JP2003512013A - 組換えオレアンドライドポリケチドシンターゼ - Google Patents

組換えオレアンドライドポリケチドシンターゼ

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JP2003512013A JP2000579721A JP2000579721A JP2003512013A JP 2003512013 A JP2003512013 A JP 2003512013A JP 2000579721 A JP2000579721 A JP 2000579721A JP 2000579721 A JP2000579721 A JP 2000579721A JP 2003512013 A JP2003512013 A JP 2003512013A
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サンジェイ クリシュナカント シャー，
ロバート マクダニエル，
リー タング，
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コーサン バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド
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Abstract

(57)【要約】 オレアンドライドポリケチドシンターゼのすべてまたは一部をコードする組換えＤＮＡ化合物を使用して、オレアンドライド、オレアンドライド誘導体、ならびに抗生物質およびモチライドとして有用なポリケチドの生成のために、宿主細胞において組換えポリケチドシンターゼ遺伝子を発現させる。１つの実施形態では、本発明の単離された組換えＤＮＡ化合物は、オレアンドライドポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）のローディングモジュールまたは拡張モジュール１〜４のいずれか１つのドメインについてのコード配列を含む。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （発明の分野） 本発明は、組換えＤＮＡ技術によってポリケチド（ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ）を
生成するための、組換え方法および材料を提供する。本発明は、農学技術、家畜
学技術、化学技術、医化学技術、医学技術、分子生物学技術、薬理学技術、およ
び獣医学技術の分野に関する。
【０００２】 （発明の背景） ポリケチドは、一連の縮合および引き続く改変を通して２−炭素ユニット（２
−ｃａｒｂｏｎ ｕｎｉｔ）から合成される、多様な化合物の大きなファミリー
を表す。ポリケチドは、多くの型の生物（真菌および菌糸体細菌、特に放線菌類
、を含む）において生じる。広範な種々のポリケチド構造が存在し、そしてポリ
ケチドのクラスは多様な活性を有する多数の化合物を包含する。エリスロマイシ
ン、ＦＫ５０６、ＦＫ５２０、ナルボマイシン、オレアンドマイシン、ピクロマ
イシン（ｐｉｃｒｏｍｙｃｉｎ）、ラパマイシン、スピノシン（ｓｐｉｎｏｃｙ
ｎ）、およびタイロシンは、このような化合物の例である。従来の化学的方法論
によってポリケチド化合物を生成する際の困難性、および野生型細胞におけるポ
リケチドの代表的な低生産性を考慮して、ポリケチド化合物を生成するための改
善された手段または代替的手段を見出すことにかなりの関心が寄せられてきた。
ＰＣＴ公開番号ＷＯ９３／１３６６３；ＷＯ９５／０８５４８；ＷＯ９６／４０
９６８；ＷＯ９７／０２３５８；およびＷＯ９８／２７２０３；米国特許第４，
８７４，７４８号；同第５，０６３，１５５号；同第５，０９８，８３７号；同
第５，１４９，６３９号；同第５，６７２，４９１号；および同第５，７１２，
１４６号；Ｆｕら、１９９４、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３：９３２１−９
３２６；ＭｃＤａｎｉｅｌら、１９９３、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６２：１５４６−
