文脈において、所望されるPKSをコードする遺伝子は、2以上のベクター上に存在するだけでなく、この遺伝子が由来した天然プロデューサー生物内と異なって順序付けられ得るかまたは配置され得る。エポチロンPKSに適用されるようなこの技術の種々の例は、以下の実施例に記載される。1実施形態において、epoA遺伝子、epoB遺伝子、epoC遺伝子およびepoD遺伝子は第1のプラスミド上に存在し、epoFおよびepoFおよび必要に応じてepoKまたはepoKのいずれかおよびepoL遺伝子は第2(または第3)のプラスミド上に存在する。
【0165】
従って、1つの重要な実施形態において、本発明の組換え核酸化合物は、発現ベクターである。本明細書中で使用される場合、用語「発現ベクター」とは、宿主細胞または無細胞転写および翻訳媒体に導入され得る任意の核酸をいう。発現ベクターは、細胞中または任意の細胞画分中の染色体DNAまたは他のDNAの一部として(例えば、細胞質中の複製ベクター)であろうと、細胞内に安定にまたは一過性に維持され得る。発現ベクターはまた、細胞または細胞抽出物中のポリペプチドに翻訳されるRNAを産生するように作用する遺伝子を含む。従って、このベクターは典型的に、遺伝子発現を増強するためのプロモーターを含むが、あるいは、内因性プロモーターの制御下で適切なコード配列を組み込むように作用し得る。さらに、発現ベクターは代表的に、選択マーカーとして作用するための抵抗付与遺伝子およびプロモーター活性を増強するための調節遺伝子、のような追加の機能的エレメントを含み得る。
【0166】
発現ベクターの種々の成分は、ベクターの意図される用途に依存して広く変動し得る。特に、この成分はベクターが使用されるかまたは機能するように意図される宿主細胞(単数または複数)に依存する。E.coli中でのベクターの発現および維持のためのベクター成分は、酵母細胞およびStreptomyces細胞のような他の通常使用される生物体のためのベクター成分と同様に、広く公知であり市販される。
【0167】
1実施態様において、本発明のベクターはSorangium宿主細胞を形質転換するために使用され、本発明の組換えSorangium宿主細胞を提供する。本明細書中において参考として援用される米国特許第5,686,295号は、Sorangium宿主細胞を形質転換するための方法を記載するが、他の方法もまた用いられ得る。Sorangiumは、本発明のエポチロン誘導体を発現するための好都合な宿主であり、ここでは、このような誘導体を産生する組換えPKSは組換えベクターから発現され、この組換えベクターではエポチロンPKS遺伝子プロモーターは組換えコード配列の発現を駆動するために配置される。このエポチロンPKS遺伝子プロモーターは、本発明によって組換え形態で提供され、その重要な実施形態である。このプロモーターは、トランスポゾン配列の末端とepoA遺伝子のオープンリーディングフレームの開始部位との間で約500ヌクレオチドの配列内に含まれる。必要に応じて、プロモーター内にこの500bp領域のさらなる上流由来の配列を含み得る。当業者は、エポチロンを産生するSorangium宿主が宿主細胞として使用される場合、組換えベクターは変更された配列を含むPKSの一部のみの発現を駆動する必要があることを認識する。従って、このようなベクターは、単一の変更されたエポチロンPKS遺伝子のみを含み得、このエポチロンPKSポリペプチドの残りは宿主細胞染色体DNA中の遺伝子によって提供される。この宿主細胞が天然にエポチロンを産生する場合、エポチロン誘導体は天然に存在するエポチロン(単数または複数)を含む混合物中で産生される。
【0168】
当業者はまた、本発明の組換えDNA化合物が、エポチロン生合成に含まれる1以上の遺伝子が不活性にされたSorangium宿主細胞を構築するために使用され得ることを認識する。従って、本発明は、本発明のエポチロン誘導体を発現するための好ましい宿主細胞であり得るようなSorangium宿主細胞を提供し、その結果、エポチロンの複雑な混合物が回避される。特に好ましいこの型の宿主細胞として、エポチロンPKS遺伝子ORFのいずれか1以上が破壊されている宿主細胞、および/またはエポチロン改変酵素遺伝子のいずれかまたはそれ以上が破壊されている宿主細胞が挙げられる。このような宿主細胞は、代表的に、変更されるべき遺伝子セグメントに隣接する領域に対して相同でかつ所望される相同な二重交差組換え事象が起こるように配置されるDNAを含むベクターを使用した相同組換えを含むプロセスによって構築される。
【0169】
従って、相同組換えは、遺伝子を欠失、破壊、または変更するために使用され得る。好ましい例示の実施形態において、本発明は、組換えエポチロンを産生するSorangium cellulosum宿主細胞を提供し、この宿主細胞では、epoK遺伝子は本発明の組換えDNAベクターを使用する相同組換えによって欠失されるかまたは破壊されている。epoKエポキシダーゼ遺伝子産物を作製し得ないこの宿主細胞は、エポチロンAおよびBを作製することができず、従ってエポチロンCおよびDの好ましい供給源である。
【0170】
相同組換えはまた、変更されるべきモジュールのモジュールまたはドメインについてコード配列を、所望の特異性のモジュールまたはドメインを特定するコード配列で置換することによってPKSモジュールの特異性を変更するために使用され得る。別の好ましい例示の実施形態において、本発明は、組換えエポチロン産生Sorangium cellulosum宿主細胞を提供し、この宿主細胞では、epoD遺伝子によってコードされたモジュール4のATドメインについてのコード配列は、本発明の組換えDNAベクターを使用する相同組換えによって変更され、マチルマロニルCoAのみを結合するATドメインをコードする。エポチロンA、C、およびEを作製できないこの宿主細胞は、エポチロンB、D、およびFの好ましい供給源である。本発明はまた、エポチロン生合成遺伝子の変更および欠失の両方が行われた組換えSorangium宿主細胞を提供する。例えば、本発明は、上記の変更および欠失の両方が行われた組換えSorangium cellulosum宿主細胞を提供し、エポチロンDのみを作製する宿主細胞を産生する。
【0171】
同様の様式で、当業者は、本発明が、野生型産生細胞が作製するよりも複雑でないエポチロン混合物を作製する広範囲の種々の組換えSorangium cellulosum宿主細胞、および1以上のエポチロン誘導体を作製する宿主細胞を提供することを理解する。このような宿主細胞として、エポチロンA、CおよびEのみを作製する宿主細胞;エポチロンB、D、およびFのみを作製する宿主細胞;エポチロンDのみを作製する宿主細胞;ならびにエポチロンCのみを作製する宿主細胞が挙げられる。
【0172】
別の好ましい実施形態において、本発明は、発現ベクターおよび組換えMyxococcus(好ましくはM.xanthus)、組換えエポチロンPKSまたはエポチロン誘導体についてのPKSを発現する発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。現在、M.xanthus中で染色体外で複製するベクターは公知ではない。しかし、Mx8、Mx9、Mx81、およびMx82を含む、M.xanthus染色体DNA内に組み込むことが公知の多数のファージが存在する。これらのファージの組み込み機能および付着機能は、プラスミド上に配置され、M.xanthus染色体DNA内へ組み込むファージをベースとする発現ベクターを作製する。これらのうち、ファージMx9およびMx8は、本発明の目的のために好ましい。Salmiら、1998年2月、Genetic determinants of immunity and integration of temperate Myxococcus xanthus phage Mx8、J.Bact.180(3):614−621に記載されるプラスミドpPLH343は、E.coli内で複製し、付着機能および組み込み機能をコードするファージMx8遺伝子を含むプラスミドである。
【0173】
エポチロンPKS遺伝子のプロモーターは、Myxococcus xanthus宿主細胞内で機能する。従って、1実施形態において、本発明はSorangium cellulosum エポチロンPKS遺伝子のプロモーターから誘導された組換え宿主細胞中での使用のための組換えプロモーターを提供する。このプロモーターは、1つ以上のエポチロンPKS遺伝子または組換え宿主細胞での別の有用な遺伝子産物の発現を駆動するために使用され得る。本発明はまた、エポチロンPKS発現ベクターを提供し、このベクターでは1つ以上のエポチロンPKSまたはエポチロン改変酵素遺伝子はそれら自体のプロモーターの制御下にある。本発明の組換えPKSを発現する目的のためのMyxococcus xanthus宿主細胞内での使用のための別の好ましいプロモーターは、M.xanthusのpilA遺伝子のプロモーターである。このプロモーター、ならびにpilAプロモーターによって制御された遺伝子からの高レベルの遺伝子産物を発現する2つのM.xanthus株である、pilA欠失株およびpilS欠失株は、WuおよびKaiser,1997年12月、Regulation of expression of the pilA gene in Myxococcus xanthus,J.Bact.179(24):7748−7758に記載され、これは本明細書中において参考として援用される。必要に応じて、本発明は、pilA欠失およびpilS欠失の両方を含む組換えMyxococcus宿主細胞を提供する。別の好ましいプロモーターは、sdcK遺伝子の飢餓依存性プロモーターである。
【0174】
Myxococcus xanthusにおける使用のための選択マーカーとして、カナマイシン耐性付与遺伝子、テトラサイクリン耐性付与遺伝子、クロラムフェニコール耐性付与遺伝子、ゼオシン耐性付与遺伝子、スペクチノマイシン耐性付与遺伝子、およびストレプトマイシン耐性付与遺伝子が挙げられる。Myxococcusにおける使用のための本発明の組換えDNA発現ベクターは代表的に、このような選択マーカーを含み、エポチロンPKSまたはエポチロン改変酵素遺伝子から誘導されたプロモーターをさらに含み得る。
【0175】
本発明は、本発明の組換えMyxococcus xanthus発現ベクターおよび宿主細胞を調製する際に使用するための好ましい発現ベクターを提供する。プラスミドpKOS35−82.1およびpKOS35−82.2(図3)と命名されたこれらのベクターは、E.coli宿主細胞内で複製し得、およびM.xanthusの染色体DNA内に組み込み得る。このベクターは、Mx8の付着遺伝子および組み込み遺伝子、ならびに都合よく下流に配置された制限酵素認識部位を有するpilAプロモーターを含む。この2つのベクターは、ベクター上のpilAプロモーターの配向の点でのみ互いに異なり、本発明のエポチロンPKSおよび改変酵素遺伝子を含むように容易に改変され得る。ベクターの構築は実施例2に記載される。
【0176】
本発明の特に好ましいMyxococcus宿主細胞は、エポチロンまたはエポチロン誘導体またはエポチロンもしくはエポチロン誘導体の混合物を、20mg/L以上、より好ましくは200mg/L以上、そして最も好ましくは1g/L以上で産生する宿主細胞である。これらのレベルで産生するM.xanthus宿主細胞が、特に好ましい。本発明の目的のために用いられ得るM.xanthus宿主細胞としては、DZ1(Camposら,1978,J.Mol.Biol.119:167−178(これは本明細書中で参考として援用される))、TA産生細胞株ATCC31046、DK1219(HodgkinおよびKaiser,1979,Mol.Gen.Genet.171:177−191(本明細書中で参考として援用される))、およびDK1622細胞株(Kaiser,1979,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76:5952−5956(本明細書中で参考として援用される))が挙げられる。
【0177】
別の好ましい実施形態において、本発明は、発現ベクター、ならびにそれらの発現ベクターを含み本発明の組換えPKSを発現する組換えPseudomonas fluorescens宿主細胞を提供する。本発明のP.fluorescens発現ベクターおよび宿主細胞を構築する際に使用するためのプラスミドは、プラスミドpRSF1010であり、これはE.coliおよびP.fluorescens宿主細胞内で複製する(Scholzら、1989、Gene75:271−8(本明細書中において参考として援用される)を参照のこと)。低いコピー数のレプリコンおよびベクターもまた使用され得る。上記のように、本発明はまた、組換え型の形態のSorangium cellulosum エポチロンPKSおよびエポチロン改変酵素遺伝子のプロモーターを提供する。このプロモーターは、P.fluorescens宿主細胞中でのエポチロンPKS遺伝子または他の遺伝子の発現を駆動するために使用され得る。さらに、ソラフェンPKS遺伝子のプロモーターは、Sorangiumプロモーターが機能する任意の宿主細胞内で使用され得る。従って、1実施態様において、本発明は、P.fluorescens宿主細胞内で使用するためのエポチロンPKS発現ベクターを提供する。
【0178】
別の好ましい実施形態において、本発明の発現ベクターは、本発明の組換えPKSを発現する組換えStreptomyces宿主細胞を構築するために使用される。本発明に従って有用であるStreptomyces宿主細胞として、S.coelicolor、S.lividans、S.venezuelae、S.ambofaciens、S.fradiaeなどが挙げられる。本発明の好ましいStreptomyces宿主細胞/ベクターの組み合わせとして、S.coelicolor CH999ならびにS.lividans K4−114およびK4−155宿主細胞(これらはアクチノロジン(actinorhodin)を産生しない)、ならびに米国特許第5,830,750号および1997年3月31日出願の米国特許出願第08/828,898号、および1998年10月28日出願の同第09/181,833号に記載されるようなpRM1およびpRM5ベクターから誘導される発現ベクターが挙げられる。本発明の特に好ましいStreptomyces宿主細胞は、エポチロンまたはエポチロン誘導体またはエポチロンもしくはエポチロン誘導体の混合物を、20mg/L以上、より好ましくは200mg/L以上、そして最も好ましくは1g/L以上で産生する宿主細胞である。これらのレベルで産生するS.coelicolorおよびS.lividans宿主細胞が、特に好ましい。さらに、密接に関連したSaccharopolyspora属の種は、エポチロンを産生するために使用され得、この種としてS.erythraeaが挙げられるがこれらに限定されない。
【0179】
本発明は、Streptomycesにおける使用のための広範な種々の発現ベクターを提供する。複製ベクターについては、複製起点は、例えば、非限定的に、低コピー数レプリコンおよびこれを含むベクター(例えば、SCP2*(Hopwoodら、Genetic Manipulation of Streptomyces:A Laboratory manual(The John Innes Foundation,Norwich,U.K.,1985);Lydiateら、1985,Gene 35:223−235;ならびにKieserおよびMelton、1988,Gene 65:83−91を参照のこと、(これらの各々は本明細書中に参考として援用される))、SLP1.2(Thompsonら、1982,Gene 20:51−62、本明細書中に参考として援用される)、ならびにpSG5(ts)(Muthら、1989、Mol.Gen.Genet.219:341−348、およびBiermanら、1992、Gene 116:43−49、(これらの各々は本明細書中に参考として援用される))または高コピー数レプリコンおよびこれらを含むベクター(例えば、pIJ101およびpJV1(例えば、Katzら、1983、J.Gen.Microbiol.129:2703−2714;Varaら、1989,J.Bacteriol.171:5782−5781;およびServin−Gonzalez、1993、Plasmid 30:131−140、(これらの各々は本明細書中に参考として援用される))であり得る。しかし、高コピー数ベクターは一般的に、大きな遺伝子または複数の遺伝子の発現については好ましくない。非複製ベクターおよび組み込みベクターについては、そして一般的に任意のベクターについては、例えば、pUC、p1P、P1I、およびpBR由来のE.coliの複製起点を少なくとも含むことが有用である。ファージに基づくベクターについては、ファージphiC31およびその誘導体KC515が利用され得る(Hopwoodら、前出、を参照のこと)。プラスミドpSET152、プラスミドpSAM、プラスミドpSE101、およびpSE211(これらのすべてがS.lividansの染色体DNAに部位特異的に組み込まれる)もまた利用され得る。
【0180】
代表的には、発現ベクターは、1つ以上のマーカー遺伝子を含み、それによりこのベクターを含む宿主細胞が同定され得、そして/または選択され得る。Streptomyces宿主細胞における使用について有用な抗生物質耐性付与遺伝子には、ermE(エリスロマイシンおよびリンコマイシンに対する耐性を付与する)、tsr(チオストレプトンに対する耐性を付与する)、aadA(スペクチノマイシン(spectinomycin)およびストレプトマイシンに対する耐性を付与する)、aacC4(アプラマイシン(apramycin)、カナマイシン、ゲンタマイシン、ジェネティシン(G418)、およびネオマイシンに対する耐性を付与する)、hyg(ハイグロマイシンに対する耐性を付与する)、ならびにvph(バイオマイシンに対する耐性を付与する)耐性付与遺伝子が挙げられる。
