BR112015002724B1

BR112015002724B1 - Método para produzir um composto não catabólico heterólogo, e, composição de fermentação

Info

Publication number: BR112015002724B1
Application number: BR112015002724-5A
Authority: BR
Inventors: Hanxiao Jiang; Adam Meadows
Original assignee: Total Marketing Services; Amyris, Inc
Priority date: 2012-08-07
Filing date: 2013-08-07
Publication date: 2022-02-01
Also published as: US10927382B2; WO2014025941A1; BR112015002724A2; EP2882856B1; CN104540949A; AU2013299608B2; AU2013299608A1; US20210155939A1; CA2879178C; CA2879178A1; US20150299713A1; EP2882856A1; CN104540949B

Abstract

MÉTODO PARA PRODUZIR UM COMPOSTO NÃO CATABÓLICO HETERÓLOGO, E, COMPOSIÇÃO DE FERMENTAÇÃO A presente revelação refere-se ao uso de um método de alteração para a produção de compostos não catabólicos heterólogos em células hospedeiras microbianas. Em um aspecto, são aqui fornecidos micro-organismos geneticamente modificados que produzem compostos não catabólicos mais estavelmente quando cultivadas em série em condições aeróbicas seguido por condições microaeróbicas e métodos de produzir compostos não catabólicos cultivando os micróbios geneticamente modificados em tais condições de cultura. Em um outro aspecto, são aqui fornecidos micro-organismos geneticamente modificados que produzem compostos não catabólicos mais estavelmente quando cultivados em série na presença de maltose seguido pela redução ou ausência de maltose, e métodos de produzir compostos não catabólicos cultivando os micróbios geneticamente modificados em tais condições de cultura.

Description

1. CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente revelação refere-se ao uso de um promoter responsivo ao oxigênio como um interruptor genético para modular a produção de compostos não catabólicos heterólogos por células hospedeiras geneticamente modificadas.

2. FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[002] O advento da biologia sintética levantou a promessa de produção microbiana fermentativa de biocombustíveis, produtos químicos e biomateriais a partir de fontes renováveis em escala industrial e qualidade. Por exemplo, caminhos biológicos não nativos funcionais foram realizados com êxito em hospedeiros microbianos para a produção de precursores ao medicamento antimalária (ver, por exemplo, Martin et al., Nat Biotechnol 21:796-802 (2003); combustíveis derivados de ácido graxo e produtos químicos (por exemplo, ésteres graxos, álcoois graxos e ceras; ver, por exemplo, Steen et al., Nature 463:559-562 (2010); policetídeo sintases que produzem medicamentos que abaixam o colesterol (ver, por exemplo, Ma et al., Science 326:589-592 (2009); e policetídeos (ver, por exemplo, Kodumal, Proc Natl Acad Sci USA 101:15573-15578 (2004). Entretanto, o sucesso comercial da biologia sintética dependerá amplamente se o custo de produção dos produtos renováveis pode ser competitivo, ou não, com os custos de produção de seus respectivos homólogos não renováveis.

[003] Estabilidade da tensão pode ser um acionador principal do custo das fermentações industriais, uma vez que afeta o tempo que uma fermentação contínua pode ser corrida produtivamente. Estabilidade da tensão geralmente refere-se à capacidade de um micróbio de manter características de produção favoráveis (isto é, alto rendimento (gramas de composto por grama de substrato) e produtividade (gramas por litro de caldo de fermentação por hora)) de um produto de fermentação não catabólica durante períodos de cultivo prolongados. Em particular, estabilidade genética, que é a propensão de produzir população microbiana com pouca ou nenhuma alteração da frequência alélica pretendida de genes relevantes para a produção de produto com o tempo, exerce um papel principal na produção prolongada de produto.

[004] Para fermentação não catabólica de produtos a não ser biomassa (cujos produtos, por definição, consomem energia metabólica e carbono que poderiam de alguma maneira ser usados na produção de mais células), a base da instabilidade é dobrada: mutação e seleção evolucionária. Primeiro, mutações de perda-de-produção surgem espontânea e aleatoriamente. Segundo, uma vantagem da taxa de crescimento ou “adequação” das células com menor rendimento de produto leva a uma varredura da população eventual por pequenos produtores e, assim, diminui o desempenho de cultura geral. Este fenômeno pode ser referido como “degeneração da tensão.”

[005] Fermentações de etanol combustível Brasileiro atingem rendimentos extremamente altos de etanol de açúcar por longos períodos de tempo, isto é, cerca de 90 % de rendimento teórico máximo. Isto é, em parte, em virtude de a produção de etanol ser catabólica: ela gera 2 ATP por molécula de açúcar produzida e é balanceada redox sem o envolvimento de oxigênio. Uma célula que sofre mutação não produz etanol é menos ajustada em condições de pouco oxigênio do fermentador e não varrerá a população. Isto permite que fermentações de etanol industriais reciclem a maioria da biomassa de levedura em toda a estação, minimizando assim a conversão de açúcar em biomassa de célula de levedura e direcionando quase todo o açúcar para a produção de etanol. Esta propagação prolongada e reutilização da biomassa aumenta a eficiência da produção de etanol: gastos operacionais são reduzidos em virtude de menos açúcar ir para a biomassa durante cada ciclo (isto é, o rendimento aumenta); e gastos capitais são reduzidos em virtude de menos e menores fermentadores serem necessários para fabricar biomassa para inoculações.

[006] Ao contrário, a produção de muitos hidrocarbonetos derivados de acetil-CoA (por exemplo, isoprenóides, ácidos graxos e policetídeos) é de natureza geralmente não catabólica; normalmente requer uma entrada de rede de ATP, NADPH, e carbono, frequentemente com grandes quantidades de oxigênio fornecidos para ajudar no equilíbrio redox do sistema. Um ambiente como este faz evolução para produto inferior, biomassa superior rendendo genótipos mais favoráveis e leva a uma maior taxa de degeneração da tensão.

[007] Uma maneira de diminuir a pressão seletiva negativa de produzir produtos não catabólicos é apagar a formação de produto durante períodos onde o produto não é desejado, tais como durante fases da fermentação onde biomassa deve ser gerada, de maneira a maximizar a produtividade do fermentador. Assim, há uma necessidade na tecnologia de interruptores que controlam o cronômetro da produção de compostos derivados de acetil-CoA durante a fermentação.

3. SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[008] Aqui são fornecidos processos de fermentação para produzir um composto não catabólico heterólogo a partir de células hospedeiras geneticamente modificadas. Em algumas modalidades, os processos compreendem duas fases: um estágio de preparo durante o qual produção de composto não catabólico é substancialmente reduzida (o estágio “desligado”), enquanto que biomassa da célula é acumulada; e uma fase de produção, durante a qual produção de composto não catabólico é ligada. Assim, a pressão seletiva negativa associada com produção de composto não catabólico é aliviada durante um estágio de fermentação no qual a produção não é necessária. A redução ou eliminação da produção de composto não catabólico durante o estágio de preparo resulta em (i) uma melhor taxa de crescimento das células durante o estágio de preparo; e (ii) melhor estabilidade de produção da tensão durante o estágio de produção. Isto resulta em produção de composto não catabólico prolongada mais longa, aumentando assim o rendimento e/ou produtividade geral da tensão. Vantajosamente, os estados “desligado” e “ligado” da produção de composto não catabólico nos métodos de fermentação aqui fornecidos são controlados por meio de condições facilmente obtidas, disponíveis e industrialmente relevantes.

[009] Em um aspecto, os estados “desligado” e “ligado” de produção de composto não catabólico na cultura de fermentação são controlados pelos níveis de oxigênio durante fermentação, por exemplo, a quantidade de oxigênio dissolvido no meio de cultura, em conjunto com o uso de promotores sensíveis ao oxigênio que acionam a expressão genética de enzimas de caminho que afetam a produção de composto não catabólico heterólogo. Estes métodos se beneficiam da observação de que oxigênio pode ser fornecido em quantidades limitadas na cultura de células modificadas por engenharia genética para produzir compostos não catabólicos heterólogos. Estas células podem manter o crescimento e viabilidade em condições microaeróbicas, economizando assim custos associados com corrida de um processo de fermentação completamente aeróbico. Em algumas modalidades, condições microaeróbicas podem ser alcançadas, uma vez que a população de célula hospedeira atinge uma densidade suficiente para consumir oxigênio tão rápido quanto o oxigênio é abastecido. Vantajosamente, acoplando expressão genética do caminho aos promotores sensíveis ao oxigênio, produção do composto é ligada somente quando o consumo de oxigênio pela população de célula hospedeira é alto o suficiente para atingir condições microaeróbicas no fermentador, que efetivamente ocorre no final do estágio de preparo, isto é, quando densidades de células ideais foram alcançadas para eficiente produção do composto. Assim, expressão genética do caminho é firmemente acoplada para atingir uma densidade de população que é ideal para o início da fase de produção. Desta maneira, os métodos aqui fornecidos utilizam níveis de oxigênio e um interruptor genético para realizar estágios “desligado” e “ligado” de um melhor processo de fermentação para a produção de compostos não catabólicos heterólogos.

[0010] Assim, é aqui fornecido um método para produzir um composto não catabólico heterólogo em células hospedeiras geneticamente modificadas, o método compreendendo: (a) cultivar uma população de células hospedeiras geneticamente modificadas em um meio de cultura compreendendo uma fonte de carbono em condições aeróbicas, em que a célula hospedeira compreende um ou mais ácidos nucleicos heterólogos que codificam uma ou mais enzimas de um caminho enzimático para o preparo do composto não catabólico heterólogo, em que expressão de uma ou mais enzimas é positivamente regulada pela atividade de um promotor responsivo microaeróbico, em que as condições aeróbicas limitam a quantidade de composto não catabólico heterólogo produzida pelas células hospedeiras; e (b) cultivar a dita população ou uma subpopulação desta em um meio de cultura compreendendo uma fonte de carbono em condições microaeróbicas, em que as ditas condições microaeróbicas aumentam a produção do composto não catabólico pela dita população ou subpopulação desta.

[0011] Em algumas modalidades, o promotor responsivo microaeróbico é um promotor de DAN1 que sofreu mutação. Em algumas modalidades, o promotor de DAN1 que sofreu mutação compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 e 10. Em algumas modalidades, a sequência de promotor de DAN1 que sofreu mutação compreende SEQ ID NO:1. Em algumas modalidades, a sequência de promotor de DAN1 que sofreu mutação compreende SEQ ID NO:2.

[0012] Em algumas modalidades, o promotor responsivo microaeróbico é operavelmente ligado a um ou mais ácidos nucleicos heterólogos que codificam uma ou mais enzimas do caminho enzimático, e as ditas condições microaeróbicas aumentam a expressão de uma ou mais enzimas do caminho enzimático. Em algumas modalidades, o promotor responsivo microaeróbico é operavelmente ligado a um ácido nucleico heterólogo que codifica um regulador transcripcional que positivamente regula a expressão de um ou mais ácidos nucleicos heterólogos que codificam uma ou mais enzimas do caminho enzimático, e as ditas condições microaeróbicas aumentam a expressão do regulador transcripcional. Em algumas modalidades, o regulador transcripcional é Gal4p, e um ou mais ácidos nucleicos heterólogos que codificam uma ou mais enzimas do caminho enzimático são cada operavelmente ligados a um promotor responsivo ao Gal4p selecionado do grupo que consiste em pGALl, pGAL7 e pGALlO. Em algumas modalidades, a célula hospedeira compreende adicionalmente um rompimento funcional de Gal80p.

[0013] Em algumas modalidades, as condições microaeróbicas compreendem uma concentração de oxigênio dissolvido no meio de cultura de menos que cerca de 20 %, menos que cerca de 15 %, menos que cerca de 10 %, ou menos que cerca de 5 %. Em algumas modalidades, as condições microaeróbicas compreendem uma concentração de oxigênio dissolvido no meio de cultura de cerca de 0 %. Em algumas modalidades, as condições microaeróbicas resultam em uma taxa de absorção de oxigênio das células hospedeiras de menos que cerca de 50 mmols, menos que cerca de 40 mmols, menos que cerca de 30 mmols, menos que cerca de 20 mmols por litro de meio, ou menos que cerca de 10 mmols por litro de meio. Em algumas modalidades, as condições microaeróbicas resultam em uma taxa de absorção de oxigênio específica das células hospedeiras de menos que cerca de 30 mmols, menos que cerca de 25 mmols, menos que cerca de 20 mmols, menos que cerca de 15 mmols, menos que cerca de 10 mmols, ou menos que cerca de 5 mmols por grama de peso de célula seco por hora.

[0014] Em algumas modalidades, produção de composto não catabólico heterólogo pela população das células hospedeiras geneticamente modificadas pela duração da cultura da etapa (b) é melhorada comparada à alcançada em um processo de fermentação aeróbico em que a expressão de uma ou mais enzimas do caminho enzimático não é limitada pela atividade do promotor responsivo microaeróbico.

[0015] Também é fornecido aqui um método para produzir um isoprenóide heterólogo em células hospedeiras geneticamente modificadas, o método compreendendo: (a) cultivar uma população de células hospedeiras geneticamente modificadas em um meio de cultura compreendendo uma fonte de carbono em condições aeróbicas, em que a célula hospedeira compreende: (i) um ou mais ácidos nucleicos heterólogos que codificam uma ou mais enzimas do caminho de mevalonato (MEV), cada um operavelmente ligado a um promotor responsivo ao Gal4p selecionado do grupo que consiste em pGALl, pGAL7 e pGALlO; e (ii) um ácido nucleico que codifica Gal4p, operavelmente ligado a um promotor responsivo microaeróbico; em que as condições aeróbicas limitam a quantidade de isoprenóide heterólogo produzida pelas células hospedeiras; e (b) cultivar a dita população ou uma subpopulação desta em um meio de cultura compreendendo uma fonte de carbono em condições microaeróbicas, em que as ditas condições microaeróbicas aumentam a produção de isoprenóide heterólogo pela dita população ou subpopulação desta.

[0016] Em um outro aspecto, os estados “desligado” e “ligado” de produção de composto não catabólico na cultura de fermentação são controlados pela quantidade do açúcar maltose no meio de cultura, em conjunto com o uso de promotores responsivos à maltose que regulam s expressão genética de enzimas de caminho que efetuam a produção de composto não catabólico heterólogo. Vantajosamente, acoplando a expressão genética do caminho aos promotores sensíveis à maltose, produção do composto pode ser ligada e desligada controlando a quantidade de maltose na matéria-prima. Por exemplo, um promotor responsivo à maltose pode ser ligado como uma tomada “ligada” para induzir a produção do composto não catabólico heterólogo na presença de maltose. Altemativamente um promotor responsivo à maltose pode ser ligado como uma tomada “desligada” para induzir a expressão de um regulador negativo do caminho enzimático para a produção do composto na presença de maltose. Desta maneira, os métodos aqui fornecidos utilizam níveis de maltose no meio de cultura e um interruptor genético para realizar os estágios “desligado” e “ligado” de um processo de fermentação melhorado para a produção de compostos não catabólicos heterólogos.

[0017] Assim, aqui é fornecido um método para produzir um composto não catabólico heterólogo em células hospedeiras geneticamente modificadas, o método compreendendo: (a) cultivar uma população de células hospedeiras geneticamente modificadas em um meio de cultura compreendendo uma fonte de carbono compreendendo maltose, em que a célula hospedeira compreende um ou mais ácidos nucleicos heterólogos que codificam uma ou mais enzimas de um caminho enzimático para o preparo do composto não catabólico heterólogo, em que a expressão de uma ou mais enzimas é negativamente regulada pela atividade de um promotor responsivo à maltose, em que a presença de maltose no meio de cultura limita a quantidade de composto não catabólico heterólogo produzida pelas células hospedeiras; e (b) cultivar a dita população ou uma subpopulação desta em um meio de cultura compreendendo uma fonte de carbono em que maltose é ausente ou em quantidades suficientemente baixas, de maneira tal que o promotor responsivo à maltose não seja mais ativo, e produção do composto não catabólico heterólogo pelas células hospedeiras é aumentada.

[0018] Em algumas modalidades, o promotor responsivo à maltose é operavelmente ligado a um ácido nucleico heterólogo que codifica um regulador transcripcional que negativamente regula a expressão de um ou mais ácidos nucleicos heterólogos que codificam uma ou mais enzimas do caminho enzimático, e a maltose na etapa (a) aumenta a expressão do regulador transcripcional. Em algumas modalidades, o regulador transcripcional é Gal80p, a célula hospedeira compreende adicionalmente Gal4p, e um ou mais ácidos nucleicos heterólogos que codificam uma ou mais enzimas do caminho enzimático são cada uma operavelmente ligadas a um promotor responsivo ao Gal4p selecionado do grupo que consiste em pGALl, pGAL7 e pGALlO. Em algumas modalidades, o promotor responsivo à maltose compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste em pMALl (SEQ ID NO: 12), pMAL2 (SEQ ID NO: 13), pMALll (SEQ ID NO: 14), pMAL12 (SEQ ID NO: 15), pMAL31 (SEQ ID NO: 16) e pMAL32 (SEQ ID NO: 17). Em algumas modalidades, o promotor responsivo à sequência de maltoses compreende pMAL32 (SEQ ID NO: 17).

[0019] Em algumas modalidades, o meio de cultura da etapa (a) compreende pelo menos 0,1 % (p/v) maltose. Em algumas modalidades, o meio de cultura da etapa (a) compreende 0,25 % a 3 % (p/v) maltose. Em algumas modalidades, o meio de cultura da etapa (b) compreende não mais que 0,08 % (p/v) de maltose. Em algumas modalidades, produção de composto não catabólico heterólogo pela população de células hospedeiras geneticamente modificadas pela duração da cultura da etapa (b) é melhorada comparada à alcançada em um processo de fermentação em que a expressão de uma ou mais enzimas do caminho enzimático não é limitada pela atividade do promotor responsivo à maltose.

[0020] Também é aqui fornecido um método para produzir um isoprenóide heterólogo em células hospedeiras geneticamente modificadas, o método compreendendo: (a) cultivar uma população de células hospedeiras geneticamente modificadas em um meio de cultura compreendendo uma fonte de carbono compreendendo maltose, em que a célula hospedeira compreende: (i) um ou mais ácidos nucleicos heterólogos que codificam uma ou mais enzimas do caminho de mevalonate (MEV), cada uma operavelmente ligada a um promotor responsivo ao Gal4p selecionado do grupo que consiste em pGALl, pGAL7 e pGALlO; (ii) um ácido nucleico que codifica Gal4p; e (iii) um ácido nucleico que codifica Gal80p, operavelmente ligado a um promotor responsivo à maltose; em que a maltose no meio de cultura limita a quantidade de isoprenóide heterólogo produzida pelas células hospedeiras; e (b) cultivar a dita população ou uma subpopulação desta em um meio de cultura compreendendo uma fonte de carbono em que maltose está ausente ou em quantidades suficientemente baixas, de maneira tal que o promotor responsivo à maltose não seja mais ativo, e produção do composto não catabólico heterólogo pelas células hospedeiras é aumentada.

[0021] Em algumas modalidades, a produção do composto não catabólico durante etapa (a) dos métodos aqui descritos é menos que 50, 40, 30, 20 ou 10 % da produção do composto não catabólico durante a etapa (b). Em algumas modalidades, a cultura da etapa (a) é por um período de pelo menos 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96 ou mais que 96 horas. Em algumas modalidades, a cultura da etapa (a) é por um período de tempo suficiente para a dita população atingir uma densidade celular (ODÓOO) entre 0,01 e 400. Em algumas modalidades, a cultura da etapa (b) é por um período de 3 a 20 dias. Em algumas modalidades, a produção do composto não catabólico é medida em termos de rendimento (grama de composto não catabólico produzido por grama de substrato de carbono) ou produtividade (gramas de composto não catabólico produzido por litro de meio de cultura por hora). Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente recuperar o composto não catabólico.

[0022] Em um outro aspecto, são fornecidas aqui composições de fermentação produzidas pelos métodos de fermentação aqui descritos. Em algumas modalidades, a composição de fermentação compreende uma população de células hospedeiras geneticamente modificadas em um meio de cultura compreendendo uma fonte de carbono, em que a célula hospedeira compreende um ou mais ácidos nucleicos heterólogos que codificam uma ou mais enzimas de um caminho enzimático para o preparo do composto não catabólico heterólogo, em que a expressão de uma ou mais enzimas é positivamente regulada pela atividade de um promotor responsivo microaeróbico. Em algumas modalidades, o promotor responsivo microaeróbico é operavelmente ligado a um ou mais ácidos nucleicos heterólogos que codificam uma ou mais enzimas do caminho enzimático, em que a expressão de uma ou mais enzimas de um caminho enzimático é aumentada em condições de fermentação microaeróbicas. Em algumas modalidades, o promotor responsivo microaeróbico é operavelmente ligado a um ácido nucleico heterólogo que codifica um regulador transcripcional que positivamente regula a expressão de um ou mais ácidos nucleicos heterólogos que codificam uma ou mais enzimas do caminho enzimático, em que a expressão do regulador transcripcional é aumentada em condições de fermentação microaeróbicas. Em algumas modalidades, o regulador transcripcional é Gal4p, e um ou mais ácidos nucleicos heterólogos que codificam uma ou mais enzimas do caminho enzimático, são cada um operavelmente ligados a um promotor responsivo ao Gal4p selecionado do grupo que consiste em pGALl, pGAL7 e pGALlO.

[0023] Em algumas modalidades, a composição de fermentação compreende uma população de células hospedeiras geneticamente modificadas em um meio de cultura compreendendo uma fonte de carbono, em que a célula hospedeira compreende: (a) um ou mais ácidos nucleicos heterólogos que codificam uma ou mais enzimas do caminho de mevalonato (MEV), cada um operavelmente ligado a um promotor responsivo ao Gal4p; e (b) um ácido nucleico que codifica Gal4p, operavelmente ligado a um promotor responsivo microaeróbico. Em algumas modalidades, a célula hospedeira compreende adicionalmente um rompimento funcional de Gal80p. Em algumas modalidades, o promotor responsivo microaeróbico é um promotor de DAN1 que sofreu mutação. Em algumas modalidades, o promotor de DAN1 que sofreu mutação compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 e 10. Em algumas modalidades, a sequência de promotor de DAN1 que sofreu mutação compreende SEQ ID NO:1. Em algumas modalidades, a sequência de promotor de DAN1 que sofreu mutação compreende SEQ ID NO:2. Em algumas modalidades, o meio de cultura compreende uma concentração de oxigênio dissolvido de 100 %. Em algumas modalidades, o meio de cultura compreende uma concentração de oxigênio dissolvido de menos que cerca de 20 %, menos que cerca de 15 %, menos que cerca de 10 %, ou menos que cerca de 5 %. Em algumas modalidades, o meio de cultura compreende uma concentração de oxigênio dissolvido de cerca de 0 %.

[0024] Em algumas modalidades, a composição de fermentação compreende uma população de células hospedeiras geneticamente modificadas em um meio de cultura compreendendo uma fonte de carbono, em que a célula hospedeira compreende um ou mais ácidos nucleicos heterólogos que codificam uma ou mais enzimas de um caminho enzimático para o preparo do composto não catabólico heterólogo, em que a expressão de uma ou mais enzimas é positivamente regulada pela atividade de um promotor responsivo à maltose. Em algumas modalidades, o promotor responsivo à maltose é operavelmente ligado a um ou mais ácidos nucleicos heterólogos que codificam uma ou mais enzimas do caminho enzimático, em que a expressão de uma ou mais enzimas de um caminho enzimático é diminuída na presença de maltose. Em algumas modalidades, o promotor responsivo à maltose é operavelmente ligado a um ácido nucleico heterólogo que codifica um regulador transcripcional que negativamente regula a expressão de um ou mais ácidos nucleicos heterólogos que codificam uma ou mais enzimas do caminho enzimático, em que a expressão do regulador transcripcional é aumentada na presença de maltose. Em algumas modalidades, o regulador transcripcional é Gal80p, a célula hospedeira compreende adicionalmente Gal4p, e um ou mais ácidos nucleicos heterólogos que codificam uma ou mais enzimas do caminho enzimático são cada um operavelmente ligados a um promotor responsivo ao Gal4p selecionado do grupo que consiste em pGALl, pGAL7 e pGALlO.

[0025] Em algumas modalidades, a composição de fermentação compreende uma população de células hospedeiras geneticamente modificadas em um meio de cultura compreendendo uma fonte de carbono, em que a célula hospedeira compreende: (a) um ou mais ácidos nucleicos heterólogos que codificam uma ou mais enzimas do caminho de mevalonato (MEV), cada um operavelmente ligado a um promotor responsivo ao Gal4p; (b) um ácido nucleico que codifica Gal4p; e (c) um ácido nucleico que codifica Gal80p, operavelmente ligado a um promotor responsivo à maltose. Em algumas modalidades, o promotor responsivo à maltose compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste em pMALl (SEQ ID NO: 12), pMAL2 (SEQ ID NO:13), pMALll (SEQ ID NO: 14), pMAL12 (SEQ ID NO: 15), pMAL31 (SEQ ID NO: 16) e pMAL32 (SEQ ID NO: 17). Em algumas modalidades, o promotor responsivo à sequência de maltoses compreende pMAL32 (SEQ ID NO: 17). Em algumas modalidades, o meio de cultura compreende pelo menos 0,1 % (p/v) maltose. Em algumas modalidades, o meio de cultura compreende 0,25 % a 3 % (p/v) maltose. Em algumas modalidades, o meio de cultura compreende não mais que 0,08 % de maltose.

[0026] Em algumas modalidades, a célula hospedeira é selecionada do grupo que consiste em uma célula fúngica, uma célula bacteriana, uma célula de planta, e uma célula animal. Em algumas modalidades, a célula hospedeira é uma célula de levedura. Em algumas modalidades, o composto não catabólico é selecionado do grupo que consiste em um aminoácido, um ácido graxo, um isoprenóide, e um policetídeo.

[0027] Em algumas modalidades, as células hospedeiras são capazes de produzir um isoprenóide e compreende pelo menos um ácido nucleico heterólogo que codifica uma enzima de caminho de isoprenóide selecionado do grupo que consiste em: (a) uma enzima que condensa duas moléculas de acetil-coenzima A para formar acetoacetil-CoA; (b) uma enzima que condensa acetoacetil-CoA com uma outra molécula de acetil-CoA para formar 3-hidróxi-3-metilglutaril-CoA (HMG-CoA); (c) uma enzima que converte HMG-CoA em mevalonato; (d) uma enzima que converte mevalonato em mevalonato 5-fosfato; (e) uma enzima que converte mevalonato 5-fosfato em mevalonato 5-pirofosfato; (f) uma enzima que converte mevalonato 5-pirofosfato em IPP; (g) uma enzima que converte IPP em DMAPP; (h) um poliprenil sintase que pode condensar moléculas de IPP e/ou DMAPP para formar compostos de poliprenila contendo mais que cinco carbonos; (i) uma enzima que condensa IPP com DMAPP para formar GPP; (j) uma enzima que condensa duas moléculas de IPP com uma molécula de DMAPP; (k) uma enzima que condensa IPP com GPP para formar FPP; (1) uma enzima que condensa IPP e DMAPP para formar GGPP; e (m) uma enzima que condensa IPP e FPP para formar GGPP.

[0028] Em algumas modalidades, as células hospedeiras compreendem adicionalmente um ácido nucleico heterólogo que codifica uma enzima que modifica um poliprenila, selecionada do grupo que consiste em um geraniol sintase, um linalool sintase, um limoneno sintase, um mirceno sintase, um ocimeno sintase, um a-pineno sintase, β-pineno sintase, um sabineno sintase, um y-terpineno sintase, um terpinoleno sintase, um amorfadieno sintase, um a-fameseno sintase, um β-fameseno sintase, um famesol sintase, um nerolidol sintase, um patchouliol sintase, um nootkatone sintase, um abietadieno sintase.