１５５０；ならびにＲｏｈｒ、１９９５、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ
．Ｅｎｇｌ．３４（８）：８８１−８８８（これらの各々は、本明細書中で参考
として援用される）を参照のこと。
【０００３】 ポリケチドは、天然では、ポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）酵素によって合成
される。複数の大きなタンパク質の複合体であるこれらの酵素は、脂肪酸の生合
成において２−炭素ユニットの縮合を触媒するシンターゼと類似する。ＰＫＳ酵
素の２つの主要な型が公知である；これらは、それらの組成において、および合
成の様式において異なる。これらの２つの主要なＰＫＳ酵素の型を、一般に、Ｉ
型または「モジュール型」ＰＫＳ酵素、およびＩＩ型「反復（ｉｔｅｒａｔｉｖ
ｅ）」ＰＫＳ酵素という。
【０００４】 モジュール型ＰＫＳは、エリスロマイシン、メチマイシン、ナルボマイシン、
オレアンドマイシン、ピクロマイシン、およびタイロシンを含む、多数の１２、
１４、および１６員のマクロライド系抗生物質の生成を担う。１４員のポリケチ
ドについてのモジュール型ＰＫＳ酵素は、しばしば３つ以上のオープンリーディ
ングフレーム（ＯＲＦ）からなるＰＫＳ遺伝子によりコードされる。モジュール
型ＰＫＳの各ＯＲＦは、ケトシンターゼ活性の１、２、またはそれより多い「モ
ジュール」を含み得、その各モジュールは、少なくとも２つ（ローディングモジ
ュールの場合）そしてより代表的には３つ（最も単純な拡張モジュール（ｅｘｔ
ｅｎｄｅｒ ｍｏｄｕｌｅ）について）またはそれより多い酵素活性、すなわち
「ドメイン」からなる。これらの大きな多機能性酵素（３００，０００ｋＤａを
超える）は、アシルチオエステル間の脱炭酸縮合、続く種々のβ−炭素プロセシ
ング活性のサイクルを含む、複数の段階の経路を通して、ポリケチドマクロラク
トンの生合成を触媒する（Ｏ’Ｈａｇａｎ、Ｄ．Ｔｈｅ ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ
ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ；Ｅ．Ｈｏｒｗｏｏｄ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９１
（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。
【０００５】 過去５年程の間に、モジュール型ＰＫＳの機能および特異性の研究は、６−デ
オキシエリスロノライド（ｄｅｏｘｙｅｒｙｔｈｒｏｎｏｌｉｄｅ）Ｂ（６−ｄ
ＥＢ）シンターゼ（ＤＥＢＳ）遺伝子を伴って開発された、プラスミドに基づく
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ発現系によって大きく促進さ
れている（Ｋａｏら、１９９４、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６５：５０９−５１２、Ｍ
ｃＤａｎｉｅｌら、１９９３、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６２：１５４６−１５５７、
ならびに米国特許第５，６７２，４９１号、および同第５，７１２，１４６号（
これらの各々は、本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。ＤＥＢ
Ｓについてのこのプラスミドに基づく遺伝子系に対する利点は、天然のＤＥＢＳ
宿主生物（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｅｒｙｔｈｒａｅａ）を操作
するための飽き飽きして限られた技術を克服し、組換えＰＫＳのより容易な構築
を可能にし、そして「清澄な」宿主バックグラウンドを提供することによって、
ＰＫＳ分析の複雑性を低減させることである。この系はまた、Ｓｔｒｅｐｔｏｍ
ｙｃｅｓにおいて第１のコンビナトリアルモジュール型ポリケチドライブラリー
の構築を促進した（ＰＣＴ公開番号ＷＯ９８／４９３１５（本明細書中で参考と
して援用される）を参照のこと）。
【０００６】 ＰＫＳの遺伝子操作による、ポリケチド生合成の局面（例えば、単量体選択、