【0181】
ベクター上の組換えPKS遺伝子は、典型的には、付随(attendant)リボソーム結合部位配列を有するプロモーターの制御下である。好ましいプロモーターは、actIプロモーターおよびその付随のアクチベーター遺伝子actII−ORF4であり、これは、上述のようにpRM1およびpRM5発現ベクターで提供される。このプロモーターは、二次代謝産物が正常に合成される場合、増殖の静止期において活性化される。他の有用なStreptomycesプロモーターとしては、構成的に作用する、ermE遺伝子およびmelC1遺伝子、ならびに任意の増殖期で誘導され得るtipA遺伝子およびmerA遺伝子に由来するプロモーターが挙げられるがこれらに限定されない。さらに、T7 RNAポリメラーゼ系は、Streptomycesに移入され、そして本発明のべクターおよび宿主細胞において利用され得る。この系において、T7 RNAポリメラーゼについてのコード配列は、染色体のニュートラルな部位に挿入されるか、または誘導性merAプロモーターの制御下にあるベクター中に挿入され、そして目的の遺伝子は、T7プロモーターの制御下に配置される。上記のように、1つ以上のアクチベーター遺伝子もまた、プロモーターの活性を高めるために用いられ得る。上記のactII−ORF4遺伝子に加えて、アクチベーター遺伝子は、dnrI遺伝子、redD遺伝子、およびptpA遺伝子(これらは、本発明の組換え遺伝子の発現を駆動するために、それらの同族のプロモーターとともに使用され得る)を含む(米国特許出願番号09/181,833、前出を参照のこと)。
【0182】
本発明はまた、エポチロンPKSの発現を駆動する組換え発現ベクターおよび植物細胞中においてエポチロンまたはエポチロン誘導体を産生するPKS酵素を提供する。このようなベクターは、1998年7月10日に出願された米国特許出願番号09/114,083号、およびPCT特許公開番号99/02669号(これらのそれぞれは、本明細書中で参考として援用される)における教示に従って構築される。エポチロンを発現する植物および植物細胞は、病害抵抗性であり、真菌感染に抵抗し得る。植物、Myxococcus、Pseudomonas、およびStreptomyces宿主細胞を含む、任意の異種宿主細胞におけるエポチロンまたはエポチロン誘導体の改善された産生のために、異種ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼを発現するように細胞が形質転換され得る。1996年10月11日に出願された米国特許出願番号08/728,742号、およびPCT特許公開番号第97/13845号(これら両方は、本明細書中で参考として援用される)を参照のこと。
【0183】
エポチロンまたはエポチロン誘導体PKSをコードする組換え発現ベクターを提供することに加えて、本発明はまた、上記のように、エポチロン改変酵素遺伝子をコードするDNA化合物を提供する。先に議論したように、これらの遺伝子産物は、エポチロンCおよびDをエポチロンAおよびBに変換し、そしてエポチロンAおよびBをエポチロンEおよびFに変換する。本発明はまた、組換え発現ベクターおよびこれらのベクターで形質転換された、これらの遺伝子のうちの任意の1つ以上を発現し、そのようにして対応するエポチロンまたはエポチロン誘導体を産生する宿主細胞を提供する。1つの局面において、本発明は、組換え形態のepoK遺伝子およびこれらの遺伝子酸物を発現する宿主細胞(これは、エポチロンCおよびDをエポチロンAおよびBにそれぞれ変換する)を提供する。
【0184】
別の重要な実施形態において、上記のように、本発明は、epoL、epoKおよびSorangium細胞のエポチロンPKS遺伝子クラスターと関連するORFの任意のうちのいずれか1つ以上の機能を破壊するためのベクターを提供する。本発明はまた、これらの遺伝子の任意の1つ以上を欠く(またはその不活性化された形態を含む)組換えSorangium宿主細胞を提供する。これらの細胞は、これらの遺伝子の任意の1つ以上が存在しないことから生じる、対応するエポチロンおよびエポチロン誘導体を産生するために使用され得る。
【0185】
本発明はまた、組換えエポチロンPKSまたはエポチロン誘導体についてのPKSを含むが、いずれのエポチロン改変酵素遺伝子をも含まない(またはその不活性化された形態で含む)非Sorangium宿主細胞を提供する。本発明のこれらの宿主細胞は、エポチロンCおよびDのC−12−C−13アルケンを形成し得るデヒドラターゼ活性の存在しないエポチロンGおよびHの産生が期待される。この脱水反応は、Streptomyces宿主細胞中のepoL遺伝子産物の不在下で起こると考えられる。宿主細胞は、デヒドラターゼ活性が存在し、P450エポキシダーゼおよびヒドロキシラーゼ(これは、エポチロンAおよびBをエポチロンEおよびFにそれぞれ変換する)の遺伝子が存在しない場合、エポチロンCおよびD(または対応するエポチロンCおよびDの誘導体)を産生する。宿主細胞はまた、ヒドロキシラーゼ遺伝子のみが存在しない場合、エポチロンAおよびB(または対応するエポチロンAおよびBの誘導体)を産生する。これらの宿主細胞における発現について、メチルマロニルCoAのみに特異的なATとのハイブリッドモジュール4を、必要に応じて1つ以上のさらなるハイブリッドモジュールと組み合わせて含む本発明の組換えエポチロンPKS酵素が好ましい。これらの宿主細胞における発現について、マロニルCoAのみに特異的なATとのハイブリッドモジュール4を、必要に応じて1つ以上のさらなるハイブリッドモジュールと組み合わせて含む、本発明の組換えエポチロンPKS酵素が好ましい。
【0186】
本発明の組換え宿主細胞はまた、所望のエポチロンまたはエポチロン誘導体の産生を増加する他の遺伝子および対応する遺伝子産物を含み得る。非制限的な例として、エポチロンPKSタンパク質は、ローディングドメインおよびモジュール2〜9のACPドメインならびにNRPSのPCPドメインのホスホパンテテイニル化(phosphopantetheinylation)を必要とする。ホスホパンテテイニル化は、ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ(PPTase)と呼ばれる酵素によって媒介される。所望のPKS酵素上で作用し得るPPTaseを天然に発現しない宿主細胞において機能的PKS酵素を産生するために、またはPPTaseが律速である宿主細胞における機能的PKSの量を増加させるために、PCT特許公開第97/13845号および同第98/27203号、ならびに1996年10月11日に出願された米国特許出願番号第08/728,742号および同第08/989,332号(これらのそれぞれは、本明細書中で参考として援用される)に記載されるような、Sfpが挙げられるが、これには限定されない異種PPTaseが導入され得る。
【0187】
本発明の宿主細胞は、本発明の化合物を産生するために、他の目的について当該分野で公知の条件下で増殖され得、そして発酵され得る。本発明の化合物は、標準的な手順によって、これらの培養された細胞の発酵ブロスから単離され得、そして精製され得る。Sorangium宿主細胞から本発明の化合物を産生するための発酵条件は、PCT特許公開第93/10121号、同第97/19086号、同第98/22461号、および同第99/42602号(これらのそれぞれは、本明細書中で参考として援用される)に記載されるプロトコールに基づき得る。本発明の新規なエポチロンアナログ、ならびに本発明の宿主細胞によって産生されるエポチロンは、PCT特許公開第93/10121号、同第97/19086号、同第98/08849号、同第98/22461号、同第98/25929号、同第99/01124号、同第99/02514号、同第99/07692号、同第99/27890号、同第99/39694号、同第99/40047号、同第99/42602号、同第99/43653号、同第99/43320号、同第99/54319号、同第99/54319号、同第98/54319号、および同第99/54330号、ならびに米国特許第5,969,145号(これらのそれぞれは、本明細書中で参考として援用される)に記載されるように誘導され得、そして処方され得る。
【0188】
(本発明の化合物)
本発明の好ましい化合物には、以下が挙げられる:14−メチルエポチロン誘導体(マロニルCoAの代わりにメチルマロニルCoAを結合するATを有する本発明のハイブリッドモジュール3の利用によって作られる);8,9−デヒドロエポチロン誘導体(ER、DH、およびKRの代わりにDHおよびKRを有する本発明のハイブリッド6の利用によって作られる);10−メチルエポチロン誘導体(マロニルCoAの代わりにメチルマロニルCoAを結合するATを有する本発明のハイブリッドモジュール5の利用によって作られる);9−ヒドロキシエポチロン誘導体(ER、DH、およびKRの代わりにKRを有する本発明のハイブリッド6の利用によって作られる);8−デスメチル−14−メチルエポチロン誘導体(マロニルCoAの代わりにメチルマロニルCoAを結合するATを有する本発明のハイブリッドモジュール3、およびメチルマロニルCoAの代わりにマロニルCoAを結合するハイブリッドモジュール6の利用によって作られる);および8−デスメチル−8,9−デヒドロエポチロン誘導体(ER、DH、およびKRの代わりにDHおよびKRを有し、ならびにメチルマロニルCoAの代わりにマロニルCoAを特定化するATを有する本発明のハイブリッドモジュール6の利用によって作られる)。
【0189】
より一般的には、本発明の好ましいエポチロン誘導体化合物は、本明細書に記載されるエポチロンPKS遺伝子を改変し、必要に応じて、エポチロン改変酵素の作用によっておよび/またはこの遺伝子が発現された場合に産生される得られたエポチロンを化学的に改変することによって産生され得る化合物である。従って、本発明は、以下の式の化合物:
【0190】
【化9】
(このグリコシル化形態および立体異性体形態(ここで、立体化学は示さない)を含む)を提供し、
ここで、Aは、置換または非置換の直鎖、分枝鎖または環式のアルキル、アルケニルまたはアルキニル残基(必要に応じて、O、SおよびNから選択される1〜3個のヘテロ原子を含む)であるか;あるいはここで、Aは置換または非置換の芳香族残基を含み;
R2は、H,H、またはH,低級アルキル、または低級アルキル,低級アルキルを表し;
X5は、=Oまたはその誘導体、あるいはH,OHまたはH,NR2(ここで、Rは、H、またはアルキル、またはアシルである)を表し、またはH,OCORまたはH,OCONR2(ここで、Rは、Hまたはアルキルである)であるか、またはH,Hであり;
R6は、Hまたは低級アルキルを表し、そして対応する炭素上の残りの置換基は、Hであり;
X7は、OR,NR2(ここで、Rは、H、またはアルキルまたはアシルである)を表すか、あるいはOCOR、またはOCONR2(ここで、Rは、Hまたはアルキルである)であるか、あるいは、X7は、X9と一緒になってカルボネートの環またはカルバメートの環を形成し、そしてここで、対応する炭素上の残りの置換基がHであり;
R8は、Hまたは低級アルキルを表し、この炭素上の残り置換基はHであり;
X9は、=Oまたはその誘導体を表すか、あるいはH,ORまたはH,NR2(ここで、RはH、またはアルキルまたはアシルである)であるか、あるいはH,OCORまたはH,OCONR2である(ここで、Rは、Hまたはアルキルである)か、あるいはH,Hを表すか、あるいはここで、X9は、X7またはX11と一緒になって、環式カルボネートまたはカルバメートを形成し得;
R10は、H,HまたはH,低級アルキル、または低級アルキル,低級アルキルであり;
X11は、=Oまたはその誘導体であるか、あるいは、H,OR、またはH,NR2(ここで、Rは、H、またはアルキルまたはアシルである)であるか、あるいはH,OCORまたはH,OCONR2(ここで、Rは、Hまたはアルキルである)であるか、あるいはH,Hであるか、あるいは、X11は、X9と組み合わせて環式カルボネートまたはカルバメートを形成し得;
R12は、H,H、またはH,低級アルキル、または低級アルキル,低級アルキルであり;
X13は、=Oまたはその誘導体、あるいはH,ORまたはH,NR2(ここで、Rは、H、アルキルまたはアシルである)であるか、あるいはH,OCORまたはH,OCONR2である(ここで、Rは、Hまたはアルキルである);
R14は、H,H、またはH,低級アルキル、または低級アルキル,低級アルキルであり;
R16は、Hまたは低級アルキルであり;そして
ここで、必要に応じてHまたは別の置換基は、12位および13位ならびに/あるいは8位および9位から除去されて二重結合を形成し得、ここで、この2重結合は、必要に応じてエポキシドに変換され得る。
【0191】
以下の式の化合物:
【0192】
【化10】
が特に好ましく、ここで、示された置換基は、上で定義された通りである。
【0193】
以下の式の化合物:
【0194】
【化11】
がとりわけ好ましく、ここで、両方のZがOであるか、または1つのZがNであり、そして他方のZがOであり、そして残りの置換基が上で定義された通りである。
【0195】
本明細書中で使用される場合、「芳香族部分を含む」置換基は、フェニル、ピリジル、ピリミジル、チオフェニル、またはチアゾリルのような少なくとも1つの芳香族環を含む。この置換基はまた、ナフチル、インドリル、ベンゾチアゾリルなどの縮合芳香族残基を含み得る。芳香族部分はまた、非芳香族性の環に縮合し得る、および/または非芳香族性の例えばアルキレン残基を介して、置換基であるこの化合物の残りに結合され得る。芳香族部分は、置換されても置換されていなくてもよく、置換基の残りも同様であり得る。
【0196】
好ましい実施形態のAは、図2に示される「R」基を含む。
【0197】
本明細書中で使用される場合、用語アルキルは、1つの水素原子の除去によって炭化水素部分から誘導される、C1〜C8飽和の、直鎖または分枝鎖の炭化水素ラジカルを示す。アルケニルおよびアルキニルは、対応する不飽和形態を示す。アルキルの例には、以下が挙げられるが、これらには限定されない:メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、n−ブチル、tert−ブチル、ネオペンチル、i−ヘキシル、n−ヘプチル、n−オクチル。低級アルキル(またはアルケニルまたはアルキニル)は、1〜4Cラジカルを示す。メチルが好ましい。アシルは、アルキルCO、アルケニルCOまたはアルキニルCOを示す。
【0198】
本明細書中で使用される場合、用語ハロおよびハロゲンは、フッ素、塩素、臭素、およびヨウ素から選択される原子を示す。本明細書中で使用される場合、用語ハロアルキルは、1、2、また3個のハロゲン原子が任意の1つの炭素に結合されるアルキル基を示し、これには、限定しないが、クロロメチル、ブロモエチル、トリフルオロメチルなどが挙げられる。
【0199】
本明細書中で使用される場合、用語ヘテロアリールは、5〜10個の環原子を有する環式芳香族ラジカルを示し、その1つの環原子がS、OおよびNから選択され;0、1、または2個の環原子が、S、O、およびNから独立して選択されるさらなるへテロ原子であり;そして残りの環原子が炭素であり、このラジカルが任意の環原子を通じてこの分子の残りに接続され、例えば、ピリジル、ピラジニル、ピリミジニル、ピロリル、ピラゾリル、イミダゾリル、チアゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアジアゾリル、オキサジアゾリル、チオフェニル、フラニル、キノリニル、イソキノリニルなどである。
【0200】
用語複素環には、限定しないが、ピロリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、オキサゾリジニル、イソオキサゾリジニル、モルホリニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、およびテトラヒドロフリルが挙げられる。
【0201】
本明細書中で使用される場合、用語「置換される」とは、例えば、Cl、Br、F、I、OH、CN、アルキル、アルコキシ、アリールで置換されるアルコキシ、ハロアルキル、アルキルチオ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、メルカプト、ニトロ、カルボキシアルデヒド、カルボキシ、アルコキシカルボニル、またはカルボキサミドで、水素原子の任意の独立した置換によって置換される基を示す。いずれか1つの置換基は、アリール、ヘテロアリール、またはヘテロシクロアルキル基であり得る。
【0202】
式(1)の2、4、6、8、10、12、14および16位の置換基の性質は、少なくとも初めに、それぞれ、モジュール9、8、7、6、5、4、3、および2のAT触媒ドメインの特異性によって決定されることは明らかである。マロニルCoA、メチルマロニルCoA、エチルマロニルCoA(および一般的に、低級アルキルマロニルCoA)、ならびにヒドロキシマロニルCoAを受容するATドメインが入手可能であるので、これらの位置の置換基の少なくとも1つが、Hであり得、そして他方がH、低級アルキル、特にメチルおよびエチル、またはOHであり得る。これらの位置でのさらなる反応(例えば、エポチロンPKSのモジュール8によって触媒されるようなメチルトランスフェラーゼ反応)はまた、これらの位置でのHを置換するために使用され得る。さらに、H、OHの実施形態は、=Oに酸化され得るか、または隣接環Cとともに脱水されて、π結合を形成し得る。OHおよび=Oの両方が、容易に、さらに以下に記載されるように誘導される。