[0029] Em algumas modalidades, as células hospedeiras compreendem uma pluralidade de ácidos nucleicos heterólogos que codificam todas as enzimas de um caminho de mevalonato. Em algumas modalidades, o isoprenóide é selecionado do grupo que consiste em um hemiterpeno, monoterpeno, diterpeno, triterpeno, tetraterpeno, e politerpeno. Em algumas modalidades, o isoprenóide é um isoprenóide Cs-Czo- Em algumas modalidades, o isoprenóide é um sesquiterpene. Em algumas modalidades, o isoprenóide é selecionado do grupo que consiste em abietadieno, amorfadieno, careno, α-fameseno, β-fameseno, famesol, geraniol, geranilgeraniol, isopreno, linalool, limoneno, mirceno, nerolidol, ocimeno, patchoulol, β-pineno, sabineno, y-terpineno, terpinoleno e valenceno.

[0030] Em algumas modalidades, as células hospedeiras são capazes de produzir um policetídeo e compreende pelo menos um ácido nucleico heterólogo que codifica uma enzima de síntese de policetídeo, em que a enzima de síntese de policetídeo é selecionada do grupo que consiste em: (a) uma enzima que condensa pelo menos um de acetil-CoA e malonil-CoA com uma proteína carreadora de acila; (b) uma enzima que condensa um primeiro reagente selecionado do grupo que consiste em acetil-CoA e malonil-CoA com um segundo reagente selecionado do grupo que consiste em malonil- CoA ou metilmalonil-CoA para formar um produto de policetídeo; (c) uma enzima que reduz um grupo químico β-ceto em um policetídeo composto a um grupo β-hidroxi; (d) uma enzima que desidrata um grupo químico alcano em um composto de policetídeo para produzir um alceno α-β-insaturado; (e) uma enzima que reduz uma ligação dupla α-β em um composto de policetídeo a um alcano saturado; e (f) uma enzima que hidrolisa um composto de policetídeo de uma proteína carreadora de acila.

[0031] Em algumas modalidades, o policetídeo é um lipídeo tendo pelo menos um de atividade antibiótica, antifungica e antitumoral. Em algumas modalidades, o policetídeo é selecionado do grupo que consiste em um composto macrolídeo, um antibiótico, um antifungico, um citostático, um composto anticolesterolêmico, um composto antiparasítico, um composto coccidiostático, um promotor de crescimento animal e um inseticida.

[0032] Em algumas modalidades, as células hospedeiras são capazes de produzir um ácido graxo e compreende pelo menos um ácido nucleico heterólogo que codifica uma enzima de síntese de ácido graxo, em que a enzima de síntese de ácido graxo é selecionada do grupo que consiste em: (a) uma enzima que covalentemente liga pelo menos um de acetil-CoA e malonil- CoA a uma proteína carreadora de acila (ACP); (b) uma enzima que condensa acetil-ACP e malonil-ACP para formar acetoacetil-ACP; (c) reduzir a ligação dupla em acetoacetil-ACP com NADPH para formar um grupo hidroxila em D-3-hidroxibutiril hidroxilase-ACP; (d) uma enzima que desidrata D-3- Hidroxibutiril hidroxilase-ACP para criar uma ligação dupla entre os beta- e gama-carbonos que formam crotonil-ACP; (e) uma enzima que reduz crotonil ACP com NADPH para formar butiril-ACP; e (f) uma enzima que hidrolisa um composto de acila Cl6 de uma proteína carreadora de acila para formar palmitato. Em algumas modalidades, o ácido graxo é selecionado do grupo que consiste em palmitato, palmitoil CoA, ácido palmitoléico, ácido sapiênico, ácido oléico, ácido linoléico, ácido a-linolênico, ácido araquidônico, ácido eicosapentaenóico, ácido erúcico, e ácido docosaexaeóico.

4. BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0033] FIGURA 1 fornece uma representação esquemática do caminho de mevalonato (“MEV”) para a produção de isopentenil difosfato (“IPP”).

[0034] FIGURA 2 fornece uma representação esquemática da conversão de IPP e dimetilallil pirofosfato (“DMAPP”) a geranil pirofosfato (“GPP”), famesil pirofosfato (“FPP”), e geranilgeranil pirofosfato (“GGPP”).

[0035] FIGURA 3 mostra a degeneração da tensão (isto é, declínio da produção de composto não catabólico com o tempo) de uma população de células de levedura hospedeiras capazes de produzir um composto não catabólico, fameseno.

[0036] FIGURA 4 fornece uma representação esquemática de um interruptor de baixo oxigênio a base de GAL-regulon exemplar para o controle da produção de composto não catabólico heterólogo em uma célula hospedeira.

[0037] FIGURA 5 fornece uma representação esquemática de um interruptor de maltose a base de GAL-regulon exemplar para o controle de produção de composto não catabólico heterólogo em uma célula hospedeira.

[0038] FIGURA 6 fornece resultados que demonstram que células hospedeiras capazes de produzir o isoprenóide fameseno, e compreendendo o caminho MEV mediante regulação positiva por um promotor responsivo microaeróbico (“interruptor de baixo O2”), produz quantidades muito baixas de fameseno na condição de alto teor de O2 (placa de agitação), e na condição de baixo O2 (frasco de agitação com baixa RPM), produção é substancialmente aumentada a níveis que atendem a produção de uma tensão pai não alterável na qual o caminho MEV é constitutivamente expresso.

[0039] FIGURA 7 fornece resultados que demonstram que células hospedeiras capazes de produzir o isoprenóide fameseno, e compreendendo o caminho MEV mediante regulação positiva por uma alteração de baixo O2, apresentam melhor estabilidade de produção de fameseno em uma corrida de fermentação longa quando o estágio de preparo do fermentação é realizado em condições aeróbicas (afetando assim um estado “desligado”) comparado à produção de uma tensão constitutivamente de produção que produziu fameseno em todo o estágio de preparo.

[0040] FIGURA 8 fornece resultados que demonstram que células hospedeiras capazes de produzir o isoprenóide fameseno, e compreendendo o caminho MEV mediante regulação negativa por um promotor responsivo à maltose (“alteração com maltose”), produz quantidades muito baixas de fameseno na presença de maltose (1.3 %), e na ausência de maltose, produção é substancialmente aumentada a níveis próximos da produção de uma tensão pai não alterável na qual o caminho MEV é constitutivamente expresso.

[0041] FIGURA 9 fornece resultados que demonstram que células hospedeiras capazes de produzir o isoprenóide fameseno, e compreendendo o caminho MEV tanto mediante (i) regulação positiva por um promotor responsivo microaeróbico (“alteração em baixo O2”); quanto regulação negativa por um promotor responsivo à maltose (“alteração com maltose”), têm melhores taxas de crescimento durante o estado “desligado” de produção do composto comparado a um fameseno que produz tensão pai constitutivamente.

[0042] FIGURA 10 fornece resultados que demonstram que células hospedeiras capazes de produzir o isoprenóide fameseno, e compreendendo o caminho MEV mediante regulação negativa por uma alteração com maltose, apresentam melhor estabilidade de produção de fameseno em uma corrida de fermentação longa quando o estágio de preparo do fermentação é realizado na presença de maltose (afetando assim um estado “desligado”), comparado à produção de uma tensão constitutivamente de produção que produziu fameseno em todo o estágio de preparo.

[0043] FIGURA 11 fornece resultados que demonstram, para o promotor sensível à maltose pMALl 1, (a) a sensibilidade a várias quantidades de maltose e a alimentações mistas no meio de cultura, e bem como (B) à capacidade de alteração para o estado “ligado” na ausência de maltose, seguindo repressão por maltose no estado “desligado”.

[0044] FIGURA 12 fornece resultados que demonstram, para o promotor sensível à maltose pMAL12, (a) a sensibilidade a várias quantidades de maltose e a alimentações mistas no meio de cultura, e bem como (B) à capacidade de alteração para o estado “ligado” na ausência de maltose, seguindo repressão por maltose no estado “desligado”.

[0045] FIGURA 13 fornece resultados que demonstram, para o promotor sensível à maltose pMAL31, (a) a sensibilidade a várias quantidades de maltose e a alimentações mistas no meio de cultura, e bem como (B) à capacidade de alteração para o estado “ligado” na ausência de maltose, seguindo repressão por maltose no estado “desligado”.

[0046] FIGURA 14 fornece resultados que demonstram, para o promotor sensível à maltose pMAL32, (a) a sensibilidade a várias quantidades de maltose e a alimentações mistas no meio de cultura, e bem como (B) à capacidade de alteração para o estado “ligado” na ausência de maltose, seguindo repressão por maltose no estado “desligado”.

5. DESCRIÇÃO DAS MODALIDADES 5.1 Definições

[0047] Da forma aqui usada, o termo “endógeno” refere-se a uma substância ou processo que pode ocorrer naturalmente em uma célula hospedeira.

[0048] Da forma aqui usada, a frase “funcionalmente rompe” ou um “rompimento funcional” por exemplo, de um gene alvo significa que o gene alvo é alterado de maneira tal a diminuir na célula hospedeira a atividade da proteína codificada pelo gene alvo. Similarmente, “funcionalmente rompe” ou um “rompimento funcional” por exemplo, de uma proteína alvo significa que a proteína alvo é alterada de maneira a diminuir na célula hospedeira a atividade do proteína. Em algumas modalidades, a atividade da proteína alvo codificada pelo gene alvo é eliminada na célula hospedeira. Em outras modalidades, a atividade da proteína alvo codificada pelo gene alvo é diminuída na célula hospedeira. Rompimento funcional do gene alvo pode ser alcançado deletando todo ou parte do gene, de maneira tal que a expressão do gene seja eliminada ou reduzida, ou de maneira tal que o produto da atividade do gene seja eliminado ou reduzido. Rompimento funcional do gene alvo também pode ser alcançado mutando um elemento regulatório do gene, por exemplo, o promotor do gene, de maneira tal que a expressão seja eliminada ou reduzida, ou mutando a sequência de codificação do gene, de maneira tal que a atividade do gene produto seja eliminada ou reduzida. Em algumas modalidades, rompimento funcional do gene alvo resulta na remoção da armação de leitura aberta completa do gene alvo.

[0049] Da forma aqui usada, o termo “geneticamente modificado” denota uma célula hospedeira que compreende uma sequência de nucleotídeos heteróloga.

[0050] Da forma aqui usada, o termo “heterólogo” refere-se ao que não é normalmente encontrado na natureza. O termo “composto heterólogo” refere-se à produção de um composto por uma célula que não normalmente produz o composto, ou à produção de um composto em um nível no qual ele não é normalmente produzido pela célula.

[0051] Da forma aqui usada, a frase “enzima heteróloga” refere-se a uma enzima que não é normalmente encontrada em uma dada célula na natureza. O termo engloba uma enzima que é: (a) exógena para uma dada célula (isto é, codificada por uma sequência de nucleotídeos que não está naturalmente presente na célula hospedeira ou não naturalmente presente em um dado contexto na célula hospedeira); e (b) naturalmente encontrada na célula hospedeira (por exemplo, a enzima é codificada por uma sequência de nucleotídeos que é endógena à célula), mas que é produzida em uma quantidade não natural (por exemplo, maior ou menor que a naturalmente encontrada) na célula hospedeira.

[0052] Da forma aqui usada, a frase “operavelmente ligado” refere-se a uma ligação funcional entre sequências ácidos nucleicos, de maneira tal que o promotor ligado e/ou região regulatória funcionalmente controla a expressão da sequência de codificação.

[0053] Da forma aqui usada, o termo “produção” geralmente refere-se a uma quantidade de composto não catabólico produzido por células hospedeiras geneticamente modificadas fornecidas aqui. Em algumas modalidades, produção é expressa na forma de um rendimento do composto não catabólico pela célula hospedeira. Em outras modalidades, produção é expressam na forma de uma produtividade da célula hospedeira na produção do composto não catabólico.

[0054] Da forma aqui usada, o termo “produtividade” refere-se à produção de um composto não catabólico por uma célula hospedeira, expressa na forma da quantidade de composto não catabólico produzido (em peso) por quantidade de caldo de fermentação no qual a célula hospedeira é cultivada (em volume) com o tempo (por hora).

[0055] Da forma aqui usada, o termo “promotor” refere-se a um ácido nucleico sintético ou naturalmente derivado que é capaz de conferir, ativar ou melhorar a expressão de uma sequência de codificação de DNA. Um promotor pode compreender uma ou mais sequências transcripcionalmente reguladoras específicas para melhorar adicionalmente a expressão e/ou alterar a expressão espacial e/ou expressão temporal da sequência de codificação. Um promotor pode ser posicionado 5' (a montante) da sequência de codificação mediante seu controle. A distância entre o promotor e uma sequência de codificação a ser expressa pode ser aproximadamente a mesma que a distância entre o promotor e a sequência de ácidos nucleicos nativos que ele controla. Conforme conhecido na tecnologia, variação desta distância pode ser acomodada sem perda da função do promotor. O promotor regulado aqui usado geralmente permite a transcrição da sequência de ácidos nucleicos que codifica um regulador transcripcional (por exemplo, um ativador, tal como pGal4, ou um repressor, tal como pGal80), embora em um ambiente permissivo (por exemplo, condições de fermentação microaeróbicas, ou a presença de maltose), mas cessa a transcrição da sequência de ácidos nucleicos que codifica um regulador transcripcional, embora em um ambiente não permissivo (por exemplo, condições de fermentação aeróbicas, ou na ausência de maltose).

[0056] A frase “estabilidade da tensão” geralmente refere-se à estabilidade da produção do composto heterólogo por períodos prolongados de fermentação por células hospedeiras geneticamente modificadas descritas aqui. Em particular, estabilidade refere-se à capacidade de um micróbio de manter características de produção favoráveis (isto é, alto rendimento (gramas de composto por grama de substrato) e/ou produtividade (gramas por litro de caldo de fermentação por hora)) de um produto de fermentação não catabólico durante períodos de cultivo prolongados, por exemplo, 3 a 20 dias. Estabilidade genética, que é a propensão de produzir população microbiana para ter pouca a nenhuma alteração da frequência alélica pretendida de genes relevantes para a produção de produto com o tempo, exerce um papel principal na produção prolongada do produto.

[0057] O termo “rendimento” refere-se à produção de um composto não catabólico por uma célula hospedeira, expressa na forma da quantidade de composto não catabólico produzido por quantidade de fonte de carbono consumida pela célula hospedeira, em peso.

5.2 Uso de um promotor sensível ao oxigênio na combinação com fermentação microaeróbica como um interruptor para a produção de compostos heterólogos

[0058] Em algumas modalidades, os métodos e composições aqui fornecidos utilizam promotores sensíveis ao oxigênio para acionar a expressão das enzimas heterólogas capazes realizar a produção de composto não catabólico em células hospedeiras geneticamente modificadas em condições de fermentação microaeróbicas. Quando fermentação da célula hospedeira é realizada em condições de fermentação aeróbicas, a produção de composto não catabólico é substancialmente reduzida e desligada; quando as condições de fermentação são microaeróbicas, produção de composto não catabólico é ligada ou aumentada. Assim, as células geneticamente modificadas aqui descritas possibilitam o uso de condições de baixo oxigênio como uma alteração para a produção de composto não catabólicos. Em particular, o controle do tempo da produção de composto não catabólico para ocorrer somente quando a produção é desejada redireciona o fluxo de carbono durante a fase de não produção na manutenção da célula e biomassa. Este uso mais eficiente de carbono reduz muito a carga metabólica nas células hospedeiras, aumenta a estabilidade dos genes heterólogos, reduz a degeneração da tensão, e contribui para melhor saúde geral e viabilidade das células. Desta maneira, os métodos e células hospedeiras geneticamente modificadas aqui fornecidos utilizam condições de fermentação em baixo como uma alteração para realizar os estágios “desligado” e “ligado” de um processo de fermentação melhorado para a produção de compostos não catabólicos heterólogos.

[0059] Na primeira etapa (isto é, o estágio de “construção”, etapa (a)), as células hospedeiras geneticamente modificadas crescem em um meio de crescimento ou “de construção” em condições aeróbicas, isto é, em que oxigênio é fornecido em quantidades não limitantes. Na segunda etapa (isto é, o estágio de “produção”, etapa (b)), a fermentação é realizada em condições microaeróbicas, que serve como um interruptor não genético para substancialmente aumentar a produção do composto não catabólico. O crescimento inicial em condições completamente aeróbicas garante que as exigências de energia das células sejam atendidas, embora a biomassa das células rapidamente aumente. Daí em diante, alteração das condições microaeróbicas possibilita a síntese do produto não catabólico.

5.2.1 Promotores de DAN1 sensíveis ao oxigênio

[0060] Em algumas modalidades, um promotor sensível ao oxigênio usado para regular a expressão das enzimas capazes de realizar compostos não catabólicos nos métodos aqui fornecidos é o promotor de DAN1, e homólogos e variantes destes (SEQ ID NOS: 1-11). Em algumas modalidades, os promotores de DAN 1 são de S. cerevisiae. Os promotores de DAN 1 tipo selvagem (SEQ ID NO:1) são inativos em condições aeróbicas, mas altamente ativos nas condições anaeróbicas. Ver, por exemplo, Kwast et al., J Bacteriol. 184(l):250-265 (2002); Piper et al., J Biol Chem 277(40):37001-37008 (2002); e ter Linde et al., J Bacteriol. 181(24):7409-7413 (1999).

[0061] Os genes DAN/TIR de Saccharomyces cerevisiae estão entre um grande grupo de genes que são sobre-regulados durante adaptação ao crescimento anaeróbico (ver, Lai et al., Mol Célula Biol. 25(10):4075-4091 (2005); Sertil et al., Gene 192(2): 199-205 (1997); e Tai et al., J Biol Chem. 280(1 ):437-447 (2005). Estes genes codificam para manoproteínas de parede celular, que exercem um papel significativo na permeabilidade da parede celular. As cinéticas de expressão destes genes variam de 30 minutos a 3 horas depois do início de ação da anaerobiose (ver Abramova et al., J Bacteriol. 183(9):2881-2887 (2001)). Parece que um remodelamento da parede celular programado complexo ocorre durante a adaptação à anaerobiose, conforme mostrado pelo fato de que as manoproteínas de parede celular aeróbicas principais codificadas por CWP1 e CWP2 são substituídas por suas contrapartidas anaeróbicas, codificadas pelos genes DAN/TIR, nestas condições.

[0062] Anaerobiose exigente, que é requerida para indução eficiente dos promotores de DAN1 tipo selvagem, foi alcançada borbulhando culturas com nitrogênio para depletar oxigênio (ver Cohen et al., Nucleic Acids Res 29(3):799-808 (2001)). Entretanto, Nevoigt et al. desenvolveram uma série de mutantes de promotores de DANI (SEQ ID NOS: 1-10) que podem ser induzidos em condições que envolvem a simples eliminação ou redução da aeração. Ver Nevoigt et al., Biotechnology and Bioengineering 96(3):550-558 (2007); e Pedido de patente dos Estados Unidos No. 2007/0178505, cujos conteúdos estão aqui incorporados pela referência na íntegra.

[0063] Assim, em algumas modalidades, os promotores de DANls usados nos métodos aqui fornecidos são os descritos no pedido de patente dos Estados Unidos No. 2007/0178505, e incluem os promotores compreendendo SEQ ID No: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10. Em algumas modalidades, os promotores de DANls usados nos métodos aqui fornecidos compreendem SEQ ID No: 1, 2, 3, 4, 5, ou 6. Em algumas modalidades, os promotores de DANls usados nos métodos aqui fornecidos compreendem SEQ ID No: 1 ou 2. Em algumas modalidades, os promotores de DANls usados nos métodos aqui fornecidos compreendem SEQ ID No: 1. Em algumas modalidades, os promotores de DANls usados nos métodos aqui fornecidos compreendem SEQ ID No: 2.

[0064] Em uma outra modalidade, os promotores de DAN1 usados nos métodos aqui fornecidos compreendem uma mutação em uma ou mais das seguintes posições de SEQ ID No: 11: 1-56; 66-139; 148-232; 245-283; 290-293; 301-302; 310; 322-326; 334-347; 357-371; 380-450; ou 458-551. De acordo com este aspecto e em uma modalidade, a mutação é na posição: 4, 7, 15, 18, 19, 21, 22, 26, 28, 36, 40, 53, 56, 60, 63, 66, 74, 75, 78, 86, 99, 122, 132, 135, 136, 149, 153, 162, 164, 165, 171, 172, 176, 187, 196, 198, 201, 205, 207, 211, 216, 226, 228, 233, 234, 237, 241, 260, 269, 274, 277, 280, 281, 285, 296, 299, 303, 307, 308, 310, 313, 322, 327, 331, 332, 337, 338, 343, 344, 346, 366, 368, 373, 375, 376, 381, 384, 386, 390, 391, 392, 396, 397, 402, 404, 422, 427, 428, 429, 432, 434, 439, 445, 467, 469, 470, 477, 480, 490, 492, 508, 511, 514, 518, 528, ou uma combinação destes. Em uma modalidade, mutações nestas posições podem ser em qualquer nucleotídeo a não ser o nucleotídeo tipo selvagem, enquanto que em uma outra modalidade, mutações em cada posição é em um nucleotídeo específico conforme descrito daqui em diante.

[0065] Em uma outra modalidade, os promotores de DAN1 usados nos métodos aqui fornecidos compreendem uma sequência compreendendo uma substituição de: (a) um T com um C na posição do nucleotídeo 4, 15, 19, 36, 53, 56, 60, 66, 74, 75, 78, 86, 99, 132, 136, 176, 201, 205, 207, 216, 226, 228, 269, 277, 281, 285, 299, 303, 310, 327, 331, 332, 375, 376, 390, 428, 434, 467, 477, 480, 508, 511, ou uma combinação destes; (b) um A com um G na posição do nucleotídeo 7, 18, 26, 40, 122, 135, 149, 153, 162, 164, 165, 171, 172, 187, 196, 211, 233, 234, 237, 241, 260, 274, 280, 308, 313, 322, 337, 343, 344, 346, 366, 368, 381, 384, 386, 396, 397, 402, 404, 422, 427, 429, 432, 445, 470, 490, 492, ou uma combinação destes; (c) um C com um A na posição do nucleotídeo 21; (d) um A com um C na posição do nucleotídeo 237, 338, 469, 514, 518; (e) um C com um T na posição do nucleotídeo 28, 296, 307, 373, 392, 528, ou uma combinação destes; (f) um G com um A na posição do nucleotídeo 22, 63, 391, 439 ou uma combinação destes; (g) um T com um G no nucleotídeo 198; ou qualquer combinação destes, da sequência apresentada em SEQ ID NO: 11.

[0066] Em uma outra modalidade, os promotores de DAN1 usados nos métodos aqui fornecidos compreendem mutações em uma porção de um promotor que é estrutural ou funcionalmente homóloga à porção dos promotores de DAN1 que sofreu mutações da forma aqui descrita. Em uma outra modalidade, o promotor usado nos métodos aqui fornecidos compreende mutações em um promotor que é homólogo aos promotores de DAN1. Em uma modalidade, promotores homólogos ou porções destes são derivados de sequências de S. cerevisiae, embora em uma outra modalidade, eles são derivados de outras espécies de Saccharomyces, embora em uma outra modalidade, eles são derivados de Saccharomycetaceae, embora em uma outra modalidade, eles são derivados de Saccharomycetales, embora em uma outra modalidade, eles são derivados de Saccharomycetes, embora em uma outra modalidade, eles são derivados de Saccharomycotina, embora em uma outra modalidade, eles são derivados de Ascomycota, embora em uma outra modalidade, eles são derivados de espécies fúngicas. Em uma outra modalidade, promotores homólogos aos promotores de DAN1 mostram dependência de oxigênio similar como os promotores de DAN1. Versados na tecnologia seriam capazes de determinar a dependência do oxigênio de um promotor usando métodos que são rotina na tecnologia. Determinações de promotores homólogos ou regiões promotoras são feitas rotineiramente por versados na tecnologia usando ferramentas conhecidas na tecnologia, tal como alinhamento de sequências.

[0067] Em uma modalidade, um promotor homólogo a DAN1 é DAN2, DAN3, DAN4, TIR1, TIR2, TIR3, ou TIR4. Em uma outra modalidade, um promotor homólogo a DAN1 é CYC1, CYC7, ANB1, COX5b, ERG11, MOX1, MOX2, MOX4/UPC2, ROX7/MOT3, ou promotores ROX1.

[0068] Em uma modalidade, mutações podem ser em uma porção de um promotor que corresponde a sítios de ligação aos elementos de resposta anaeróbicos que, em uma modalidade, é ARI ou AR2, embora em uma outra modalidade, mutações podem ser nos sítios de ligação Mot3 ou Roxl.

5.2.1.1 Alvos de regulação do promotor de DAN1

[0069] Em algumas modalidades, os métodos aqui fornecidos utilizam células hospedeiras geneticamente modificadas que compreendem um ácido nucleico heterólogo que codifica uma ou mais enzimas de um caminho enzimático para o preparo do composto não catabólico heterólogo. Em algumas modalidades, expressão de uma ou mais enzimas está mediante controle direto de um promotor de DAN1 que sofreu mutação. Isto é, uma ou mais sequências de ácidos nucleicos heterólogos que codificam uma ou mais enzimas do caminho enzimático são cada uma operavelmente ligadas a (isto é, é posicionada 3’ de) um promotor de DAN1 que sofreu mutação, e os promotores de DAN 1 mutantes acionam a expressão de cada um dos ditos um ou mais ácidos nucleicos heterólogos em condições microaeróbicas.

[0070] Em outras modalidades, expressão de uma ou mais enzimas de um caminho enzimático é indiretamente regulada pelo promotor de DAN1 que sofreu mutação. Por exemplo, regulação indireta de uma ou mais enzimas do caminho pode ser alcançada operavelmente ligando um promotor de DAN1 que sofreu mutação a um único regulador transcripcional heterólogo, cuja expressão, por sua vez, diretamente regula a expressão de uma ou mais enzimas (por exemplo, todos os membros) do caminho.

[0071] O GAL regulon em levedura fornece uma rede regulatória exemplar de ativadores, repressores e promotores que pode ser utilizada em combinação com um promotor de DAN1 que sofreu mutação aqui descrito. Levedura pode utilizar galactose como uma fonte de carbono por meio da expressão dos genes GAL para importar galactose e metabolizá-la no interior da célula. Os genes GAL incluem genes estruturais GALI, GAL2, GAL7, e GAL 10 genes, que respectivamente codificam galactoquinase, galactose permease, β-D-galactose-1-fosfato uridiltransferase, e uridina difosfogalactose-4-epimerase, e genes reguladores GAL4, GAL80, e GAL3. O produto do gene GAL4 é um regulador positivo (isto é, ativador) e o produto do gene GAL80 é um regulador negativo (isto é, repressor) da expressão dos genes GALI, GAL2, GAL7, e GAL10. Gal4p ativa a transcrição se ligando à montante sequências de ativação (UAS), tais como as dos genes estruturais GAL, isto é, nos promotores pGALl, pGAL7 e pGALlO. Na ausência de galactose, muito pouca expressão das proteínas estruturais (Gallp, Gal2p, Gal7p, e GallOp) é tipicamente detectada, devido à interação de Gal80p com Gal4p e prevenindo atividade transcriptional de Gal4p. Na presença de galactose, entretanto, Gal3p interage com Gal80p, aliviando a repressão de Gal4p por Gal80p. Isto permite a expressão dos genes à jusante das sequências de ligação de Gal4p, tais como os produtos dos genes GALI, GAL2, GAL7, e GAL 10.