およびβ−炭素プロセシングの程度）を制御する能力は、新規の抗生物質のコン
ビナトリアル操作において大いなる関心を刺激した（Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ、１
９９８、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１：３１９−３２９；Ｃａ
ｒｒｅｒａｓおよびＳａｎｔｉ、１９９８、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃ
ｈ．９：４０３−４１１；ならびに米国特許第５，７１２，１４６号および同第
５，６７２，４９１号（これらの各々は、本明細書中で参考として援用される）
を参照のこと）。この関心は、ＰＫＳ酵素をコードする遺伝子の組換えＤＮＡ技
術によるクローニング、分析、および操作をもたらした。得られた技術は、天然
において生じるか、またはさもなければポリケチドを生成しない宿主において生
じるよりも高いレベルでのＰＫＳによって合成されるポリケチドを生成するいず
れかのために、既知のＰＫＳ遺伝子クラスターを操作することを可能にする。こ
の技術はまた、既知のＰＫＳ遺伝子クラスターから生成されるポリケチドと構造
的に関連するが異なる分子を生成することを可能にする。
【０００７】 オレアンドマイシンは、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕ
ｓにおいてモジュール型ＰＫＳにより生成される抗菌性ポリケチドである（米国
特許第２，７５７，１２３号（本明細書中で参考として援用される）に記載され
る）。オレアンドマイシンは、以下に示される構造を有する（従来の番号付けス
キームおよび立体化学的表示を伴う）。
【０００８】
【化１】 特定の他のマクロライド抗生物質の場合、ＰＫＳのマクロライド生成物である８
，８ａ−デオキシオレアンドライド（ｄｅｏｘｙｏｌｅａｎｄｏｌｉｄｅ）（本
明細書中では、単純に、オレアンドライド（ｏｌｅａｎｄｏｌｉｄｅ）とも言及
する（しかし、他の状況でオレアンドライドは、エポキシ化アグリコンを言及す
る））は、エポキシ化（Ｃ−８およびＣ−８ａにて）およびグリコシル化（オレ
アンドロースでＣ−３にて、およびデソサミンでＣ−５にて）によりさらに改変
されて、オレアンドマイシンを生成する。
【０００９】 「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ａ ｔｙｐｅ Ｉ
ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｗｈｉｃｈ ｈａｓ ａｎ ｕｎ
ｕｓｕａｌ ｃｏｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ」（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ
．２４２：３５８−３６２）と表題付けられたＳｗａｎら、１９９４の参考文献
（本明細書中で参考として援用される）は、オレアンドライドＰＫＳの、モジュ
ール５および６をコードすると仮定されるＯＲＦＢと命名された遺伝子のコード
領域、ならびにモジュール４のＡＣＰドメインを含むと仮定されるＯＲＦＡと命
名された遺伝子のフラグメントのＤＮＡ配列を記載する。「Ｔｗｏ ｇｌｙｃｏ
ｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ ａｎｄ ａ ｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅ ａｒ
ｅ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｏｌｅａｎｄｏｍｙｃｉｎ ｍｏｄｉｆｉｃａｔ
ｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ ｉｔｓ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｂｙ Ｓｔｒｅｐ
ｒｏｍｙｃｅｓ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ」（Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．