【0203】
従って、R2、R6、R8、R10、R12、R14およびR16の広範な種々の実施形態は、合成的に入手可能である。上記式(1)に関する定義において記載されるこれらの置換基の実施形態に関して記載される制限は、以下の実施例8におけるSARの説明に記載される情報を反映する。
【0204】
同様に、β−カルボニル改変(または改変なし)は、エポチロンPKS遺伝子クラスターを、活性KR、DHおよび/またはERドメインを含むかまたは含まないエポチロン遺伝子クラスターの対応する位置で適切な配列を含むように、改変することによって、容易に制御され得る。従って、合成的に入手可能なX5、X7、X9、X11およびX13の実施形態は多数であり、これには、隣接する環の位置によるπ−結合の形成が含まれる。
【0205】
OHにより占められる位置は、当該分野に周知の手段により、エーテルまたはエステルに容易に変換される;誘導体化されるべきでない位置でのOHの保護が、要求され得る。さらに、ヒドロキシルは、脱離基(例えば、トシレート)に変換され得、そしてアミノまたはハロ置換基によって置換され得る。上記で議論されるような広範な種々の「ヒドロキシル誘導体」は、当該分野において公知である。
【0206】
同様に、オキソ基を含む環の位置は、「カルボニル誘導体」(例えば、オキシム、ケタールなど)に変換され得る。オキソ部分を有する最初の反応生成物は、さらに反応され得、より複雑な誘導体を得る。実施例8に記載されるように、このような誘導体は、最終的に、2つの環の位置を連結する環状置換基を生じ得る。
【0207】
最初に合成されるポリケチドの改変において有用な酵素(例えば、トランスメチラーゼ、デヒドラターゼ、オキシダーゼ、グリコシル化酵素など)は、このポリケチドが細胞内で合成される場合には、宿主をこれらの改変酵素の生成のための組換え材料を含むように改変することにより、宿主細胞によって内因的に供給され得るか、あるいは精製形態でまたは比較的粗製の抽出物としてのいずれかで、無細胞系に供給され得る。従って、例えば、12〜13位でのπ−結合のエポキシ化は、直接インビトロでepoKのタンパク質産物を使用して行われ得る。
【0208】
Aの特性は、本明細書中以下の実施例6に記載されるような、不活性化されたモジュール1 NRPS(モジュール2基質を用いる)またはKS2ノックアウト(モジュール2基質を用いる)を含むエポチロンPKSを使用することによって最も簡便に制御される。制限されたバリエーションは、ローディングモジュールのAT触媒特性を変えることによって得られ得;さらなるバリエーションは、モジュール1のNRPSを、異なる特性のNRPSと、または従来のPKSモジュールと、置き換えることによって達成される。しかし、現在、改変体は、実施例6に記載されるように、合成モジュール2基質前駆体およびモジュール3基質前駆体を、適切に改変されたエポチロンPKSに供給することによってより容易に調製される。
【0209】
(薬学的組成物)
本化合物は、本発明の薬学的組成物を提供するように容易に処方され得る。本発明の薬学的組成物は、薬学的調製物の形態(例えば、固体、半固体、または液体形態)で使用され得る。この調製物は、1種以上の本発明の化合物を、活性成分として、外部、腸内または非経口的用途に適切な有機または無機のキャリアまたは賦形剤と混合して、含む。この活性成分は、例えば、錠剤、ペレット、カプセル、坐剤、ペッサリー、溶液、エマルジョン、懸濁液、および使用に適切な任意の他の形態のための、通常の非毒性の薬学的に受容可能なキャリアとともに配合され得る。
【0210】
使用され得るキャリアとしては、固体形態、半固体形態、または液状形態の、水、グルコース、ラクトース、アカシアゴム、ゼラチン、マンニトール、デンプンペースト、三ケイ酸マグネシウム、タルク、コーンスターチ、ケラチン、コロイド状シリカ、ジャガイモデンプン、尿素、および調製物を製造する際の用途に適切な他のキャリアが挙げられる。さらに、補助安定化剤、肥厚剤(thickening)、ならびに着色剤および香料が使用され得る。例えば、本発明の化合物は、本質的に米国特許第4,916,138号(本明細書中において参考として援用される)中に記載されるようなヒドロキシプロピルメチルセルロースとともに、または本質的にEPO特許公報第428,169号(本明細書中において参考として援用される)に記載されるような界面活性剤とともに利用され得る。
【0211】
経口投薬形態は、本質的にHondoら、1987、Transplantation Proceedings XIX、補遺6:17〜22(本明細書中において参考として援用される)によって記載されるように調製され得る。外部適用のための投薬形態は、本質的にEPO特許公報第423,714号(本明細書中において参考として援用される)中に記載されるように調製され得る。活性化合物は、疾患のプロセスまたは状態に対する所望の効果を生じるに十分な量で、薬学的組成物中に含まれる。
【0212】
感染、免疫系障害(または免疫機能を抑制するため)、または癌によって引き起こされる状態および疾患の処置のために、本発明の化合物は、従来の非毒性の薬学的に受容可能なキャリア、アジュバントおよびビヒクルを含む投薬量単位処方物において、経口的に、局所的に、非経口的に、吸入スプレーによって、または直腸的に投与され得る。本明細書中で使用される場合、非経口との用語には、皮下注射、ならびに静脈内、鞘内、筋肉内、および胸骨内への注射または注入技術が含まれる。
【0213】
本発明の化合物の投薬量レベルは、1日あたり体重1kgあたり約0.01mg〜約100mg、好ましくは1日あたり体重1kgあたり約0.1mg〜約50mgのオーダーである。この投薬量レベルは、上記状態の処置において有用である(1日あたり1患者あたり約0.7mg〜約3.5mg(70kgの患者を想定))。さらに、本発明の化合物は、周期(intermittent)に基づいて、すなわち半週間隔、週間隔、半月間隔または月間隔で投与され得る。
【0214】
単回投薬形態を生じるようにキャリア物質と組み合わせられ得る活性成分の量は、処置される宿主および特定の投与様式に依存して変化する。例えば、ヒトへの経口投与が意図される処方物は、0.5mg〜5gの活性剤を含み得、これは、キャリア物質の適切かつ都合のよい量(これは、全組成物の約5パーセント〜約95パーセントで変動し得る)とともに配合される。投薬単位形態は、一般には、約0.5mg〜約500mgの活性成分を含む。外部投与のために、本発明の化合物は、例えば0.00001重量%〜60重量%、好ましくは0.001重量%〜10重量%、および最も好ましくは約0.005重量%〜0.8重量%の範囲内で処方され得る。
【0215】
しかし、任意の特定の患者についての特定の用量レベルは、種々の因子に依存することが理解される。これらの因子には、以下が挙げられる:使用される特定の化合物の活性;被験体の年齢、体重、全身の健康状態、性別および常食;投与の時間および経路ならびに薬物の排出の速度;薬物の組合せがその処置において使用されるか否か;ならびに治療が求められる特定の疾患または状態の重篤度。
【0216】
本発明の詳細な説明が上記に提供された。以下の実施例は、本発明の例示の目的のために与えられる。そして本発明の範囲すなわち特許請求の範囲に対する限定として解釈されない。
【0217】
(実施例1)
(コスミドクローンおよびそれらのサブクローンのDNA配列決定)
エポチロン産生株であるSorangium cellulosum SMP44を、セルロース含有培地上で増殖させ(Bollagら、1995、Cancer Research 55:2325−2333(これは、本明細書中で参考として援用される)を参照のこと)、そしてエポチロン産生を、培養上澄のLC/MS分析によって確認した。全DNAを、Jaouaら、1992、Plasmod 28:157−165(これは、本明細書中で参考として援用される)によって記載される手順を用いることによって、この株から調製した。コスミドライブラリーを調製するために、S.cellulosumゲノムDNAを、Sau3AIを用いて部分的に消化させ、そしてBamHI−消化pSupercos(Stratagene)と連結させた。DNAを、製造者によって推奨されるようにλ期においてパッケージングし、次いで、この混合物を使用して、E.coli XL1−Blue MR細胞を感染させた。この手順により、約3,000個の単離されたコロニーを、LB−アンプリコンプレート上に得た。S.cellulosumゲノムのサイズがおよそ107のヌクレオチドであると推定されるので、3000個のコロニー中に存在するこのDNA挿入物は、およそ10個のS.cellulosumゲノムに対応する。
【0218】
このライブラリーをスクリーニングするために、KSドメインの2つのセグメントを使用し、テンプレートとしてSorangium cellulosumゲノムDNAを用いるPCRのためのオリゴヌクレオチドプライマーを設計した。次いで、生成されたフラグメントを、プローブとして使用し、このライブラリーをスクリーニングした。このアプローチを選択した。なぜならば、これは、1ダースを越えるPKS遺伝子についての実験から、KSドメインが、実験されたすべてのPKSドメインのうちで最も高く保存される(アミノ酸レベルで)ことが見出されたからである。従って、産生されたプローブがエポチロンPKS遺伝子を検出し、かつこのライブラリー中に存在する他のPKS遺伝子クラスターを検出することが予測された。DEBSおよびソラフェン(soraphen)PKS遺伝子配列から編集されたケトシンターゼ(KS)ドメイン内の保存領域を用いて合成される2つの変性オリゴヌクレオチドは以下である(変性位置のための標準命名法が使用される):CTSGTSKCSSTBCACCTSGCSTGCおよびTGAYRTGSGCGTTSGTSCCGSWGA。推測されるサイズに対応する、約750bpの単一バンドが、プライマーとしてこれらのオリゴおよびテンプレートとしてS.cellulosum SMP44ゲノムDNAを用いるPCR後に、アガロースゲル中に見出された。このフラグメントを、ゲルから取り出し、そしてpUC118のHincII部位(これは、一本鎖のDNAを作製するための挿入配列を有するpUC118の誘導体である)にクローニングした。E.coliの形質転換後、10個の独立したクローン由来のプラスミドDNAを単離し、そして配列決定した。この分析によって、それぞれ、PKS遺伝子中のKSドメインの共通のセグメントに対応する9つの独特の配列が明らかにされた。9つのうち、3つが、この生物から以前に単離されたポリケチドシンターゼ遺伝子クラスターと同一であり、そしてこのモジュールの分析からエポチロン遺伝子クラスターに属さないことが決定された。残りの6つのKSフラグメントを、ベクターから切り出し、プールし、32Pを用いて末端標識し、そして高いストリンジェンシー条件下でのコスミドライブラリーを含有するコロニーを用いたハイブリダイゼーションにおけるプローブとして使用した。
【0219】
このスクリーニングによって、そのプールしたKSプローブにハイブリダイズされる15個のコスミドを同定した。DNAを、各コスミドから調製し、NotIを用いて消化し、アガロースゲル上で分離し、そしてプローブとしてそのプールしたKSフラグメントを使用するサザンハイブリダイゼーションのために、ニトロセルロース膜に移した。この結果は、これらのコスミドのうちの2つが、KSハイブリダイズ挿入物を含有しないことを明らかにし、13個のコスミドをさらなる分析のために残した。ブロットから標識を除去(stripped)し、そしてよりストリンジェントでない条件下で、DEBS遺伝子クラスターのモジュール4由来のエノイルレダクターゼドメインに対応する配列を含む標識されたDNAを用いてリプローブした。エポチロンPKS遺伝子クラスターが、ERドメインを含む2つの連続したモジュールをコードすることが予測されるので、そしてPKS遺伝子クラスターすべてがERドメイン含有モジュールを有するわけではないので、ERプローブを用いたハイブリダイゼーションは、エポチロンPKS遺伝子クラスター由来の挿入DNAを含むコスミドを同定することが予測された。2つのコスミドは、ERプローブに強くハイブリダイズすることが見出された。1つは、中程度にハイブリダイズされ、そして最後のコスミドは、弱くハイブリダイズされた。NotIフラグメントの制限パターンの分析により、ERプローブで強くハイブリダイズされたこれらの2つのコスミドが互いに重複することが示された。ヌクレオチド配列はまた、T7およびT3プライマー結合部位を用いて、これら13個のコスミドの各々の末端から得られた。すべてが、PKS遺伝子に対する相同性が示す配列を含んだ。ERプローブに対して強くハイブリダイズされたコスミドのうちの1つ由来の配列は、NRPSに対する(特に、NRPSのアデニル化ドメインに対する)相同性を示した。エポチロンのチアゾール部分がアセテートとシステイン分子との間のアミド結合の形成(引き続く環化工程による)から誘導され得ることが推測されたので、ERドメインもまた含むコスミド中のNRPSドメインの存在が、このコスミドがエポチロンPKS遺伝子クラスターの全てまたは一部を含み得るという推定を支持した。
【0220】
12の残りのコスミドの予備制限分析により、3つが目的のコスミドと重複し得ることが示唆された。これを立証するために、オリゴヌクレオチドを、(上記末端配列決定から決定される)4つのコスミドの各々の末端について合成し、そして4つのコスミドDNAの各々を用いるPCRにおけるプライマーセットとして使用した。重複は、非同族(non−cognate)プライマー−テンプレート反応由来のバンドの出現によって示される。この実験の結果により、これらのコスミドのうちの2つがNRPSを含むコスミドと重複することが立証された。3つのコスミドの制限マッピングにより、これらのコスミドが実際には重複することが明らかとなった。さらに、PKS配列は最後の重複フラグメント中の挿入物の末端まで伸長したので、NRPSはクラスターの5’末端にマッピングするという仮定に基づき、この結果はまた、この遺伝子クラスターの3’末端が同定されたクローンの中で単離されていなかったことを示した。
【0221】
エポチロン生合成遺伝子の残りのセグメントを単離するために、PCRフラグメントを、推定遺伝子クラスターの最も3’末端の領域を含むコスミドから産生した。このフラグメントを、プローブとして使用し、再びおよそ3000のコロニーのSorangium cellulosumゲノムDNAの新規の調製されたコスミドライブラリーをスクリーニングした。いくつかのハイブリダイズクローンを、同定した:DNAを、それらのうちの6つから作製した。NotI消化フラグメントの分析により、すべてが重複領域を含むことが示された。最も大きな挿入DNAを含むコスミド(これはまた、プローブを作製するために使用されるコスミドとの最も短い重複を有した)を、さらなる分析のために選択した。
【0222】
制限マップを、図1に示されるように、4つのコスミドについて作製した。コスミドpKOS35−70.8A3の1つの末端から得られた配列は、PKS配列または任意の関連の改変酵素に対して相同性を示さなかった。同様に、コスミドpKOS35−79.85の1つの末端由来の配列もまた、PKS領域に対応する配列を含まなかった。これらの知見は、エポチロンクラスターが4つのコスミド挿入物によって包含される約70kb領域内に含まれるという観察を支持した。
【0223】
このコスミド中の挿入物を配列決定するために、4つのコスミド由来のNotI制限フラグメントの各々を、市販のpBluescriptプラスミドのNotI部位にクローニングした。最初の配列決定を、このクローンの各々の末端において行った。この配列の分析により、完全配列を有する前に、このPKS遺伝子クラスター中の10個のモジュール、ローディングドメインおよび9個のモジュールが存在することの予測が可能となった。
【0224】
配列を、以下のように完全PKSについて得た。13個の非重複NotIフラグメントの各々を、単離し、そして部分的HinPI消化に供した。約2〜4kb長のフラグメントを、アガロースゲルから取り出し、そしてpUC118のAccI部位においてクローニングした。各々の少なくとも4倍の適用範囲を提供するために、NotIフラグメントの各ライブラリー由来の十分なクローンを、配列決定した。NotI部位の各々にわたって配列決定するために、1セットのオリゴ(各NotI部位に対して、1つは5’であり、他方は3’である)を作製し、そして各NotI部位を含んだフラグメントのPCR増幅におけるプライマーとして使用した。この様式で産生された各フラグメントを、クローニングし、そして配列決定した。
【0225】
ヌクレオチド配列を、約72kbに対応する直鎖状セグメントについて決定した。分析は、ローディングドメインおよび9のモジュールを有するPKS遺伝子クラスターを明らかにした。このPKS配列の下流はORF(epoKと示される)であり、これは、シトクロムP450オキシダーゼ遺伝子に対する強い相同性を示し、そしてエポチロンエポキシダーゼをコードする。epoKの15kb下流のヌクレオチド配列もまた、決定した:多数のさらなるORFが同定されたが、任意の公知のデヒドラターゼに対する相同性を示すORFは、同定されなかった。epoL遺伝子は、デヒドラターゼ活性をコードし得るが、この活性は、その代わりに、エポチロンPKS内に存在し得るか、または別の遺伝子によってコードされ得る。
【0226】