[0072] Assim, em algumas modalidades, um ou mais promotores ativados por GAL4, por exemplo, pGALl, pGAL7, e/ou pGALlO, são operavelmente ligados, e são usados para acionar a expressão, a uma ou mais enzimas de um caminho enzimático para o preparo do composto não catabólico heterólogo, e expressão do produto do gene GAL4 é acionada por um promotor de DAN1 que sofreu mutação aqui descrito. Desta maneira, a expressão de uma ou mais enzimas do caminho é induzida por Gal4p em condições microaeróbicas. Em algumas tais modalidades, expressão do gene GAL80 é reduzida ou eliminada, usando técnicas conhecidas para rompimento do gene, de maneira tal que Gal80p não esteja mais presente para negativamente regular atividade Gal4p, independente das condições de oxigênio da fermentação. Em algumas modalidades, o promotor de pGAL4 nativo é substituído por um ácido nucleico heterólogo compreendendo um promotor de DANI que sofreu mutação. Em algumas modalidades, a célula hospedeira compreende um ácido nucleico heterólogo compreendendo um ácido nucleico que codifica Gal4p, operavelmente ligado a um ácido nucleico heterólogo compreendendo promotores de DAN1 que sofreu mutações. Em uma modalidade, um promotor de DAN1 que sofreu mutação é operavelmente ligado a uma sequência de codificação para Gal4p, e a sequência de codificações de uma ou mais enzimas (por exemplo, todos os membros) do caminho enzimático para o preparo do composto não catabólico heterólogo são operavelmente ligadas a promotores responsivos a GAL4. Em algumas modalidades, o promotor responsivo a GAL4 é pGALl. Em algumas modalidades, o promotor responsivo a GAL4 é pGAL7. Em algumas modalidades, o promotor responsivo a GAL4 é pGALlO.

5.2.2 Quantidades aeróbica e microaeróbica de oxigênio

[0073] Em certas modalidades dos métodos aqui fornecidos, as células são cultivadas ou mantidas durante o estágio de preparo em condições que não são limitadas por oxigênio, isto é, condições aeróbicas, seguido por cultura pela manutenção das células em condições que são limitantes de oxigênio, isto é, condições microaeróbicas ou anaeróbicas.

[0074] A manutenção das condições completamente aeróbicas pode ser desafiadora, particularmente em processos em grande escala, devido às limitações de transferência de massa e a solubilidade relativamente baixa de oxigênio em soluções aquosas. Por exemplo, se ar for usado para aspergir em tanques, a solubilidade de oxigênio em água é 9 miligramas por litro a 20 °C. Se oxigênio puro for usado em vez de ar, então a solubilidade aumenta para 43 miligramas por litro. Em qualquer caso (ar de aspersão ou oxigênio puro), esta quantidade de oxigênio é depletada em segundos por uma população microbiana ativa e concentrada, a menos que oxigênio seja continuamente abastecido. Em comparação, as quantidades de outros nutrientes que são usados pelas células durante o mesmo período (segundos, por exemplo. menos que um minuto) são insignificantes comparadas às concentrações de massa. Observou-se que as células hospedeiras que produzem compostos não catabólicos heterólogos são capazes de tolerar algum período de limitação de oxigênio e ainda produzem altos níveis de compostos isoprenóides. Esta flexibilidade permite um processo mais econômico fornecendo economias em termos de projeto de tanque, menor demanda de gás oxigênio, menores custos de energia para aeração e similares.

[0075] Limitação de oxigênio ocorre quando a taxa de crescimento das células hospedeiras específica é menos que a taxa de crescimento específica máxima onde oxigênio não é limitante (por exemplo, fornecido em excesso). A taxa de crescimento específica é a taxa de crescimento das células por unidade de biomassa por unidade de tempo e tem as unidades de tempo recíprocas (1/t). A taxa de crescimento específica máxima para as células em um meio de cultura refere-se ao efeito de uma concentração de substrato na taxa de crescimento que, neste caso, é oxigênio. Geralmente, células crescerão lentamente em um nível baixo do substrato, e à medida em que o nível do substrato no meio aumenta, então a taxa de crescimento da célula também. Entretanto, a taxa de crescimento da célula não continua a aumentar indefmidamente em níveis mais altos de substrato, um dado aumento na quantidade de substrato produzirá um aumento cada vez menor na taxa de crescimento da célula. Desta forma, a taxa de crescimento finalmente atinge um limite, que é frequentemente referido como a taxa de crescimento específica máxima.

[0076] Um tratamento teórico da relação entre taxas de crescimento em cultura é bem conhecido por versados na tecnologia, e é referido como a equação de Monod. Ver, por exemplo, Pirt, Principles of Microbe and Cell Cultivation, Wiley, NY, 1975, páginas 4-10. Neste tratamento teórico, a taxa específica máxima é um limite assimtótico nunca é alcançado até que um nível infinito de substrato seja alcançado. Na prática, entretanto, a taxa de crescimento específica máxima pode ser considerada como obtida quando as condições em investigação (por exemplo, um nível de substrato, tal como oxigênio) suporta a taxa de crescimento inicial mais rápida. Por exemplo, em um reator de lote-alimentado, a condição inicial onde todos os substratos requeridos para o crescimento (por exemplo nutrientes e oxigênio) são fornecidos em excesso e fermentação ocorre em temperatura ideal para a célula hospedeira é tratada como as condições para a taxa de crescimento máxima. Ver, por exemplo, Lee et al. (1996) Trends Biotechnol. 14: 98-105 e Korz et al. (1995) J Biotechnology 39:59-65. Taxa de crescimento específica máxima também é, algumas vezes, referida como crescimento ilimitado.

[0077] Em um método, limitação de oxigênio é quantificada pela concentração de oxigênio no meio e é expressa em termos de concentração de oxigênio dissolvido (DOC). O DOC no meio de cultura pode ser menos que cerca de 20 %, menos que cerca de 15 %, menos que cerca de 10 %, e menos que cerca de 5 %. Em outras modalidades o DOC é cerca de 0 % ou abaixo do nível de detecção. Entretanto, em virtude de oxigênio ser consumido pelas células relativamente rapidamente, um DOC de zero pode significar que as células são cultivadas em condições anaeróbicas (sem oxigênio) ou que as células consomem oxigênio tão rápido quanto é abastecido. Em um outro método, uso de oxigênio pelas células é expresso em termos de taxa de absorção de oxigênio (ORR; a taxa das células de consumo de oxigênio por litro de meio) para diferenciar entre estas duas possibilidades. Taxas de absorção de oxigênio adequadas incluem menos que cerca de 50 mmols, menos que cerca de 40 mmols, menos que cerca de 30 mmols, menos que cerca de 20 mmols por litro de meio, ou menos que cerca de 10 mmols por litro de meio. Altemativamente, taxa de absorção de oxigênio específica (SORR que é ORR dividido pela densidade celular) pode ser usada quando valores normalizados com relação às densidades celulares são preferidos. A quantidade de micro-organismo por litro de fermentação, ou a densidade de micro-organismo, pode ser medida medindo o peso de micro-organismo isolado de um dado volume do meio de fermentação. Uma medição comum é o peso seco das células por litro de meio de fermentação. Um outro método que pode ser usado para monitorar a fermentação, embora o progresso seja por uma medição da densidade ótica do meio. Um método comum é medir a densidade ótica a um comprimento de onda de 600 nm, referido como ODÔOO, ou o OD. O OD pode ser correlacionado como uma densidade de um tipo específico de organismo em um meio específico, mas a relação específica entre OD e quantidade de micro-organismo por volume geralmente não será aplicável através de todos os tipos de meios. Uma curva de calibração pode ser criada medindo o OD e o peso de célula seco sobre uma faixa de densidades da célula. Em alguns casos, estas correlações podem ser usadas em diferentes fermentações do mesmo micro-organismos ou similares no mesmo meio ou similares. Taxas de absorção de oxigênio específicas adequadas incluem menos que cerca de 30 mmols, menos que cerca de 25 mmols, menos que cerca de 20 mmols, menos que cerca de 15 mmols, menos que cerca de 10 mmols, ou menos que cerca de 5 mmols por grama de peso de célula seco por hora.

[0078] O meio de cultura pode ser mantido para ter um teor de oxigênio dissolvido durante o curso da cultura para manter o crescimento da célula e manter o metabolismo da célula para a produção de composto não catabólicos conforme necessário, de acordo com o estágio de preparo ou estágio de produção. A concentração de oxigênio do meio de cultura pode ser monitorada usando métodos conhecidos, tais como por meio do uso de um eletrodo de oxigênio. Oxigênio pode ser adicionado ao meio de cultura usando métodos conhecidos na tecnologia, por meio de agitação e aeração do meio por agitação ou aspersão. Embora aeração do meio tenha sido descrita com relação ao uso de ar, outras fontes podem ser usadas. Particularmente usado é o uso de um gás de aeração que contém uma fração de volume de oxigênio maior que a fração do volume de oxigênio em ar ambiente. Além do mais, tais gases de aeração podem incluir outros gases, que não afetam negativamente a cultura.

[0079] Em algumas modalidades, condições microaeróbicas são alcançadas borbulhando a cultura com nitrogênio, por exemplo, nitrogênio de alta pureza (99,8 %). Em algumas modalidades, condições microaeróbicas são alcançadas cultivando as células em vasos apertados com ar, por exemplo, vasos com tampa de rosca e similares. Em virtude de oxigênio dissolvido residual ser consumido durante o crescimento da célula, estas condições acentuadamente diminuem, mas não completamente eliminam, a disponibilidade de oxigênio durante o curso do crescimento da célula. Em algumas modalidades, condições microaeróbicas podem ser alcançadas por meio de mistura de ar em uma quantidade apropriada com um gás carreador. Altemativamente, uma vazão apropriadamente baixa de ar pode ser aspergida. O nível de oxigênio no meio de fermentação pode ser monitorado usando um eletrodo de oxigênio ou qualquer outro dispositivo adequado e a vazão da mistura de gás é ajustada para garantir que o nível de oxigênio no fluido de fermentação seja mantido a um nível constante. Além das variações na vazão do gás de entrada ou a composição do gás de entrada, condições microaeróbicas também podem ser produzidas diminuindo a taxa de agitação (assim diminuindo a oxigenação de uma cultura grande), ou adicionando mais matéria-prima para aumentar a densidade celular (e assim maior demanda de oxigênio), ou combinações destes.

[0080] Em algumas modalidades, oxigênio dissolvido (dCE) pode ser controlado alimentando açúcar nas células hospedeiras para manter a concentração de dCE em níveis não detectáveis por meio da maioria da fermentação. Em algumas modalidades, oxigênio pode ser fornecido por meio da aspersão de gás comprimido a agitação mecânica do caldo de fermentação. Em algumas modalidades, o oxigênio é fornecido a uma taxa que varia de aproximadamente 50 a 200 mmol Ch/L/h, por exemplo, aproximadamente 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 ou 200 mmol Ch/L/h. Em uma modalidade particular, oxigênio é fornecido a uma taxa de aproximadamente 110 mmol O2/L/I1. De maneira a utilizar todo este oxigênio disponível, açúcar é alimentado o mais rápido possível para garantir que NADH suficiente seja produzido por meio de seu catabolismo para converter todo dCh disponível no meio em H2O. Para garantir isto, açúcar pode ser alimentado em uma taxa ligeiramente mais rápida que a demanda estequiométrica de O2, de maneira tal que algum etanol seja produzido. Periodicamente, nenhum açúcar é alimentado para induzir a cultura para reconsumis o etanol que foi produzido, um processo que também requer consumo de O2 pela cultura. Uma vez que o etanol é esgotado, a concentração de dÜ2 aumenta rapidamente, sinalizando que a cultura é depletada de carbono oxidável. Esta ponta de dCh é medida por uma sonda e o processo retoma a alimentação de açúcar, retomando o dCh a níveis indetectáveis.

[0081] Assumindo um ambiente bem misturado sem gradientes espaciais e negligenciando o termo de diluição imperceptível (uma vez que o O2 que entra no tanque é imperceptível comparado ao O2 que entra na fase de gás), a equação diferencial de Ia ordem descrevendo a mudança no oxigênio dissolvido no fermentador é dada por:

onde: dO2 é a concentração de oxigênio dissolvido no reator no tempo t ki é o coeficiente de transferência de massa vapor-líquido para O2 a é a razão de área de superfície da bolha para volume do líquido dθ2sat é a concentração no equilíbrio de O2 na fase líquida que corresponde à temperatura, pressão, e concentração de O2 na fase gasosa do processo qoi é a taxa de consumo de oxigênio específica por um grama de biomassa (mmol/g dw/h) [X] é a concentração de biomassa no reator no tempo t

[0082] Esta equação pode ser simplificada para salientar que existem dois componentes que afetam a concentração de oxigênio dissolvido: a taxa de transferência de oxigênio (OTR), que é uma função das características de transferência de massa do caldo (kl), a área superficial para transporte de gás (a) e a força de acionamento para transferência de massa (dCEsat-dOs); e a taxa de absorção de oxigênio (ORR), que é uma função da concentração de biomassa ([X]) e a rapidez com a qual a biomassa consome O2 (qo2). Então, simplificando:

[0083] Estas equações podem ser usadas para ajudar a entender o perfil de dCh no tempo.

5.3 Uso de um promotor responsivo à maltose em combinação com manipulação de maltose como uma produção de alteração de compostos heterólogos

[0084] Em algumas modalidades, os métodos e composições aqui fornecidos utilizam promotores responsivos à maltose em combinação com manipulação de teor de maltose no meio de fermentação para regular, tanto direta quanto indiretamente, a expressão de enzimas heterólogas capazes de realizar a produção de composto não catabólico em células hospedeiras geneticamente modificadas.

[0085] Em uma modalidade, quando fermentação da célula hospedeira é realizada na presença de maltose, por exemplo, pelo menos 0,1 % de maltose, produção de composto não catabólico é substancialmente reduzida ou desligada, e quando a quantidade de maltose na fermentação do meio de cultura é reduzida ou eliminada, a produção de composto não catabólico é ligada ou aumentada. Assim, em algumas modalidades, as células geneticamente modificada forma aqui descritas compreendem genes de caminho biossintético heterólogos que são regulados por um promotor responsivo à maltose que possibilita o uso de maltose no meio de fermentação como uma mudança para a produção de composto não catabólicos. O controle de tempo de produção de composto não catabólico para ocorrer somente quando a produção é desejada redireciona o fluxo de carbono durante a fase de não produção na manutenção da célula e biomassa. Este uso mais eficiente de carbono reduz muito a carga metabólica nas células hospedeiras, melhora o crescimento da célula, aumenta a estabilidade dos genes heterólogos, reduz a degeneração da tensão, e contribui para melhor saúde geral e viabilidade das células.

[0086] Em algumas modalidades, o método de fermentação compreende um processo de duas etapas que utiliza maltose como uma alteração para realizar os estágios “desligado” e “ligado”. Na primeira etapa (isto é, o estado de “construção”, etapa (a)) em que produção do composto não é desejada, as células hospedeiras geneticamente modificadas crescem em um meio de crescimento ou “de construção” compreendendo maltose em uma quantidade suficiente para induzir a expressão de genes mediante o controle de um promotor responsivo à maltose, e o produto do gene induzido age para regular negativamente a produção do composto não catabólico. Na segunda etapa (isto é, o estágio de “produção”, etapa (b)), a fermentação é realizada em um meio de cultura compreendendo uma fonte de carbono em que maltose está ausente ou em quantidades suficientemente baixas, de maneira tal que o promotor responsivo à maltose não seja mais ativo, e produção do composto não catabólico heterólogo pelas células hospedeiras seja ligado ou aumentado.

[0087] Em outras modalidades, o promotor responsivo à maltose pode ser operavelmente ligado a um ou mais ácidos nucleicos heterólogos que codificam uma ou mais enzimas do caminho enzimático, e a presença de uma quantidade de ativação de maltose no meio de cultura aumenta a expressão de uma ou mais enzimas do caminho enzimático. Desta maneira, o promotor responsivo à maltose pode ser ligado para agir como um regulador positivo da produção de composto não catabólico.

5.3.1 Promotores responsivos à maltose

[0088] Em modalidades preferidas, promotores responsivos à maltose usados nos métodos e composições aqui fornecidos promovem a transcrição de uma sequência de codificação de DNA operavelmente ligada na presença de maltose. Em algumas modalidades, um promotor responsivo à maltose usado para regular a expressão de enzimas capazes de realizar compostos não catabólicos nos métodos e composições aqui fornecidos é qualquer promotor responsivo à maltose conhecido na tecnologia. Em algumas modalidades, o promotor responsivo à maltose é selecionado do grupo que consiste em pMALl (SEQ ID NO: 12), pMAL2 (SEQ ID NO: 13), pMALll (SEQ ID NO: 14), pMAL12 (SEQ ID NO: 15), pMAL31 (SEQ ID NO: 16) e pMAL32 (SEQ ID NO: 17). Em modalidades particulares, o promotor sensível à maltose é pMAL32 (SEQ ID NO: 17).

[0089] Outros promotores responsivos à maltose usados nos métodos e composições aqui fornecidos podem ser derivados da rede regulatória para o sistema de fermentação de maltose de S. cerevisiae. Fermentação de maltose em espécies de Saccharomyces requer a presença de pelo menos um de cinco loci MAL não ligados: MALI, MAL2, MAL3, MAL4, e MAL6. Cada um destes loci consiste em um complexo de genes envolvidos no metabolismo da maltose; o complexo inclui maltase, uma maltose permease, e um ativador destes genes. No locus MAL6, o ativador é codificado pelo gene MAL63. Mal63p é um ativador de transcrição que se liga ao DNA requerido para a indução dependente de maltose dos genes estruturais MAL que codificam maltose permease e maltase.

[0090] Um complexo intermediário ativador MAL é estável na ausência de maltose indutora, mas a adição de maltose causa a liberação de ativador de MAL indutível do complexo em uma forma ativa capaz de ligação ao DNA e ativação da transcrição. Ver, por exemplo, Ran, F. e Michels., C.UM., J. Biol. Chem. 285( 18): 13850-13862 (2010). Sítios de ligação da proteína MAL63 no promotor MAL61-62 divergentemente transcrito foram, caracterizados como uma sequência de ativação à montante para os genes MAL. Ver, por exemplo, Ni, B. e Needleman, R., “Identification os Upstream Activating Sequence of MAL and the Binding Sites for the MAL63 Activator of Saccharomyces cerevisiae,” Molecular and Cellular Biology 10(7):3797- 3800 (1990), cujos conteúdos estão aqui incorporados pela referência na íntegra.

[0091] Outros promotores responsivos à maltose usados nos métodos e composições aqui fornecidos podem ser derivados da rede regulatória para o sistema de metabolismo maltose/maltodextrina de E. coli. O ácido nucleico malT codifica MalT, um regulador positivo de quatro promotores responsivos à maltose (PPQ, PEFG, PKBM, e Ps). A combinação de malT e um promotor mal cria um sistema de expressão firmemente regulado que mostrou funcionar como um forte promotor induzido pela adição de maltose. Ver, por exemplo, Schleif, “Two Positively Regulated Systems, ara and mal,” pp. 1300-1309 em Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology, Segunda edição, Neidhardt et al., eds., ASM Press, Washington, D.C., 1996; e Boos, W. e Shuman, H., “Maltose/Maltodextrin System of Escherichia coli: Transport, Metabolism and Regulation,” Microbiology and Molecular Biology Reviews, 62(1 ):204-229 (1998)), cujos conteúdos estão aqui incorporados na íntegra.

[0092] Outros promotores responsivos à maltose usados nos métodos e composições aqui fornecidos incluem os em Berkner et al., “Inducible and constitutive promotors for genetic systems in Sulfolobus acidocaldarious, ” Extremophiles 14:249-259 (2010); e patente U.S. no. 5.824.545.

5.3.1.1 Alvos de promotor responsivo à regulação de maltose

[0093] Em algumas modalidades, os métodos aqui fornecidos utilizam células hospedeiras geneticamente modificadas que compreendem um ácido nucleico heterólogo que codifica uma ou mais enzimas de um caminho enzimático para o preparo do composto não catabólico heterólogo. Em algumas modalidades, a expressão de uma ou mais enzimas está mediante controle direto de um promotor responsivo à maltose aqui descrito. Isto é, uma ou mais sequências de ácidos nucleicos heterólogos que codificam uma ou mais enzimas do caminho enzimático são cada uma operavelmente ligada a (isto é, é posicionada 3’ de) um responsivo à maltose, e o promotor responsivo à maltose aciona a expressão de cada um dos ditos um ou mais ácidos nucleicos heterólogos na presença de maltose.

[0094] Em outras modalidades, expressão de uma ou mais enzimas de um caminho enzimático é indiretamente regulado pelo promotor responsivo à maltose. Por exemplo, regulação indireta de uma ou mais enzimas do caminho pode ser alcançada operavelmente ligando um promotor responsivo à maltose a um regulador transcripcional heterólogo único, cuja expressão, por sua vez, diretamente regula a expressão de uma ou mais enzimas (por exemplo, todos os membros) do caminho.

[0095] O GAL regulon em levedura, descrito em detalhe anteriormente, fornece uma rede regulatória exemplar de ativadores, repressores e promotores que podem ser utilizados em combinação com um promotor responsivo à maltose aqui descrito.

[0096] Em algumas modalidades, um ou mais promotores ativados por GAL4, por exemplo, pGALl, pGAL7, e/ou pGALlO, são operavelmente ligados, e são usados para acionar a expressão, a uma ou mais enzimas de um caminho enzimático para o preparo do composto não catabólico heterólogo. Em algumas modalidades, a célula hospedeira compreende adicionalmente um ácido nucleico que codifica GAL4. Em algumas modalidades, o produto do gene GAL4 é constitutivamente expresso, isto é, mediante o controle de um promotor constitutivo. Em algumas modalidades, a célula hospedeira compreende adicionalmente um ácido nucleico que codifica GAL80 mediante o controle de um promotor responsivo à maltose aqui descrito, e expressão do produto do gene GAL80 é induzida na presença de maltose. GalδOp, por sua vez, interage com Gal4p e previne atividade transcripcional de Gal4p. Quando maltose é removida ou suficientemente depletada, de maneira tal que expressão de GAL80 não seja mais induzida, Gal4p é aliviado da repressão por Gal80p, e é livre para ativar a expressão de uma ou mais enzimas de um caminho enzimático para o preparo do composto não catabólico heterólogo.

[0097] Em outras modalidades, o promotor de pGAL4 nativo é substituído por um ácido nucleico heterólogo compreendendo um promotor responsivo à maltose. Em algumas modalidades, a célula hospedeira compreende um ácido nucleico heterólogo compreendendo um ácido nucleico que codifica Gal4p, operavelmente ligado a um ácido nucleico heterólogo compreendendo promotor responsivo à maltose. Em uma modalidade, um promotor responsivo à maltose é operavelmente ligado a uma sequência de codificação para Gal4p, e as sequências de codificações de uma ou mais enzimas (por exemplo, todos os membros) do caminho enzimático para o preparo do composto não catabólico heterólogo são operavelmente ligadas aos promotores responsivos a GAL4, de maneira tal que a expressão de uma ou mais enzimas sejam induzidas na presença de maltose. Em algumas modalidades, o promotor responsivo a GAL4 é pGALl. Em algumas modalidades, o promotor responsivo a GAL4 é pGAL7. Em algumas modalidades, o promotor responsivo a GAL4 é pGALlO.

5.3.2 Quantidades de repressão e não repressão de maltose

[0098] Maltose é um açúcar dissacarídeo formado de 2 moléculas de glicose, conforme mostrado a seguir. Ela tem a fórmula química, C12H22O11, e um peso molecular de 343 g/mol.

[0099] Em algumas modalidades dos métodos aqui fornecidos, uma quantidade de maltose de “indução”, isto é, uma quantidade de maltose suficiente para induzir a expressão de uma sequência de codificação operavelmente ligada a um promotor responsivo à maltose, e uma quantidade de maltose de “não indução”, isto é, uma quantidade de maltose abaixo da qual a expressão de uma sequência de codificação operavelmente ligada a um promotor responsivo à maltose não é induzido, para uso nos métodos aqui fornecidos pode ser determinada por quaisquer células hospedeiras geneticamente modificadas capazes de produzir um composto não catabólico heterólogo. Em algumas modalidades, uma quantidade de maltose de não indução é determinada realizando uma curva de expressão do gene na presença de quantidades crescentes de maltose no meio de cultura a ser testado no processo de fermentação, isto é, uma titulação de maltose. Por exemplo, uma população de células hospedeiras geneticamente modificadas pode ser dividida em uma pluralidade de subpopulações e cultivadas em paralelo, em que cada subpopulação cresce em meios de cultura compreendendo uma quantidade de maltose diferente, por exemplo, crescente (incluindo sem maltose), e expressão do gene reportador ou produção de composto não catabólico é ensaiada depois de um período de tempo definido.

[00100] Em algumas modalidades, onde o promotor responsivo à maltose é ligado para realizar um estado “desligado” de produção de composto não catabólico na presença de maltose, a titulação de maltose compreende pelo menos duas concentrações de maltose, enquanto que a produção de composto não catabólico das células hospedeiras fica estável em um patamar a um mínimo, isto é, onde nenhuma diminuição adicional na produção do composto é observada com um aumento na em concentração de maltose. Em algumas modalidades, a quantidade de maltose de “repressão” é pelo menos a quantidade de maltose mínima na qual a produção de composto não catabólico das células hospedeiras fica em um platô em seu mínimo (por exemplo, em zero). Esta quantidade também pode ser referida como uma quantidade de maltose de “saturação” ou “ideal” para repressão de produção de composto não catabólico para a célula hospedeira particular. Em algumas tais modalidades, a quantidade de maltose de “repressão” pode incluir qualquer concentração de maltose na qual a produção de composto não catabólico diminuiu com relação a um estado “ligado”, mesmo onde há um nível de produção baixo do composto. Em algumas modalidades, a quantidade de maltose de não repressão, nesta configuração do interruptor, é qualquer quantidade de maltose abaixo da quantidade de maltose de “repressão”. Em algumas modalidades, a quantidade de maltose de não repressão é pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 ou maior que 100 vezes menos que a quantidade de maltose de repressão. Em uma modalidade particular, a quantidade de maltose de não repressão é menos que 0,8 % (p/v) do meio de cultura. Em uma outra modalidade particular, a quantidade de maltose de não repressão é menos que 0 % (p/v) do meio de cultura.

[00101] Em uma modalidade específica, a quantidade de maltose de repressão é a quantidade ideal ou de saturação para uma dada célula hospedeira, conforme descrito anteriormente, e a quantidade de não repressão é sem maltose. Em uma outra modalidade específica, a quantidade de maltose de repressão é pelo menos 0,25 %, e a quantidade de não repressão é sem maltose. Em uma outra modalidade específica, a quantidade de maltose de repressão é uma quantidade de maltose de 0,25 % a 3 %, e a quantidade de não repressão é sem maltose. Em uma outra modalidade específica, a quantidade de maltose de repressão é pelo menos 3 %, e a quantidade limitante é sem maltose.

[00102] Em algumas modalidades onde o promotor responsivo à maltose é ligado para realizar um estado “desligado” de produção de composto não catabólico na presença de maltose, a quantidade de maltose de repressão no meio de cultura é pelo menos 0,1 % (peso de maltose por volume de meio de cultura). Em algumas modalidades, a quantidade de maltose de repressão no meio de cultura é pelo menos 0,25 %. Em algumas modalidades, a quantidade de maltose de repressão no meio de cultura é pelo menos 0,5 %. Em algumas modalidades, a quantidade de maltose de repressão no meio de cultura é pelo menos 0,75 %. Em algumas modalidades, a quantidade de maltose de repressão no meio de cultura é pelo menos 1,0 %. Em algumas modalidades, a quantidade de maltose de repressão no meio de cultura é pelo menos 1,25 %. Em algumas modalidades, a quantidade de maltose de repressão no meio de cultura é pelo menos 1,5 %. Em algumas modalidades, a quantidade de maltose de repressão no meio de cultura é pelo menos 1,75 %. Em algumas modalidades, a quantidade de maltose de repressão no meio de cultura é pelo menos 2,0 %. Em algumas modalidades, a quantidade de maltose de repressão no meio de cultura é pelo menos 2,25 %. Em algumas modalidades, a quantidade de maltose de repressão no meio de cultura é pelo menos 2,5 %. Em algumas modalidades, a quantidade de maltose de repressão no meio de cultura é pelo menos 2,75 %. Em algumas modalidades, a quantidade de maltose de repressão no meio de cultura é pelo menos 3,0 %. Em algumas modalidades, a quantidade de maltose de repressão no meio de cultura é pelo menos 3,25 %. Em algumas modalidades, a quantidade de maltose de repressão no meio de cultura é pelo menos 3,5 %. Em algumas modalidades, a quantidade de maltose de repressão no meio de cultura é pelo menos 3,75 %. Em algumas modalidades, a quantidade de maltose de repressão no meio de cultura é pelo menos 4,0 %. Em algumas modalidades, a quantidade de maltose de repressão no meio de cultura é pelo menos 4,25 %. Em algumas modalidades, a quantidade de maltose de repressão no meio de cultura é pelo menos 4,5 %. Em algumas modalidades, a quantidade de maltose de repressão no meio de cultura é pelo menos 4,75 %. Em algumas modalidades, a quantidade de maltose de repressão no meio de cultura é pelo menos 5,0 %. Em algumas modalidades, a quantidade de maltose de repressão no meio de cultura é entre 5 % e 50 %. Em algumas modalidades, a quantidade de maltose de repressão no meio de cultura é cerca de 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 % 45 % ou cerca de 50 %.