２８（６）：１１７７−１１８５）と表題付けられたＱｕｉｒｏｓら、１９９８
の参考文献（本明細書中で参考として援用される）は、その生合成の間のオレア
ンドマイシン改変に関与する遺伝子および遺伝子産物を記載する。詳細には、こ
の参考文献は、オレアンドマイシンをプロデューサー細胞に対して非毒性にする
ことに関与するグリコシルトランスフェラーゼ、およびグリコシル化形態が細胞
から排出された後に、オレアンドマイシンを再活性化させるグリコシダーゼを記
載する。Ｏｌａｎｏら、１９９８年８月「Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａ Ｓｔｒ
ｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｒ
ｅｇｉｏｎ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｏｌｅａｎｄｏｍｙｃｉｎ ｂｉｏｓｙ
ｎｔｈｅｓｉｓ，ｗｈｉｃｈ ｅｎｃｏｄｅｓｔ ｔｗｏ ｇｌｙｃｏｓｙｌｔ
ｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ ｆｏｒ ｇｌｙｃｏｓｙｌａ
ｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍａｃｒｏｌａｃｔｏｎｅ ｒｉｎｇ」Ｍｏｌ．Ｇｅ
ｎ．Ｇｅｎｅｔ．２５９（３）２９９−３０８、およびＰＣＴ特許公開番号９９
／０５２８３（本明細書中で参考として援用される）もまた参照のこと。多数の
半合成的オレアンドマイシン誘導体が記載されているが（米国特許第４，０８５
，１１９号；同第４，０９０，０１７号；同第４，１２５，７０５号；同第４，
１３３，９５０号；同第４，１４０，８４８号；同第４，１６６，９０１号；同
第４，３３６，３６８号；および同第５，２６８，４６２号（本明細書中で参考
として援用される）を参照のこと）、このような誘導体の数および多様性は、Ｐ
ＫＳ遺伝子を操作する不可能性に起因して、制限されている。
【００１０】 オレアンドライドＰＫＳの迅速な操作を可能にする遺伝的な系は、薬学的適用
、農学的適用、および獣医学的適用のための新規の化合物を作製するために有益
である。このような化合物の生成は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃ
ｏｌｏｒおよびＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓならびに他の宿主細胞におけるオレアンド
ライドＰＫＳの異種発現が可能であった場合に、達成され得る。本発明は、これ
らおよび他の必要性を満たす。
【００１１】 （発明の要旨） 本発明は、組換え宿主細胞においてオレアンドライドＰＫＳから全体または一
部が誘導されたＰＫＳ酵素を発現させるための組換え方法および材料を提供する
。本発明はまた、このようなＰＫＳ酵素によって生成されるポリケチドを提供す
る。本発明は、究極的にはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕ
ｓにおいてオレアンドライドの生成を生じる、完全なＰＫＳを構築するタンパク
質についての遺伝子のすべてを、組換え形態で提供する。オレアンドライドはさ
らに、オレアンドマイシンを形成するためにグリコシル化およびエポキシ化され
る。従って、１つの実施形態において、本発明は、オレアンドライドＰＫＳ遺伝
子によってコードされる少なくとも１つのドメイン、モジュール、またはタンパ
ク質をコードするヌクレオチド配列を有する核酸を含む組換え材料に関する。本
発明の１つの好ましい実施形態では、本発明のＤＮＡ化合物は、８，８ａ−デオ
キシオレアンドライドシンターゼのローディングモジュールおよび拡張モジュー
ル１〜４のドメインのうちの少なくとも１つ、好ましくは２つ以上についてのコ
ード配列を含む。
【００１２】 １つの実施形態において、本発明は、１つ以上のオレアンドライドＰＫＳ遺伝
子の発現を駆動するように位置付けられた異種プロモーターを含む、組換えベク
ターを提供する。好ましい実施形態において、プロモーターは、別のＰＫＳ遺伝
子由来である。関連した実施形態において、本発明は、オレアンドライドを生成
するベクターを含む組換え宿主細胞を提供する。好ましい実施形態において、宿