このPKS遺伝子は、6つのオープンリーディングフレームに組織化される。ポリペプチドレベルにおいて、ローディングドメインならびにモジュール1、2、および9は、個々のポリペプチドに現れる;これらの対応する遺伝子は、それぞれepoA、epoB、epoCおよびepoFと示される。モジュール3、4、5、および6は、遺伝子がepoDと示される単一のポリペプチドに含まれ、そしてモジュール7および8は、遺伝子がepoEと示される別のポリペプチド上に存在する。epoC、epoD、epoEおよびepoFがオペロンを構成することは、ORF間の間隔から明らかである。epoA、epoB、およびepoK遺伝子はまた、大きなオペロンの一部であり得るが、epoBとepoCとの間には約100bp、そしてepoFとepoKとの間には約115bpの間隔が存在し、これは、プロモーターを含み得る。本発明は、遺伝子間配列を、組換え形態で提供する。少なくとも1つ、しかし潜在的には1つ以上のプロモーターが、エポチロン遺伝子の全てを発現するために、使用される。エポチロンPKS遺伝子クラスターは、以下に概略的に示される。
【0227】
【化12】
モジュールの詳細な試験は、エポチロンの生合成のために使用され得るものと一致する生物および組成物を示す。以下の記載は、ポリペプチドレベルにおいてである。ローディングモジュールならびにモジュール3、4、5、および9におけるATドメインの配列は、マロニルローディングドメインに対するコンセンサス配列との類似性を示し、それぞれC−14、C−12(エポチロンAおよびC)、C−10、およびC−2におけるH側鎖の存在、ならびにローディング領域と一致する。モジュール2、6、7、および8のATドメインは、メチルマロニル特異的ATドメインのコンセンサス配列に類似し、再度、それぞれC−16、C−8、C−6、およびC−4におけるメチル側鎖の存在と一致する。
【0228】
このローディングモジュールはKSドメインを含み、ここで、その活性部位に通常存在するシステイン残基が、チロシンの代わりである。このドメインはKSyと示され、そしてデカルボキシラーゼとして働く(これは、その通常の機能の一部である)が、縮合酵素としては機能し得ない。従って、このローディングドメインは、マロニルCoAを負荷し、それをACPに移動させ、そしてそれを脱カルボキシル化して、システインとの縮合のために必要とされるアセチル残基を得ると、予測される。
【0229】
モジュール1は、非リボソームペプチドシンテターゼであり、これはシステインを活性化し、そしてローディングモジュール上のアセテートとの縮合を触媒する。この配列は、ATP結合ドメインおよびATPaseドメインに高度に類似するセグメントを含み、アミノ酸、ホスホパントテニル化部位、および延長ドメインの活性化のために、必要とされる。データベース検索において、モジュール1は、以前に同定された多数のペプチドシンテターゼに対して、非常に高度な類似性を示す。
【0230】
モジュール2は、C−15〜C−17におけるエポチロンの構造を決定する。モジュール2におけるDHドメインの存在は、この分子のC−16〜17デヒドロ部分を与える。モジュール3におけるドメインは、C−14およびC−15におけるエポチロンの構造と一致する;KRの作用に由来するOHは、この分子のラクトン化に使用される。
【0231】
モジュール4は、C−12およびC−13における構造を制御し、ここで、二重結合がエポチロンCおよびDに見出され、DHドメインの存在と一致する。ATドメインの配列は、マロネート負荷を特異的にするドメインに類似するようであるが、これはまたメチルマロネートをも負荷し得、これによって、天然に発生する生物の発酵ブロスに見出されるエポチロンの混合物を、部分的に説明する。
【0232】
予測した機能のアレイからの有意な逸脱が、モジュール4において見出された。このモジュールは、DHドメインを含み、これによってエポチロンCおよびDの合成をPKSの生成として指向することが予測された。厳密な分析は、モジュール4のATドメインとKRドメインとの間の間隔が、機能的なDHドメインを収容するに十分には大きくないことを明らかにした。従って、モジュール4における還元の程度は、モジュール4により指向される縮合の後に形成されるβケトのケト還元を超えては進行しない。C−12,13不飽和が実証されたので(エポチロンCおよびD)、二重結合を導入するさらなるデヒドラターゼ機能が存在しなければならず、そしてこの機能は、PKS自体の中に存在するか、またはエポチロン生合成遺伝子クラスター中のORF中に存在すると、考えられる。
【0233】
従って、このデヒドラターゼの作用は、このポリケチドの合成の間、または環化が起こった後のいずれかに、起こり得る。前者の場合においては、アシル鎖成長の最後に生成する化合物が、エポチロンCおよびDである。C−12,13脱水が後ポリケチド事象(post−polyketide event)である場合には、完結したアシル鎖が、以下に示すように、C−13においてヒドロキシル基を有する。エポチロンGおよびHの名称は、デヒドラターゼの非存在下で、またはデヒドラターゼの作用の前に生成する、13−ヒドロキシ化合物に割り当てられた。
【0234】
【化13】
エポチロンG(R=H)およびH(R=CH3)。
【0235】
モジュール5および6の各々は、C−11およびC−9におけるメチレン基を得るための、還元ドメイン(KR、DHおよびER)の全セットを有する。モジュール7および9は、C−7およびC−3においてヒドロキシルを得るために、KRドメインを有し、そしてモジュール8は、機能的KRドメインを有さず、C−5におけるケト基の存在と一致する。モジュール8はまた、メチルトランスフェラーゼ(MT)ドメインを含み、この結果として、C−4においてジェミナルジメチル基が存在する。モジュール9は、チオエステラーゼドメインを有し、これは、ポリケチド合成を終結させ、そして閉環を触媒する。エポチロンPKSの遺伝子、タンパク質、モジュール、およびドメインを、本明細書中上記の表に要約する。
【0236】
この配列の検査は、epoAとepoB(ローディングドメインとモジュール1)との間、およびepoCとepoDとの間の、翻訳的結合を明らかにした。非常に小さなギャップが、epoDとepoEとの間、およびepoEとepoFとの間に見られたが、100bpを超えるギャップが、epoBとepoCとの間、およびepoFとepoKとの間に見られた。これらの遺伝子間領域は、プロモーターを含み得る。配列決定の努力は、調節遺伝子の存在を明らかにせず、そしてエポチロン合成がSorangium Cellulosumにおけるオペロン特異的調節によって調節されない可能性がある。
【0237】
エポチロンPKSおよび隣接領域の配列は、以下に示すような単一のコンティーグにまとめられた。
【0238】
【化14】
(実施例2)
(Myxococcus xanthus発現ベクターの構築)
ファージM×8の一体化機能および付着機能を提供するDNAを、市販のpACYC184(New England Biolabs)に挿入した。プラスミドpPLH343由来の約2360bpのMfeI〜SmaI(Salmiら、1998年2月、J.Bact.180(3):614〜621に記載される)を単離し、そしてプラスミドpACYC184の大きなEcoRI〜XmnI制限フラグメントに連結した。このように形成した環状DNAは、大きさが約6kbであり、そしてプラスミドpKOS35−77と呼ばれた。
【0239】
プラスミドpKOS35−77は、エポチロンPKS遺伝子プロモーターの制御下で、本発明の組換えPKS遺伝子を発現するための好都合なプラスミドとして、作用する。1つの例示的な実施形態においては、その相同性プロモーターを有するエポチロンPKS遺伝子全体が、1つ以上のフラグメントとしてプラスミドに挿入され、本発明の発現ベクターを与える。
【0240】
本発明はまた、本発明の組換えPKS遺伝子がMyxococcus xanthusプロモーターの制御下にある、発現ベクターを提供する。例示的なベクターを構築するために、M.xanthusのpilA遺伝子のプロモーターを、PCR増幅産物として単離した。プラスミドpSWU357(これは、pilA遺伝子プロモーターを含み、そしてWuおよびKaiser、1997年12月、J.Bact.179(24):7748〜7758に記載される)を、PCRプライマーSeq1およびMXPillプライマー:
Seq1:5’−AGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGC−3’;および
Mxpill:5’−TTAATTAAGAGAAGGTTGCAACGGGGGGC−3’
と混合し、そして標準的なPCR条件を使用して増幅して、約800bpのフラグメントを得た。このフラグメントを、制限酵素KpnIを用いて切断し、そして市販のプラスミドpLitmus28(New England Biolabs)の大きなKpnI〜EcoRV制限フラグメントに連結した。得られた環状DNAを、プラスミドpKOS35−71Bと示した。
【0241】
プラスミドpKOS35−71B由来のpilA遺伝子のプロモーターを、約800bpのEcoRV〜SnaBI制限フラグメントとして単離し、そしてプラスミドpKOS35−77の大きなMscI制限フラグメントと連結して、約6.8kbの大きさの環状DNAを得た。約800bpのフラグメントは、1つまたは2つのいずれかの方向で挿入し得るので、この連結は同じ大きさの2つのプラスミドを生成し、これらをプラスミドpKOS35−82.1およびpKOS35−82.2と示した。これらのプラスミドの制限部位および機能マップを、図3に与える。
【0242】
プラスミドpKOS35−82.1およびpKOS35−82.2は、本発明のベクターのための好都合な出発材料として働き、ここで、組換えPKS遺伝子が、Myxococcus xanthus pilA遺伝子プロモーターの制御下に置かれる。これらのプラスミドは、このプロモーターの転写開始部位のすぐ下流に位置する、単一のPacI制限酵素認識配列を含む。1つの例示的な実施形態においては、その相同性のプロモーターを有さない全エポチロンPKS遺伝子が、1つ以上のフラグメントとして、そのプラスミドにPacI部位で挿入され、本発明の発現ベクターを与える。
【0243】
これらのプラスミドにおけるpilAプロモーターの配列を、以下に示す。
【0244】
【化15】
本発明の組換えMyxococcus xanthus宿主細胞を作製するために、M.xanthusをCYE培地(CamposおよびZusman、1975、Regulation of development in Myxococcus xanthus:effect of 3’:5’−cyclic AMP,ADP,and nutrition、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 72:518〜522)中で増殖させ、300rpm、30℃で100のKlettとする。他に示さない限り、このプロトコルの残りを、25℃で実施する。次いで、細胞を遠心分離(8000rpmで10分間、SS34またはSA600ローター中)によりペレット化し、そして脱イオン水中に再懸濁させる。これらの細胞を再度ペレット化し、そして最初の容量の1/100に再懸濁させる。
【0245】
DNA(1〜2μL)を、0.1cmキュベット中、室温で、400オーム、25μFD、8.8〜9.4の範囲の時間定数の0.65Vで、細胞中にエレクトロポレーションする。このDNAには塩がないべきであり、従って蒸留水または脱イオン水に再懸濁されるか、あるいは0.025μm Type VS膜(Millipore)で透析されるべきである。低効率のエレクトロポレーションのために、DNAをスポット透析(spot dialyze)し、そしてCYE中で増殖させる。エレクトロポレーションの直後に、1mLのCYEを添加し、そしてこの細胞を、先に50mLエルレンマイアーフラスコに添加したさらなる1.5mLのCYEと共に、キュベット中でプールする(総容量2.5ml)。この細胞を4〜8時間(または一晩)、30〜32℃で300rpmで増殖させ、そして選択マーカーを発現させる。次いで、この細胞を、プレート上のCYE軟質寒天内で選択的にプレートする。カナマイシンが選択マーカーである場合には、代表的な収量は、1μgのDNAあたり103〜105である。ストレプトマイシンが選択マーカーである場合には、これは寒天に結合するので、これは寒天の頂部に含まれなければならない。
【0246】
この手順を用いて、本発明の組換えDNA発現ベクターがMyxococcus宿主細胞にエレクトロポレーションされ、これは、本発明の組換えPKSを発現し、そしてエポチロン、エポチロン誘導体、およびこれによりコードされる他の新規なポリケチドを生成する。
【0247】
(実施例3)
(Myxococcus xanthusにおけるエポチロンの発現のための細菌人工染色体(BAC)の構築)
発酵によりエポチロンを産生するように、異種宿主においてエポチロンPKSおよび改変酵素遺伝子を発現させるために、Sorangium cellulosumに密接に関連し、かつ多くのクローニングベクターが利用可能であるMyxococcus xanthusがまた、本発明の方法に従って使用され得る。M.xanthusおよびS.cellulosumは両方とも粘液細菌であるので、これらは、遺伝子発現、翻訳制御、および翻訳後改変(あるならば)の共通のエレメントを共有し、それによりS.cellulosum由来のepo遺伝子がM.xanthusにおいてエポチロンを産生するように発現され得る可能性を高めるということが予期される。第2に、M.xanthusは、遺伝子のクローニングおよび発現のために開発された。DNAは、エレクトロポレーションにより導入され得、そして多くのベクターおよび遺伝子マーカー(染色体への外来DNAの安定な挿入を可能にするものを含む)が、外来DNAの導入のために利用可能である。最後に、M.xanthusは、発酵槽における複合培地中で比較的容易に増殖され得、そして必要とされる場合には、遺伝子発現を増加させるための操作に供され得る。
【0248】
Myxococcus xanthusにエポチロン遺伝子クラスターを導入するために、本発明のコスミドおよび相同組換えを使用して完全な遺伝子クラスターをアセンブルすることによって、染色体中にエポチロンクラスターを構築し得る。あるいは、完全なエポチロン遺伝子クラスターは細菌人工染色体(BAC)においてクローン化され得、次いで、染色体への組み込みのためにM.xanthusに移動され得る。
【0249】
コスミドpKOS35−70.1A2およびpKOS35−79.85由来の遺伝子クラスターをアセンブルするために、これらのコスミド由来の小さな相同性領域をMyxococcus xanthusに導入して、遺伝子クラスターのより大きな断片のための組換え部位を提供する必要がある。図4に示されるように、プラスミドpKOS35−154およびpKOS90−22を作製して、これらの組換え部位を導入する。M.xanthusの染色体においてエポチロン遺伝子クラスターをアセンブルするためのストラテジーを、図5に示す。最初に、いかなる遺伝子または転写単位をも破壊しない、細菌染色体中の中立部位(neutral site)を選択する。1つのこのような領域は、devS遺伝子の下流であり、これは、M.xanthusの増殖または発生に影響しないことが示されている。第1のプラスミドであるpKOS35−154を、DraIで直鎖化し、そしてM.xanthus中にエレクトロポレーションする。このプラスミドは、エポチロン遺伝子クラスターの2つのフラグメントに隣接する、dev座の2つの領域を含む。epo遺伝子領域間には、カナマイシン耐性マーカーおよびgalK遺伝子が挿入される。相同性領域としてdev配列を使用する二重組換えによって、このDNAをdev領域に組換える場合、コロニーにおいてカナマイシン耐性が生じる。この株K35−159は、pKOS35−79.85の組換えを可能にする、エポチロン遺伝子クラスターの小さな領域を含む。pKOS35−79.85における耐性マーカーは、K35−159についての耐性マーカーと同じであるので、テトラサイクリントランスポゾンをコスミドに転移(transpose)し、そしてカナマイシンマーカー中に挿入されたトランスポゾンを含むコスミドを選択した。このコスミドpKOS90−23を、K35−159にエレクトロポレーションし、そしてオキシテトラサイクリン耐性コロニーを選択して、株K35−174を作製した。コスミド由来の所望されない領域を取り除き、そしてエポチロン遺伝子のみを残すために、細胞を、1%ガラクトースを含有するCYEプレート上にプレートした。galK遺伝子の存在は、細胞を1%ガラクトースに対して感受性にさせる。K35−174のガラクトース耐性コロニーは、組換えによってかまたはgalK遺伝子内の変異によって、galKマーカーを欠損した細胞を表す。組換え事象が生じている場合、ガラクトース耐性株は、カナマイシンおよびオキシテトラサイクリンに対して感受性である。両方の抗生物質に対して感受性である株は、サザンブロット分析により確証される。正しい株を同定し、そしてK35−175と命名する。これは、epoL遺伝子にまたがる2つのオープンリーディングフレームを通してモジュール7由来のエポチロン遺伝子クラスターを含む。
【0250】