[00103] Em algumas modalidades, a quantidade de maltose de não repressão é uma quantidade que é pelo menos 2 vezes, 10 vezes, 100 vezes, 1000 vezes, 10.000 vezes ou 100.000 vezes menos que uma quantidade de maltose de repressão conforme determinado de acordo com os métodos descritos anteriormente. Em algumas modalidades, a quantidade de maltose de não repressão é uma quantidade que é pelo menos 2 vezes, 10 vezes, 100 vezes, 1000 vezes, 10.000 vezes ou 100.000 vezes menos que a quantidade de maltose de saturação conforme determinado de acordo com os métodos descritos anteriormente. Em algumas modalidades, a quantidade de maltose de não repressão é uma quantidade que é menos que 50 %, menos que 20 %, menos que 10 %, menos que 1 %, menos que 0,5 %, menos que 0,2 %, menos que 0,1 %, menos que 0,01 %, ou menos que 0,001 % de uma quantidade de maltose de repressão, conforme determinado de acordo com os métodos descritos anteriormente. Em algumas modalidades, a quantidade de maltose de não repressão é uma quantidade que é menos que 50 %, menos que 20 %, menos que 10 %, menos que 1 %, menos que 0,1 %, menos que 0,01 %, ou menos que 0,001 % da quantidade de maltose de saturação, conforme determinado de acordo com os métodos descritos anteriormente. Em uma modalidade específica, a quantidade de maltose de não repressão é 0 mg/L (0 %), isto é, sem maltose. Assim, nesta modalidade específica, as células hospedeiras crescem durante o estágio de produção em um meio de cultura de célula que não compreende nenhuma fonte externa de maltose.

[00104] Em algumas modalidades, onde o promotor responsivo à maltose é ligado para realizar um estado “ligado” de produção de composto não catabólico na presença de maltose, a titulação de maltose compreende pelo menos duas concentrações de maltose, enquanto que a produção de composto não catabólico das células hospedeiras fica em um platô a um máximo, isto é, onde nenhum aumento adicional na produção do composto é observado com um aumento na concentração de maltose. Em algumas modalidades, a quantidade de maltose “de não repressão” é pelo menos a quantidade de maltose mínima na qual a produção de composto não catabólico das células hospedeiras fica em um platô em seu máximo. Esta quantidade também pode ser referida como uma quantidade de maltose de “saturação” ou “ideal” para a indução de produção de composto não catabólico para a célula hospedeira particular, nesta configuração do interruptor. Em algumas tais modalidades, a quantidade de maltose de “indução” pode incluir qualquer concentração de maltose na qual a produção de composto não catabólico foi aumentada com relação a um estado “desligado”, mesmo onde a produção do composto é subideal. Em algumas modalidades, a quantidade de maltose de não indução, nesta configuração do interruptor, é qualquer quantidade de maltose abaixo da quantidade de maltose de “indução”. Em algumas modalidades, a quantidade de maltose de não indução é pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 ou maior que 100 vezes menos que a quantidade de maltose de indução. Em uma modalidade particular, a quantidade de maltose de não indução é menos que 0,8 % (p/v) do meio de cultura. Em uma outra modalidade particular, a quantidade de maltose de não indução é menos que 0 % (p/v) do meio de cultura.

[00105] Em uma modalidade específica, a quantidade de maltose de indução é a quantidade ideal ou de saturação para uma dada célula hospedeira, conforme descrito anteriormente, e a quantidade de não indução é sem maltose. Em uma outra modalidade específica, a quantidade de maltose de indução é pelo menos 0,25 %, e a quantidade de não indução é sem maltose. Em uma outra modalidade específica, a quantidade de maltose de indução é uma quantidade de maltose de 0,25 % a 3 %, e a quantidade de não indução é sem maltose. Em uma outra modalidade específica, a quantidade de maltose de indução é pelo menos 3 %, e a quantidade limitante é sem maltose.

[00106] Em algumas modalidades onde o promotor responsivo à maltose é ligado para realizar um estado “ligado” de produção de composto não catabólico na presença de maltose, a quantidade de maltose de indução no meio de cultura é pelo menos 0,1 % (peso de maltose por volume de meio de cultura). Em algumas modalidades, a quantidade de maltose de indução no meio de cultura é pelo menos 0,25 %. Em algumas modalidades, a quantidade de maltose de indução no meio de cultura é pelo menos 0,5 %. Em algumas modalidades, a quantidade de maltose de indução no meio de cultura é pelo menos 0,75 %. Em algumas modalidades, a quantidade de maltose de indução no meio de cultura é pelo menos 1,0 %. Em algumas modalidades, a quantidade de maltose de indução no meio de cultura é pelo menos 1,25 %. Em algumas modalidades, a quantidade de maltose de indução no meio de cultura é pelo menos 1. Em algumas modalidades, a quantidade de maltose de indução no meio de cultura é pelo menos 1,75 %. Em algumas modalidades, a quantidade de maltose de indução no meio de cultura é pelo menos 2,0 %. Em algumas modalidades, a quantidade de maltose de indução no meio de cultura é pelo menos 2,25 %. Em algumas modalidades, a quantidade de maltose de indução no meio de cultura é pelo menos 2,5 %. Em algumas modalidades, a quantidade de maltose de indução no meio de cultura é pelo menos 2,75 %. Em algumas modalidades, a quantidade de maltose de indução no meio de cultura é pelo menos 3,0 %. Em algumas modalidades, a quantidade de maltose de indução no meio de cultura é pelo menos 3,25 %. Em algumas modalidades, a quantidade de maltose de indução no meio de cultura é pelo menos 3,5 %. Em algumas modalidades, a quantidade de maltose de indução no meio de cultura é pelo menos 3,75 %. Em algumas modalidades, a quantidade de maltose de indução no meio de cultura é pelo menos 4,0 %. Em algumas modalidades, a quantidade de maltose de indução no meio de cultura é pelo menos 4,25 %. Em algumas modalidades, a quantidade de maltose de indução no meio de cultura é pelo menos 4,5 %. Em algumas modalidades, a quantidade de maltose de indução no meio de cultura é pelo menos 4,75 %. Em algumas modalidades, a quantidade de maltose de indução no meio de cultura é pelo menos 5,0 %. Em algumas modalidades, a quantidade de maltose de indução no meio de cultura é entre 5 % e 50 %. Em algumas modalidades, a quantidade de maltose de indução no meio de cultura é cerca de 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 % 45 % ou cerca de 50 %.

[00107] Em algumas modalidades, a quantidade de maltose de não repressão é uma quantidade que é pelo menos 2 vezes, 10 vezes, 100 vezes, 1000 vezes, 10.000 vezes ou 100.000 vezes menos que uma quantidade de maltose de repressão conforme determinado de acordo com os métodos descritos anteriormente. Em algumas modalidades, a quantidade de maltose de não repressão é uma quantidade que é pelo menos 2 vezes, 10 vezes, 100 vezes, 1000 vezes, 10.000 vezes ou 100.000 vezes menos que a quantidade de maltose de saturação conforme determinado de acordo com os métodos descritos anteriormente. Em algumas modalidades, a quantidade de maltose de não repressão é uma quantidade que é menos que 50 %, menos que 20 %, menos que 10 %, menos que 1 %, menos que 0,5 %, menos que 0,2 %, menos que 0,1 %, menos que 0,01 %, ou menos que 0,001 % de uma quantidade de maltose de repressão conforme determinado de acordo com os métodos descritos anteriormente. Em algumas modalidades, a quantidade de maltose de não repressão é uma quantidade que é menos que 50 %, menos que 20 %, menos que 10 %, menos que 1 %, menos que 0,1 %, menos que 0,01 %, ou menos que 0,001 % da quantidade de maltose de saturação conforme determinado de acordo com os métodos descritos anteriormente. Em uma modalidade específica, a quantidade de maltose de não repressão é 0 mg/L (0 %), isto é, sem maltose. Assim, nesta modalidade específica, as células hospedeiras crescem durante o estágio de produção em um meio de cultura de célula que não compreende nenhuma fonte externa de maltose.

5.3.3 Produção de produtos não catabólicos

[00108] Em algumas modalidades dos métodos de fermentação aqui fornecidos, a utilização tanto der um promotor responsivo microaeróbico em combinação com manipulação de oxigênio condições, quanto de um promotor responsivo à maltose em combinação com condições de manipulação de maltose, a produção do composto não catabólico durante o estágio de preparo (etapa (a) dos métodos descritos anteriormente) é menos que 50, 40, 30, 20 ou 10 % da produção de composto não catabólico máxima das células hospedeiras geneticamente modificadas, por exemplo, a quantidade de produção de composto não catabólico quando a célula hospedeira é cultivada durante o estágio de produção (etapa (b) dos métodos descritos anteriormente).

[00109] Os períodos de tempo durante os quais o estágio de preparo e estágio de produção do processo de fermentação são realizados podem variar e dependerão de fatores, tais como as taxas de crescimento da célula hospedeira, da taxa de crescimento intrínseca da célula hospedeira; e outras condições de cultura, tais como o pH, temperatura, dependendo dos requerimentos específicos da célula hospedeira, da fermentação, e do processo. Entretanto, espera-se que qualquer duração do estágio de preparo resulta em algum benefício para a produtividade final da fermentação, uma vez que alguma quantidade da pressão seletiva negativa associada com produção de composto não catabólico é aliviada no estado “desligado”.

[00110] Em algumas modalidades, o estágio de preparo é realizado por um período de tempo suficiente para produzir uma quantidade de biomassa celular que pode suportar a produção do composto não catabólico durante o estágio de produção. Em algumas modalidades, o estágio de preparo é realizado por um período de tempo suficiente para a população presente no tempo de inoculação para se submeter a uma pluralidade de pareamentos até que uma densidade celular desejada seja alcançada. Em algumas modalidades, o estágio de preparo é realizado por um período de tempo suficiente para a população de célula hospedeira alcançar uma densidade celular (ODÓOO) entre 0,01 e 400 no vaso ou recipiente de fermentação no qual o estágio de preparo é realizado. Em algumas modalidades, o estágio de preparo é realizado até que um ODÓOO de pelo menos 0,01 seja alcançado. Em algumas modalidades, o estágio de preparo é realizado até que um ODÓOO de pelo menos 0,1 seja alcançado. Em algumas modalidades, o estágio de preparo é realizado até que um ODÓOO de pelo menos 1,0 seja alcançado. Em algumas modalidades, o estágio de preparo é realizado até que um ODÓOO de pelo menos 10 seja alcançado. Em algumas modalidades, o estágio de preparo é realizado até que um ODÓOO de pelo menos 100 seja alcançado. Em algumas modalidades, o estágio de preparo é realizado até que um ODÓOO entre 0,01 e 100 seja alcançado. Em algumas modalidades, o estágio de preparo é realizado até que um ODÓOO entre 0,1 e 10 seja alcançado. Em algumas modalidades, o estágio de preparo é realizado até que um ODÔOO entre 1 e 100 seja alcançado. Em outras modalidades, o estágio de preparo é realizado por um período de pelo menos 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96 ou mais que 96 horas.

[00111] Em algumas modalidades, o estágio de produção é realizado por um período de tempo suficiente para produzir uma quantidade desejada do composto não catabólico. Em algumas modalidades, o estágio de produção é realizado por um período de pelo menos 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96 ou mais que 96 horas.

[00112] Em algumas modalidades, o estágio de produção é realizado por um período de entre 3 e 20 dias. Em algumas modalidades, o estágio de produção é realizado por um período de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou mais que 20 dias.

[00113] Em uma modalidade particular, o método de produzir um composto não catabólico compreende conduzir a fermentação das células hospedeiras geneticamente modificadas em condições aeróbicas suficientes para permitir o crescimento e manutenção das células hospedeiras geneticamente modificadas; então subsequentemente fornecer as condições de fermentação microaeróbicas suficientes para induzir a produção do composto não catabólico, e manter as condições microaeróbicas em toda a corrida de fermentação.

[00114] Em uma outra modalidade, o método de produzir um composto não catabólico compreende cultivar as células hospedeiras em meio de cultura de construção ou de produção separados. Por exemplo, o método pode compreender cultivar as células hospedeiras geneticamente modificadas em um estágio de preparo em que a célula é cultivada em condições de não produção para produzir um inoculo, então transferir o inoculo em um segundo meio de fermentação em condições adequadas para induzir a produção do composto, e manter condições de estado estável no segundo estágio de fermentação para produzir uma cultura de célula contendo um produto não catabólico.

[00115] Em algumas modalidades, o método aqui fornecido é suficiente para produzir um ou mais composto não catabólicos em uma quantidade maior que cerca de 10 gramas por litro de meio de fermentação. Em algumas tais modalidades, o composto derivado não catabólico é produzido em uma quantidade de cerca de 10 a cerca de 50 gramas, mais que cerca de 15 gramas, mais que cerca de 20 gramas, mais que cerca de 25 gramas, ou mais que cerca de 30 gramas por litro de cultura de célula.

[00116] Em algumas modalidades, o método aqui fornecido é suficiente para produzir um ou mais composto não catabólicos em uma quantidade maior que cerca de 50 miligramas por grama de peso de célula seco. Em algumas modalidades, o composto recombinantemente produzido não catabólico é produzido em uma quantidade de cerca de 50 a cerca de 1500 miligramas, mais que cerca de 100 miligramas, mais que cerca de 150 miligramas, mais que cerca de 200 miligramas, mais que cerca de 250 miligramas, mais que cerca de 500 miligramas, mais que cerca de 750 miligramas, ou mais que cerca de 1000 miligramas por grama de peso de célula seco.

[00117] Em algumas modalidades, a prática do método aqui fornecido resulta em maior produção do composto não catabólico pela população de células hospedeiras geneticamente modificadas, comparada à produção que resulta de um método que não compreende um estágio de preparo durante o qual as células hospedeiras são cultivadas em condições de não produção. Em algumas modalidades, a prática do método resulta na produção de um ou mais composto não catabólicos em uma quantidade que é pelo menos cerca de 10 %, pelo menos cerca de 15 %, pelo menos cerca de 20 %, pelo menos cerca de 25 %, pelo menos cerca de 30 %, pelo menos cerca de 35 %, pelo menos cerca de 40 %, pelo menos cerca de 45 %, pelo menos cerca de 50 %, pelo menos cerca de 60 %, pelo menos cerca de 70 %, pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 90 %, pelo menos cerca de 2 vezes, pelo menos cerca de 2.5 vezes, pelo menos cerca de 5 vezes, pelo menos cerca de 10 vezes, pelo menos cerca de 20 vezes, pelo menos cerca de 30 vezes, pelo menos cerca de 40 vezes, pelo menos cerca de 50 vezes, pelo menos cerca de 75 vezes, pelo menos cerca de 100 vezes, pelo menos cerca de 200 vezes, pelo menos cerca de 300 vezes, pelo menos cerca de 400 vezes, pelo menos cerca de 500 vezes, ou pelo menos cerca de 1.000 vezes, ou mais, maior que a quantidade de composto não catabólico produzida por um método que não compreende um estágio de preparo durante o qual as células hospedeiras são cultivadas em condições de não produção, em um volume por unidade de base de cultura de célula.

[00118] Em algumas modalidades, a prática do método resulta na produção de um ou mais composto não catabólicos em uma quantidade que é pelo menos cerca de 10 %, pelo menos cerca de 15 %, pelo menos cerca de 20 %, pelo menos cerca de 25 %, pelo menos cerca de 30 %, pelo menos cerca de 35 %, pelo menos cerca de 40 %, pelo menos cerca de 45 %, pelo menos cerca de 50 %, pelo menos cerca de 60 %, pelo menos cerca de 70 %, pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 90 %, pelo menos cerca de 2 vezes, pelo menos cerca de 2.5 vezes, pelo menos cerca de 5 vezes, pelo menos cerca de 10 vezes, pelo menos cerca de 20 vezes, pelo menos cerca de 30 vezes, pelo menos cerca de 40 vezes, pelo menos cerca de 50 vezes, pelo menos cerca de 75 vezes, pelo menos cerca de 100 vezes, pelo menos cerca de 200 vezes, pelo menos cerca de 300 vezes, pelo menos cerca de 400 vezes, pelo menos cerca de 500 vezes, ou pelo menos cerca de 1.000 vezes, ou mais, maior que a quantidade de composto não catabólico produzida por um método que não compreende um estágio de preparo durante o qual as células hospedeiras são cultivadas em condições de não produção, em uma base de peso de célula seco por unidade.

[00119] Em algumas modalidades, a prática do método resulta na produção de um ou mais composto não catabólicos em uma quantidade que é pelo menos cerca de 10 %, pelo menos cerca de 15 %, pelo menos cerca de 20 %, pelo menos cerca de 25 %, pelo menos cerca de 30 %, pelo menos cerca de 35 %, pelo menos cerca de 40 %, pelo menos cerca de 45 %, pelo menos cerca de 50 %, pelo menos cerca de 60 %, pelo menos cerca de 70 %, pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 90 %, pelo menos cerca de 2 vezes, pelo menos cerca de 2.5 vezes, pelo menos cerca de 5 vezes, pelo menos cerca de 10 vezes, pelo menos cerca de 20 vezes, pelo menos cerca de 30 vezes, pelo menos cerca de 40 vezes, pelo menos cerca de 50 vezes, pelo menos cerca de 75 vezes, pelo menos cerca de 100 vezes, pelo menos cerca de 200 vezes, pelo menos cerca de 300 vezes, pelo menos cerca de 400 vezes, pelo menos cerca de 500 vezes, ou pelo menos cerca de 1.000 vezes, ou mais, maior que a quantidade de composto não catabólico produzida por um método que não compreende um estágio de preparo durante o qual as células hospedeiras são cultivadas em condições de não produção, em uma base de volume por unidade de cultura de célula por unidade de tempo.

[00120] Em algumas modalidades, a prática do método resulta na produção de um ou mais composto não catabólicos em uma quantidade que é pelo menos cerca de 10 %, pelo menos cerca de 15 %, pelo menos cerca de 20 %, pelo menos cerca de 25 %, pelo menos cerca de 30 %, pelo menos cerca de 35 %, pelo menos cerca de 40 %, pelo menos cerca de 45 %, pelo menos cerca de 50 %, pelo menos cerca de 60 %, pelo menos cerca de 70 %, pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 90 %, pelo menos cerca de 2 vezes, pelo menos cerca de 2.5 vezes, pelo menos cerca de 5 vezes, pelo menos cerca de 10 vezes, pelo menos cerca de 20 vezes, pelo menos cerca de 30 vezes, pelo menos cerca de 40 vezes, pelo menos cerca de 50 vezes, pelo menos cerca de 75 vezes, pelo menos cerca de 100 vezes, pelo menos cerca de 200 vezes, pelo menos cerca de 300 vezes, pelo menos cerca de 400 vezes, pelo menos cerca de 500 vezes, ou pelo menos cerca de 1.000 vezes, ou mais, maior que o quantidade de composto não catabólico produzido por um método que não compreende um estágio de preparo durante o qual as células hospedeiras são cultivadas em condições de não produção, em uma base de peso de célula seco por unidade de tempo por unidade.

5.3.4 Meios e condições de cultura

[00121] Materiais e métodos para a manutenção e crescimento de culturas microbianas são bem conhecidos por versados na tecnologia de ciência de microbiologia ou fermentação (ver, por exemplo, Bailey et al., Biochemical Engineering Fundamentals, segunda edição, McGraw Hill, New York, 1986). Deve ser dada consideração ao meio de cultura, pH, temperatura, e requerimentos apropriados para condições aeróbicas, microaeróbicas ou anaeróbicas, dependendo dos requerimentos específicos da célula hospedeira, da fermentação e do processo.

[00122] Os métodos de produzir compostos não catabólicos aqui fornecidos podem ser realizados em um meio de cultura adequado em um recipiente adequado, mas sem limitações uma placa de cultura celular, um frasco ou um fermentador. Ainda, os métodos podem ser realizados em qualquer escala de fermentação conhecida na tecnologia para suportar produção industrial de produtos microbianos. Qualquer fermentador adequado pode ser usado incluindo um fermentador de tanque agitado, um fermentador de levantamento de ar, um fermentador de bolha ou qualquer combinação destes. Em modalidades particulares que utilizam Saccharomyces cerevisiae como a célula hospedeira, tensões podem crescer em um fermentador, conforme descrito em detalhe por Kosaric, et al, em Ullmann's Enciclopédia of Industrial Chemistry, Sexta edição, Volume 12, páginas 398-473, Wiley- VCH Verlag GmbH & Co. KDaA, Weinheim, Alemanha. Ainda, os métodos podem ser realizados em qualquer volume de fermentação, por exemplo, fermentações de escala de laboratório (por exemplo, 10 mL a 20 L) a escala piloto (por exemplo, 20 L a 500 L) a escala industrial (por exemplo, 500 L a >500.000 L).

[00123] Em algumas modalidades, o meio de cultura para uso nos métodos de produzir compostos não catabólicos conforme aqui fornecido inclui qualquer meio de cultura no qual um micro-organismo geneticamente modificado capaz de produzir um composto não catabólico pode subsistir, isto é, suportar e manter o crescimento e viabilidade. Em algumas modalidades, o meio de cultura, também promove o caminho biossintético necessário para produzir o composto não catabólico desejado.

[00124] Em algumas modalidades, o meio de cultura é um meio aquoso compreendendo fontes assimiláveis de carbono, nitrogênio e fosfato. Um meio como este também pode incluir sais, minerais, metais e outros nutrientes apropriados. Em algumas modalidades, a fonte de carbono e cada um dos nutrientes celulares essenciais são adicionados incremental ou continuamente aos meios de fermentação e cada nutriente requerido é mantido no nível essencialmente mínimo necessário para assimilação eficiente por crescimento das células, por exemplo, de acordo com uma curva de crescimento da célula predeterminada com base na função metabólica ou respiratória das células que convertem a fonte de carbono a uma biomassa.

[00125] Condições adequadas e meios adequados para cultivar microorganismos são bem conhecidos na tecnologia. Em algumas modalidades, o meio adequado é suplementado com um ou mais agentes adicionais, tais como, por exemplo, um indutor (por exemplo, quando uma ou mais sequências de nucleotídeos que codificam um produto do gene estão mediante o controle de um promotor indutível), um repressor (por exemplo, quando uma ou mais sequências de nucleotídeos que codificam um produto do gene estão mediante o controle de um promotor repressível), ou um agente de seleção (por exemplo, um antibiótico para selecionar micro-organismos compreendendo as modificações genéticas).

[00126] Em algumas modalidades, a fonte de carbono é um monossacarídeo (açúcar simples), um dissacarídeo, um polissacarídeo, uma fonte de carbono não fermentável ou uma ou mais combinações destes. Exemplos não limitantes de monossacarídeos adequados incluem glicose, galactose, manose, frutose, ribose e combinações destes. Exemplos não limitantes de dissacarídeos adequados incluem sacarose, lactose, maltose, trealose, celobiose e combinações destes. Exemplos não limitantes de polissacarídeos adequados incluem amido, glicogênio, celulose, quitina e combinações destes. Exemplos não limitantes de fontes de carbono não fermentáveis adequadas incluem acetato e glicerol.

[00127] A concentração de uma fonte de carbono, tal como glicose, no meio de cultura deve promover o crescimento da célula, mas não ser tão alta para reprimir o crescimento do micro-organismo usado. Tipicamente, culturas são corridas com uma fonte de carbono, tal como glicose, sendo adicionada em níveis para alcançar o nível de crescimento e biomassa desejados, mas em níveis não detectáveis (com limites de detecção sendo cerca de <0,1 g/L). Em outras modalidades, a concentração de uma fonte de carbono, tal como glicose, no meio de cultura é maior que cerca de 1 g/L, preferivelmente maior que cerca de 2 g/L, e mais preferivelmente maior que cerca de 5 g/L. Além do mais, a concentração de uma fonte de carbono, tal como glicose, no meio de cultura é tipicamente menos que cerca de 100 g/L, preferivelmente menos que cerca de 50 g/L, e mais preferivelmente menos que cerca de 20 g/L. Deve-se notar que referências às concentrações do componente da cultura podem ser tanto às concentrações do componente inicial e/ou em andamento. Em alguns casos, pode ser desejável permitir que o meio de cultura seja depletado de uma fonte de carbono durante a cultura.

[00128] Fontes de nitrogênio assimiláveis que podem ser usadas em um meio de cultura adequado incluem, mas sem limitações, fontes de nitrogênio simples, fontes de nitrogênio orgânico e fontes de nitrogênio complexas. Tais fontes de nitrogênio incluem amónia anidra, sais de amónio e substâncias de origem animal, vegetal e/ou microbiana. Fontes de nitrogênio adequadas incluem, mas sem limitações, hidrolisados de proteína, hidrolisados de biomassa microbiana, peptona, extrato de levedura, sulfato de amónio, ureia e aminoácidos. Tipicamente, a concentração das fontes de nitrogênio no meio de cultura é maior que cerca de 0,1 g/L, preferivelmente maior que cerca de 0,25 g/L, e mais preferivelmente maior que cerca de 1,0 g/L. Além de certas concentrações, entretanto, a adição de uma fonte de nitrogênio ao meio de cultura não é vantajosa para o crescimento dos micro- organismos. Como um resultado, a concentração das fontes de nitrogênio no meio de cultura é menos que cerca de 20 g/L, preferivelmente menos que cerca de 10 g/L e mais preferivelmente menos que cerca de 5 g/L. Adicionalmente, em alguns casos pode ser desejável permitir que o meio de cultura seja depletado das fontes de nitrogênio durante a cultura.

[00129] O meio de cultura efetivo pode conter outros compostos, tais como sais inorgânicos, vitaminas, traços de metais ou promotores de crescimento. Tais outros compostos também podem estar presentes em fontes de carbono, nitrogênio ou mineral no meio efetivo ou pode ser adicionado especificamente ao meio.

[00130] O meio de cultura também pode conter uma fonte de fosfato adequada. Tais fontes de fosfato incluem tanto fontes inorgânicas quanto orgânicas. Fontes de fosfato preferidas incluem, mas sem limitações, fosfato sais, tais como fosfatos de sódio e potássio mono ou dibásicos, fosfato de amónio e misturas destes. Tipicamente, a concentração de fosfato no meio de cultura é maior que cerca de 1,0 g/L, preferivelmente maior que cerca de 2,0 g/L e mais preferivelmente maior que cerca de 5,0 g/L. Além de certas concentrações, entretanto, a adição de fosfato ao meio de cultura não é vantajosa para o crescimento dos micro-organismos. Desta maneira, a concentração de fosfato no meio de cultura é tipicamente menos que cerca de 20 g/L, preferivelmente menos que cerca de 15 g/L e mais preferivelmente menos que cerca de 10 g/L.