主細胞は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓまたはＳ．ｃｏｅｌｉ
ｃｏｌｏｒである。
【００１３】 別の実施形態において、本発明は、オレアンドライドＰＫＳのすべてまたは一
部、および第２のＰＫＳの少なくとも一部を含むハイブリッドＰＫＳの発現を駆
動するように位置付けられたプロモーターを含む、組換えベクターを提供する。
関連した実施形態において、本発明は、ハイブリッドＰＫＳおよびその対応する
ポリケチドを生成するベクターを含む組換え宿主細胞を提供する。好ましい実施
形態において、宿主細胞は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓまた
はＳ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒである。
【００１４】 関連する実施形態において、本発明は、ポリケチドのライブラリーを生成する
ための組換え材料を提供し、ここで、このライブラリーのポリケチドメンバーは
、本発明のハイブリッドＰＫＳ酵素によって合成される。生じたポリケチドは、
さらに改変され、それらを代表的にはヒドロキシル化および／またはグリコシル
化を経て、他の有用な化合物（例えば、抗生物質）へ変換し得る。抗生物質の調
製の際の有用な中間体である、本発明により提供される改変されたマクロライド
は、特に有益である。
【００１５】 別の関連する実施形態において、本発明は、改変されたＰＫＳをコードする核
酸を調製するための方法を提供し、この方法は、オレアンドライドＰＫＳコード
配列を骨格として使用する工程、および変異誘発、不活性化、欠失、挿入、また
は置換のいずれかによって酵素活性をコードするヌクレオチド配列の部分を改変
する工程を包含する。このように改変されたオレアンドライドＰＫＳコードヌク
レオチド配列は、次いで適切な宿主細胞において発現され得、そしてこの細胞を
使用して、オレアンドライドＰＫＳによって生成されるポリケチドと異なるポリ
ケチドを生成し得る。さらに、オレアンドライドＰＫＳコード配列の部分は、他
のＰＫＳコード配列内に挿入され、その産物を改変し得る。
【００１６】 別の関連する実施形態において、本発明は、多重した細胞コロニー、コロニー
のライブラリーを構築することに関し、ここで、ライブラリーの各コロニーは、
オレアンドライドＰＫＳから全体または一部が誘導されたモジュール型ＰＫＳの
生成のための発現ベクターを含む。従って、モジュール型ＰＫＳの少なくとも一
部は、オレアンドライドを生成するＰＫＳに見出されるモジュール型ＰＫＳと同
一であり、そしてそのようにして同定される。この誘導された部分は、合成的に
調製され得るか、またはオレアンドライドを生成する生物体由来のＤＮＡから直
接的に調製され得る。さらに、本発明は、生じたポリケチドおよび抗生物質ライ
ブラリーをスクリーニングする方法を提供する。
【００１７】 本発明はまた、新規なポリケチド、モチライド、抗生物質、およびそれらから
誘導される他の有用な化合物を提供する。本発明の化合物はまた、別の化合物の
製造に使用され得る。好ましい実施形態において、本発明の化合物は、動物また
はヒトへの投与のために、混合物または溶液における抗生物質として処方される
。
【００１８】 本発明のこれらおよび他の実施形態は、以下の説明、実施例、および以下に示
される特許請求の範囲においてより詳細に記載される。
【００１９】 （発明の詳細な説明） 本発明は、組換え宿主細胞においてポリケチドを生成するために有用な、化合
物および方法を提供する。本明細書中で使用される場合、用語、組換え体とは、
ヒトの介入によって生成された、化合物または組成物をいう。本発明は、オレア
ンドライドＰＫＳの全てまたは一部をコードする、組換えＤＮＡ化合物を提供す
る。本発明は、組換え宿主細胞においてオレアンドライドＰＫＳを生成する際、
およびオレアンドライドＰＫＳの一部から構成されるハイブリッドＰＫＳを生成
する際に有用な、組換え発現ベクターを提供する。本発明は、組換えＰＫＳによ
り生成されるポリケチド、ならびに化学的プロセスおよび／またはポリケチド改
変酵素を用いた処理によってポリケチドから誘導されるものを提供する。
【００２０】 本発明の多くのそして多様な、利点および適用を理解するために、以下の本発