モジュール1〜モジュール7を導入するために、上記のプロセスを1回以上繰り返す。プラスミドpKOS90−22をDraIで直鎖化し、そしてK35−175にエレクトロポレーションして、K35−180を作製する。この株を、pKOS35−70.1A2、pKOS90−38のテトラサイクリン耐性バージョンでエレクトロポレーションし、そしてオキシテトラサイクリンに対して耐性であるコロニーを選択する。これは、株K35−185を作製する。ここで、エポチロン遺伝子クラスター全体を有する組換え体を、1%ガラクトースに対する耐性により選択する。これは、株K35−188を生じる。この株は、すべてのエポチロン遺伝子およびすべての潜在的プロモーターを含む。この株を発酵させ、そしてエポチロンAおよびBの産生について試験する。
【0251】
1つのフラグメントとして遺伝子クラスター全体をクローン化するために、細菌人工染色体(BAC)のライブラリーを構築する。最初に、SMP44細胞をアガロースに包埋し、そしてBIO−RAD genomic DNA plugキットにより溶解する。DNAプラグ(plug)を、Sau3AIまたはHindIIIのような制限酵素で部分的に消化し、そしてFIGEまたはCHEFゲルにおいて電気泳動する。DNAフラグメントを、アガロースからDNAを電気溶出することによってか、またはアガロースを分解するためにゲラーゼ(gelase)を使用することによって、単離する。フラグメントを単離するための選り抜きの方法は、Strongら、1997、Nucleic Acids Res.19:3959−3961(本明細書中で参考として援用される)に記載されるような電気溶出である。DNAを、適切な制限酵素で切断したBAC(pBeloBACII)中に連結する。pBeloBACIIのマップを以下に示す。
【0252】
【化16】
DNAを、Shengら、1995、Nucleic Acids Res.23:1990−1996(本明細書中で参考として援用される)の方法によりDH10B細胞内にエレクトロポレーションして、S.cellulosumゲノムライブラリーを作製する。エポチロンクラスターのNRPS領域由来のプローブを使用して、コロニーをスクリーニングする。陽性コロニーを拾い上げ、そして制限分析のためにDNAを単離して、完全な遺伝子クラスターの存在を確認する。この陽性クローンを、pKOS35−178と命名する。
【0253】
pKOS35−178を導入するために使用され得る株を作製するために、プラスミドpKOS35−164を構築する。このpKOS35−164は、dev座に隣接されるエポチロン遺伝子クラスターの上流および下流の相同性領域を含み、そしてプラスミドpKOS90−22およびpKOS35−154と類似したカナマイシン耐性galKカセットを含む。このプラスミドは、K35−183を作製するために、Kafeshiら、1995、Mol.Microbiol.15:483−494の方法に従って、DraIで直鎖化され、そしてM.xanthusにエレクトロポレーションされる。プラスミドpKOS35−178を、エレクトロポレーションによってかまたはバクテリオファージP1での形質導入によって、K35−183に導入し得、そしてクロラムフェニコール耐性コロニーを選択する。あるいは、pRP4由来の接合性転移の起点を含むpKOS35−178のバージョンを、E.coliからK35−183へのDNAの転移のために構築し得る。このプラスミドは、最初に、RP4由来のoriT領域およびpACYC184由来のテトラサイクリン耐性マーカーを含むトランスポゾンを構築すること、次いで、pKOS35−178にインビトロまたはインビボで、このトランスポゾンを転移させることによって作製される。このプラスミドを、S17−1に形質転換し、そしてM.xanthusに接合させた。この株K35−190を、1%ガラクトースの存在下で増殖させて、この第2の組換え事象について選択する。この株は、すべてのエポチロン遺伝子およびすべての潜在的プロモーターを含む。この株を発酵させ、そしてエポチロンAおよびBの産生について試験する。
【0254】
dev座にpKOS35−178を組み込むことに加えて、これはまた、ミクソファージ(myxophage)Mx8またはMx9由来の組み込み機能を使用して、ファージ付着部位に組み込まれ得る。pACYC184由来のテトラサイクリン遺伝子と共に、Mx8またはMx9のいずれかに由来する組み込み遺伝子およびatt部位を含むトランスポゾンを構築する。このトランスポゾンの代替的バージョンは、付着部位のみを有し得る。このバージョンでは、次いで、インテグラーゼ遺伝子を含むか、または任意の構成的プロモーター(例えば、mglプロモーター(Magriniら、1996年7月、J.Bact.181(13):4062−4070(本明細書中で参考として援用される)を参照のこと))から、エレクトロポレーションされた株において発現されるインテグラーゼタンパク質を有するプラスミドの同時エレクトロポレーション(coelectroporation)によって、インテグラーゼ遺伝子がトランスで(in trans)供給される。一旦、トランスポゾンが構築されると、これは、pKOS35−178に転移されて、pKOS35−191を作製する。このプラスミドは、上記のように、Myxococcus xanthusに導入される。この株は、すべてのエポチロン遺伝子およびすべての潜在的プロモーターを含む。この株を発酵させ、そしてエポチロンAおよびBの産生について試験する。
【0255】
一旦、エポチロン遺伝子がMyxococcus xanthusの株において確立されると、遺伝子クラスターの任意の部分の操作(例えば、プロモーターの変化またはモジュールの交換)が、カナマイシン耐性およびgalKカセットを使用して実施され得る。
【0256】
epo遺伝子を含むMyxococcus xanthusの培養物を、多数の培地において増殖させ、そしてエポチロンの産生について試験する。エポチロン(特に、BまたはD)の産生レベルが低すぎて、大規模発酵が可能でない場合、Streptomycesにおける産生を増強することに関して以下に記載されるように、M.xanthus−産生クローンを、培地の開発および株の改善に供する。
【0257】
(実施例4)
(Streptomyces発現ベクターの構築)
本発明は、Streptomyces宿主におけるモジュール型ポリケチドシンターゼ遺伝子の異種発現のための組換え発現ベクターを提供する。これらのベクターは、増殖中の細胞が定常期に入る場合に高レベルでの制御された発現を可能にするために、遺伝子actII ORF4により調節されるactIプロモーターを使用する、発現ベクターを含む。とりわけ、利用可能なベクターは、プラスミドpRM1およびpRM5、ならびにそれらの誘導体(例えば、pCK7)である。これらは、安定な、法線菌類におけるチオストレプトン(thiostrepton)耐性についてのマーカーを保有する低コピー数のプラスミドである。このようなプラスミドは、クローン化されるDNAの長い挿入物に適応し得、そしてS.coelicolorおよびS.lividansにおけるDEBS PKS、S.lividansにおけるピクロマイシンPKS遺伝子、ならびにS.lividansにおけるオレアンドマイシンPKS遺伝子の発現のために使用されている。米国特許第5,712,146号を参照のこと。当業者は、S.lividansが、後期増殖まで、ロイシンについてのTTAコドンを認識するtRNAを作製しないこと、およびより早くタンパク質の産生が所望される場合には、適切なコドン改変がなされ得ることを認識する。
【0258】
【化17】
別のベクターは、プラスミドpSET152の誘導体である。これは、actII ORF4−PactI発現系を含むが、アプラマイシン耐性についての選択マーカーを保有する。これらのベクターは、アクチノファージphiC31のattP部位およびインテグラーゼ遺伝子を含み、そしてStreptomyces宿主において自律的に複製しないが、細胞への導入後に、phiC31の付着部位で、染色体への部位特異的組換えによって組み込む。pCK7およびpSET152の誘導体は、各プラスミドから発現される異なるPKS遺伝子による、ポリケチドの異種産生のために共に使用されてきた。米国特許出願番号60/129,731(1999年4月16日出願、本明細書中で参考として援用される)を参照のこと。
【0259】
【化18】
Streptomycesにおいて機能するエポチロンPKSについての発現ベクターを開発する必要性は、重大である。エポチロン化合物は、現在、緩徐に増殖する、遺伝学的に扱いにくい宿主であるSorangium cellulosumにおいて産生されるか、または合成的に作製される。すべての公知の抗生物質のうちの70%より多くおよび重要な複合ポリケチドを産生するストレプトミセス菌は、エポチロンおよびエポチロン誘導体の産生について優良な宿主である。S.lividansおよびS.Coelicolorは、異種PKS系の発現のために開発されてきた。これらの生物は、クローン化された異種PKS遺伝子を安定的に維持し得、制御された条件下において高レベルでそれらを発現し得、そしてそれらが、自らがコードするポリケチドを産生し得るように、対応するPKSタンパク質を改変(例えば、ホスホパンテテイニル化(phosphopantetheinylation))し得る。さらに、これらの宿主は、ポリケチド合成のために必要とされる基質(例えば、マロニルCoAおよびメチルマロニルCoA)を産生するために必要な経路を含む。広範な種々のクローニングベクターおよび発現ベクターが、これらの宿主について利用可能であり、外来DNAの大きなセグメントの導入および安定な維持のための方法も同様である。緩徐に増殖するSorangium宿主と比較して、S.lividansおよびS.coelicolorは、多くの培地で良好に増殖し、そして発酵槽におけるポリケチドの高レベル産生に適応されている。多くのアプローチが、収率の改善のために利用可能であり、これには、発現率を増加させるための合理的アプローチ、前駆体供給を増加するための合理的アプローチなどが含まれる。ストレプトミセス菌において産生される多数の他のポリケチドについて、ずっと以前に有効と証明された、ポリケチドの力価を増加させるための経験的方法はまた、本発明のエポチロンおよびエポチロン誘導体の産生宿主細胞に使用され得る。
【0260】
異種のStreptomyces宿主における発酵によるエポチロン生成のため、エポチロンPKS(NRPSモジュールを含む)遺伝子をpCK7(モジュール6を通じるローディングドメイン)およびpKOS010−153(モジュール7〜9)の誘導体における2つのセグメントにクローニングする。この2つのプラスミドは、チオストレプトン(thiostrepton)およびアプラマイシン(apramycin)耐性についての選択を使用するS.lividansに導入される。このアレンジメントにおいて、pCK7誘導体は、自律的に複製し、一方pKOS010−153誘導体は、染色体中に組み込まれる。両方のベクターにおいて、エポチロン遺伝子の発現は、プラスミド内に常在するactIプロモーターからである。
【0261】
クローニングを容易にするために、2つのエポチロンPKSコードセグメント(1つはモジュール6を通じるローディングドメイン、そして1つはモジュール7〜9のローディングドメイン)を、eryPKSのモジュール5のKSドメインのN末端セグメントとの翻訳融合物としてクローニングした。第1の翻訳配列としてKSSを使用するこのプロモーターから、高レベル発現が示された(本明細書において参考として援用される、Jacobsenら、1998、Biochemistry 37:4928〜4934を参照のこと)。従来のBsaBI部位は、epoAのKSコード領域およびepoE中のモジュール7のKSコード領域を含む、多くのKSドメインにおいて高度に保存されているアミノ酸配列EPIAVをコードするDNAセグメント内に含まれる。
【0262】
エポチロンPKSのローディングドメインおよびモジュール1〜6の発現ベクターは、pKOS039〜124と名付けられ、そしてモジュール7〜9の発現ベクターは、pKOS039−126と名付けられた。当業者は、他のベクターおよびベクター成分が、等価のベクターを作製するために用いられ得ることを認識する。本発明の好ましい発現ベクター(以下に記載され、そしてpKOS039−124およびpKOS039−126に由来する)は、ブダペスト条約の条項のもとに寄託されているので、プラスミドpKOS039−124およびpKOS039−126の構築の概要のみを以下に提供する。
【0263】
eryKS5リンカーコード配列を、約0.4kb PacI−BglII制限フラグメントとして、プラスミドpKOS10−153からpKOS039−98にクローニングして、プラスミドpKOS039−117を構築した。eryKS5リンカーのコード配列を、コスミドpKOS35−70.1A2由来の約8.7kb EcoRI−XbaI制限フラグメントを、EこRI−XbaIで消化したプラスミドpLItmus28に挿入することにより、エポチロンローディングドメインのコード配列に連結した。得られたプラスミド由来の約3.4kbのBsaBI−NotI制限フラグメントおよび約3.7kbのNotI−HindIII制限フラグメントを、BsaBI−HindIIIで消化したプラスミドpKOS039−117に挿入して、プラスミドpKOS039−120を構築した。プラスミドpKOS039−120の約7kbのPacI−XbaI制限フラグメントをプラスミドpKAO18’に挿入し、プラスミドpKOS039−123を構築した。コスミドpKOS35−70.1A2の約34kbのXbaI−AvrII制限フラグメントを、pKOS039−123の約21.1kbのAvrII−XbaI制限フラグメントと連結することにより、最後のpKOS039−124発現ベクターを構築した。
【0264】
プラスミドpKOS039−126発現ベクターを以下のように構築した。まず、モジュール7のコード配列を、pKOS35−70.4の約6.9kbのBglII−NotI制限フラグメントおよびpKOS35−79.85の約5.9kbのNotI−HindIII制限フラグメントを、BglII−HindIII消化したプラスミドpLitmus28にクローニングすることにより、コスミドpKOS35−70.4およびpKOS35−79.85から連結して、プラスミドpKOS039−119を構築した。コスミドpKOS35−79.85の約12kbのNdeI−NheI制限フラグメントを、NdeI−XbaI消化したプラスミドpKOS039−119にクローニングして、プラスミドpKOS039−122を構築した。
【0265】
eryKS5リンカーコード配列をモジュール7のコード配列と融合するため、コスミドpKOS35−70.4由来の約1kbのBsaBI−BglII制限フラグメントを、BsaBI−BclI消化したプラスミドpKOS039−117にクローニングして、プラスミドpKOS039−121を構築した。プラスミドpKOS039−122由来の約21.5kbのAvrII制限フラグメントを、AvrII−XbaI消化したプラスミドpKOS039−121にクローニングして、プラスミドpKOS039−125を構築した。プラスミドpKOS039−125の約21.8kbのPacI−EcoRI制限フラグメントを、プラスミドpKOS039−44の約9kbのPacI−EcoRI制限フラグメントと連結して、pKOS039−126を構築した。
【0266】
プラスミドpKOS039−124およびpKOS126を、S.lividans K4−114に導入して、引き続き、対応する薬物耐性マーカーについての選択を用いる。プラスミドpKOS039−126は、streptomyces中で自律的に複製しないので、この選択は、このプラスミドがphiC31のattB部位で部位特異的組換えにより染色体に組み込まれた細胞についてである。このプラスミドは、安定に組み込むので、アパラマイシン耐性についての連続する選択は必要ない。所望の場合、選択は維持され得る。培地中のチオストレプトンの存在が維持され、プラスミドpKOS039−124の連続する選択は保証される。プラスミドpKOS039−124およびpKOS039−126をStreptomyces lividans K4−114に形質転換し、そしてこのプラスミドを含む形質転換体を培養して、エポチロンの産生について試験した。最初の試験は、エポチロンの存在を示さない。
【0267】
これらのベクターからのエポチオロンの産生を改善するため、eryKS5リンカー配列をエポチオロンPKS遺伝子コード配列で置換し、そしてこのベクターをStreptomyces coelicolor CH999に導入した。epoA遺伝子コード配列からコード配列のPCRにより増幅するために、以下の2つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いた:
【0268】
【化19】
鋳型DNAをコスミドpKOS35−70.8A3から誘導した。約0.8kbのPCR産物を制限酵素PacIおよびBamHIで消化し、次いでプラスミドpKOS039−120の約2.4kbのBamHI−NotIおよび約6.4kbのPacI−NotI制限フラグメントと連結して、プラスミドpKOS039−136を構築した。epoA、epoB、epoCおよびepoDの遺伝子の発現ベクターを作製するため、プラスミドpKOS039−136の約5kbのPacI−AvrII制限フラグメントを、プラスミドpKOS039−124の約50kbのPacI−AvrII制限フラグメントに連結して、発現プラスミドpKOS039−124Rを構築した。プラスミドpKOS039−124Rは、ブダペスト条約の条項のもとでATCCに寄託されており、そして受託番号_として利用可能である。
【0269】
epoE遺伝子コード配列由来の配列をPCRにより増幅するために、2つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いた:
【0270】
【化20】