[00131] Um meio de cultura adequado também pode incluir uma fonte de magnésio, preferivelmente na forma de um sal físiologicamente aceitável, tais como sulfato de magnésio heptaidratado, embora outras fontes de magnésio em concentrações que contribuem com quantidades similares de magnésio possam ser usadas. Tipicamente, a concentração de magnésio no meio de cultura é maior que cerca de 0,5 g/L, preferivelmente maior que cerca de 1,0 g/L, e mais preferivelmente maior que cerca de 2,0 g/L. Além de certas concentrações, entretanto, a adição de magnésio ao meio de cultura não é vantajosa para o crescimento dos micro-organismos. Desta maneira, a concentração de magnésio no meio de cultura é tipicamente menos que cerca de 10 g/L, preferivelmente menos que cerca de 5 g/L, e mais preferivelmente menos que cerca de 3 g/L. Adicionalmente, em alguns casos pode ser desejável permitir que o meio de cultura seja depletado de uma fonte de magnésio durante a cultura.

[00132] Em algumas modalidades, o meio de cultura também pode incluir um agente quelante biologicamente aceitável, tal como o citrato de tri- sódio di-idratado. Em tal caso, a concentração de um agente quelante no meio de cultura é maior que cerca de 0,2 g/L, preferivelmente maior que cerca de 0,5 g/L, e mais preferivelmente maior que cerca de 1 g/L. Além de certas concentrações, entretanto, a adição de um agente quelante ao meio de cultura não é vantajosa para o crescimento dos micro-organismos. Desta maneira, a concentração de um agente quelante no meio de cultura é tipicamente menos que cerca de 10 g/L, preferivelmente menos que cerca de 5 g/L, e mais preferivelmente menos que cerca de 2 g/L.

[00133] O meio de cultura também inicialmente pode incluir um ácido ou base biologicamente aceitável para manter o pH desejado do meio de cultura. Ácidos biologicamente aceitáveis incluem, mas sem limitações, ácido clorídrico, ácido sulfurico, ácido nítrico, ácido fosfórico e misturas destes. Bases biologicamente aceitáveis incluem, mas sem limitações, hidróxido de amónio, hidróxido de sódio, hidróxido de potássio e misturas destes. Em algumas modalidades, a base usada é hidróxido de amónio.

[00134] O meio de cultura também pode incluir uma fonte de cálcio biologicamente aceitável incluindo, mas sem limitações, cloreto de cálcio. Tipicamente, a concentração da fonte de cálcio, tais como cloreto de cálcio, di-idratado, no meio de cultura é na faixa de cerca de 5 mg/L a cerca de 2000 mg/L, preferivelmente na faixa de cerca de 20 mg/L a cerca de 1000 mg/L, e mais preferivelmente na faixa de cerca de 50 mg/L a cerca de 500 mg/L.

[00135] O meio de cultura também pode incluir cloreto de sódio. Tipicamente, a concentração de cloreto de sódio no meio de cultura é na faixa de cerca de 0,1 g/L a cerca de 5 g/L, preferivelmente na faixa de cerca de 1 g/L a cerca de 4 g/L, e mais preferivelmente na faixa de cerca de 2 g/L a cerca de 4 g/L.

[00136] Em algumas modalidades, o meio de cultura também pode incluir traços de metais. Tais traços de metais podem ser adicionados ao meio de cultura como uma solução de estoque que, para conveniência, pode ser preparada separadamente do resto do meio de cultura. Tipicamente, a quantidade de tais solução de traços de metais adicionada ao meio de cultura é maior que cerca de 1 ml/L, preferivelmente maior que cerca de 5 mL/L, e mais preferivelmente maior que cerca de 10 mL/L. Além de certas concentrações, entretanto, a adição de traços de metais ao meio de cultura não é vantajosa para o crescimento dos micro-organismos. Desta maneira, a quantidade de tais solução de traços de metais adicionada ao meio de cultura é tipicamente menos que cerca de 100 mL/L, preferivelmente menos que cerca de 50 mL/L, e mais preferivelmente menos que cerca de 30 mL/L. Deve-se notar que, além da adição de traços de metais em uma solução de estoque, os componentes individuais podem ser adicionados separadamente, cada um em faixas que correspondem independentemente às quantidades dos componentes impostas pelas faixas anteriores da solução de traços de metais.

[00137] O meio de cultura pode incluir outras vitaminas, tais como biotina, cálcio, pantotenato, inositol, piridoxina-HCl, e tiamina-HCl. Tais vitaminas podem ser adicionadas ao meio de cultura como uma solução de estoque que, para conveniência, pode ser preparada separadamente do resto do meio de cultura. Além de certas concentrações, entretanto, a adição de vitaminas ao meio de cultura não é vantajosa para o crescimento dos micro- organismos.

[00138] Os métodos de fermentação aqui descritos podem ser realizados em modos de cultura convencionais que incluem, mas sem limitações, lote, lote alimentado, reciclagem da célula, contínuo e semicontínuo. Em algumas modalidades, a fermentação é realizada em modo de lote alimentado. Em um caso como este, alguns dos componentes do meio são depletados durante a cultura durante o estágio de produção da fermentação. Em algumas modalidades, a cultura pode ser abastecida com concentrações relativamente altas de tais componentes no início, por exemplo, do estágio de produção, de maneira tal que crescimento e/ou produção de composto não catabólico é suportado por um período de tempo antes das adições serem requeridas. As faixas preferidas destes componentes são mantidas em toda a cultura fazendo adições à medida em que os níveis são depletados pela cultura. Os níveis dos componentes no meio de cultura podem ser monitorados, por exemplo, amostrando o meio de cultura periodicamente e ensaiando com relação às concentrações. Altemativamente, uma vez que um procedimento de cultura padrão é desenvolvido, adições podem ser feitas em intervalos cronometrados que correspondem aos níveis conhecidos em toda a cultura. Conforme versados na tecnologia perceberão, a taxa de consumo de nutriente aumenta durante a cultura à medida em que a densidade celular do meio aumenta. Além disso, para evitar a introdução de micro-organismos estranhos no meio de cultura, adição é realizada usando métodos de adição assépticos, conforme conhecido na tecnologia. Além do mais, uma pequena quantidade de agente antiespumante pode ser adicionada durante a cultura.

[00139] A temperatura do meio de cultura pode ser qualquer temperatura adequada para o crescimento das células geneticamente modificadas e/ou produção de composto não catabólicos. Por exemplo, antes da inoculação do meio de cultura com um inoculo, o meio de cultura pode ser levado e mantido a uma temperatura na faixa de cerca de 20 °C a cerca de 45 °C, preferivelmente a uma temperatura na faixa de cerca de 25 °C a cerca de 40 °C, e mais preferivelmente na faixa de cerca de 28 °C a cerca de 32 °C.

[00140] O pH do meio de cultura pode ser controlado pela adição de ácido ou base ao meio de cultura. Em tais casos quando amónia é usada para controlar o pH, ela também convenientemente serve como uma fonte de nitrogênio no meio de cultura. Preferivelmente, o pH é mantido de cerca de 3,0 a cerca de 8,0, mais preferivelmente de cerca de 3,5 a cerca de 7,0 e acima de tudo preferivelmente de cerca de 4,0 a cerca de 6,5.

[00141] Em algumas modalidades, a concentração da fonte de carbono, tais como a concentração de maltose ou glicose, do meio de cultura é monitorada durante a cultura. A concentração de glicose do meio de cultura pode ser monitorada usando técnicas conhecidas, tal como, por exemplo, uso do teste da enzima glicose ou cromatografia líquida de alta pressão, que podem ser usadas para monitorar a concentração de glicose no sobrenadante, por exemplo, um componente sem célula do meio de cultura, e os níveis de maltose podem ser similarmente monitorados. Conforme previamente estabelecido, a concentração da fonte de carbono deve ser mantida abaixo do nível no qual a inibição do crescimento da célula ocorre. Embora tal concentração possa variar de organismo para organismo, para glicose como uma fonte de carbono, a inibição do crescimento da célula ocorre em concentrações de glicose maiores que em cerca de 60 g/L, e pode ser determinada prontamente por experimento. Desta maneira, quando a glicose é usada como uma fonte de carbono, a glicose é preferivelmente alimentada no fermentador e mantida abaixo dos limites de detecção. Altemativamente, a concentração de glicose no meio de cultura é mantida na faixa de cerca de 1 g/L a cerca de 100 g/L, mais preferivelmente na faixa de cerca de 2 g/L a cerca de 50 g/L, e ainda mais preferivelmente na faixa de cerca de 5 g/L a cerca de 20 g/L. Embora a concentração da fonte de carbono possa ser mantida em níveis desejados pela adição, por exemplo, de uma solução de glicose substancialmente pura, é aceitável, e pode ser preferido, manter a concentração da fonte de carbono do meio de cultura pela adição de alíquotas do meio de cultura original. O uso de alíquotas do meio de cultura original pode ser desejável, em virtude de a concentrações de outros nutrientes no meio (por exemplo as fontes de nitrogênio e fosfato) poder ser mantida simultaneamente. Desta maneira, as concentrações de traços de metais podem ser mantidas no meio de cultura pela adição de alíquotas da solução de traços de metais.

5.3.5 Recuperação de compostos não catabólicos

[00142] Uma vez que o não catabólico é produzido pela célula hospedeira, ele pode ser recuperado ou isolado para uso subsequente que usa quaisquer métodos de separação e purificação adequados conhecidos na tecnologia. Em algumas modalidades, uma fase orgânica compreendendo o não catabólico é separada da fermentação por centrifugação. Em outras modalidades, uma fase orgânica compreendendo o composto não catabólico separado da fermentação espontaneamente. Em outras modalidades, uma fase orgânica compreendendo o composto derivado não catabólico é separada da fermentação adicionando um desemulsificante e/ou um agente de nucleação na reação de fermentação. Exemplos ilustrativos de desemulsificantes incluem floculantes e coagulantes. Exemplos ilustrativos de agentes de nucleação incluem gotículas do composto não catabólico em si e solventes orgânicos, tais como dodecano, miristrato de isopropila e oleato de metila.

[00143] O composto não catabólico produzido nestas células pode estar presente na cultura sobrenadante e/ou associado com as células hospedeiras. Em modalidades onde o composto não catabólico é associado com a célula hospedeira, a recuperação do não catabólico pode compreender um método de permeabilizar ou lisar as células. Alternativa ou simultaneamente, o não catabólico no meio de cultura pode ser recuperado usando um processo de recuperação incluindo, mas sem limitações, cromatografia, extração, extração com solvente, separação com membrana, eletrodiálise, osmose reversa, destilação, derivatização química e cristalização.

[00144] Em algumas modalidades, o composto não catabólico é separado de outros produtos que podem estar presentes na fase orgânica. Em algumas modalidades, a separação é alcançada usando técnicas de adsorção, destilação, extração gás-líquido (arraste), extração líquido-líquido (extração com solvente), ultrafiltração e técnicas cromatográficas padrão.

[00145] Em algumas modalidades, o composto não catabólico recuperado é puro, por exemplo, pelo menos cerca de 40 % puro, pelo menos cerca de 50 % puro, pelo menos cerca de 60 % puro, pelo menos cerca de 70 % puro, pelo menos cerca de 80 % puro, pelo menos cerca de 90 % puro, pelo menos cerca de 95 % puro, pelo menos cerca de 98 % puro, ou mais que 98 % puro, onde “puro” no contexto de um composto não catabólico refere-se a um composto não catabólico que é livre de outros compostos não catabólicos, contaminantes, etc.

5.4 Micro-organismos geneticamente modificados

[00146] Aqui fornecidos são micro-organismos geneticamente modificados (por exemplo, uma célula de Saccharomyces cerevisiae geneticamente modificado) que produz composto derivado de acetil-CoA heterólogo (não catabólico). Os micro-organismos geneticamente modificados produzem grandes quantidades de um ou mais compostos biossintetizados de acetil-CoA comparado a um micro-organismo pai que não tem as modificações genéticas aqui descritas.

[00147] Métodos para modificar geneticamente micróbios usando vetores de expressão ou construtos de integração cromossômica, por exemplo, para realizar maior produção de um ou mais compostos não catabólicos em uma célula hospedeira, são bem conhecidos na tecnologia. Ver, por exemplo, Sherman, F., et al., Methods Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1978); Guthrie, C., et al. (Eds.) Guide To Yeast Genetics and Molecular Biology Vol. 194, Academic Press, San Diego (1991); Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning — A Laboratory Manual, 3a edição, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY; e Ausubel et al., eds., Edição Atual, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, NY.; cujas descrições estão aqui incorporadas pela referência. Além do mais, a inibição da expressão do gene, por exemplo, que resulta em maior produção de um ou mais compostos não catabólicos na célula, pode ser realizada por deleção, mutação e/ou rearranjo do gene. Ela também pode ser realizada com o uso de RNA antissentido, siRNA, miRNA, ribozimas, DNA de fita tripla e inibidores de transcrição e/ou tradução. Além do mais, transposons podem ser empregados para romper a expressão do gene, por exemplo, inserindo-o entre o promotor e a região de codificação ou entre dois genes adjacentes para inativar um ou ambos os genes.

[00148] Em algumas modalidades, maior produção de composto não catabólico na célula é realizada pelo uso de vetores de expressão para expressar uma proteína particular, por exemplo, uma proteína envolvida em um caminho biossintético, conforme descrito anteriormente. Geralmente, vetores de expressão são moléculas recombinantes de polinucleotídeo compreendendo sinais de replicação e sequências de controle da expressão, por exemplo, promotores e terminadores, operativamente ligados a uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo. Vetores de expressão usados para expressar sequências de nucleotídeos que codificam polipeptídeo incluem vetores virais (por exemplo, retrovirus, adenovirus e vírus adeno- associados), vetores de plasmídeo e cosmídeos. Exemplos ilustrativos de vetores de expressão adequados para uso nas células de levedura incluem, mas sem limitações, plasmídeos CEN/ARS e 2μ. Exemplos ilustrativos de promotores adequados para uso nas células de levedura incluem, mas sem limitações, o promotor do gene TEF1 de K. lactis, o promotor do gene PGK1 de Saccharomyces cerevisiae, o promotor do gene TDH3 de Saccharomyces cerevisiae, promotores repressíveis, por exemplo, o promotor do gene CTR3 de Saccharomyces cerevisiae, e promotores indutíveis, por exemplo, promotores indutíveis de galactose de Saccharomyces cerevisiae (por exemplo, promotores dos genes GALI, GAL7, e GAL10).

[00149] Vetores de expressão e construtos de integração cromossômica podem ser introduzidos nas células microbianas por qualquer método conhecido por um versado na tecnologia, sem limitação. Ver, por exemplo, Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1292-3 (1978); Cregg et al., Mol. Célula. Biol. 5:3376-3385 (1985); patente U.S. No. 5.272.065; Goeddel et al., eds, 1990, Methods in Enzymology, vol. 185, Academic Press, Inc., CA; Krieger, 1990, Gene Transfer and Expression — A Laboratory Manual, Stockton Press, NY; Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning — A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY; e Ausubel et al., eds., Edição Atual, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates e Wiley Interscience, NY. Técnicas exemplares incluem, mas sem limitações, esferoplastia, eletroporação, transformação mediada por PEG 1000 e acetato de lítio ou transformação mediada por cloreto de lítio.

5.4.1 Células hospedeiras

[00150] Células usadas nos métodos e composições aqui fornecidos incluem qualquer célula capaz de natural ou recombinantemente produzir um composto não catabólico, por exemplo, um isoprenóide, um policetídeo, um ácido graxo e similares. Em algumas modalidades, a célula é uma célula procariótica. Em algumas modalidades, a célula é uma célula bacteriana. Em algumas modalidades, a célula é uma célula de Escherichia coli. Em algumas modalidades, a célula é uma célula eucariótica. Em algumas modalidades, a célula é uma célula mamífera. Em algumas modalidades, a célula é uma célula de ovário de hamster chinês (CHO), uma célula COS-7, uma célula de fibroblasto de camundongo, uma célula de carcinoma embrional de camundongo ou uma célula tronco embriônica de camundongo. Em algumas modalidades, a célula é uma célula de inseto. Em algumas modalidades, a célula é uma célula S2, uma célula de Schneider, uma célula SI2, uma célula 5B1-4, uma célula Tn5, ou uma célula Sf9. Em algumas modalidades, a célula é uma célula de organismo eucariótico unicelular.

[00151] Em algumas modalidades, a célula é uma célula bacteriana micelial. Em algumas modalidades, a célula bacteriana micelial é da classe de actinomivetos. Em modalidades particulares, a célula bacteriana micelial é dos gêneros Streptomyces, por exemplo, Streptomyces ambofaciens, Streptomyces avermitilis, Streptomyces azureus, Streptomyces cinnamonensis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces curacoi, Streptomyces erythraeus, Streptomyces fradiae, Streptomyces galilaeus, Streptomyces glaucescens, Streptomyces hygroscopicus, Streptomyces lividans, Streptomyces parvulus, Streptomyces peucetius, Streptomyces rimosus, Streptomyces roseofulvus, Streptomyces thermotolerans, Streptomyces violaceoruber.

[00152] Em uma outra modalidade, a célula é uma célula fúngica. Em uma modalidade mais particular, a célula é uma célula de levedura. Leveduras usadas nos métodos e composições aqui fornecidos incluem leveduras que foram depositadas com depósitos de micro-organismo (por exemplo IFO, ATCC, etc.) e pertence aos gêneros Aciculoconidium, Ambrosiozyma, Arthroascus, Arxiozyma, Ashbya, Babjevia, Bensingtonia, Botryoascus, Botryozyma, Brettanomyces, Bullera, Bulleromyces, Candida, Citeromyces, Clavispora, Cryptococcus, Cystofilobasidium, Debaryomyces, Dekkara, Dipodascopsis, Dipodascus, Eeniella, Endomycopsella, Eremascus, Eremothecium, Erythrobasidium, Fellomyces, Filobasidium, Galactomyces, Geotrichum, Guilliermondella, Hanseniaspora, Hansenula, Hasegawaea, Holtermannia, Hormoascus, Hyphopichia, Issatchenkia, Kloeckera, Kloeckeraspora, Kluyveromyces, Kondoa, Kuraishia, Kurtzmanomyces, Leucosporidium, Lipomyces, Lodderomyces, Malassezia, Metschnikowia, Mrakia, Myxozyma, Nadsonia, Nakazawaea, Nematospora, Ogataea, Oosporidium, Pachysolen, Phachytichospora, Phaffia, Pichia, Rhodosporidium, Rhodotorula, Saccharomyces, Saccharomycodes, Saccharomycopsis, Saitoella, Sakaguchia, Saturnospora, Schizoblastosporion, Schizosaccharomyces, Schwanniomyces, Sporidiobolus, Sporobolomyces, Sporopachydermia, Etapahanoascus, Sterigmatomyces, Sterigmatosporidium, Symbiotaphrina, Sympodiomyces, Sympodiomycopsis, Torulaspora, Trichosporiella, Trichosporon, Trigonopsis, Tsuchiyaea, Udeniomyces, Waltomyces, Wickerhamia, Wickerhamiella, Williopsis, Yamadazyma, Yarrowia, Zygoascus, Zygosaccharomyces, Zygowilliopsis, e Zygozyma, entre outros.

[00153] Em modalidades particulares, leveduras usadas nos métodos e composições aqui fornecidos incluem Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Schizosaccharomyces pombe, Dekkera bruxellensis, Kluyveromyces lactis (previamente chamado Saccharomyces lactis), Kluveromyces marxianus, Arxula adeninivorans, ou Hansenula polimorpha (agora conhecido como Pichia angusta). Em algumas modalidades, o micróbio é uma cepa do gênero Candida, tais como Candida lipolitica, Candida guilliermondii, Candida krusei, Candida pseudotropicalis, ou Candida utilis.

[00154] Em uma modalidade particular, a célula é uma célula de Saccharomyces cerevisiae. Em algumas modalidades, a cepa da célula de Saccharomyces cerevisiae é selecionada do grupo que consiste em levedura de Baker, CBS 7959, CBS 7960, CBS 7961, CBS 7962, CBS 7963, CBS 7964, IZ-1904, TA, BG-1, CR-1, SA-1, M-26, Y-904, PE-2, PE-5, VR-1, BR- 1, BR-2, ME-2, VR-2, MA-3, MA-4, CAT-1, CB-1, NR-1, BT-1, e AL-1. Em algumas modalidades, a cepa de Saccharomyces cerevisiae é selecionada do grupo que consiste em PE-2, CAT-1, VR-1, BG-1, CR-1, e SA-1. Em uma modalidade particular, a cepa de Saccharomyces cerevisiae é PE-2. Em uma outra modalidade particular, a cepa de Saccharomyces cerevisiae é CAT-1. Em uma outra modalidade particular, a cepa de Saccharomyces cerevisiae é BG-1.

[00155] Em algumas modalidades, o a é uma célula microbiana haplóide. Em outras modalidades, a célula é uma célula microbiana diplóide. Em algumas modalidades, a célula é heterozigota. Em outras modalidades, a célula é homozigota a não ser para seu alelo tipo par (isto é, se a célula deve esporular, as quatro células microbianas haplóides resultantes devem ser geneticamente idênticas, exceto seu alelo tipo par, que em duas das células haplóides deve ser tipo par de um e nas outras duas células haplóides deve ser tipo par alfa).

[00156] Em algumas modalidades, a célula é uma célula que é adequada para fermentação industrial, por exemplo, fermentação de bioetanol. Em modalidades particulares, a célula é condicionada para subsistir em alta concentração de solvente, alta temperatura, utilização de substrato expandida, limitação de nutriente, estresse osmótico devido à contaminação ácida, por sulfito bactérias ou combinações destes, que são condições de estresse reconhecidas do ambiente de fermentação industrial.

[00157] Composto não catabólico exemplar que produz células, por exemplo, células que produzem recombinantemente isoprenóides, policetídeos, e ácidos graxos, e métodos para gerar tais células, são fornecidos a seguir.

5.5 Produção de isoprenóides

[00158] Em algumas modalidades, o composto não catabólico é um isoprenóide. Isoprenóides são derivados de isopentenil pirofosfato (IPP), que pode ser biossintetizado por enzimas do caminho dependente de mevalonato (“MEV”) ou do caminho 1-deóxi-D-xilulose 5-difosfato (“DXP”).

5.5.1 Caminho MEV

[00159] Em algumas modalidades dos métodos aqui fornecidos, o micro-organismo geneticamente modificado compreende uma ou mais sequência de nucleotídeos heteróloga que codificam uma ou mais enzimas do caminho MEV, que efetuam maior produção de um ou mais compostos isoprenóides, comparado a uma célula pai geneticamente não modificada.

[00160] Em algumas modalidades, a célula que produz isoprenóide compreende uma sequência de nucleotídeos heteróloga que codifica uma enzima que pode condensar duas moléculas de acetil-coenzima A para formar acetoacetil-CoA, por exemplo, um acetil-CoA tiolase. Exemplos ilustrativos de sequências de nucleotídeos que codificam uma enzima como esta incluem, mas sem limitações: (NC_000913 REGION: 2324131.2325315; Escherichia coli), (D49362; Paracoccus denitrificans), e (L20428; Saccharomyces cerevisiae).

[00161] Em algumas modalidades, a célula que produz isoprenóide compreende uma sequência de nucleotídeos heteróloga que codifica uma enzima que pode condensar acetoacetil-CoA com uma outra molécula de acetil-CoA para formar 3-hidróxi-3-metilglutaril-CoA (HMG-CoA), por exemplo, um HMG-CoA sintase. Exemplos ilustrativos de sequências de nucleotídeos que codificam uma enzima como esta incluem, mas sem limitações: (NC_001145. complemento 19061.20536; Saccharomyces cerevisiae), (X96617; Saccharomyces cerevisiae), (X83882; Arabidopsis thaliana), (AB037907; Kitasatospora griseola), (BT007302; Homo sapiens), e (NC_002758, Locus tag SAV2546, GenelD 1122571; Staphilococcus aureus).

[00162] Em algumas modalidades, a célula que produz isoprenóide compreende uma sequência de nucleotídeos heteróloga que codifica uma enzima que pode converter HMG-CoA em mevalonato, por exemplo, um HMG-CoA redutase. Exemplos ilustrativos de sequências de nucleotídeos que codificam uma enzima como esta incluem, mas sem limitações: (NM_206548; Drosophila melanogaster), (NC_002758, Locus tag SAV2545, GenelD 1122570; Staphilococcus aureus), (NM_204485; Gallus gallus), (ABO 15627; Streptomyces sp. KO 3988), (AF542543; Nicotiana attenuata), (AB037907; Kitasatospora griseola), (AX128213, fornecendo a sequência que codifica um HMGR truncado; Saccharomyces cerevisiae), e (NC 001145: complemento (115734.118898; Saccharomyces cerevisiae).

[00163] Em algumas modalidades, a célula que produz isoprenóide compreende uma sequência de nucleotídeos heteróloga que codifica uma enzima que pode converter mevalonato em mevalonato 5-fosfato, por exemplo, um mevalonato quinase. Exemplos ilustrativos de sequências de nucleotídeos que codificam uma enzima como esta incluem, mas sem limitações: (L77688; Arabidopsis thaliana), e (X55875; Saccharomyces cerevisiae).

[00164] Em algumas modalidades, a célula que produz isoprenóide compreende uma sequência de nucleotídeos heteróloga que codifica uma enzima que pode converter mevalonato 5-fosfato em mevalonato 5- pirofosfato, por exemplo, um fosfomevalonato quinase. Exemplos ilustrativos de sequências de nucleotídeos que codificam uma enzima como esta incluem, mas sem limitações: (AF429385; Hevea brasiliensis), (NM 006556; Homo sapiens), e (NC_001145. complemento 712315.713670; Saccharomyces cerevisiae).

[00165] Em algumas modalidades, a célula que produz isoprenóide compreende uma sequência de nucleotídeos heteróloga que codifica uma enzima que pode converter mevalonato 5-pirofosfato em IPP, por exemplo, um mevalonato pirofosfato decarboxilase. Exemplos ilustrativos de sequências de nucleotídeos que codificam uma enzima como esta incluem, mas sem limitações: (X97557; Saccharomyces cerevisiae), (AF290095; Enterococcus faecium), e (U49260; Homo sapiens).

[00166] Em algumas modalidades, a célula que produz isoprenóide compreende uma ou mais sequências de nucleotídeos heterólogas que codificam mais que uma enzima do caminho MEV. Em algumas modalidades, a célula que produz isoprenóide compreende uma ou mais sequências de nucleotídeos heterólogas que codificam duas enzimas do caminho MEV. Em algumas modalidades, a célula que produz isoprenóide compreende uma ou mais sequências de nucleotídeos heterólogas que codificam uma enzima que pode converter HMG-CoA em mevalonato e uma enzima que pode converter mevalonato em mevalonato 5-fosfato. Em algumas modalidades, a célula que produz isoprenóide compreende uma ou mais sequências de nucleotídeos heterólogas que codificam três enzimas do caminho MEV. Em algumas modalidades, a célula que produz isoprenóide compreende uma ou mais sequências de nucleotídeos heterólogas que codificam quatro enzimas do caminho MEV. Em algumas modalidades, a célula que produz isoprenóide compreende uma ou mais sequências de nucleotídeos heterólogas que codificam cinco enzimas do caminho MEV. Em algumas modalidades, a célula que produz isoprenóide compreende uma ou mais sequências de nucleotídeos heterólogas que codificam seis enzimas do caminho MEV.

[00167] Em algumas modalidades, a célula que produz isoprenóide compreende adicionalmente uma sequência de nucleotídeos heteróloga que codifica uma enzima que pode converter IPP gerado por meio do caminho MEV em seu isômero, dimetilalil pirofosfato (“DMAPP”). DMAPP pode ser condensado e modificado por meio da ação de várias enzimas adicionais para formar isoprenóides simples e mais complexos (Figura 2).

5.5.2 DXP Caminho

[00168] Em algumas modalidades dos métodos aqui fornecidos, a célula que produz isoprenóide compreende uma ou mais sequências de nucleotídeos heterólogas que codificam uma ou mais enzimas de o caminho DXP, que efetua maior produção de um ou mais isoprenóide compostos comparada a uma célula pai geneticamente não modificada.