明の説明は、以下のように構成される。第一節において、本発明によって提供さ
れる組換えオレアンドライドＰＫＳを記載する。第ＩＩ節において、本発明によ
って提供される、オレアンドライドＰＫＳおよびオレアンドライド改変酵素の異
種発現のための方法を記載する。第ＩＩＩ節において、本発明によって提供され
るハイブリッドＰＫＳ遺伝子、およびそれによって生成されるポリケチドを記載
する。第ＶＩ節において、本発明によって提供されるポリケチド化合物、および
それらの化合物の薬学的組成物を記載する。この詳細な説明に続いて、本発明を
例示する種々の実施例を提供する。
【００２１】 オレアンドライドシンターゼ遺伝子は、他のＰＫＳ遺伝子と同様に、１つのロ
ーディングモジュール、多くの拡張モジュール、および１つのチオエステラーゼ
ドメインで組織化された、コード配列から構成される。以下により十分に記載さ
れるように、これらのドメインおよびモジュールの各々は、１つ以上の特定の機
能を有するポリペプチドである。一般的に、そのローディングモジュールは、そ
のポリケチドを合成するために使用される第一の基礎単位（ｂｕｉｌｄｉｎｇ
ｂｌｏｃｋ）を結合し、そしてそれを第一の拡張モジュールへ転移させることを
担う。複合体ポリケチドを形成するために使用される基礎単位は、代表的にはア
シルチオエステル、最も一般的には、アセチルＣｏＡ、プロピオニルＣｏＡ、マ
ロニルＣｏＡ、２−ヒドロキシマロニルＣｏＡ、２−メチルマロニルＣｏＡ、お
よび２−エチルマロニルＣｏＡである。他の基礎単位としては、アミノ酸様アシ
ルチオエステルが挙げられる。ＰＫＳは、このアシルチオエステル基礎単位間の
、反復される脱炭酸クライゼン縮合を経る、ポリケチドの生合成を触媒する。各
モジュールは、基礎単位を結合し、１つ以上の機能を実施し、そして生じた化合
物を次のモジュールへ転移させることを担う。この次のモジュールは、順番に、
合成が完了するまで、その次の基礎単位を結合し、そして伸長した化合物をその
次のモジュールに転移させることを担う。この完了時点で、酵素的チオエステラ
ーゼ活性は、このＰＫＳからこのポリケチドを切断する。。
【００２２】 このようなモジュール型組織化は、複合体ポリケチドを合成するＰＫＳ酵素の
クラスの特徴であり、そして当該分野で周知である。６−デオキシエリスロノラ
イドＢ（６−ｄＥＢ）として公知のポリケチドは、この型の複合体ポリケチドの
古典的な例である。ｅｒｙＡＩ、ｅｒｙＡＩＩ、およびｅｒｙＡＩＩＩとして公
知の遺伝子（また本明細書中では、６−ｄＥＢシンターゼを含むタンパク質（Ｄ
ＥＢＳ１、ＤＥＢＳ２、およびＤＥＢＳ３として公知）についてのＤＥＢＳ遺伝
子とも呼ばれる）は、６−ｄＥＢを合成するＤＥＢＳとして公知の複数サブユニ
ットタンパク質をコードし、これらは、米国特許第５，８２４，５１３号（本明
細書中で参考として援用される）に記載される。モジュール型ＰＫＳ遺伝子を操
作する組換え方法は、米国特許第５，６７２，４９１号；同第５，８４３，７１
８号；同第５，８３０，７５０号；および同第５，７１２，１４６号；ならびに
ＰＣＴ公開番号９８／４９３１５および同９７／０２３５８号（これらの各々は
本明細書中で参考として援用される）に記載される。
【００２３】 ＤＥＢＳのローディングモジュールは、２つのドメイン（アシルトランスフェ
ラーゼ（ＡＴ）ドメインおよびアシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）ドメイン）
からなる。ＤＥＢＳの各拡張モジュールは、他のモジュール型ＰＫＳ酵素の拡張
モジュールと同様に、ケトシンターゼ（ＫＳ）ドメイン、ＡＴドメイン、および
ＡＣＰドメイン、ならびに伸長中のポリケチド鎖のβ炭素を改変する酵素活性に
ついての０個、１個、２個、または３個のドメインを含む。モジュールは、他の
酵素活性（例えば、メチルトランスフェラーゼ活性）についてのドメインもまた
含み得る。最後に、放出ドメインは、チオエステラーゼ、およびしばしばシクラ
ーゼ活性を含む。
【００２４】 このローディングモジュールのＡＴドメインは、特定のアシルＣｏＡ（ＤＥＢ
Ｓについて、これは、通常はプロピオニル、しかし時々ブチリルまたはアセチル
）を認識し、そしてこのアシルＣｏＡをチオールエステルとしてこのローディン
グモジュールのＡＣＰに転移させる。同時に、各拡張モジュール上のＡＴは、特