鋳型DNAをコスミドpKOS35−70.1A2から誘導した。約0.4kbの増幅産物を、制限酵素PacIおよびAvrIIで消化し、そしてプラスミドpKOS039−126の約29.5kbのPacI−AvrII制限フラグメントまたは、プラスミドpKOS039−125の約23.8kbのPacI−AvrII制限フラグメントのいずれかと連結して、それぞれ、プラスミドpKOS039−126RまたはプラスミドpKOS039−125Rを構築した。プラスミドpKOS039−126Rは、ブダペスト条約の条項のもとでATCCに寄託されており、そして受託番号_として利用可能である。
【0271】
プラスミド対pKOS039−124RおよびpKOS039−126R(ならびにプラスミド対pKOS039−124およびpKOS039−126)は、epoA,epoB、epoC、epoD、epoE、epoF、epoKおよびepoL遺伝子の完全相補物を含む。後者の2つの遺伝子は、プラスミドpKOS039−126R(およびプラスミドpKOS039−126)上に存在する;しかし、これらの遺伝子が高レベルで発現されることを保証するため、本発明の別の発現ベクターであるプラスミドpKOS039−141(図8)を構築した。ここでは、epoK遺伝子およびepoL遺伝子は、ermE*プロモーターの制御下に配置されている。
【0272】
epoK遺伝子配列を、以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用いてPCRにより増幅した:
【0273】
【化21】
epoL遺伝子配列を以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用いてPCRにより増幅した:
【0274】
【化22】
増幅のための鋳型DNAをコスミドpKOS35−79.85から誘導した。PCR産物を、配列分析のためにPCR−スクリプトにサブクローニングした。次いで、epoKおよびepoL遺伝子を、それぞれNdeI−HindIII制限フラグメントおよびHindIII−EcoRI制限フラグメントとしてクローンから単離し、そしてermE*プロモーターを含むプラスミドpKOS039−134Bの約6kbのNdeI−EcoRI制限フラグメントと連結して、プラスミドpKOS039−140を構築した。プラスミドpKOS039−140の約2.4kbのNheI−PstI制限フラグメントをXbaI−PstI消化したプラスミドpSAM−Hyg(ハイグロマイシン耐性を付与する遺伝子を含む、プラスミドpSAM2誘導体)にクローニングして、プラスミドpKOS039−141を構築した。
【0275】
プラスミドpKOS039−126Rの別の改変体を構築して、epoK遺伝子およびepoL遺伝子なしで、発現ベクター上にepoE遺伝子およびepoF遺伝子を提供した。このプラスミドpKOS045−12(図9)は、以下のように構築した。プラスミドpXH106(本明細書中に援用される、J.Bact.1991,173:5573〜5577に記載される)を制限酵素StuIおよびBamHIで消化し、そしてxylEおよびハイグロマイシン耐性を付与する遺伝子を含有する約2.8kbの制限フラグメントを単離し、そしてEcoRV−BglIIで消化したプラスミドpLitmus28にクローニングする。得られたプラスミドの約2.8kbのNcoI−AvrII制限フラグメントを、プラスミドpKOS039−125Rの約18kbのPacI−BspHI制限フラグメントおよびプラスミドpKOS039−42の約9kbのSpeI−PacI制限フラグメントに連結して、プラスミドpKOS045−12を構築した。
【0276】
epoL遺伝子のみを含んだ発現ベクターを構築するために、プラスミドpKOS039−141を、制限酵素NdeIで部分的に消化して、約9kbのNdeI制限フラグメントを単離し、次いで、このフラグメントを連結により環状化してプラスミドpKOS039−150を生じた。
【0277】
次いで、上記の種々の発現ベクターを、種々の組み合わせで、Streptomyces coelicolor CH999およびS.lividans K4−114に形質転換し、この形質転換宿主細胞を、プレート上および液体培養(R5培地、アガーなしのR2YE培地と同一である)中で発酵させた。代表な発酵条件は、以下のとおりである。第1に、50μg/Lのチオストレプトンを含有する約5mLの種培養物(シード培養物)を接種し、そして30℃で2日間増殖させた。次いで、シード培養物の約1〜2mlを用いて、50μg/Lのチオストレプトンおよび1mMのシステインを含有する約50mLの生成培養物に接種し、そして生成培養物を30℃で5日間増殖させた。また、シード培養物を用いて細胞のプレート(このプレートは、10mMプロピオネートを有する生成培養物と同じ培地を含んだ)を調製し、これを30℃で9日間増殖させた。
【0278】
特定のStreptomyces coelicolor培養物および培養ブロスをエポチロンの産生のために分析した。液体培養物を等量の酢酸エチルで3回抽出し、有機抽出物を混合し、そしてエバポレートし、そして残留物をLC/MS分析のためにアセトニトリル中に溶解した。寒天プレート培地を切り取って、そして等量のアセトンで2回抽出し、そしてアセトン抽出物を混合して水性スラリーにエバポレートした。これを等量の酢酸エチルで3回抽出した。有機抽出物を混合して、そしてエバポレートし、そして残留物をLC/MS分析のためにアセトニトリル中に溶解した。
【0279】
エポチロンの産生をLC−質量分析法を用いて評価した。分析用HPLCのUV検出器からのアウトプットフローを、Perkin−Elmer/Sciex API100LC質量分析計とAlltech500エバポレート光散乱検出器との間で等しく分けた。サンプルを水中で平衡化した、4.6×150mmの逆相HPLCカラム(MetaChem 5m ODS−3 Inertsil)上に、1.0mL/分の流速で注入した。UV検出を250nmに設定した。H2Oで1分間、次いで0〜100%アセトニトリルの直線勾配で10分間以上、を用いてサンプル成分を分離した。これらの条件下で、エポチロンAは、10.2分で溶出し、そしてエポチロンBは、10.5分で溶出する。これらの化合物の同一性を、それぞれ、75Vおよび300Vのオリフィス電圧(orifice voltage)およびリング電圧設定、ならびに0.1amuの質量分解能で大気の化学イオン化供給源を用いて得た質量分析により確認した。これらの条件下で、エポチロンAは、494.4amuで[M+H]を示し、ここで、476.4amu、318.3amuおよび306.4amuでフラグメントが観察された。エポチロンBは、508.4amuで[M+H]を示し、ここで、490.4amu、320.3amuおよび302.4amuでフラグメントが観察された。
【0280】
ベクター対pKOS039−124RおよびpKOS039−126Rまたは対pKOS039−124およびpKOS039−126を含む形質転換体は、検出可能な量のエポチロンAおよびBを産生した。これらのプラスミド対およびさらなるプラスミドpKOS039−141を含む形質転換体は、類似の量のエポチロンAおよびBを産生した。このことは、epoKおよびepoL遺伝子のさらなるコピーが、使用される試験条件下では産生に必要ないことを示す。従って、これらの形質転換体は、組換えepoA、epoB、epoC、epoD、epoE、epoF、epoKおよびepoLの遺伝子が存在する場合、エポチロンAおよびBを産生した。いくつかの培養物において、プロピオネートの非存在は、エポチロンAに対するエポチロンBの比を増加させることが観察された。
【0281】
プラスミド対pKOS039−124RおよびpKOS045−12を含む形質転換体は、このプラスミド対およびさらなるプラスミドpKOS039−150を含む形質転換体と同様に、エポチロンCおよびDを産生した。これらの結果は、epoL遺伝子が、C−12−C−13二重結合を形成するために使用される試験条件下では、必要ないことを示した。これらの結果は、エポチロンPKS遺伝子単独が、2重結合を形成し得るか、またはStreptomyces coelicolorが、エポチロンGおよびHをエポチロンCおよびDに転換し得る遺伝子産物を発現するかのいずれかであることを示す。従って、これらの形質転換体は、組換えepoA、epoB、epoC、epoD、epoE、およびepoFの遺伝子が存在する場合、エポチロンCおよびDを産生した。
【0282】
本明細書において記載されるエポチロンPKSの異種発現は、最大タンパク質および組換え宿主細胞において以前に発現された活性酵素複合体の組換え発現を示すと考えられる。エポチロン産生Streptomyces coelicolor形質転換体は、エポチロンPKS遺伝子もしくはそれらの産物またはエポチロンのいずれかが細胞増殖を阻害するか、または細胞に幾分か毒性であることを示す増殖特徴を示した。いずれのこのような阻害または毒性も、細胞中のエポチロンの蓄積に起因し得、そしてネイティブなSorangiumプロデューサー細胞が、事実上細胞外にエポチロンを汲み出すトランスポータータンパク質を含み得ることが考えられる。このようなトランスポーター遺伝子は、epoK遺伝子の下流に配置されるORFの中に含まれると考えられ、そして上記されている。従って、本発明は、この領域中のORFの(全てを含む)1つ以上の産物をコードする組換え遺伝子を含むStreptomycesおよび他の宿主細胞を提供する。
【0283】
例えば、各ORFを、pSAM2−を基礎とするプラスミド中で、ermE*プロモーターの後ろにクローニングし(本明細書中に参考として援用される、Stassiら、1998、Appl.Microbiol.Biotechnol.49:725〜731を参照のこと)、このプラスミドを、Streptomyces coelicolorおよびS.lividansの染色体中に、ファージphiC31のattBとは異なる部位で組み込み得る(本明細書中に参考として援用される、Smokvinaら、1990、Gene 94:53〜59を参照のこと)。ハイグロマイシン耐性遺伝子を運搬するpSAM2を基礎とするベクターを、さらなるクローニング部位に沿ってermE*プロモーターを保有するように改変する。各ORF下流をベクターにクローニングし、次いでこれをハイグロイマイシン選択を使用して宿主細胞(本発明のpKOS039−124RおよびpKOS039−126Rまたは他の発現ベクターも含む)に導入する。epoKの下流に個々の遺伝子のそれぞれを保有するクローンを、エポチロンの産生増加について分析する。
【0284】
さらなる発酵および株の改良の努力を、以下に例証されるように行い得る。種々の構築物におけるPKS遺伝子の発現のレベルを、同じ宿主における類似の発現ベクター中にクローン化された遺伝子から産生した、別の異種PKS mRNA(例えば、ピクロマイシン(picromycin))のレベルに関して、対応するmRNAのレベルを(定量的RT PCRにより)アッセイすることにより測定し得る。エポチロン転写物の1つが、十分に生産されない場合、異なる発現ベクター中に対応するDNAセグメントをクローニングすることにより、その産生を増大させる実験を行う。例えば、1つ以上の遺伝子産物が生合成の速度を律速にする場合に、任意の1つ以上のエポチロンPKS遺伝子の複数のコピーを細胞に導入し得る。低レベルの産生を基準が、低レベルのPKS遺伝子発現に(RNAレベルで)相関しない場合、あらゆる商業的に重要な発酵産物の収量の改善のバックボーンである、経験的な変異誘発、およびスクリーニングアプローチを行う。胞子を、UV、X線、または化学的変異原に供し、そして個々の生存物を、プレーティングおよび釣菌し、そして小規模発酵において産生される化合物のレベルについて試験する。このプロセスを自動化し得るが、試験生物として感受性の菌類であるMucor hiemalisを用いて、数千の単離株を、定量化可能なエポチロン産生について試験し得る。
【0285】
産生したエポチロンの収量を増加させる別の方法は、エポチロンPKSのローディングドメインのKSYドメインをKSQドメインへと変化させることである。このような変化したローディングドメインは、種々の方法のいずれかにおいて構築され得るが、1つの例示的方法は以下である。本発明のプラスミドpKOS39−124Rは、出発物質として都合良く用いられ得る。構築において有用なDNAフラグメントを増幅するために、以下の4つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いる:
【0286】
【化23】
ならびにN39−73およびN39−74(これらは上記に記載される)。N37−73およびN39−83を用いて生成したPCRフラグメント、ならびにN39−74およびN39−84を用いて生成したPCRフラグメントは、それぞれ、制限酵素PacIおよびBamHIを用いて処理され、そしてプラスミドpKOS39−120の約3.1kbのPacI−BamHIフラグメントと連結されて、プラスミドpKOS039−148を構築する。プラスミドpKOS039−148の約0.8kbのPacI−BamHI制限フラグメント(2つのPCR増幅産物を含む)を、プラスミドpKOS39−120の約2.4kbのBamHI−NotI制限酵素フラグメントおよび約6.4kbのPacI−NotI制限酵素フラグメントと連結し、pKOS39−136Qを構築する。プラスミドpKOS039−136Qの約5kbのPacI−AvrII制限フラグメントを、プラスミドpKOS039−124の約50kbのPacI−AvrII制限酵素フラグメントに連結して、プラスミドpKOS39−124Qを構築する。次いで、プラスミドpKOS039−124QおよびpKOS039−126Rを、エポチロン産物のためのStreptomyces coelicolor CH999中に形質転換する。
【0287】
epoA〜epoFの(必要に応じて、epoK、またはepoKおよびepoLと共に)クローン化および発現させた遺伝子は、エポチロン化合物の合成のために十分であり、そしてC−12H〜C−12メチルの同族体の分布は、天然の宿主において見出される分布(A:B::2:1)に類似しているように見える。この割合は、モジュール4のATドメインが、メチルマロニルに特異的なATコンセンサスドメインよりもむしろマロニルのATドメインに非常に類似しているコとを反映する。従って、エポチロンDおよびBは、それらのC−12非メチル化対応物CおよびAよりも低い量で産生される。本発明は、エポチロンDおよび/またはBを独占的に産生するPKS遺伝子を提供する。詳細には、多数の供給源(例えば、ナルボノライドPKS、ラパマイシンPKS、および上記に列挙される他のもの)由来のメチルマロニルCoAに特異的なATドメインを用いて、天然に存在するモジュール4のドメインを置換し得る。この交換を、エポチロンPKSをコードするDNAセグメント中の適切な部位への後継のDNAの直接的クローニングによってか、または相同組換えを介しての遺伝子置換により行う。
【0288】
相同組換えを介しての遺伝子置換のために、交換されるドナー配列を、送達ベクター中の、epoモジュール4のATドメインをコードするDNAに隣接する少なくとも1kbの長さのセグメントの間に配置する。相同領域におけるクロスオーバーにより、送達ベクター中のATドメインとepoAT4ドメインとの交換が生じる。pKOS039−124およびpKOS039−124Rは、AT4コード配列を含むので、これらを、置換のための宿主DNAとして用い得る。隣接するDNAセグメントを、複製のために、温度感受性である多数のE.coliプラスミドのうちの1つにクローン化する。異種ATドメインを、これらのプラスミドにおいて、いくつかのAT交換を同時に行う能力を可能にするカセットとして、相同領域の間に、正確な方向でクローン化し得る。再構築したプラスミド(pKOS039−124*またはpKOS039−124R*)を、エポチロンBの合成を指向する能力について、ならびに/あるいはStreptomyces coelicolorおよび/もしくはS.lividansにおいてpKOS039−126またはpKOS039−126Rと共にこのプラスミドを導入することにより、試験する。
【0289】
ポリケチドの力価は、異なる遺伝子置換を保有する株間で変化し得るので、本発明は、上記のStreptomyces coelicolor宿主において産性したCおよびDの混合物の力価に等しい力価の、エポチロンDの産生を保証するために、多数の異種メチルマロニルCoAに特異的なATドメインを提供する。さらに、ドナー遺伝子のより大きなセグメントを、ATドメインに加えてモジュールの全体に対応する隣接する上流および下流の配列を含む、置換に用い得る。モジュールの全体を置換に用いる場合、KS、メチルマロニルAT、DH、KR、ACPのコードDNAセグメントを、例えば、限定するわけではないが、ラパマイシンPKSの第10のモジュール、またはFK−520 PKSの第1もしくは第5のモジュールをコードする、DNAから獲得し得る。
【0290】
(実施例5)
(EpoKの異種発現、およびエポチロンBへのエポチロンDの転換)
本実施例は、epoKについてのE.coli発現ベクターの構築を記載する。epoK遺伝子産物を、ポリヒスチジンタグ(hisタグ)を有する融合タンパク質としてE.coliにおいて発現させた。この融合タンパク質を精製し、そしてエポチロンDをエポチロンBへと転換するために用いた。
【0291】
プラスミドを、EpoKのアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかに融合した6つのヒスチジン残基から構成される融合タンパク質をコードするように構築した。以下のオリゴを用いて、このプラスミドを構築した:
【0292】
【化24】
テンプレートDNAとしてpKOS35−83.5を含むPCR反応において、アミノ末端hisタグ融合タンパク質であるpKOS55−121をコードするプラスミドを、プライマー55−101.aおよび55−101.bを用いて構築し、そしてカルボキシ末端hisタグをコードするプラスミドであるpKOS55−129を、プライマー55−101.cおよび55−101.dを用いて構築した。プラスミドpKOS35−83.5は、pBluescriptSKII+(Stratagene)へと連結されたepoK遺伝子を含む約5kbのNotIフラグメントを含む。このPCR産物を、制限酵素BamHIおよびNdeIを用いて切断し、そしてpET22b(Invitrogen)のBamHI部位およびNdeI部位へと連結した。両方のプラスミドを配列決定して、変異がPCR増幅の間で導入されていないことを検証した。タンパク質ゲルを、当該分野で公知のように泳動した。
【0293】
EpoKの精製を以下のように行った。プラスミドpKOS55−121およびpKOS55−129を、プラスミドpREP4−groELSを発現するgroELSを含むBL21(DE3)(Caspersら、1994,Cellular and Molecular Biology 40(5):635−644)中に形質転換した。この株を、2mM MgSO4、1%グルコース、20mgチアミン、5mgFeCl2、4mg CaCl2、および50mgレブリン酸を補充した250mLのM9培地中に播種した。この培養物を、0.4〜0.6のOD600まで増殖させ、その時点で、IPTGを1mMになるように添加し、そして培養物をさらに2時間増殖させた。この細胞を収集し、そして−80℃で凍結させた。凍結した細胞を、10mlの緩衝液1(5mMイミダゾール、500mM NaCl、および45mM Tris pH7.6)に再懸濁し、そして設定8で、各15秒間で3回、超音波処理により溶解した。細胞片を、SS−34ローターで16,000rpmにて30分間スピンすることによってペレット化した。上清を取り出し、そして再び、16,000rpmにて30分間スピンした。上清を5mLニッケルカラム(Novagen)へと充填し、その後、このカラムを50mLの緩衝液1(Novagen)を用いて洗浄した。EpoKを5mM〜1Mのイミダゾールの勾配を用いて溶出した。EpoKを含む画分をプールし、そして1Lの透析緩衝液(45mM Tris pH7.6、0.2mM DTT、0.1mM EDTA、および20%グリセロール)に対して2度透析した。アリコートを、液体窒素中で凍結させ、そして−80℃で保存した。このタンパク質調製物は、90%を超える純度であった。
【0294】
EpoKアッセイを以下のように行った(Betlachら、Biochem(1998)37:14937(本明細書中で参考として援用される)を参照のこと)。簡単には、反応は、100μLの容量において、50mM Tris(pH7.5)、21μMホウレンソウフェレドキシン、0.132単位のホウレンソウフェレドキシン:NADP+オキシドレダクターゼ、0.8単位のグルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ、1.4mM NADP、および7.1mM グルコース−6−リン酸、100μMまたは200μMのエポチロンD(S.Danishefskyからの贈与物)、および1.7μMアミノ末端hisタグ化EpoKまたは1.6μMカルボキシ末端hisタグ化EpoKからなる。この反応物を、30℃で67分インキュベートし、そして90℃にて2分間加熱することにより停止させた。不溶性の物質を、遠心分離により取り除き、そして50μLの上清をLC/MSにより分析した。HPLC条件は以下である:Metachem 5μ OSD−3 Inertsil(4.6×150mm);80%H2Oで1分間、次いで1mL/分にて10分間にわたり100%MeCNまで、UV(λmax=250nm)、ELSD、およびMS検出を用いる。これらの条件下で、エポチロンDは、11.6分で溶出し、そしてエポチロンBは、9.3分で溶出した。このLC/MSスペクトルは、1 amuの質量分解能で、それぞれ20Vおよび250Vに設定したオリフィス電圧および環電圧を用いて、大気圧化学的イオン化供給源を使用して得た。これらの条件下で、エポチロンEは、m/z493に[M+H]を示す(405および304にフラグメントが観察される)。エポチロンBは、m/z509に[M+H]を示す(491および320にフラグメントが観察される)。
【0295】
EpoKおよびエポチロンDを含む反応物は、純粋なエポチロンBと、同じ保持時間、分子量、および質量フラグメント化パターンを示した、コントロールにおいて存在しない化合物を含んだ。100μMのエポチロンD濃度にて、アミノ末端hisタグ化EpoKおよびカルボキシ末端hisタグ化EpoKは、それぞれ82%および58%をエポチロンBへと転換し得た。200μMの存在下で、転換は、それぞれ44%および21%であった。これらの結果は、EpoKが、エポチロンDをエポチロンBへと転換し得ることを実証する。
【0296】
(実施例6)
(化学生合成により改変したエポチロン)
本実施例は、化学生合成を介するエポチロン誘導体の産生のためには、本発明により提供される一連のチオエステルを記載する。Sorangium cellulosum由来のエポチロンについての生合成遺伝子クラスターのDNA配列は、PKSのプライミングが、ポリケチドおよびアミノ酸成分の混合物を含むことを示す。プライミングは、マロニルCoAによるローディングドメインのPKS様部分のローディング、続いて脱カルボキシル化、およびシステインによるモジュール1のNRPSのローディング、次いで酵素結合N−アセチルシステインを形成するための縮合を含む。チアゾリンを形成する環化の後に、酵素結合2−メチルチアゾール−4−カルボキシレート(ローディングドメインの産物)およびNRPSを形成させるための酸化が続く。引き続いての、モジュール2のケトシンターゼによるメチルマロニルCoAとの縮合は、以下の線図にしめされるように、モジュールに対する基質を提供する。
【0297】
【化25】
本発明は、PCT特許公開番号99/03986および97/02358において、6−DEBアナログおよびエリスロマイシンアナログを作製するために記載された様式と類似の様式でエポチロン誘導体を産生するための、化学生合成についての方法および試薬を提供する。供給する基質の2つの型として、以下を提供する:NRPS産物のアナログ、およびモジュール3の基質のアナログ。モジュール2の基質を、変異したNRPS様ドメインを有するPKS酵素と共に用い、そしてモジュール3の基質を、モジュール2における変異したKSドメインを有するPKS酵素と共に用いる。
【0298】
以下は、改変型不活化NRPSを有するエポチロンPKSに対する基質として用いるためのモジュール2の基質を(N−アセチルシステアミンチオエステルとして)示す:
【0299】
【化26】
モジュール2の基質を、対応するカルボン酸の活性化、およびN−アセチルシステアミンを用いる処理により調製する。活性化方法は、酸塩化物の形成、混合無水物の形成、またはカルボジイミドのような縮合剤との反応を包含する。
【0300】
例示的なモジュール3の基質(また、KS2ノックアウトを有するエポチロンPKSに対する基質としての使用のためにNAcチオエステルとして)は、以下である:
【0301】
【化27】
これらの化合物は、3工程プロセスで調製される。第1の工程では、適切なアルデヒドを、Wittig試薬または等価物で処理して、置換アクリルエステルを形成する。このエステルを、酸にサポニン化し、次いで、活性化し、N−アセチルシステアミンで処理する。
【0302】
モジュール2基質およびモジュール3基質を作製するための例示的な反応スキームは以下である。エポチロンPKSによるポリケチド合成のための開始物質を作製するのに適切なさらなる化合物を、図2にカルボン酸(または、カルボン酸に転換し得るアルデヒド)として示し、これらは、本発明の宿主細胞に提供するためのN−アシルシステアミドに転換される。
【0303】
(A.チオフェン−3−カルボキシレートN−アセチルシステアミンチオエステル)
2mLの乾燥テトラヒドロフラン中のチオフェン−3−カルボン酸(128mg)の溶液を、不活性雰囲気下でトリエチルアミン(0.25mL)およびジフェニルホスホリルアジド(0.50mL)で処理した。1時間後、N−アセチルシステアミン(0.25mL)を添加し、そして反応を12時間進行させた。その混合物を水に注ぎ込み、そして等量の酢酸エチルで3回抽出した。有機相を合わせて、水、1N HCl、飽和CuSO4、およびブラインで順次洗浄し、次いで、MgSO4で乾燥させ、濾過し、そして減圧下で濃縮した。エーテル、続いて酢酸エチルを使用するSiO2でのクロマトグラフィーは純粋な生成物を提供し、これは静置した際に結晶化した。
【0304】
(B.フラン−3−カルボキシレートN−アセチルシステアミンチオエステル)
2mLの乾燥テトラヒドロフラン中のフラン−3−カルボン酸(112mg)の溶液を、不活性雰囲気下でトリエチルアミン(0.25mL)およびジフェニルホスホリルアジド(0.50mL)で処理した。1時間後、N−アセチルシステアミン(0.25mL)を添加し、そして反応を12時間進行させた。その混合物を水に注ぎ込み、そして等量の酢酸エチルで3回抽出した。有機相を合わせて、水、1N HCl、飽和CuSO4、およびブラインで順次洗浄し、次いで、MgSO4で乾燥させ、濾過し、そして減圧下で濃縮した。エーテル、続いて酢酸エチルを使用するSiO2でのクロマトグラフィーは純粋な生成物を提供し、これは静置した際に結晶化した。
【0305】
(C.ピロール−2−カルボキシレートN−アセチルシステアミンチオエステル)
2mLの乾燥テトラヒドロフラン中のピロール−2−カルボン酸(112mg)の溶液を、不活性雰囲気下でトリエチルアミン(0.25mL)およびジフェニルホスホリルアジド(0.50mL)で処理した。1時間後、N−アセチルシステアミン(0.25mL)を添加し、そして反応を12時間進行させた。その混合物を水に注ぎ込み、そして等量の酢酸エチルで3回抽出した。有機抽出物を合わせて、水、1N HCl、飽和CuSO4、およびブラインで順次洗浄し、次いで、MgSO4で乾燥させ、濾過し、そして減圧下で濃縮した。エーテル、続いて酢酸エチルを使用するSiO2でのクロマトグラフィーは純粋な生成物を提供し、これは静置した際に結晶化した。
【0306】
(D.2−メチル−3−(3−チエニル)アクリレート N−アセチルシステアミンチオエステル)
(1)エチル2−メチル−3−(3−チエニル)アクリレート:乾燥テトラヒドロフラン(20mL)中のチオフェン−3−カルボキシアルデヒド(1.12g)および(カルベトキシエチリデン)トリフェニルホスホラン(4.3g)の混合物を、16時間加熱して還流した。その混合物を周囲温度まで冷却し、そして減圧下で乾燥するまで濃縮した。固体の残渣を1:1エーテル/ヘキサンに懸濁し、そして濾過してトリフェニルホスフィンオキサイドを取り除いた。その濾過物を、1:1のエーテル/ヘキサンを使用して、SiO2のパッドを通して濾過し、淡黄色オイルとして生成物(1.78g、91%)を提供した。
【0307】
(2)2−メチル−3−(3−チエニル)アクリル酸:(1)からのエステルを、メタノール(5ml)と8N KOH(5ml)との混合物中に溶解し、そして30分間加熱して還流した。その混合物を周囲温度まで冷却し、水で希釈し、そしてエーテルで2回洗浄した。水相を、1N HClを使用して酸性化し、次いで等量のエーテルで3回抽出した。有機抽出物を合わせて、MgSO4で乾燥させ、濾過し、そして減圧下で乾燥するまで濃縮した。2:1ヘキサン/エーテルからの結晶化は無色針状の生成物を提供した。
【0308】
(3)2−メチル−3−(3−チエニル)アクリレートN−アセチルシステアミンチオエステル:不活性雰囲気下にある2mLの乾燥テトラヒドロフラン中の2−メチル−3−(3−チエニル)アクリル酸(168mg)の溶液を、トリエチルアミン(0.56mL)およびジフェニルホスホリルアジド(0.45mL)で処理した。15分後、N−アセチルシステアミン(0.15mL)を添加し、そして反応を4時間進行させた。その混合物を水に注ぎ込み、そして等量の酢酸エチルで3回抽出する。有機相を合わせて、水、1N HCl、飽和CuSO4、およびブラインで順次洗浄し、次いで、MgSO4で乾燥させ、濾過し、そして減圧下で濃縮する。酢酸エチルを使用するSiO2でのクロマトグラフィーは純粋な生成物を提供し、これは静置した際に結晶化した。
【0309】
上記の化合物を、本発明の組換えエポチロンPKSを含有する宿主細胞の培養物に供給する。ここでモジュール2のNRPSまたはKSドメインのいずれかが適切に変異によって不活性化されて、本発明の対応するエポチロン誘導体を調製する。
【0310】
(実施例7 Sorangium cellulosum SMP44におけるエポチロンおよびエポチロン誘導体を産生すること)
本発明は、種々の組換えSorangium cellulosum宿主細胞を提供し、その宿主細胞は、天然に存在するエポチロン産生細胞およびエポチロン誘導体を産生する宿主細胞よりも、少ないエポチロンの複合体混合物を産生する。本実施例は、エポチロンAおよびBを産生することなくエポチロンCおよびDのみを産生する株をいかにして作製するかを記載することによって、このような株の構築を例証する。この株を構築するために、不活性化変異を、epoK中で作製する。プラスミドpKOS35−83.5(このプラスミドは、epoK遺伝子を有するNotIフラグメント、Tn5由来のカナマイシンおよびブレオマイシン耐性マーカーを含む)を、epoK遺伝子のScaI部位に連結して、pKOS90−55を構築する。耐性マーカーの方向は、カナマイシンプロモーターで開始される転写が、epoKのすぐ下流の遺伝子の発現を駆動するようなものである。換言すれば、変異は非極性であるべきである。次に、RP4からの複合的な転移の起点であるoriTがpKOS90−55に連結されて、pKOS90−63を作製する。そのプラスミドを、S17−1に導入し得、そしてSMP44に結合し得る。そのトランス結合体を、以前に記載されたようにフレオマイシン(phleomycin)プレート上で選択する。あるいは、プラスミドのエレクトロポレーションを、Myxococccus xanthusについての上記の条件を使用して達成し得る。
【0311】
Myxococccus xanthusについての、3種の一般化された形質転換ファージが存在するので、M.xanthusからSMP44にDNAを転移し得る。最初に、プラスミドpKOS90−55を線状化すること、およびM.xanthusにエレクトロポレーションすることによって、epoK変異をM.xanthus中に構築する。カナマイシン耐性コロニーを選択し、そしてこれはepoKの遺伝子置換を有する。この株は、Mx9、Mx8、Mx4 ts18 hft hrmファージで感染され、ファージ溶解物を作製する。次いで、これらの溶解物は、SMP44に個々に感染し、そしてフレオマイシン耐性コロニーを選択する。一旦その株が構築されたならば、以下に記載するような標準的な発酵手順を利用して、エポチロンCおよびDを産生する。
【0312】
S42培地上でSorangium宿主細胞(分散されている)の新鮮なプレートを調製する。S42培地は、脱イオン水とともに、トリプトン、0.5g/L;MgSO4、1.5g/L;HEPES、12g/L;寒天、12g/Lを含む。S42培地のpHを、KOHで7.4に合わせる。S42培地を調製するために、121℃で少なくとも30分間のオートクレーブ後、以下の成分(1リットルあたり)を添加する:CaCl2、1g;K2HPO4、0.06g;クエン酸Fe、0.008g;グルコース、3.5g;硫酸アンモニウム、0.5g;使用済み液体培地、35mL;そして200マイクログラム/mLのカナマイシンを、コンタミネーションを防ぐために添加する。32℃で4〜7日間、またはオレンジ色のsorangiaが表面に出現するまで、培養物をインキュベートする。
【0313】
寒天プレート/バイオリアクターに接種するための種培養を調製するために、以下のプロトコールに従う。寒天からオレンジ色のSorangium細胞のパッチ(約5mm2)をこすり取り、そして38mmシリコーンフォーム閉合部を備える250mlバッフルフラスコに移す。このフラスコは、ジャガイモデンプン、8g;脱脂ダイズ粗びき粉、2g;酵母抽出物、2g;鉄(III)ナトリウム塩EDTA、0.008g;MgSO4・7H2O、1g;CaCl2・2H2O、1g;グルコース、2g;HEPES緩衝剤、11.5gを含有する、50mlのSoymeal Mediumを含む。脱イオン水を使用して、そして10% KOHでpHを7.4に調整する。2〜3滴の消泡剤Bを添加して、泡立ちを防止する。コフィン振盪機中で30℃、250RPMにて4〜5日間インキュベートする。培養物は、オレンジ色に見えるべきである。この種培養を、スケールアップのために繰り返しサブクローニングして、生産培地の所望の容量に接種し得る。
【0314】