[00169] Em algumas modalidades, a célula que produz isoprenóide compreende uma sequência de nucleotídeos heteróloga que codifica uma enzima que pode condensar duas moléculas de acetil-coenzima A para formar acetoacetil-CoA, por exemplo, uma acetil-CoA tiolase. Exemplos ilustrativos de sequências de nucleotídeos que codificam uma enzima como esta incluem, mas sem limitações: (NC 000913 REGION: 2324131.2325315; Escherichia coll), (D49362; Paracoccus denitrificans), e (L20428; Saccharomyces cerevisiae).

[00170] Em algumas modalidades, a célula que produz isoprenóide compreende uma sequência de nucleotídeos heteróloga que codifica uma enzima, por exemplo, l-deóxi-D-xilulose-5-fosfato sintase, que pode condensar piruvato com D-gliceraldeído 3-fosfato para preparar 1-deóxi-D- xilulose-5-fosfato. Exemplos ilustrativos de sequências de nucleotídeos que codificam uma enzima como esta incluem, mas sem limitações: (AF035440; Escherichia coli), (NC_002947, locus tag PP0527; Pseudomonas putida KT2440), (CP000026, locus tag SPA2301; Salmonella enterica Paratyphi, ver ATCC 9150), (NC 007493, locus tag RSP 0254; Rhodobacter sphaeroides 2.4.1), (NC 005296, locus tag RPA0952; Rhodopseudomonas palustris CGA009), (NC 004556, locus tag PD1293; Xilella fastidiosa Temeculal), e (NC_003076, locus tag AT5G11380; Arabidopsis thaliana).

[00171] Em algumas modalidades, a célula que produz isoprenóide compreende uma sequência de nucleotídeos heteróloga que codifica uma enzima, por exemplo, l-deóxi-D-xilulose-5-fosfato redutoisomerase, que pode converter l-deóxi-D-xilulose-5-fosfato a 2C-metil-D-eritritol-4-fosfato. Exemplos ilustrativos de sequências de nucleotídeos incluem, mas sem limitações: (ABO 13300; Escherichia coll), (AF148852; Arabidopsis thaliana), (NC_002947, locus tag PP 1597; Pseudomonas putida K.T2440), (AL939124, locus tag SCO5694; Streptomyces coelicolor A3(2)), (NC 007493, locus tag RSP_2709; Rhodobacter sphaeroides 2.4.1), e (NC 007492, locus tag Pfl_l 107; Pseudomonas fluorescens PfO-1).

[00172] Em algumas modalidades, a célula que produz isoprenóide compreende uma sequência de nucleotídeos heteróloga que codifica uma enzima, por exemplo, 4-difosfocitidil-2C-metil-D-eritritol sintase, que pode converter 2C-metil-D-eritritol-4-fosfato a 4-difosfocitidil-2C-metil-D-eritritol. Exemplos ilustrativos de sequências de nucleotídeos incluem, mas sem limitações: (AF230736; Escherichia coli), (NC_007493, locus tag RSP_2835; Rhodobacter sphaeroides 2.4.1), (NC_003071, locus tag AT2G02500; Arabidopsis thaliana), e (NC 002947, locus tag PP 1614; Pseudomonas putida K.T2440).

[00173] Em algumas modalidades, a célula que produz isoprenóide compreende uma sequência de nucleotídeos heteróloga que codifica uma enzima, por exemplo, 4-difosfocitidil-2C-metil-D-eritritol quinase, que pode converter 4-difosfocitidil-2C-metil-D-eritritol a 4-difosfocitidil-2C-metil-D- eritritol-2-fosfato. Exemplos ilustrativos de sequências de nucleotídeos incluem, mas sem limitações: (AF216300; Escherichia coli) e (NC 007493, locus tag RSP 1779; Rhodobacter sphaeroides 2.4.1).

[00174] Em algumas modalidades, a célula que produz isoprenóide compreende uma sequência de nucleotídeos heteróloga que codifica uma enzima, 2C-metil-D-eritritol 2,4-ciclodifosfato sintase, que pode converter 4- difosfocitidil-2C-metil-D-eritritol-2-fosfato a 2C-metil-D-eritritol 2,4- ciclodifosfato. Exemplos ilustrativos de sequências de nucleotídeos incluem, mas sem limitações: (AF230738; Escherichia coli), (NC_007493, locus tag RSP 6071; Rhodobacter sphaeroides 2.4.1), e (NC 002947, locus tag PPI618; Pseudomonasputida KT2440).

[00175] Em algumas modalidades, a célula que produz isoprenóide compreende uma sequência de nucleotídeos heteróloga que codifica uma enzima, por exemplo, l-hidróxi-2-metil-2-(E)-butenil-4-difosfato sintase, que pode converter 2C-metil-D-eritritol 2,4-ciclodifosfato a l-hidróxi-2-metil-2- (E)-butenil-4-difosfato. Exemplos ilustrativos de sequências de nucleotídeos incluem, mas sem limitações: (AY033515; Escherichia coli), (NC_002947, locus tag PP0853; Pseudomonas putida KT2440), e (NC 007493, locus tag RSP 2982; Rhodobacter sphaeroides 2.4.1).

[00176] Em algumas modalidades, a célula que produz isoprenóide compreende uma sequência de nucleotídeos heteróloga que codifica uma enzima, por exemplo, isopentil/dimetilallil difosfato sintase, que pode converter l-hidróxi-2-metil-2-(E)-butenil-4-difosfato tanto em IPP quanto seu isômero, DMAPP. Exemplos ilustrativos de sequências de nucleotídeos incluem, mas sem limitações: (AY062212; Escherichia coli) e (NC_002947, locus tag PP0606; Pseudomonas putida KT2440).

[00177] Em algumas modalidades, a célula que produz isoprenóide compreende uma ou mais sequências de nucleotídeos heterólogas que codificam mais que uma enzima do caminho DXP. Em algumas modalidades, a célula que produz isoprenóide compreende uma ou mais sequências de nucleotídeos heterólogas que codificam duas enzimas do caminho DXP. Em algumas modalidades, a célula que produz isoprenóide compreende uma ou mais sequências de nucleotídeos heterólogas que codificam três enzimas do caminho DXP. Em algumas modalidades, a célula que produz isoprenóide compreende uma ou mais sequências de nucleotídeos heterólogas que codificam quatro enzimas do caminho DXP. Em algumas modalidades, a célula que produz isoprenóide compreende uma ou mais sequências de nucleotídeos heterólogas que codificam cinco enzimas do caminho DXP. Em algumas modalidades, a célula que produz isoprenóide compreende uma ou mais sequências de nucleotídeos heterólogas que codificam seis enzimas do caminho DXP. Em algumas modalidades, a célula que produz isoprenóide compreende uma ou mais sequências de nucleotídeos heterólogas que codificam cinco enzimas do caminho DXP. Em algumas modalidades, a célula que produz isoprenóide compreende uma ou mais sequências de nucleotídeos heterólogas que codificam sete enzimas do caminho DXP.

[00178] Em algumas modalidades, “diafonia” (ou interferência) entre os processos metabólicos da própria célula hospedeira e os processos envolvidos com a produção de IPP são minimizados ou eliminados completamente. Por exemplo, diafonia é minimizada ou eliminada completamente quando o micro-organismo hospedeiro depende exclusivamente do caminho DXP para sintetizar IPP, e um caminho MEV é introduzido para fornecer IPP adicional. Um organismo hospedeiro como este não poderia ser equipado para alterar a expressão das enzimas MEV do caminho ou processo dos intermediários associados com o caminho MEV. Organismos que dependem exclusiva ou predominantemente do caminho DXP incluem, por exemplo, Escherichia coli.

[00179] Em algumas modalidades, a célula hospedeira produz IPP por meio do caminho MEV, tanto exclusivamente quanto em combinação com o caminho DXP. Em outras modalidades, um caminho DXP do hospedeiro é funcionalmente desabilitado, de maneira tal que a célula hospedeira produz IPP exclusivamente através de um caminho MEV heterologamente introduzido. O caminho DXP pode ser funcionalmente desabilitado desabilitando a expressão do gene ou inativando a função de uma ou mais das enzimas DXP do caminho.

[00180] Em algumas modalidades, o isoprenóide produzido pela célula é um isoprenóide C5. Estes compostos são derivados de uma unidade de isopreno e também são chamados hemiterpenos. Um exemplo ilustrativo de um hemiterpeno é isopreno. Em outras modalidades, o isoprenóide é um isoprenóide Cio. Estes compostos são derivados de duas unidades de isopreno e também são chamados monoterpenos. Exemplos ilustrativos de monoterpenos são limoneno, citranelol, geraniol, mentol, perillil álcool, linalol, tujona, e mirceno. Em outras modalidades, o isoprenóide é um isoprenóide C15. Estes compostos são derivados de três unidades de isopreno e também são chamados sesquiterpenos. Exemplos ilustrativos de sesquiterpenos são periplanona B, gingcolídeo B, amorfadieno, artemisinina, ácido artemísico, valenceno, nootkatone, epi-cedrol, epi-aristolocheno, famesol, gossipol, sanonina, periplanona, forscolina e patchoulol (que é também conhecido como álcool de patchouli). Em outras modalidades, o isoprenóide é um isoprenóide €20- Estes compostos são derivados de quatro unidades de isopreno e também chamadas diterpenos. Exemplos ilustrativos de diterpenos são casbeno, eleuterobina, paclitaxel, prostratina, pseudopterosina e taxadieno. Ainda em outros exemplos, o isoprenóide é um isoprenóide €20+- Estes compostos são derivados de mais que quatro unidades de isopreno e incluem: triterpenos (compostos de isoprenóide C30 derivado de 6 unidades de isopreno), tais como arbrusideE, bruceantina, testosterona, progesterona, cortisona, digitoxina e esqualeno; tetraterpenos (compostos de isoprenóide C40 derivados de 8 isoprenóides), tal como β-caroteno; e politerpenos (compostos de isoprenóide C40+ derivados de mais que 8 unidades de isopreno), tal como poliisopreno. Em algumas modalidades, o isoprenóide é selecionado do grupo que consiste em abietadieno, amorfadieno, careno, α-fameseno, β-fameseno, farnesol, geraniol, geranilgeraniol, isopreno, linalool, limoneno, mirceno, nerolidol, ocimeno, patchoulol, β-pineno, sabineno, y-terpineno, terpinoleno e valenceno. Compostos de isoprenóide também incluem, mas sem limitações, carotenóides (tais como licopeno, α- e β-caroteno, α- e β-criptoxantina, bixina, zeaxantina, astaxantina, e luteína), compostos esteróides e compostos que são compostos de isoprenóides modificados por outros grupos químicos, tais como terpeno-alcalóides mistos e coenzima Q-10.

[00181] Em algumas modalidades, a célula que produz isoprenóide compreende adicionalmente uma sequência de nucleotídeos heteróloga que codifica uma enzima que pode converter IPP gerado por meio do caminho MEV em DMAPP,/?or exemplo, um IPP isomerase. Exemplos ilustrativos de sequências de nucleotídeos que codificam uma enzima como esta incluem, mas sem limitações: (NC 000913, 3031087.3031635; Escherichia coll), e (AF082326; Haematococcus pluvialis).

[00182] Em algumas modalidades, a célula que produz isoprenóide compreende adicionalmente uma sequência de nucleotídeos heteróloga que codifica um poliprenil sintase que pode condensar moléculas de IPP e/ou DMAPP para formar compostos de poliprenila contendo mais que cinco carbonos.

[00183] Em algumas modalidades, a célula que produz isoprenóide compreende uma sequência de nucleotídeos heteróloga que codifica uma enzima que pode condensar uma molécula de IPP com uma molécula de DMAPP para formar uma molécula de geranil pirofosfato (“GPP”), por exemplo, um GPP sintase. Exemplos ilustrativos de sequências de nucleotídeos que codificam uma enzima como esta incluem, mas sem limitações: (AF513111; Abies grandis), (AF513112; Abies grandis), (AF513113; Abies grandis), (AY534686; Antirrhinum majus), (AY534687; Antirrhinum majus), (Y17376; Arabidopsis thaliana), (AEO16877, Locus API 1092; Bacillus cereus; ATCC 14579), (AJ243739; Citrus sinensis), (AY534745; Clarkia breweri), (AY953508; Ips pint), (DQ286930; Lycopersicon esculentum), (AF182828; Mentha x piperita), (AF182827; Mentha x piperita), (MPI249453; Mentha x piperita), (PZE431697, Locus CAD24425; Paracoccus zeaxantinaifaciens), (AY866498; Picrorhiza kurrooa), (AY351862; Vitis vinifera), e (AF203881, Locus AAF12843; Zymomonas mobilis).

[00184] Em algumas modalidades, a célula que produz isoprenóide compreende uma sequência de nucleotídeos heteróloga que codifica uma enzima que pode condensar duas moléculas de IPP com uma molécula de DMAPP, ou adicionar uma molécula de IPP a uma molécula de GPP, para formar uma molécula de famesil pirofosfato (“FPP”), por exemplo, um FPP sintase. Exemplos ilustrativos de sequências de nucleotídeos que codificam uma enzima como esta incluem, mas sem limitações: (ATU80605; Arabidopsis thaliana), (ATHFPS2R; Arabidopsis thaliana), (AAU36376; Artemisia annua), (AF461050; Bos taurus), (D00694; Escherichia coli K-12), (AE009951, Locus AAL95523; Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum ATCC 25586), (GFFPPSGEN; Gibberella fujikuroi), (CP000009, Locus AAW60034; Gluconobacter oxydans 621H), (AFO19892; Helianassim annuus), (HUMFAPS; Homo sapiens), (KLPFPSQCR; Kluyveromyces lactis), (LAU15777; Lupinus albus), (LAU20771; Lupinus albus), (AF309508; Mus musculus), (NCFPPSGEN; Neurospora crassa), (PAFPS1; Parentãoium argentatum), (PAFPS2; Parentãoium argentatum), (RATFAPS; Rattus norvegicus), (YSCFPP; Saccharomyces cerevisiae), (D89104; Schizosaccharomyces pombe), (CP000003, Locus AAT87386; Streptococcus pyogenes), (CP000017, Locus AAZ51849; Streptococcus pyogenes), (NC_008022, Locus YP 598856; Streptococcus pyogenes MGAS10270), (NC 008023, Locus YP 600845; Streptococcus pyogenes MGAS2096), (NC 008024, Locus YP 602832; Streptococcus pyogenes MGAS 10750), (MZEFPS; Zea mays), (AE000657, Locus AAC06913; Aquifex aeolicus VF5), (NM_202836; Arabidopsis thaliana), (D84432, Locus BAA12575; Bacillus subtilis), (U12678, Locus AAC28894; Bradyrhizobium japonicum USDA 110), (BACFDPS; Geobacillus stearothermophilus), (NC 002940, Locus NP 873754; Haemophilus ducreyi 35000HP), (L42023, Locus AAC23087; Haemophilus influenzae Rd K.W20), (J05262; Homo sapiens), (YP_395294; Lactobacillus sakei subsp. sakei 23K), (NC_005823, Locus YP 000273; Leptospira interrogans serovar Copenhageni str. Fiocruz Ll- 130), (AB003187; Micrococcus luteus), (NC_002946, Locus YP_208768; Neisseria gonorrhoeae FA 1090), (U00090, Locus AAB91752; Rhizobium sp. NGR234), (J05091; Saccharomyces cerevisae), (CP000031, Locus AAV93568; Silicibacter pomeroyi DSS-3), (AE008481, Locus AAK99890; Streptococcus pneumoniae R6), e (NC 004556, Locus NP 779706; Xilella fastidiosa Temeculal).

[00185] Em algumas modalidades, a célula que produz isoprenóide compreende adicionalmente uma sequência de nucleotídeos heteróloga que codifica uma enzima que pode combinar IPP e DMAPP ou IPP e FPP para formar geranilgeranil pirofosfato (“GGPP”). Exemplos ilustrativos de sequências de nucleotídeos que codificam uma enzima como esta incluem, mas sem limitações: (ATHGERPIRS; Arabidopsis thaliana), (BT005328; Arabidopsis thaliana), (NM_119845; Arabidopsis thaliana), (NZ AAJMO1000380, Locus ZP 00743052; Bacillus thuringiensis serovar israelensis, ATCC 35646 sql563), (CRGGPPS; Catharanassim roseus), (NZAABF02000074, Locus ZPOO144509; Fusobacterium nucleatum subsp. vincentii, ATCC 49256), (GFGGPPSGN; Gibberella fujikuroi), (AY371321; Ginkgo biloba), (AB055496; Hevea brasiliensis), (ABO 17971; Homo sapiens), (MCI276129; Mucor circinelloides f lusitanicus), (ABO 16044; Mus musculus), (AABX01000298, Locus NCU01427; Neurospora crassa), (NCU20940; Neurospora crassa), (NZAAKL01000008, Locus ZP 00943566; Ralstonia solanacearum UW551), (AB 118238; Rattus norvegicus), (SCU31632; Saccharomyces cerevisiae), (ABO 16095; Synechococcus elongates), (SAGGPS; Sinapis alba), (SSOGDS; Sulfolobus acidocaldarius), (NC 007759, Locus YP 461832; Syntrophus aciditrophicus SB), (NC 006840, Locus YP_204095; Vibrio fischeri ESI 14), (NM_112315; Arabidopsis thaliana), (ERWCRTE; Pantoea agglomerans), (D90087, Locus BAA14124; Pantoea ananatis), (X52291, Locus CAA36538; Rhodobacter capsulatus), (AF195122, Locus AAF24294; Rhodobacter sphaeroides), e (NC_004350, Locus NP 721015; Streptococcus mutans UA159).

[00186] Em algumas modalidades, a célula que produz isoprenóide compreende adicionalmente uma sequência de nucleotídeos heteróloga que codifica uma enzima que pode modificar um poliprenil para formar um hemiterpeno, um monoterpeno, um sesquiterpeno, um diterpeno, um triterpeno, um tetraterpeno, um politerpeno, um composto esteróide, um carotenóide, ou um composto isoprenóide modificado.

[00187] Em algumas modalidades, o nucleotídeo heterólogo codifica um careno sintase. Exemplos ilustrativos de sequências de nucleotídeos adequadas incluem, mas sem limitações: (AF461460, REGION 43.1926; Picea abies) e (AF527416, REGION: 78.1871; Salvia stenophilla).

[00188] Em algumas modalidades, o nucleotídeo heterólogo codifica um geraniol sintase. Exemplos ilustrativos de sequências de nucleotídeos adequadas incluem, mas sem limitações: (AJ457070; Cinnamomum tenuipilum), (AY362553; Ocimum basilicum), (DQ234300; Perilla frutescens tensão 1864), (DQ234299; Perilla citriodora cepa 1861), (DQ234298; Perilla citriodora cepa 4935), e (DQ088667; Perilla citriodora).

[00189] Em algumas modalidades, o nucleotídeo heterólogo codifica um linalool sintase. Exemplos ilustrativos de uma sequência de nucleotídeos adequada incluem, mas sem limitações: (AF497485; Arabidopsis thaliana), (AC002294, Locus AAB71482; Arabidopsis thaliana), (AY059757; Arabidopsis thaliana), (NM_104793; Arabidopsis thaliana), (AF 154124; Artemisia annua), (AF067603; Clarkia breweri), (AF067602; Clarkia concinna), (AF067601; Clarkia breweri), (U58314; Clarkia breweri), (AY840091; Lycopersicon esculentum), (DQ263741; Lavandula angustifolia), (AY083653; Mentha citrate), (AY693647; Ocimum basilicum), (XM 463918; Oryza sativa), (AP004078, Locus BAD07605; Oryza sativa), (XM_463918, Locus XP_463918; Oryza sativa), (AY917193; Perilla citriodora), (AF271259; Perilla frutescens), (AY473623; Picea abies), (DQ195274; Picea sitchensis), e (AF444798; Perilla frutescens var. crispa cultivar No. 79).

[00190] Em algumas modalidades, o nucleotídeo heterólogo codifica um limoneno sintase. Exemplos ilustrativos de sequências de nucleotídeos adequadas incluem, mas sem limitações: (+)-limoneno sintases (AF514287, REGION: 47.1867; Citrus limon) e (AY055214, REGION: 48.1889; Agastache rugosa) e (-)-limoneno sintases (DQ 195275, REGION: 1.1905; Picea sitchensis), (AF006193, REGION: 73.1986; Abies grandis), e (MHC4SLSP, REGION: 29.1828; Mentha spicata).

[00191] Em algumas modalidades, o nucleotídeo heterólogo codifica um mirceno sintase. Exemplos ilustrativos de sequências de nucleotídeos adequadas incluem, mas sem limitações: (U87908; Abies grandis), (AY195609; Antirrhinum majus), (AY195608; Antirrhinum majus), (NM_127982; Arabidopsis thaliana TPS 10), (NM_113485; Arabidopsis thaliana ATTPS-CIN), (NM_113483; Arabidopsis thaliana ATTPS-CIN), (AF271259; Perilla frutescens), (AY473626; Picea abies), (AF369919; Picea abies), e (AJ304839; Quercus ilex).

[00192] Em algumas modalidades, o nucleotídeo heterólogo codifica um ocimeno sintase. Exemplos ilustrativos de sequências de nucleotídeos adequadas incluem, mas sem limitações: (AY 195607; Antirrhinum majus), (AY 195609; Antirrhinum majus), (AY 195608; Antirrhinum majus), (AK221024; Arabidopsis thaliana)., (NM_113485; Arabidopsis thaliana ATTPS-CIN), (NM-l 13483; Arabidopsis thaliana ATTPS-CIN), (NM_117775; Arabidopsis thaliana ATTPS03), (NM_001036574; Arabidopsis thaliana ATTPS03), (NM_127982; Arabidopsis thaliana TPS10), (ABI 10642; Citrus unshiu CitMTSL4), e (AY575970; Lotus corniculatus var. japonicus).

[00193] Em algumas modalidades, o nucleotídeo heterólogo codifica um a-pineno sintase. Exemplos ilustrativos de sequências de nucleotídeos adequadas incluem, mas sem limitações: (+) a-pineno sintase (AF543530, REGION: 1.1887; Pinus taeda), (-)α-pineno sintase (AF543527, REGION: 32.1921; Pinus taeda), e (+)/(-)α-pineno sintase (AGU87909, REGION: 6111892; Abies grandis).

[00194] Em algumas modalidades, o nucleotídeo heterólogo codifica um β-pineno sintase. Exemplos ilustrativos de sequências de nucleotídeos adequadas incluem, mas sem limitações: (-) β-pineno sintases (AF276072, REGION: 1.1749; Artemisia annua) e (AF514288, REGION: 26.1834; Citrus limon).

[00195] Em algumas modalidades, o nucleotídeo heterólogo codifica um sabineno sintase. Um exemplo ilustrativo de uma sequência de nucleotídeos adequada inclui, mas sem limitações, AF051901, REGIÃO: 26.1798 da Salvia officinalis.

[00196] Em algumas modalidades, o nucleotídeo heterólogo codifica um y-terpineno sintase. Exemplos ilustrativos de sequências de nucleotídeos adequadas incluem, mas sem limitações: (AF514286, REGIÃO: 30,1832 de Citrus limon) e (ABI 10640, REGIÃO 1.1803 de Citrus unshiü).

[00197] Em algumas modalidades, o nucleotídeo heterólogo codifica um terpinoleno sintase. Exemplos ilustrativos de uma sequência de nucleotídeos adequada incluem, mas sem limitações: (AY693650 de Oscimum basilicum) e (AY906866, REGIÃO: 10,1887 de Pseudotsuga menziesií).

[00198] Em algumas modalidades, o nucleotídeo heterólogo codifica um amorfadieno sintase. Um exemplo ilustrativo de uma sequência de nucleotídeos adequada é SEQ ID NO. 37 do pedido de patente U.S. No. 2004/0005678.

[00199] Em algumas modalidades, o nucleotídeo heterólogo codifica um a-fameseno sintase. Exemplos ilustrativos de sequências de nucleotídeos adequadas incluem, mas sem limitações DQ309034 de Pirus communis cultivar d'Anjou (pear; gene name AFS1) e AY 182241 de Malus domestica (maçã; gene AFS1). Pechouus et al., Planta 219(l):84-94 (2004).

[00200] Em algumas modalidades, o nucleotídeo heterólogo codifica um β-fameseno sintase. Exemplos ilustrativos de sequências de nucleotídeos adequadas incluem, mas sem limitações número de acesso ao GenBank AF024615 de Mentha x piperita (hortelã; gene Tspall), e AY835398 de Artemisia annua. Picaud et al., Phytochemistry 66(9): 961-967 (2005).

[00201] Em algumas modalidades, o nucleotídeo heterólogo codifica um famesol sintase. Exemplos ilustrativos de sequências de nucleotídeos adequadas incluem, mas sem limitações número de acesso ao GenBank AF529266 de Zea mays e YDR481C de Saccharomyces cerevisiae (gene Pho8). Song, L., Applied Biochemistry and Biotechnology 128:149-158 (2006).

[00202] Em algumas modalidades, o nucleotídeo heterólogo codifica um nerolidol sintase. Um exemplo ilustrativo de uma sequência de nucleotídeos adequada inclui, mas sem limitações, AF529266 de Zea mays (milho; gene tpsl).

[00203] Em algumas modalidades, o nucleotídeo heterólogo codifica um patchouliol sintase. Exemplos ilustrativos de sequências de nucleotídeos adequadas incluem, mas sem limitações AY508730 REGIÃO: 1.1659 de Pogostemon cablin.

[00204] Em algumas modalidades, o nucleotídeo heterólogo codifica um nootkatone sintase. Exemplos ilustrativos de uma sequência de nucleotídeos adequada incluem, mas sem limitações AF441124 REGIÃO: 1.1647 de Citrus sinensis e AY917195 REGIÃO: 1.1653 de Perilla frutescens.

[00205] Em algumas modalidades, o nucleotídeo heterólogo codifica um abietadieno sintase. Exemplos ilustrativos de sequências de nucleotídeos adequadas incluem, mas sem limitações: (U50768; Abies grandis) e (AY473621; Picea abies).

5.6 Produção de policetídeos

[00206] Em algumas modalidades, o composto não catabólico é um policetídeo. Policetídeos são sintetizados por reações sequenciais catalisadas por uma coleção de atividades enzimáticas chamadas policetídeo sintases (PKSs), que são complexos de proteína de múltiplas enzimas grandes que contêm um grupo coordenado de sítios ativos. A biossíntese de policetídeo acontece em etapas começando de simples blocos de construção 2-, 3-, 4- carbono, tais como acetil-CoA, propionil CoA, butiril-CoA e seus derivados ativados, malonil-, metilmalonil- e etilmalonil-CoA, principalmente por meio de condensação decarboxilativa de unidades derivadas de malonil-CoA-por meio de reações de condensação de Claisen. Os genes PKS são normal mente organizados em um operon em bactérias e em agrupamentos de genes em eucariotas. Três tipos de policetídeo sintases foram caracterizadas: Tipo I policetídeo sintases são proteínas altamente modulares grandes subdivididas em duas classes: 1) PKSs iterativas, que reutilizam domínios de uma maneira cíclica e 2) PKSs modulares, que contêm uma sequência de módulos separados e não repetem domínios. Policetídeo sintases tipo II são agregados de proteínas monofuncionais e policetídeo sintases tipo III não usam domínios de proteína carreadora de acila.

[00207] Diferente da biossíntese de ácido graxo, na qual cada sucessiva etapa de alongamento da cadeia é seguida por uma sequência fixa de ceto- redução, desidratação e enoila, redução, conforme descrito a seguir, dos intermediários de alongamento da cadeia individual da biossíntese de policetídeo submete todas, algumas ou nenhuma modificação do grupo funcional, resultando em um grande número de produtos quimicamente diversos. Graus adicionais de complexidade surgem do uso de diferentes unidades iniciadoras e unidades de alongamento da cadeia, bem como a geração de estereoisômeros inéditos.