定の拡張ＣｏＡ（マロニルまたはα−置換型マロニル（すなわち、メチルマロニ
ル、エチルマロニル、および２−ヒドロキシマロニル））を認識し、そしてこの
拡張ＣｏＡをそのモジュールのＡＣＰに転移させてチオエステルを形成する。一
旦このＰＫＳが、アシルＡＣＰおよびマロニルＡＣＰによって開始されると、こ
のローディングモジュールのアシル基が転位して、第一の拡張モジュールのＫＳ
にてチオールエステルを形成する（トランスエステル化）；この段階で、拡張モ
ジュール１は、アシルＫＳおよびマロニル（または置換型マロニル）ＡＣＰを有
する。次いで、このローディングモジュールから誘導されたアシル基は、このマ
ロニル基のα炭素に共有結合して炭素−炭素結合を形成し、同時に脱炭酸によっ
て駆動され、そしてこのローディングユニットより２炭素長い骨格を有する新し
いアシルＡＣＰを生成する（伸長または拡張）。この伸長中のポリケチド鎖は、
このＡＣＰから次のモジュールのＫＳに転移され、そしてこのプロセスが続く。
【００２５】 各モジュールで２炭素分伸長する、このポリケチド鎖は、組立てライン様プロ
セスで、共有結合チオールエステルとして、モジュールからモジュールへ連続的
に通過される。このプロセス単独によって生成された炭素鎖は、他の全ての炭素
原子にてケトンを保有して、ポリケトンを生成する。これからポリケチドという
名前が生まれた。しかし、最も一般的には、さらなる酵素活性は、各２つの炭素
単位のβケト基が伸長中のポリケチド鎖に付加された直後であるが次のモジュー
ルに転移される前に、このβケト基を改変する。従って、炭素−炭素結合を形成
するために必要な、ＫＳドメイン、ＡＴドメイン、およびＡＣＰドメインを含有
する最小のモジュールに加えて、モジュールは、このケト基をアルコールに還元
するケトレダクターゼ（ｋｅｔｏｄｒｅｄｕｃｔａｓｅ）（ＫＲ）を含有し得る
。モジュールはまた、ＫＲ、およびそのアルコールを脱水して二重結合にするデ
ヒドラターゼ（ＤＨ）を含み得る。モジュールはまた、ＫＲ、ＤＨ、およびβ炭
素をメチレン官能基として使用してその二重結合を飽和単結合へと変換する、エ
ノイルレダクターゼ（ＥＲ）を含み得る。上記のように、モジュールは、さらな
る酵素活性も同様に含み得る。
【００２６】 一旦ポリケチド鎖がＰＫＳの最後の拡張モジュールを横切ると、このポリケチ
ド鎖は、ほとんどのＰＫＳのカルボキシル末端で見出される、放出ドメインまた
はチオエステラーゼに遭遇する。ここで、このポリケチドは、この酵素から切断
され、そして環化される。この生じたポリケチドは、テイラーイング（ｔａｉｌ
ｏｒｉｎｇ）酵素またはポリケチド改変酵素によってさらに改変され得；これら
の酵素は、糖質基またはメチル基を付加するか、あるいは他の改変（すなわち、
酸化または還元）をこのポリケチドコア分子上で行う。
【００２７】 上記の記載は、一般にモジュール型ＰＫＳ酵素に適用されるが、天然に、多く
の変異が存在する。例えば、いくつかのポリケチド（例えば、エポチロン（ｅｐ
ｏｔｈｉｌｏｎｅ））は、アミノ酸から誘導される基礎単位を組込む。このよう
なポリケチドについてのＰＫＳ酵素は、アミノ酸リガーゼまたは非リボソームペ
プチドシンテターゼ（ＮＲＰＳ）として機能する活性を含む。変異の別の例は、
ＤＥＢＳに見出される２ドメインのローディングモジュール構築物よりもしばし
ば実際に見出され、これは、このＰＫＳのローディングモジュールがＡＴおよび
ＡＣＰから構成されず、代わりに不活性化ＫＳ、ＡＴ、およびＡＣＰを利用する
場合に生じる。この不活性化ＫＳは、ほとんどの例においてＫＳQと呼ばれ、こ
こで、この上付き文字は、活性に必要な活性部位システインの代わりに存在する
、アミノ酸（グルタミン）の略語である。例えば、このオレアンドライドＰＫＳ
ローディングモジュールは、ＫＳQを含む。変異のなお別の例は、メチルトラン
スフェラーゼ活性を含むモジュールの文脈で上記にて言及され；モジュールはま
た、エピメラーゼ活性を含み得る。ＰＫＳの成分が、本発明によって提供される
オレアンドライドＰＫＳ、ならびに種々の組換えＰＫＳおよびハイブリッドＰＫ
Ｓに特に関して、以下にさらに記載される。
【００２８】 （第Ｉ節：オレアンドライドＰＫＳ） オレアンドライドＰＫＳは、以下の手順により単離され、そしてクローン化さ