同じ調製物を、(1リットルあたり)CaCl2・2H2O、1g;酵母抽出物、2g;Soytone、2g;FeEDTA、0.008g;MgSO4・7H2O、1g;HEPES、11.5gを含む培地1とともに使用し得る。10% KOHを用いてpHを7.4に調整し、そして121℃で30分間オートクレーブする。滅菌後、8mlの40%グルコースを添加する。バッフルフラスコの代わりに、ホイルカバーを備える250mlの環状スプリングフラスコを使用する。2〜3滴の消泡剤Bを含めて、そしてコフィン振盪機中で37℃、250RPMにて7日間インキュベートする。バッフルを有する細首のFernbachフラスコ(38mmシリコーンフォーム閉合部を備える)中の500mLの新鮮培地に、50mLすべてをサブクローニングする。0.5mlの消泡剤を培養物に含める。同じ条件下で2〜3日間インキュベートする。バイオリアクター発酵のために、少なくとも10%の接種物を使用する。
【0315】
固形培地上での培養のために、以下のプロトコールを使用する。以下を含む寒天プレートを調製する:(CNS培地1リットルあたり)KNO3、0.5g;Na2HPO4、0.25g;MgSO4・7H2O、1g;FeCl2、0.01g;HEPES、2.4g;寒天、15g;および滅菌Whatman濾紙。寒天が完全に凝固しない間に、濾紙の滅菌ディスクを表面に置く。プレートが乾燥したら、ちょうど十分な種培養物を添加して、表面を均質にコートする(約1mL)。滅菌ループまたはアプリケーターを用いて均質に広げ、そして32℃インキュベーター中に7日間配置する。プレートを収集する。
【0316】
5Lバイオリアクター中の生産のために、以下のプロトコールを使用する。発酵を、B.Braun Biostat MD−1 5Lバイオリアクター中で行い得る。4Lの生産培地(HEPES緩衝剤以外は、種培養のためのダイズ粗びき粉培地と同じ)を調製する。洗浄および処理していない2%(v/v)XAD−16吸着樹脂を添加する(例えば、50mL生産培地あたり1mLのXADを添加する)。酸ボトルについては、2.5N H2SO4、塩基ボトルについては、10% KOH、そして消泡剤ボトルについては、50%消泡剤Bを使用する。サンプルポートについては、培養ブロスと接触するチュービングが、小さな開口を有して、XADが日々のサンプルを収集するためにバイアルまで貫通することを可能にすることを確実にする。オートクレーブの前に混合物を完全に攪拌して、成分を均一に分配する。pHプローブを較正し、そして溶存酸素プローブを試験して、正確に機能することを保証する。小さな消泡剤プローブ(約3インチ長)を使用する。ボトルについて、滅菌状態で密着し得るチュービングを使用するが、サンプルポートについてはシリコーンチュービングを使用する。すべてのフィッティングが確実であること、およびそれらのチュービングが、Cクランプを用いて固定されているが、強固過ぎないことを確認する。チュービングは排出コンデンサーに固定しない。0.2μmフィルターディスクを、空気と接触する任意の開口チュービングと接触させる。より長いチュービング(例えば、排出コンデンサーおよび空気入口チュービング)については、より長いACRO50フィルターディスクを使用する。接種のために滅菌した空のボトルを準備する。121℃で90分間の滅菌時間でオートクレーブする。一旦リアクターがオートクレーブの外に持ち出されたならば、チュービングを、それらのそれぞれのポンプヘッドを通して、酸ボトル、塩基ボトル、および消泡剤ボトルに接続する。これらのボトルにクランプを開放し、チュービングが閉じて密着しないことを確認する。温度プローブをコントロールユニットに装着する。低い空気流速で空気入口を通して空気を散布させる間、リアクターを冷却する。
【0317】
ポンプが作動していること、および流速または目詰まりに問題がないことを保証した後、ウォーターバスからのホースをウォータージャケットおよび排出コンデンサーに接続する。ウォータージャケットがほぼ満たされていることを確認する。温度を32℃に設定する。pHプローブ、D.O.プローブ、および消泡剤プローブをメインコントロールユニットに接続する。消泡剤プローブが適切に機能することをテストする。培養物の設定値を7.4に設定する。攪拌を400RPMに設定する。空気および窒素ガスを使用してD.O.プローブを較正する。空気の流れを、発酵が操作される速度(例えば、1 LPM(リットル/分))を使用して調整する。溶存酸素レベルを制御するために、カスケード設定下でパラメーターを調整し、その結果、攪拌が、50%のD.O.値を維持するために空気のより低いレベルを補償する。最小の攪拌および最大の攪拌を、コントロールユニットの設定に基づいて、それぞれ400RPMおよび1000RPMに設定する。必要な場合、設定を調整する。
【0318】
ファーメンターに接種する前にいかなるコンタミネーションについても種培養物をチェックする。Sorangium cellulosum細胞は、細胞の反対の端に2つの大きな別個の環状の液胞を有する、丸剤のような棒状の形態である。長さは、細胞の奥行きの約5倍である。10%接種物(最小)容量(例えば、4Lの生産培地に400mL)を使用する。ベッセルからの最初のサンプルを取り、そしてベンチpHに対してチェックする。ファーメンターpHとベンチpHとの間の違いが0.1単位以上離れている場合、1ポイントの再較正を行う。デッドバンドを0.1に調整する。ファーメンターpH、ベンチpH、温度、D.O.、空気流、攪拌、酸、塩基、および消泡剤のレベルを示す日々の25mLサンプルを取る。必要な場合、pHを調整する。収集の前に、7日間ファーメンターを作動させる。
【0319】
化合物の抽出および分析は、実質的に、上記の実施例4に記載されたように実行する。手短に言えば、発酵培養物を、酢酸エチルで2回抽出し、そして酢酸エチル抽出物を濃縮して乾燥させ、そして約500μLのMeCN−H2O(1:1)中に溶解/懸濁する。そのサンプルを、MeCN−H2O(1:1)であらかじめ平衡化した0.5mLのBakerbond ODS SPEカートリッジにロードする。そのカートリッジを、1mLの同じ溶媒、続いて2mLのMeCNで洗浄する。MeCN溶出物を濃縮して乾燥させ、そして残渣を200μLのMeCNに溶解する。サンプル(50μL)を、Beckman System Gold HPLCおよび大気圧化学イオン化源を備えるPE Sciex API100LCシングルクアドラポールMSベースの検出器から構成されるシステム上のHPLC/MSによって分析する。リング電圧およびオリフィス電圧を、それぞれ75Vおよび300Vに設定し、そしてm/z290−330および450−550からのデュアルレンジマススキャンを使用する。HPLC条件:Metachem 5μ ODS−3 Inertsil(4.6×150mm);100% H2O、1分間、次いで10分間にわたって、1mL/分で100% MeCNにする。エポチロンAは、これらの条件下で0.2分で溶出し、m/z494(M+H)、476(M+H−H2O)、318、および306に特徴的なイオンを与える。
【0320】
(実施例8 抗癌剤としてのエポチロン誘導体)
上記に示す式(1)によって以下に示される新規なエポチロン誘導体は、強力な抗癌剤であり、そして乳癌、卵巣癌、および肺癌を含むがこれらに限定されない種々の形態の癌を有する患者の処置のために使用され得る。
【0321】
チューブリン結合アッセイに基づくエポチロンの構造−活性の関係(Nicolaouら、1997、Angew.Chem.Int.Ed.Engl.36:2097−2103を参照のこと、本明細書中に参考として援用される)は、以下の図によって例証される。
【0322】
【化28】
A)重要な(3S)立体配置;
B)寛容性でない4,4−エタノ基;
C)決定的な(6R、7S)立体配置;
D)重要な(8S)立体配置、8,8−ジメチル基は寛容性でない;
E)チューブリン重合活性に必須でないエポキシド、しかし細胞毒性についてより重要であり得る;エポキシド立体配置は重要であり得る;重要なR基;寛容性である両方のオレフィンジオメトリー;
F)重要な(15S)立体配置;
G)活性を減少させる、よりかさ高い基;
H)寛容性である酸素置換;
I)重要な置換;
J)重要な複素環。
【0323】
従って、このSARは、分子のC1〜C8セグメントの改変が活性に対してより強力な効果を有し得るが、分子の残りの部分は変化に対して比較的寛容性である。C1〜C8セグメントとの置換基の立体化学のバリエーション、または機能性の除去は、活性の有意な損失をもたらし得る。エポチロン誘導体化合物A〜Hは、その分子のより感受性の低い部分における改変によってエポチロンとは異なり、よって良好な生物学的活性を有し、そして、改善された親油性および立体的プロフィールを有する、より良好な薬理動態学的な特性を提供する。
【0324】
これらの新規な誘導体を、エポチロンの生合成、必要に応じて、その後の化学的改変に関与する遺伝子を変化させることによって調製し得る。遺伝子操作によって調製された9−ヒドロキシ−エポチロン誘導体を使用して、塩基の存在下でトリホスジーンまたは1,1’カルボニルジイミダゾールでの処理によって、カーボネート誘導体(化合物D)を生成し得る。同様の様式において、9,11−ジヒドロキシ−エポチロン誘導体は、存在する場合に、C−7ヒドロキシ基の適切な保護に際して、カーボネート誘導体(化合物F)を産生する。ヒドロキシルアミンでの9オキソ−エポチロン誘導体の選択的酸化、その後の還元(水素またはシアノボロハイドライドの存在下でのラネーニッケル)は、9−アミノアナログを産生する。塩基の存在下においてp−ニトロフェニルクロロホルメートで9−アミノ誘導体を反応させること、および引き続いて水素化ナトリウムで反応させることは、カルバメート誘導体(化合物E)を産生する。同様に、存在する場合、C7ヒドロキシル基の適正な保護に際して、カルバメート化合物Gを、9−アミノ−11ヒドロキシ−エポチロン誘導体から調製し得る。
【0325】
例示的な合成を以下に提供する。
【0326】
(パートA.エポチロンD−7,9−環状カーボネート)
丸底フラスコに、5mLの塩化メチレン中の254mgのエポチロンDの溶液を添加する。これをアイスバスによって冷却し、次いで、0.3mLのトリエチルアミンを添加する。この溶液に、104mgのトリホスジーンを添加する。アイスバスを除去し、そして混合物を窒素下で5時間攪拌する。その溶液を、20mLの塩化メチレンで希釈し、そして希炭酸水素ナトリウム溶液で洗浄する。有機溶液を硫酸マグネシウムで乾燥させ、そして濾過する。乾燥のためのエバポレーションに際して、エポチロンD−7,9−環状カルボネートを単離する。
【0327】
(パートB.エポチロンD−7,9−環状カルバメート)
((i)9−アミノ−エポチロンD)
丸底フラスコに、5mLのメタノール中の252mgの9−オキソ−エポチロンDの溶液を添加する。水中の0.5mLの50%ヒドロキシルアミンおよび0.1mLの酢酸の添加に際して、その混合物を室温で一晩攪拌する。次いで、溶媒を減圧下で除去して、9−オキシム−エポチロンDを産生する。5mLのテトラヒドロフラン(THF)中のこの9−オキシム化合物の溶液に、アイスバス中で、THF中のシアノボロヒドリドの1M溶液を0.25mL添加する。その混合物を1時間反応させた後、アイスバスを除去し、そしてその溶液を室温までゆっくりと暖める。1mLの酢酸を添加し、次いで溶媒を減圧下で除去する。残渣を30mLの塩化メチレン中に溶解し、そして飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄する。有機層を分離し、そして硫酸マグネシウムで乾燥させ、そして濾過する。溶媒のエバポレーションに際して、9−アミノ−エポチロンDを産生する。
【0328】
((ii)エポチロンD−7,9−環状カルバメート)
5mLのメチレン中の250mgの9−アミノ−エポチロンDの溶液に、110mgの4−ニトロフェニルクロロホルメートを添加し、その後1mlのトリエチルアミンを添加する。その溶液を室温で16時間攪拌する。これを、25mLの塩化メチレンで希釈する。その溶液を、飽和塩化ナトリウムで洗浄し、そして有機層を分離し、そして硫酸マグネシウムで乾燥させる。濾過後、その溶液を減圧でエバポレートして乾燥させる。その残渣を、10mLの乾燥THF中に溶解する。水素化ナトリウム40mg(鉱油中の60%分散物)を、アイスバス中の溶液に添加する。アイスバスを除去し、そしてその混合物を16時間攪拌する。0.5mLの酢酸を添加し、次いで溶液を減圧でエバポレートして乾燥させる。その残渣を50mLの塩化メチレン中に再溶解し、そして飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄する。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、そしてその溶液を濾過し、そしてその有機溶媒を、減圧下でエバポレートして乾燥させる。シリカゲルカラム上での精製に際し、エポチロンD−7.9−カルバメートを単離する。
【0329】
本発明は、ここで明細書の記載および実施例によって記載されてきたが、当業者は、本発明が種々の実施形態において実施され得ること、および上記の記載および実施例は例示の目的のためであり、以下の特許請求の範囲の限定の目的ではないことを理解する。
【図面の簡単な説明】
【図1】 図1は、エポチロン遺伝子クラスターをスパニングする4つの重複コスミドクローン(8A3、1A2、4、および85と命名され、そしてpKOS35−70.8A3、pKOS35−70.1A2、pKOS35−70.4、およびpKOS35−79.85に対応する)の挿入Sorangium cellulosumゲノムDNAの制限部位地図示す。エポチロン遺伝子クラスターの機能地図もまた示す。ローディングドメイン(Loading、epoA)、非リボソームペプチドシンターゼ(NRPS、Module 1、epoB)モジュール、およびエポチロンシンターゼ遺伝子の残りの8つのモジュールの各モジュール(Module 2〜9、epoC、epoD、epoE、およびepoF)を示し、同様に、シトクロムP450様エポキシ化酵素をコードするepoK遺伝子の位置を示す。
【図2】 図2は、NRPS様モジュール1またはモジュール2KSドメインが新規なエポチロン誘導体を産生するために不活性化された、本発明のエポチロンPKSに供給され得るN−アシルシステアミンチオエステル誘導体までの複数の前駆体化合物を示す。このような化合物を作製するための一般合成手段もまた、示される。
【図3】 図3は、プラスミドpKOS35−82.1およびpKOS35−82.2の制限部位地図および機能性地図を示す。
【図4】 図4は、プラスミドpKOS35−154およびpKOS90−22の制限部位地図および機能性地図を示す。
【図5】 図5は、実施例3に記載されるような、エポチロンPKSおよび改変酵素遺伝子を、Myxococcus xanthus宿主細胞の染色体に導入するためのプロトコルの概略を示す。
【図6】 図6は、プラスミドpKOS39−124およびpKOS039−124Rの制限部位地図および機能性地図を示す。
【図7】 図7は、プラスミドpKOS039−126Rの制限部位地図および機能性地図を示す。
【図8】 図8は、プラスミドpKOS039−141の制限部位地図および機能性地図を示す。
【図9】 図9は、プラスミドpKOS045−12の制限部位地図および機能性地図を示す。
Claims (13)
- 単離された宿主細胞または組換え宿主細胞であって、配列番号2のヌクレオチド1998〜56642に対応するエポチロンポリケチドシンターゼ遺伝子においてコードされるタンパク質、または1もしくは数個のアミノ酸置換、欠失もしくは挿入を有する、該タンパク質の誘導体の発現をコードする核酸を含むが、該細胞は、配列番号2のヌクレオチド56757〜58016に対応するepoK遺伝子においてコードされるタンパク質エポキシダーゼ活性を有する遺伝子産物を発現せず、そして該宿主細胞は、エポチロンBよりも多くのエポチロンDを生成する、宿主細胞。
- 請求項1に記載の細胞であって、
Sorangium細胞であるか、または
Myxococcus細胞であるか、または
Pseudomonas細胞であるか、または
Streptomyces細胞である、
細胞。 - エポチロンDを生成するための方法であって、該方法は、請求項1に記載の細胞を、前記核酸が機能的PKSを生じるように発現される条件下で培養する工程を包含する、方法。
- 請求項2に記載の組換えStreptomyces宿主細胞または組換えMyxococcus宿主細胞であって、Sorangium cellulosumのエポチロンポリケチドシンターゼ(「PKS」)遺伝子を発現し、そして機能的に活性なSorangium cellulosum epoK遺伝子産物を発現せず、必要に応じて、1つ以上の該エポチロンPKS遺伝子を、該細胞の染色体DNA中に組み込んで含むかまたは染色体外発現ベクター中にて含み、該組換え細胞は、エポチロンBよりも多くのエポチロンDを生成する、組換え宿主細胞。
- エポチロンDを生成するための方法であって、請求項4に記載の細胞を培養する工程を包含する、方法。
- 前記細胞が、Sorangium cellulosum epoK遺伝子を含まない、請求項1に記載の細胞。
- 前記核酸が、epoA遺伝子、epoB遺伝子、epoC遺伝子、epoD遺伝子、epoE遺伝子およびepoF遺伝子を含む、請求項1に記載の細胞。
- Streptomyces細胞である、請求項2に記載の細胞。
- Streptomyces細胞である、請求項6に記載の細胞。
- Myxococcus細胞である、請求項2に記載の細胞。
- Myxococcus細胞である、請求項6に記載の細胞。
- Sorangium cellulosum epoK遺伝子を含まない、請求項4に記載の細胞。
- epoA PKS遺伝子、epoB PKS遺伝子、epoC PKS遺伝子、epoD PKS遺伝子、epoE PKS遺伝子およびepoF PKS遺伝子を含む、請求項4に記載の細胞。
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