[00208] A ordem de síntese de policetídeo completa, conforme direcionado por um policetídeo sintase segue (na ordem N-terminal a C- terminal): começando ou carregando os blocos de construção de carbono inicial em uma proteína carreadora de acila, cujos módulos de alongamento catalisam a extensão da cadeia de macrolídeo de crescimento e módulos de terminação que catalisam a liberação do macrolídeo sintetizado. Domínios do componente ou funcionalidades ativas da enzima separada na biossíntese incluem acil-para o carregamento das unidades de acila do iniciador, extensor e intermediário; proteínas carreadoras de acila que suportam o macrolídeo de crescimento como um tiol éster; β-ceto-acil sintases, que catalisam a extensão da cadeia; β-ceto redutases responsáveis pela primeira redução a uma funcionalidade álcool; desidratases, que eliminam água para dar um tioléster insaturado; enoil redutases, que catalisam a redução final para saturação completa; e tiolesterases, que catalisam a liberação e ciclização do macrolideo.

[00209] Em algumas modalidades, o micro-organismo geneticamente modificado usado para os métodos aqui descritos compreende uma sequência de nucleotídeos heteróloga que codifica uma enzima que pode condensar pelo menos um de acetil-CoA e malonil-CoA com uma proteína carreadora de acila, por exemplo, uma acil-transferase.

[00210] Em algumas modalidades, o micro-organismo geneticamente modificado aqui descrito compreende uma sequência de nucleotídeos heteróloga que codifica uma enzima que pode condensar um primeiro reagente selecionado do grupo que consiste em acetil-CoA e malonil-CoA com um segundo reagente selecionado do grupo que consiste em malonil- CoA ou metilmalonil-CoA para formar um produto de policetídeo, por exemplo, um β-ceto-acil sintase.

[00211] Em algumas modalidades, a célula que produz policetídeo compreende uma sequência de nucleotídeos heteróloga que codifica uma enzima que pode reduzir um grupo químico β-ceto em um composto de policetídeo a um grupo β-hidroxi, por exemplo, um β-ceto redutase.

[00212] Em algumas modalidades, o micro-organismo geneticamente modificado aqui descrito compreende uma sequência de nucleotídeos heteróloga que codifica uma enzima que pode desidratar um grupo químico alcano em um composto de policetídeo para produzir um alceno α-β- insaturado, por exemplo, uma desidratase.

[00213] Em algumas modalidades, a célula que produz policetídeo compreende uma sequência de nucleotídeos heteróloga que codifica uma enzima que pode reduzir uma ligação dupla α-β em um composto de policetídeo a um alcano saturado, por exemplo, um enoil-redutase.

[00214] Em algumas modalidades, a célula que produz policetídeo compreende uma sequência de nucleotídeos heteróloga que codifica uma enzima que pode hidrolisar um composto de policetídeo de uma proteína carreadora de acila, por exemplo, um tioesterase.

[00215] Em algumas modalidades, a célula que produz policetídeo compreende uma ou mais sequências de nucleotídeos heterólogas que codificam uma enzima compreendendo uma região catalítica KS. Em algumas modalidades, a célula que produz policetídeo compreende uma ou mais sequências de nucleotídeos heterólogas que codificam uma enzima compreendendo uma região catalítica AT. Em algumas modalidades, a célula que produz policetídeo compreende mais que uma sequência de nucleotídeos heteróloga que codifica uma enzima compreendendo uma região catalítica AT. Em algumas modalidades, a célula que produz policetídeo compreende uma ou mais sequências de nucleotídeos heterólogas que codificam uma enzima compreendendo uma região catalítica CLF. Em algumas modalidades, a célula que produz policetídeo compreende uma ou mais sequências de nucleotídeos heterólogas que codificam uma enzima compreendendo uma atividade ACP. Em algumas modalidades, a célula que produz policetídeo compreende mais que uma sequência de nucleotídeos heteróloga que codifica uma enzima compreendendo uma atividade ACP.

[00216] Em uma modalidade particular, a célula que produz policetídeo compreende um sistema PKS aromático mínimo, por exemplo, sequência de nucleotídeos heteróloga que codifica uma enzima compreendendo uma região catalítica KS, uma enzima compreendendo uma região catalítica AT, uma enzima compreendendo uma região catalítica CLF, e uma enzima compreendendo uma atividade ACP, respectivamente. Em uma modalidade particular, a célula que produz policetídeo compreende um sistema PKS modular mínimo, por exemplo, sequência de nucleotídeos heteróloga que codifica uma enzima compreendendo uma região catalítica KS, uma enzima compreendendo uma região catalítica AT, e uma enzima compreendendo uma atividade ACP, respectivamente. Ainda em uma outra modalidade particular, a célula que produz policetídeo compreende um sistema PKS aromático modular para nova síntese de policetídeo, por exemplo, sequência de nucleotídeos heteróloga que codifica uma enzima compreendendo uma região catalítica KS, uma ou mais enzimas compreendendo uma região catalítica AT, e uma ou mais enzimas compreendendo uma atividade ACP, respectivamente.

[00217] Em algumas modalidades, a célula que produz policetídeo compreende um sistema PKS mínimo, por exemplo, um sistema PKS aromático mínimo ou sistema PKS modular mínimo, compreende adicionalmente atividades catalíticas adicionais que podem contribuir a produção do policetídeo produto final. Em algumas modalidades, a célula que produz policetídeo compreende uma ou mais sequências de nucleotídeos heterólogas que codificam uma enzima compreendendo uma região catalítica de ciclase (CYC), que facilita a ciclização da espinha dorsal do policetídeo nascente. Em algumas modalidades, a célula que produz policetídeo compreende uma ou mais sequências de nucleotídeos heterólogas que codificam uma enzima compreendendo uma região catalítica de cetoredutase (KR). Em algumas modalidades, a célula que produz policetídeo compreende uma ou mais sequências de nucleotídeos heterólogas que codificam uma enzima compreendendo uma região catalítica de aromatase (ARO). Em algumas modalidades, a célula que produz policetídeo compreende uma ou mais sequências de nucleotídeos heterólogas que codificam uma enzima compreendendo uma região catalítica de enoilredutase (ER). Em algumas modalidades, a célula que produz policetídeo compreende uma ou mais sequências de nucleotídeos heterólogas que codificam uma enzima compreendendo uma região catalítica de tioesterase (TE). Em algumas modalidades, a célula que produz policetídeo compreende adicionalmente uma ou mais sequências de nucleotídeos heterólogas que codificam uma enzima compreendendo uma atividade holo ACP sintase, que efetua panteteinilação do ACP.

[00218] Em algumas modalidades, a célula que produz policetídeo compreende adicionalmente uma ou mais sequências de nucleotídeos heterólogas que conferem uma atividade que modifica policetídeo pós síntese. Em algumas modalidades, a célula que produz policetídeo compreende adicionalmente uma ou mais sequências de nucleotídeos heterólogas que codificam uma enzima compreendendo uma atividade glicosilase, que efetua modificações pós síntese de policetídeos, por exemplo, onde policetídeos tendo atividade antibiótica são desejados. Em algumas modalidades, a célula que produz policetídeo compreende adicionalmente uma ou mais sequências de nucleotídeos heterólogas que codificam uma enzima compreendendo uma atividade hidroxilase. Em algumas modalidades, a célula que produz policetídeo compreende adicionalmente uma ou mais sequências de nucleotídeos heterólogas que codificam uma enzima compreendendo uma atividade epoxidase. Em algumas modalidades, a célula que produz policetídeo compreende adicionalmente uma ou mais sequências de nucleotídeos heterólogas que codificam uma enzima compreendendo uma atividade metilase.

[00219] Em algumas modalidades, a célula que produz policetídeo compreende adicionalmente uma ou mais sequências de nucleotídeos heterólogas que codificam uma enzima biossintética incluindo, mas sem limitações, pelo menos uma enzima do caminho de síntese de policetídeo, e enzimas que podem modificar um composto acetil-CoA para formar um produto de policetídeo, tais como um composto macrolídeo, um antibiótico, um antifungico, um citostático, um composto anticolesterolêmico, um composto antiparasítico, um composto coccidiostático, um promotor de crescimento animal ou um inseticida. Em algumas modalidades, o composto não catabólico é um polieno. Em algumas modalidades, o composto não catabólico é uma lactona cíclica. Em algumas modalidades, o composto não catabólico compreende um anel de lactona de 14, 15, ou 16 membros. Em algumas modalidades, o composto não catabólico é um policetídeo selecionado do grupo que consiste em um policetídeo macrolídeo, antibiótico, antifungico, citostático, anticolesterolêmico, antiparasítico, um coccidiostático, promotor de crescimento animal e inseticida.

[00220] Em algumas modalidades, a célula que produz policetídeo compreende sequência de nucleotídeos heteróloga, por exemplo, sequências que codificam enzimas PKS e enzimas de modificação de policetídeo, capazes de produzir um policetídeo selecionado, mas sem limitações, dos seguintes policetídeos: Avermectin (yer, por exemplo, patente U.S. No. 5.252.474; patente U.S. No. 4.703.009; EP Pub. No. 118.367; MacNeil et al., 1993, “Industrial Microrganisms: Basic and Applied Molecular Genetics”; Baltz, Hegeman, & Skatrud, eds. (ASM), pp. 245-256, “A Comparison of Genes Encoding the Policetide Sintases for Avermectin, Erythromycin, and Nemadectin”; MacNeil et al., 1992, Gene 115: 119-125; e Ikeda e Omura, 1997, Chem. Res. 97: 2599-2609); Candicidina (FR008) (ver, por exemplo, Hu et a\., 1994, Mol. Microbiol. 14: 163-172); Carbomicina, Curamicina (ver, por exemplo, Bergh et al., Biotechnol Appl Biochem. 1992 Feb;15(l):80-9); Daunorubicina (ver, por exemplo, J Bacteriol. 1994 Qct;176(20):6270-80); Epotilona (ver, por exemplo, pedido de patente PCT No. 99/66028; e pedido de patente PCT No. 00/031247); eritromicina (ver, por exemplo, pedido de patente PCT No. 93/13663; patente U.S. No. 6.004.787; patente U.S. No. 5.824.513; Donadio et al., 1991, Science 252:675-9; e Cortes et al., Nov. 8, 1990, Nature 348:176-8); FK-506 (ver, por exemplo, Motamedi et al., 1998; Eur. J Biochem. 256: 528-534; e Motamedi et al., 1997, Eur. J Biochem. 244: 74-80); FK-520 (ver, por exemplo, pedido de patente PCT No. 00/020601; e Nielsen et al., 1991, Biochem. 30:5789-96); Griseusin (ver, por exemplo, Yu et al., J Bacteriol. 1994 May;176(9):2627-34); Lovastatina (ver, por exemplo, patente U.S. No. 5.744.350); Frenolicina (ver, por exemplo, Khosla et al., Bacteriol. 1993 Apr; 175(8):2197-204; e Bibb et al., Gene 1994 May 3; 142(1 ):31-9); Granaticina (ver, por exemplo, Sherman et al., EMBO J. 1989 Sep;8(9):2717-25; e Bechtold et al., Mol Gen Genet. 1995 Sep 20;248(5):610- 20); Medermicina (ver, por exemplo, Ichinose et al., Microbiology 2003 Jul;149(Pt 7): 1633-45); Monensina (ver, por exemplo, Arrowsmith et al., Mol Gen Genet. 1992 Aug;234(2):254-64); Nonactina (ver, por exemplo, FEMS Microbiol Lett. 2000 Feb l;183(l):171-5); Nanaomicina (ver, por exemplo, Kitao et al., J Antibiot (Tokyo). 1980 Jul;33(7):711-6); Nemadectina (ver, por exemplo, MacNeil et al., 1993, supra); Niddamicina (ver, por exemplo, pedido de patente PCT No. 98/51695; e Kakavas et al., 1997, J. Bacteriol. 179: 75157522); Oleandomicina (ver, por exemplo, Swan et al., 1994, Mol. Gen. Genet. 242: 358-362; pedido de patente PCT No. 00/026349; Olano et al., 1998, Mol. Gen. Genet. 259(3): 299-308; e Pedido de patente PCT No. WO 99/05283); Oxitetraciclina (ver, por exemplo, Kim et al., Gene. 1994 Apr 8; 141(1): 1412); Picromicina (ver, por exemplo, pedido de patente PCT No. 99/61599; pedido de patente PCT No. 00/00620; Xue et al., 1998, Chemistry & Biology 5(11): 661-667; Xue et al., October 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 12111 12116); Platenolida (ver, por exemplo, EP Pub. No. 791,656; e patente U.S. No. 5.945.320); Rapamicina (ver, por exemplo, Schwecke et al., August 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7839-7843; e Aparicio et al., 1996, Gene 169: 9-16); Rifamicina (ver, por exemplo, pedido de patente PCT No. WO 98/07868; e August et al., Feb. 13, 1998, Chemistry & Biology, 5(2): 69-79); Sorangium (ver, por exemplo, patente U.S. No. 6.090.601); Soraphen (ver, por exemplo, patente U.S. No. 5.716.849; Schupp et al., 1995, J. Bacteriology 177: 3673-3679); Spinocina (ver, por exemplo, pedido de patente PCT No. 99/46387); Spiramicina (ver, por exemplo, patente U.S. No. 5.098.837); Tetracenomicina (ver, por exemplo, Summers et al., J Bacteriol. 1992 Mar;174(6):1810-20; e Shen et al., J Bacteriol. 1992 Jun; 174(11):3818-21); Tetracicline (ver, por exemplo, J Am Chem Soc. 2009 Dec 9; 131(48): 17677- 89); Tilosina (ver, por exemplo, patente U.S. No. 5.876.991; patente U.S. No. 5.672.497; patente U.S. No. 5.149.638; EP Pub. No. 791.655; EP Pub. No. 238,323; Kuhstoss et al., 1996, Gene 183:231-6; e Merson-Davies and Cundliffe, 1994, Mol. Microbiol. 13: 349-355); e ácido 6-metilsaliciclico (ver, por exemplo, Richardson et al., Metab Eng. 1999 Apr; 1(2): 180-7; e Shao et al., Biochem Biophys Res Commun. 2006 Jun 23;345(1): 133-9).

5.7 Produção de Ácidos Graxos

[00221] Em algumas modalidades, o composto não catabólico é um ácido graxo. Ácidos graxos são sintetizados por uma série de reações de Claisen descarboxilativas de acetil-CoA e malonil-CoA catalisadas por ácido graxo sintases. Similar às policetídeo sintases, ácido graxo sintases não são uma única enzima, mas um sistema enzimático composto de polipeptídeo multifuncional 272 kDa no qual substratos são passados de um domínio funcional para o próximo. Duas classes principais de ácido graxo sintases foram caracterizadas: ácido graxo sintases tipo I são polipeptídeos multifuncionais, únicos comuns aos mamíferos e fungos (embora o arranjo estrutural das sintases fúngicas e de mamíferos sejam diferentes) e o grupo CMN das bactérias (corinebactéria, micobactéria e nocardia). Sintases tipo II, encontradas em arqueobactérias e eubactérias, são uma série de enzimas multifuncionais diferentes que participam na síntese de ácidos graxos. Os mecanismos de alongamento e redução de ácido graxo são os mesmos nas duas classes de sintases, uma vez que os domínios da enzima responsáveis por estes eventos catalíticos são enormemente homólogos entre as duas classes.

[00222] Depois de cada rodada de alongamento da cadeia de ácido graxo nas reações de condensação de Claisen descarboxilativas, o grupo β- ceto é reduzido a uma cadeia de carbono completamente saturada pela ação sequencial de uma cetoredutase, uma desidratase, e um enol redutase. A cadeia de ácido graxo de crescimento se move entre estes sítios ativos anexados a uma proteína carreadora de acila e é, finalmente, liberada pela ação de uma tioesterase, atingindo um comprimento de cadeia de carbono de 16 (ácido palmitídico).

[00223] Em algumas modalidades, o micro-organismo geneticamente modificado usado para os métodos aqui descritos compreende uma sequência de nucleotídeos heteróloga que codifica um enzima biossintética incluindo, mas sem limitações, pelo menos uma enzima do caminho de síntese do ácido graxo, e enzimas que podem modificar um composto acetil-CoA para formar um produto de ácido graxo, tais como um palmitato, palmitoil CoA, ácido palmitoléico, ácido sapiênico, ácido oléico, ácido linoléico, ácido a- linolênico, ácido araquidônico, ácido eicosapentaenóico, ácido erúcico, e ácido docosaexaeóico. Em algumas modalidades, o composto não catabólico é um ácido graxo selecionado do grupo que consiste em palmitato, palmitoil CoA, ácido palmitoléico, ácido sapiênico, ácido oléico, ácido linoléico, ácido a-linolênico, ácido araquidônico, ácido eicosapentaenóico, ácido erúcico, e ácido docosaexaeóico.

[00224] Em algumas modalidades, a célula que produz ácido graxo compreende uma sequência de nucleotídeos heteróloga que codifica uma enzima que pode co vai entemente ligar pelo menos um de acetil-CoA e malonil-CoA com uma proteína carreadora de acila, por exemplo, um acil- transferase.

[00225] Em algumas modalidades, o micro-organismo geneticamente modificado aqui descrito compreende uma sequência de nucleotídeos heteróloga que codifica uma enzima que pode condensar fração química acetila e uma fração química de malonil, cada uma ligada a uma proteína carreadora de acila (ACP), para formar acetoacetil-ACP, por exemplo, um β- Ketoacil-ACP sintase.

[00226] Em algumas modalidades, a célula que produz ácido graxo compreende uma sequência de nucleotídeos heteróloga que codifica uma enzima que pode reduzir a ligação dupla em acetoacetil-ACP com NADPH para formar um grupo hidroxila em D-3-hidroxibutiril hidroxilase-ACP, por exemplo, um β-Ketoacil-ACP redutase.

[00227] Em algumas modalidades, a célula que produz ácido graxo compreende uma sequência de nucleotídeos heteróloga que codifica uma enzima que pode desidratar D-3-Hidroxibutiril hidroxilase-ACP para criar uma ligação dupla entre os beta- e gama-carbonos que formam crotonil-ACP, por exemplo, um β-hidroxiacil-ACP desidrase.

[00228] Em algumas modalidades, a célula que produz ácido graxo compreende uma sequência de nucleotídeos heteróloga que codifica uma enzima que pode reduzir crotonil ACP com NADPH para formar butiril-ACP, por exemplo, um enoil ACP redutase.

[00229] Em algumas modalidades, a célula que produz ácido graxo compreende uma sequência de nucleotídeos heteróloga que codifica uma enzima que pode hidrolisar um composto de acila Cl6 de uma proteína carreadora de acila para formar palmitato, por exemplo, um tioesterase.

[00230] Em algumas modalidades, a célula que produz ácido graxo compreende uma ou mais sequências de nucleotídeos heterólogas que codificam acetil-CoA sintase e/ou malonil-CoA sintase, para realizar maior produção de um ou mais ácidos graxos comparara a uma célula pai geneticamente não modificada.

[00231] Por exemplo, para aumentar a produção de acetil-CoA, um ou mais dos seguintes genes podem ser expressos na célula: pdh, panK, aceEF (que codifica o componente de desidrogenase EIp e o componente di- idrolipoamida aciltransferase E2p do piruvato e complexos 2-oxoglutarato desidrogenase), fabH, fabDfabG, acpP, e fabF. Exemplos ilustrativos de sequências de nucleotídeos que codificam tais enzimas incluem, mas sem limitações: pdh (BAB34380, AAC73227, AAC73226), panK (também conhecido como coaA, AAC76952), aceEF (AAC73227, AAC73226), fabH (AAC74175), fabD (AAC74176), fabG (AAC74177), acpP (AAC74178), /aóF(AAC74179).

[00232] Em algumas modalidades, maiores níveis de ácido graxo podem ser realizados na célula atenuando ou silenciando genes que codificam proteínas envolvidas na desidratação de ácido graxo. Por exemplo, os níveis de expressão de fadE, gpsA, idhA, pflb, adhE, pta, poxB, ackA, e/ou ackB podem ser atenuados ou silenciados em uma célula hospedeira modificada por engenharia usando técnicas conhecidas na tecnologia. Exemplos ilustrativos de sequências de nucleotídeos que codificam tais proteínas incluem, mas sem limitações: fadE (AAC73325), gspA (AAC76632), IdhA (AAC74462), pflb (AAC73989), adhE (AAC74323),pto (AAC75357),/?ox5 (AAC73958), ackA (AAC75356), e ackB (BAB81430). As células hospedeiras restantes terão maiores níveis de produção de acetil-CoA quando crescidas em um ambiente apropriado.

[00233] Em algumas modalidades, a célula que produz ácido graxo compreende uma sequência de nucleotídeos heteróloga que codifica uma enzima que pode converter acetil-CoA em malonil-CoA, por exemplo, a proteína AccABCD de múltiplas subunidades. Um exemplo ilustrativo de uma sequência de nucleotídeos adequada que codifica AccABCD inclui, mas sem limitações, número de acesso AAC73296, EC 6.4.1.2.

[00234] Em algumas modalidades, a célula que produz ácido graxo compreende uma sequência de nucleotídeos heteróloga que codifica uma lipase. Exemplos ilustrativos de sequências de nucleotídeos adequadas que codificam uma lipase incluem, mas sem limitações, número, de acesso CAA89087 e CAA98876.

[00235] Em algumas modalidades, maiores níveis de ácido graxo podem ser realizados na célula inibindo PlsB, que podelevar a um aumento nos níveis de acil-ACP de cadeia longa, que inibirá as etapas precoces no caminho biossintético de ácido graxo (por exemplo, accABCD,fabH, e fabl). O nível de expressão de PlsB pode ser atenuado ou silenciado em uma célula hospedeira modificada por engenharia usando técnicas conhecidas na tecnologia. Um exemplo ilustrativo de uma sequência de nucleotídeos adequada que codifica PlsB inclui, mas sem limitações, número de acesso AAC77011. Em modalidades particulares, a mutação de plsB D31 IE pode ser usada para aumentar a quantidade de acil-CoA disponível na célula.

[00236] Em algumas modalidades, maior produção de ácidos graxos monoinsaturados pode ser realizada na célula sobre-expressando um gene sfa, que poderia resultar na supressão de fabA. Um exemplo ilustrativo de uma sequência de nucleotídeos adequada que codifica sfa inclui, mas sem limitações, número de acesso AAN79592.

[00237] Em algumas modalidades, maiores níveis de ácido graxo podem ser realizados na célula modulando a expressão de uma enzima que controla o comprimento da cadeia de um substrato de ácido graxo, por exemplo, uma tioesterase. Em algumas modalidades, a célula que produz ácido graxo foi modificada para sobre-expressar um gene tes ou fat. Exemplos ilustrativos de sequências de nucleotídeos tes adequadas incluem, mas sem limitações, números de acesso: (tesA: AAC73596, de E. Coli, capaz de produzir ácidos graxos Ci8:i) e (tesB: AAC73555 de E. Coli). Exemplos ilustrativos de sequências de nucleotídeos fat adequadas incluem, mas sem limitações: (fatB: Q41635 e AAA34215, de Umbellularia California, capaz de produzir ácidos graxos Ci2:o), (fatB2: Q39513 e AAC49269, de Cuphea hookeriana, capaz de produzir ácidos graxos Cs:o- Cio:o), (fatB3: AAC49269 e AAC72881, de Cuphea hookeriana, capaz de produzir ácidos graxos Cu:o- Ci6:o), (fatB: Q39473 e AAC49151, de Cinnamonum camphorum, capaz de produzir ácidos graxos Ci4:o), {fatB [M141T]: CAA85388, de mArabidopsis thaliana, capaz de produzir ácidos graxos Ci6:i), {fatA: NP 189147 e NP 193041, de Arabidopsis thaliana, capaz de produzir ácidos graxos Ci8:i), (fatA: CAC39106, de Bradvrhiizobium japonicum, capaz de preferencialmente produzir Ci8:i ácidos graxos ), (fatA\ AAC72883, de Cuphea hookeriana, capaz de produzir ácidos graxos Ci8:i), e (fatAl, AAL79361 de Helianassim annus).

[00238] Em algumas modalidades, maiores níveis de ácidos graxos Cio podem ser realizados na célula atenuando a expressão ou atividade de tioesterase Cie usando técnicas conhecidas na tecnologia. Exemplos ilustrativos de sequências de nucleotídeos adequadas que codificam tioesterase Ci8 incluem, mas sem limitações, números de acesso AAC73596 e P0ADA1. Em outras modalidades, maiores níveis de ácidos graxos Cio podem ser realizados na célula aumentando a expressão ou atividade de tioesterase Cio usando técnicas conhecidas na tecnologia. Um exemplo ilustrativo de uma sequência de nucleotídeos que codifica tioesterase Cio inclui, mas sem limitações, número de acesso Q39513.

[00239] Em algumas modalidades, maiores níveis de ácidos graxos Cu podem ser realizados na célula atenuando a expressão ou atividade de tioesterases endógenas que produzem ácidos graxos não Cu, usando técnicas conhecidas na tecnologia. Em outras modalidades, maiores níveis de ácidos graxos Cu podem ser realizados na célula aumentando a expressão ou atividade de tioesterases que usam o substrato Cu-ACP, usando técnicas conhecidas na tecnologia. Um exemplo ilustrativo de uma sequência de nucleotídeos que codifica uma tioesterase como esta inclui, mas sem limitações, número de acesso Q39473.

[00240] Em algumas modalidades, maiores níveis de ácidos graxos C12 podem ser realizados na célula atenuando a expressão ou atividade de tioesterases endógenas que produzem ácidos graxos não C12, usando técnicas conhecidas na tecnologia. Em outras modalidades, maiores níveis de ácidos graxos C12 podem ser realizados na célula aumentando a expressão ou atividade de tioesterases que usam o substrato C12-ACP, usando técnicas conhecidas na tecnologia. Um exemplo ilustrativo de uma sequência de nucleotídeos que codifica uma tioesterase como esta inclui, mas sem limitações, número de acesso Q41635.

6. EXEMPLOS 6.1 Exemplo 1

[00241] Este exemplo descreve um método exemplar para determinar a densidade celular (ODÔOO) de uma cultura de célula de levedura.

[00242] Uma amostra de 8 μL de uma cultura de célula foi combinada com 92 μL de diluente Triton OD (20 g/L Triton X-l 14, 200 mL/L PEG 200, 200 mL/L 100 % de etanol, água residual) em uma placa de 96 poços clara, a solução foi agitada a 1.000 RPM por 6 minutos, e o ODÔOO foi determinado medindo a absorbância a 600 nm em um espectrofotômetro M5 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).

6.2 Exemplo 2

[00243] Este exemplo descreve um método a base de vermelho de Nile exemplar usado para determinar o título de fameseno da cultura de célula de leveduras.

[00244] Uma amostra de 98 μL de uma cultura de célula foi transferida em uma placa de ensaio de base reta de poliestireno preta de 96 poços, e 2 μL de vermelho de Nile (Invitrogen, Carlsbad, CA) dissolvido a 100 μg/mL em DMSO foi adicionado a cada poços. Níveis de fluorescência foram imediatamente medidos em um espectrofotômetro M5 com excitação a 500 nm e emissão a 550 nm.

6.3 Exemplo 3

[00245] Este exemplo descreve um método com base na cromatografia gasosa exemplar (GC) usado para determinar o título do fameseno da cultura de célula de leveduras.

[00246] Amostra foi extraída com metano 1-heptano (1:1 v/v), e a mistura foi centrifugada para remover material celular. Uma alíquota do extrato metanol-heptano foi diluída em n-heptano com 0,001 % de t- carioileno (que serviu como um marcador do tempo de retenção para monitorar a injeção e eluição com êxito durante o perfil do forno de CG especificado) e então injetada em uma fase estacionária de metil silicone usando uma injeção de separação pulsada. Fameseno foi separado pelo ponto de ebulição usando CG com detecção por ionização de chama (FID).

6.4 Exemplo 4

[00247] Este exemplo demonstra o fenômeno da degeneração da cepa que ocorre quando a produção de composto não catabólico está “ligada” durante tanto o estágio de construção quanto de produção de um processo de fermentação.

[00248] Um frasco de 1 mL de suspensão de célula congelada de uma cepa de levedura compreendendo enzimas heterólogas incluindo as MEV enzimas de caminho (FIG. 1): IPP isomerase, FPP sintase, e fameseno sintase, e capaz de produzir um composto não catabólico exemplar (fameseno), foi descongelado, transferido em uma chicana de 250 mL contendo 50 mL de BSM 2.0 contendo 2 % de sacarose e 10 mg/L de D- pantotenato de cálcio e crescido em um agitador a 34 °C, 200 RPM por 24 horas. Toda a cultura foi então transferida em um frasco Fembach de 2,8 L contendo 850 mL de BSM 2,0 contendo 2,0 % de sacarose e 10 mg/L D- pantotenato de cálcio, e crescida em um agitador a 34 °C, 250 RPM por 24 horas. Toda a cultura foi então transferida em um fermentador de 2 L. A alimentação de nutriente no fermentador foi um meio de xarope de cana de açúcar brasileira não definido compreendendo 10 mg/L de D-pantotenato de cálcio, distribuído com pulsos iniciais equivalentes a uma açúcar 14 g/L/h. A taxa de alimentação foi então auto-ajustada com base na demanda do fermentador para carbono, conforme indicado pelos aumentos no oxigênio dissolvido. A fermentação foi corrida microaerobicamente a uma temperatura constante de 34 °C, um pH constante de 4,5 (controlado por adições de hidróxido de sódio), e uma taxa de transferência de oxigênio inicial de 200 mmol Ch/L/h até que o oxigênio dissolvido alcançasse 0 %, e então reduzida a 100 mmol Ch/L/h para o restante da fermentação. A cada três dias, o volume do tanque foi reduzido a cerca de 0,9 L para evitar transbordar. Traços de metais e vitaminas faltantes na alimentação do xarope da cana foram realimentados neste momento. A quantidade de fameseno produzida e o açúcar total consumido pelas células foi monitorada diariamente e a razão destes dois valores (isto é, o rendimento do produto do açúcar) foi determinada para cada período de 72 horas e disposta em gráfico, conforme mostrado na figura 3. O rendimento do produto da cultura declinou de seu pico em dias a <65 % deste pico por 21 dias.

6.5 Exemplo 5

[00249] Este exemplo fornece resultados que demonstram que células hospedeiras capazes de produzir o isoprenóide fameseno, e compreendendo o caminho MEV mediante regulação positiva por um promotor responsivo microaeróbico (“alteração com baixo O2”), produzem quantidades muito baixas de fameseno na condição de alto O2 (placa de agitação), e na condição de baixo O2 (frasco de agitação com baixa RPM), produção é substancialmente aumentada a níveis que atendem a produção de uma cepa pai não alterável na qual o caminho MEV é constitutivamente expresso. Os resultados são apresentados na figura 6.

Cepas de fameseno que produzem levedura:

[00250] Um derivado da cepa de produção de fameseno “não alterável” de uma cepa tipo selvagem de Saccharomyces cerevisiae (CEN.PK2) e que expressa os genes do caminho de mevalonato (FIG. 1) mediante o controle de promotores GAL foi usado como um controle de produção de fameseno constitutivo. A cepa não alterável compreendeu os seguintes genes de caminho de mevalonato cromossomicamente integrados de S. cerevisiae mediante o controle de promotores GAL: acetil-CoA tiolase, HMG-CoA sintase, HMG-CoA redutase, mevalonato quinase, fosfomevalonato quinase, e mevalonato pirofosfato decarboxilase; e seis cópias de fameseno sintase mutantes de Artemisinin annua. A cepa não alterável tem gene gal80 deletado e uma cópia adicional de GAL4 mediante o promotor GAL4oc, em que a sequência de codificação do GAL4 gene de Saccharomyces cerevisiae está mediante o controle regulatório de uma versão “operativa constitutiva” de seu promotor nativo (PGAL4oc; ver, por exemplo, Griggs & Johnston (1991) PNAS 88(19):8597-8601).

[00251] Produção de fameseno na cepa “não alterável” então tomou “alterável,” isto é, repressive! em condições aeróbicas. A cepa alterável de alteração em baixo O2 foi gerada no topo da cepa constitutiva substituindo os promotores do múltiplas cópias de GAL4 pelo promotor DAN1&1 (SEQ ID NO:1). A primeira cópia de pDANl#l que aciona GAL4 foi introduzida substituindo pGAL4oc por pDANl#l. Então o promotor nativo GAL4 foi substituído por pDANl#l. Esta cepa é referida como a “cepa alterável com baixo O2 #1” na figura 6. Desta cepa, terceira e quarta cópias de pDANl#l que aciona GAL4 foram integradas no locus GAS2 ao mesmo tempo. Esta segunda cepa alterável com quatro cópias de GAL4 mediante o controle do promotor DAN1#1 é referida como “cepa alterável com baixo O2 #2” na figura 7.

Regulação da produção de composto não catabólico variando as condições de oxigênio:

[00252] Tanto a cepa de controle que produz fameseno não alterável quanto a cepa alterável com baixo O2 #1 foram cultivadas em condições aeróbicas e microaeróbicas, respectivamente, para estimar a produção de fameseno em condições de fermentação pretendidas para servir como estado “desligado” e “ligado”.

[00253] Para a condição “desligada” ou “alto O2,” colônias de ambas as cepas foram coletadas em 360 uL de BSM 2.0, 2 % de sacarose em uma placa de 96 poços. Placas foram agitadas em alta RPM em um agitador ATR por 3 dias. Desta placa de pré-cultura, 6 uL de cultura foram transferidos para uma placa de 96 poços de produção contendo 360 uL de BSM 2.0, 4 % de sacarose. Placas foram agitadas em alta RPM em um agitador ATR por 2 dias. A concentração de fameseno foi determinada por GC-FID.

[00254] Para a condição “ligado” ou “baixo O2”, frascos de 125 mL foram preenchidos com 50 mL de BSM 2.0, 4 % de meio e inoculados a 0,1 OD de cada cepa. Cinquenta mL é um volume extraordinariamente grande de meio para um tamanho de frasco de 125 mL e isto ajudou a reduzir a taxa de transferência de oxigênio (OTR) no frasco para garantir que a cultura se tomasse microaeróbica. Oxigênio dissolvido foi medido por meio de uma sonda, que confirmou que ambas as cepas atingiram níveis de oxigênio dissolvidos indetectáveis em 24 h. Concentração de fameseno foi determinada por GC-FID depois de 120 h. Em 120 h, o oxigênio dissolvido para ambas as culturas foi aproximadamente o valor esperado para o equilíbrio com a fase gasosa, implicando na exaustão de carbono.

[00255] Conforme mostrado na figura 6, a cepa alterável com baixo O2 #1 produziu muito pouco fameseno em condições de alto O2, comparada à cepa não alterável constitutiva que produziu altos níveis de fameseno. Na condição de baixo O2, a indução da produção de fameseno foi alta na cepa alterável com baixo O2 #1, e excedeu a produção de fameseno pela cepa não alterável constitutiva. Estes resultados demonstram que a manipulação de oxigênio pode ser usada para realizar estado hermeticamente “desligado” e “ligado” para uma cepa que produz fameseno alterável com baixo O2.

6.6 Exemplo 6

[00256] Este exemplo fornece resultados que demonstram que células hospedeiras capazes de produzir o isoprenóide fameseno, e compreendendo o caminho MEV mediante regulação positiva por uma alteração com baixo O2, apresentam melhor estabilidade da produção de fameseno em uma corrida de fermentação longa, quando o estágio de preparo do fermentação é realizado em condições aeróbicas (afetando assim um estado “desligado”), comparada à produção de uma cepa constitutivamente de produção que produziu fameseno em todo o estágio de preparo. Os resultados são apresentados na figura 7.

[00257] Tanto para a cepa que produz fameseno constitutiva não alterável quanto para a cepa alterável com baixo O2 #2, um frasco de 1 mL de suspensão de célula congelada foi descongelado, transferido em uma chicana de 250 mL contendo 50 mL de BSM 3.0 contendo 1,6 % de sacarose 0,4 % glicose como uma fonte de carbono, e crescida em um agitador a 34 °C, 250 RPM por 24 horas. Dois mL do frasco foram então transferidos em 50 mL de BSM 3.0 contendo 1,6 % de sacarose 0,4 % de glicose como uma fonte de carbono, e crescido em um agitador a 34 °C, 250 RPM por 24 horas. Vinte cinco mL foram então transferidos em uma garrafa de inoculação com 225 mL de meio de tanque e transferidos para um fermentador de 0,5 L. A alimentação de nutriente no fermentador foi uma solução de sacarose 650 g/L, distribuída com pulsos iniciais equivalentes a um açúcar 10 g/L/h. A taxa de alimentação é então auto-ajustada com base na demanda de carbono do fermentador, conforme indicado pelo aumento no oxigênio dissolvido. A fermentação foi corrida microaerobicamente a uma temperatura constante de 34 °C, um pH constante de 4,5 (controlado por adições de hidróxido de sódio), e uma taxa de transferência de oxigênio máxima de 110 mmol 02/L/h, uma vez que o oxigênio dissolvido atinge 0 %. A cada dia, o volume do tanque foi reduzido a cerca de 0,29 L para evitar transbordar. Traços de metais e vitaminas foram reabastecidos neste momento. A quantidade de fameseno total produzida e o açúcar total consumido pelas células foi atualizada diariamente e a razão destes dois valores (isto é, o rendimento do produto cumulativo de açúcar) foi determinada para o intervalo de tempo=0 ao tempo=t e disposto em gráfico conforme mostrado na figura 7. O rendimento do produto cumulativo da cepa pai não alterável declinou continuamente de seu pico a 160 h a cerca de ~83 % do rendimento do pico da cepa filha alterável a 300 h. Ao contrário, a cepa alterável com baixo O2 #2 manteve um rendimento cumulativo que foi >95 % de seu pico de 110 h a 300 h. Assim, estes resultados demonstram que uma alteração com baixo O2, que desliga a produção de fameseno em condições aeróbicas durante o estágio de preparo de um processo de fermentação de dois estágios, resulta em melhor estabilidade de produção da produção de fameseno durante o estágio de produção.

6.7 Exemplo 7

[00258] Este exemplo fornece resultados que demonstram que células hospedeiras capazes de produzir o isoprenóide fameseno, e compreendendo o caminho MEV mediante regulação negativa por um promotor responsivo à maltose (“alteração com maltose”), produzem quantidades muito baixas de fameseno na presença de maltose (1,3 %) e na ausência de maltose a produção é substancialmente aumentada a níveis próximos da produção de uma cepa pai não alterável na qual o caminho MEV é constitutivamente expresso. Os resultados são apresentados na figura 8.

Cepas de fameseno que produzem levedura:

[00259] Um derivado da cepa de produção de fameseno “não alterável” de uma cepa tipo selvagem de Saccharomyces cerevisiae (CEN.PK2) e que expressa os genes do caminho de mevalonato (FIG. 1) mediante o controle de promotores GAL foi usado como um controle de produção de fameseno constitutivo. A cepa não alterável compreendeu os seguintes genes do caminho de mevalonato cromossomicamente integrado de S. cerevisiae mediante o controle de promotores GAL: acetil-CoA tiolase, HMG-CoA sintase, HMG-CoA redutase, mevalonato quinase, fosfomevalonato quinase e mevalonato pirofosfato decarboxilase; e seis cópias de mutantes de fameseno sintase de Artemisinin annua. A cepa não alterável tem gene gal80 deletado e uma cópia de GAL4 adicional mediante promotor GAL4oc, no qual a sequência de codificação do gene GAL4 de Saccharomyces cerevisiae está mediante o controle regulatório de uma versão “operativa constitutiva” de seu promotor nativo (PGAL4oc; ver, por exemplo, Griggs & Johnston (1991) PNAS 88(19):8597-8601).

[00260] Produção de fameseno na cepa “não alterável” então se tomou “alterável,” isto é, repressível na presença de maltose. A cepa alterável com maltose foi criada da cepa constitutiva cromossomicamente integrando uma cópia de GAL80 mediante o controle do promotor responsivo à maltose pMAL32 (SEQ ID NO: 17).

Regulação da produção de composto não catabólico cariando a maltose no meio de cultura:

[00261] Tanto a cepa de controle que produz fameseno não alterável quanto a cepa alterável com maltose foram cultivadas em meio de cultura, incluindo ou excluindo maltose, respectivamente, para estimar a produção de fameseno em condições de fermentação destinadas a servir como estado “desligado” e “ligado”.

[00262] Para condições de pré-cultura, tanto a cepa de controle que produz fameseno não alterável quanto a cepa alterável com maltose foram cultivadas e cresceram em placas de 96 poços estéreis (1,1 mL de volume de trabalho; Axygen) contendo 360 uL de meio Bird Seed (BSM, originalmente descrito por van Hoek et al., (2000). Colônias únicas foram repicadas em cada poço e incubadas por aproximadamente 72 horas a 33,5 °C, 80 % de umidade e 1000 rpm (Infers Multitron; ATR Biotec). Para os experimentos de produção de fameseno, as culturas saturadas mencionadas anteriormente foram diluídas 1/25 em placas de 1,1 mL estéreis contendo 145 μL de BSM e 5 μL de óleo mineral. A fonte de carbono tanto para 4 % de sacarose quanto uma mistura de 2,7 % de sacarose e 1,3 % de maltose. Depois de 72 horas de cultura, a extração de fameseno foi realizada adicionando 600 μL de álcool isopropílico (IPA) a cada poço. Depois de uma incubação de 30 minutos, 8 μL foram transferidos para uma placa de ensaio de base clara contendo 192 μL de IPA. Concentração de fameseno foi medida por absorbância de UV a 222 nm em um leitor de placa SpectraMax.

[00263] Conforme mostrado na figura 8, a cepa alterável com maltose produziu muito pouco fameseno na presença de maltose, comparado à cepa não alterável constitutiva que produziu altos níveis de fameseno. Na ausência de maltose, a indução da produção de fameseno foi alta na cepa alterável com maltose e se aproximou da produção de fameseno pela cepa não alterável constitutiva. Estes resultados demonstram que a manipulação da maltose pode ser usada para realizar estado “desligado” e “ligado” rigoroso para uma cepa que produz fameseno alterável por maltose.

6.8 Exemplo 8

[00264] Este exemplo fornece resultados que demonstram que células hospedeiras capazes de produzir o isoprenóide fameseno, e compreendendo o caminho MEV tanto mediante (i) regulação positiva por um promotor responsivo microaeróbico (“alteração com baixo Ch”); quanto regulação negativa por um promotor responsivo à maltose (“alteração com maltose”), melhoraram a taxa de crescimentos durante o estado “desligado” de produção do composto comparado a uma cepa pai que produz fameseno constitutivamente . Os resultados são apresentados na figura 9.

[00265] Para os experimentos da taxa de crescimento, culturas saturadas da cepa alterável com baixo O2 #1, da cepa alterável com maltose, e o produtor de fameseno não alterável constitutivo foram diluídos 1/25 em placas de 1,1 mL estéreis contendo 360 μL de meio definido recém preparado contendo 3 % (p/v) de sacarose, ou uma mistura de 2 % de sacarose e 1 % de maltose. A taxa de crescimento foi calculada medindo OD600 (leitor de placa SpectraMax M5; Molecular Devices) durante um período de 8 horas imediatamente depois da transferência do meio recém preparado (2,5, 3,5, 6 e 8 hr). Para eliminar qualquer contribuição da emulsão de fameseno para o sinal OD, culturas foram diluídas em uma solução de 20 % (v/v) PEG 20, 20 % (v/v) Etanol, 2 % (v/v) Triton X-114. Taxas de crescimento foram determinadas aplicando uma regressão linear de LN (OD) em função do tempo.

[00266] Conforme mostrado na figura 9, a cepa alterável com maltose mostrou melhor crescimento no estado “desligado” (isto é, na presença de maltose) comparado ao seu estado “ligado” e significativamente melhorou o crescimento sobre a cepa que produz fameseno constitutiva não alterável (143 % em função de 100 % de taxas de crescimento relativas). Similarmente, a cepa alterável com baixo O2 #1 mostrou significativamente melhor crescimento no estado “desligado” (isto é, em condições aeróbicas) comparada à cepa que produz fameseno constitutiva não alterável (167 % em função de 100 % de taxas de crescimento relativas).

6.9 Exemplo 9

[00267] Este exemplo fornece resultados que demonstram que células hospedeiras capazes de produzir o isoprenóide fameseno, e compreendendo o caminho MEV mediante regulação negativa por um alteração com maltose, apresentaram melhor estabilidade da produção de fameseno em uma corrida de fermentação longa quando o estágio de preparo do fermentação é realizado na presença de maltose (afetando assim um estado “desligado”), comparada à produção de uma cepa de produção que produziu constitutivamente fameseno em todo o estágio de preparo. Os resultados são apresentados na figura 10.

[00268] Tanto a cepa de controle que produz fameseno não alterável quanto a cepa alterável com maltose foram inicialmente inutilizadas em um meio de ágar sólido contendo 2 % de dextrose e 1 % de maltose e cresceram a 30 °C até que as colônias fosse visíveis. Frascos de semeadura foram preparados inoculando uma única colônia em um tubo de 15 mL contendo 3 mL de BSM 2 % de sacarose 1 % de maltose. Depois de aproximadamente 48 horas, todos os 3 mL foram transferidos em frasco de agitação de 500 mL descartável contendo 125 mL de 2 % de sacarose e 1 % de maltose BSM (meio de frasco verd). Células cresceram a 30 °C em um agitador a 200 rpm até que um OD600 entre 4 e 7 fosse atingido. Uma vez que o OD desejado foi atingido, 36 mL de um estoque de glicerol 50 % estéril foi adicionado a 84 mL de cultura, a suspensão foi aliquotada em frascos de semeadura e os frascos de semeadura foram lentamente congelados a -80 °C a uma taxa de aproximadamente 1 °C/min. A biomassa preparada antes da fermentação foi concluída por descongelamento de um ou mais frascos de semeadura em um 250 mL frasco de agitação contendo 50 mL de 2 % de sacarose e 1 % de maltose BSM (meio de preparo da biomassa) e crescendo a cultura por 24 horas a 34 °C e 200 RPM. Uma porção desta cultura foi então transferida para um frasco de 500 mL contendo 100 mL do mesmo meio para atingir um OD600 de partida de 0,1, e cresceram por mais 24 horas. 25 mL desta cultura foram então usados para inocular um fermentador de 0,5 L contendo 225 mL de meio BSM sem nenhum açúcar. Xarope de cana (sem nenhuma maltose) foi alimentado mediante demanda e a fermentação correu por 13 dias depois de um protocolo de alimentação que maximizou o rendimento de fameseno.

[00269] A quantidade de fameseno total produzida e o açúcar total consumido pelas células foi atualizado diariamente e ao razão destes dois valores foi determinada para o intervalo de tempo=0 a tempo=t e disposta em gráfico como rendimento do intervalo do fermentador normalizado, conforme mostrado na figura 10. O rendimento do intervalo normalizado da cepa pai não alterável declinou continuamente de seu pico a 120 h a bem abaixo de ~20 % do rendimento do pico da cepa filha alterável a 300 h. Ao contrário, a cepa alterável com maltose manteve um rendimento de intervalo normalizado que foi ~50 % de seu pico de 72 h a 120 h. Assim, estes resultados demonstram que uma alteração com maltose que desliga a produção de fameseno na presença de maltose durante o estágio de preparo de um processo de fermentação de dois estágios resulta em melhor estabilidade de produção da produção de fameseno durante o estágio de produção.

6.10 Exemplo 10

[00270] Este exemplo fornece resultados que demonstram, para vários promotores sensíveis à maltose aqui descritos, a sensibilidade a várias quantidades de maltose e as alimentações mistas no meio de cultura, e bem como a capacidade de alteração para o estado “ligado” na ausência de maltose, seguindo repressão por maltose no estado “desligado”. Os resultados são apresentados nas figuras 11-14.

[00271] Para cada um dos promotores responsivos à maltose pMAL 11 (SEQ ID NO: 14), pMAL12 (SEQ ID NO: 15), pMAL31 (SEQ ID NO: 16), e pMAL32 (SEQ ID NO: 17)), duas cepas reportadoras diferentes derivadas de uma cepa tipo selvagem de Saccharomyces cerevisiae (CEN.PK2) foram geradas integrando os seguintes construtos reportadores no locus ATG20: (i) pMAL>GFP, uma sequência de codificação GFP operavelmente ligada ao promotor sensível à maltose, e (ii) pMAL>GAL80; pGALl>GFP, um construto compreendendo um cassete de expressão de GFP operavelmente ligado ao promotor GAL1; e uma sequência de codificação GAL80 operavelmente ligada ao promotor sensível à maltose.

[00272] Para pMAL>GFP e cepas de alteração com pGALl>GFP, pré- culturas foram diluídas 50 vezes em meio recém preparado contendo as misturas indicadas de glicose com maltose ou sacarose com maltose. Depois de mais 24 horas de incubação, as culturas foram diluídas em uma solução de PBS para uma densidade celular final que varia de 300 - 1000 células/uL e classificado no Guava. Células foram primeiro classificadas por dispersão para frente e lateral, células de levedura intactas foram diferenciadas e afastadas de escombros muito menores e partículas finas. Células verdes fluorescentes foram identificadas usando a produção de uma cepa de controle que expressa não GFP isogênica como o sinal de fundo não fluorescente. Histogramas foram construídos usando o software Flowjo.

[00273] Conforme mostrado nas figuras 11-14 (a), cada um de pMALll, pMAL12, pMAL31 e pMAL32 foram robustamente ativados por maltose mesmo a 0,5 %, mesmo quando misturados com glicose ou sacarose. Adicionalmente, conforme mostrado nas figuras 11-14 (B), cada um de pMALl 1, pMAL12, pMAL31 e pMAL32 foi capaz de manter fortes estados desligados, quando ligado como uma alteração “ligada com maltose” (painéis da esquerda), ou fortes estados ligados, quando ligados como uma alteração “desligada com maltose” (painéis da direita) quando as cepas hospedeiras foram subsequentemente cultivadas em meios que não compreendem maltose (4 % de sacarose).

[00274] Todas as publicações, patentes e pedidos de patente citados neste pedido de patente estão aqui incorporados pela referência como se cada publicação individual ou pedido de patente fosse específica e individualmente indicada para ser incorporada pela referência. Várias modificações e variações da presente revelação ficarão evidentes aos versados na tecnologia, sem fugir do escopo e espírito da revelação. Embora a revelação tenha sido descrita em algum detalhe, a título de ilustração e exemplo com os propósitos de clareza de entendimento, ficará evidente aos versados na tecnologia na luz dos ensinamentos aqui fornecidos que certas mudanças e modificações podem ser feitas nela sem fugir do espírito e escopo das reivindicações em anexo e que as reivindicações não devem ser indevidamente limitadas a tais modalidades específicas. De fato, várias modificações dos modos descritos para realizar a revelação, que são entendidas pelos versados na tecnologia, são destinadas a estar no escopo das reivindicações

Claims

1. Método para produzir um composto não catabólico heterólogo em uma célula hospedeira geneticamente modificada, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) cultivar uma população de células hospedeiras geneticamente modificadas em um meio de cultura compreendendo uma fonte de carbono sob condições aeróbicas, em que a célula hospedeira compreende: (i) um ou mais ácidos nucleicos heterólogos que codificam uma ou mais enzimas de um caminho enzimático para o preparo do composto não catabólico heterólogo, e (ii) um promotor responsivo microaeróbico operavelmente ligado a um ácido nucleico heterólogo que codifica um regulador transcripcional que regula positivamente a expressão de um ou mais ácidos nucleicos heterólogos que codificam uma ou mais enzimas do caminho enzimático, em que a expressão do regulador transcripcional é aumentada em condições de fermentação microaeróbicas, e em que as condições aeróbicas limitam a quantidade de composto não catabólico heterólogo produzida pelas células hospedeiras; e (b) cultivar a dita população ou uma subpopulação desta em um meio de cultura compreendendo uma fonte de carbono sob condições microaeróbicas, em que as ditas condições microaeróbicas aumentam a produção do composto não catabólico pela dita população ou subpopulação desta em que o composto não catabólico heterólogo é farneseno, e em que um ou mais ácidos nucleicos heterólogos que codificam uma ou mais enzimas de uma via enzimática para fazer o composto não catabólico heterólogo codificam uma enzima da via do mevalonato (MEV), e em que o regulador transcricional é Gal4p, e o um ou mais ácidos nucleicos heterólogos que codificam uma ou mais enzimas da via enzimática são, cada um, operativamente ligados a um promotor responsivo a Gal4p selecionado do grupo que consiste em pGAL1, pGAL7 e pGAL10, e em que o promotor responsivo a microaeróbio é um promotor DAN 1 mutado com uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 e 10.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as condições microaeróbicas compreendem uma concentração de oxigênio dissolvido no meio de cultura de menos que 20 %, menos que 15 %, menos que 10 %, menos que 5 %, ou 0 %.

3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que as condições microaeróbicas resultam em uma taxa de absorção de oxigênio das células hospedeiras de menos que 50 mmols, menos que 40 mmols, menos que 30 mmols, menos que 20 mmols, ou menos que 10 mmols por litro de meio, ou em que as condições microaeróbicas resultam em uma taxa de absorção de oxigênio específica das células hospedeiras de menos que 30 mmols, menos que 25 mmols, menos que 20 mmols, menos que 15 mmols, menos que 10 mmols, ou menos que 5 mmols por grama de peso de célula seco por hora.

4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a produção de composto não catabólico heterólogo pela população de células hospedeiras geneticamente modificadas pela duração de cultura da etapa (b) é melhorada comparada à alcançada em um processo de fermentação aeróbico em que a expressão de uma ou mais enzimas do caminho enzimático não é limitada pela atividade do promotor responsivo microaeróbico.

5. Composição de fermentação, caracterizada pelo fato de que compreende uma população de células hospedeiras geneticamente modificadas em um meio de cultura compreendendo uma fonte de carbono, em que a célula hospedeira compreende: (a) um ou mais ácidos nucleicos heterólogos que codificam uma ou mais enzimas de um caminho enzimático para o preparo de um composto não catabólico heterólogo, e (b) um promotor responsivo microaeróbico operavelmente ligado a um ácido nucleico heterólogo que codifica um regulador transcripcional que regula positivamente a expressão de um ou mais ácidos nucleicos heterólogos que codificam uma ou mais enzimas do caminho enzimático, em que a expressão do regulador transcripcional é aumentada sob condições microaeróbicas; em que o composto não catabólico heterólogo é farneseno, e em que um ou mais ácidos nucleicos heterólogos que codificam uma ou mais enzimas de uma via enzimática para fazer o composto não catabólico heterólogo codificam uma enzima da via do mevalonato (MEV), e em que o regulador transcricional é Gal4p, e o um ou mais ácidos nucleicos heterólogos que codificam uma ou mais enzimas da via enzimática são, cada um, operativamente ligados a um promotor responsivo a Gal4p selecionado do grupo que consiste em pGAL1, pGAL7 e pGAL10, e em que o promotor responsivo a microaeróbio é um promotor DAN 1 mutado selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7,8, 9 e 10.

6. Composição de fermentação de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que a célula hospedeira compreende adicionalmente um rompimento funcional de Gal80p.

7. Composição de fermentação de acordo com a reivindicação 5 ou 6, caracterizada pelo fato de que o meio de cultura compreende uma concentração de oxigênio dissolvido de menos que 20 %, menos que 15 %, menos que 10 %, menos que 5 %, ou 0 %.

8. Composição de fermentação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 7, caracterizada pelo fato de que a taxa de absorção de oxigênio das células hospedeiras é menos que 50 mmols, menos que 40 mmols, menos que 30 mmols, menos que 20 mmols por litro de meio, ou menos que 10 mmols por litro de meio, ou em que a taxa de absorção de oxigênio específica das células hospedeiras é menos que 30 mmols, menos que 25 mmols, menos que 20 mmols, menos que 15 mmols, menos que 10 mmols, ou menos que 5 mmols por grama de peso de célula seco por hora.