れた。ゲノムＤＮＡが、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ
のオレアンドマイシン産生株（ＡＴＣＣ １１８９１）から単離され、制限酵素
を用いて部分消化され、そして市販のコスミドベクター中にクローン化されて、
ゲノムライブラリーが作製された。次いで、このライブラリーがＥ．ｃｏｌｉ中
に導入され、そしてオレアンドライドＰＫＳの拡張モジュール５および６をコー
ドするＫＳドメインの配列に相補的なプライマーを使用して、Ｓ．ａｎｔｉｂｉ
ｏｔｉｃｕｓ ＤＮＡから作製されたＤＮＡフラグメントを用いて探索された。
このプローブにハイブリダイズしたいくつかのコロニーがプールされ、再プレー
ティングされ、そして再度探索して、コスミドのセットの同定を得た。これらの
後のコスミドを単離し、そして市販のＥ．ｃｏｌｉ株中に形質転換された。プラ
スミドＤＮＡが単離され、そしてＤＮＡ配列分析および制限酵素消化により分析
された。これにより、所望のＤＮＡが単離されたこと、およびＰＫＳ遺伝子クラ
スター全体が、同定されたコスミドのうちの２つにおいて重複したセグメント中
に含まれることが、明らかになった。
【００２９】 これらのコスミド、およびこのコスミドから調製されたサブクローンのさらな
る分析により、種々のオレアンドライドＰＫＳ遺伝子およびＯＲＦ、ならびにこ
れらのＯＲＦによりコードされるＰＫＳタンパク質中のモジュールおよびドメイ
ンの、位置の同定が容易になった。これらの遺伝子およびモジュールの位置は、
図１および図２に示される。図１は、完全なオレアンドライドＰＫＳ遺伝子クラ
スターが、コスミドｐＫＯＳ０５５−１（インサートサイズ約４３ｋｂ）および
ｐＫＯＳ０５５−５（インサートサイズ約４７ｋｂ）のインサートＤＮＡ中に含
まれることを示す。これらのコスミドの各々は、ブダペスト条約の条項に従って
、アメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託された（コスミドｐＫＯＳ０
５５−１は、受託番号ＡＴＣＣ ２０３７９８のもとで利用可能である；コスミ
ドｐＫＯＳ０５５−５は、受託番号ＡＴＣＣ ２０３７９９のもとで利用可能で
ある）。本発明の種々のさらなる試薬が、これらのコスミドから単離され得る。
ＤＮＡ配列分析もまた、本明細書中に記載されるように、本発明の種々のサブク
ローンに対して実施された。
【００３０】 当業者は、遺伝コードの縮重性質に起因して、ヌクレオチド配列が異なる種々
のＤＮＡ化合物が、本発明の所定のアミノ酸配列をコードするように使用され得
ることを、理解する。Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓの
オレアンドライドＰＫＳをコードするネイティブのＤＮＡ配列は、本発明の好ま
しい実施形態を例示するためにのみ、本明細書中に示され、そして本発明は、本
発明のポリペプチドおよびタンパク質のアミノ酸配列をコードする、いずれの配
列のＤＮＡ化合物をも包含する。同様な様式で、ポリペプチドは代表的に、その
アミノ酸配列中に１つ以上のアミノ酸の置換、欠失、および挿入を、所望の活性
の損失または有意な損失を伴わずに、許容し得る。本発明は、代替的アミノ酸配
列を有するこのようなポリペプチド、および本発明の好ましい実施形態を例示す
るためにのみ本明細書中に示されたＤＮＡ配列によりコードされるアミノ酸配列
を、包含する。
【００３１】 本発明の組換え核酸、タンパク質、およびペプチドは多く、そして多様である
。本発明、ならびに本発明により提供される多様な化合物および方法の理解を容
易にするために、オレアンドライドＰＫＳの種々の領域の以下の説明、ならびに
対応するコード配列が、提供される。本発明の記載を容易にするために、本明細
書中で、ＰＫＳ、タンパク質、モジュール、またはドメインという言及はまた、
そのコード配列を含むＤＮＡ化合物をいい得、その逆もまた然りである。また、
他に示されない限り、異種ＰＫＳという言及は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａ
ｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ以外の生物由来のそのコード配列を含む、ＰＫＳまたは
ＤＮＡ化合物をいう。さらに、ＰＫＳまたはそのコード配列という言及は、その
任意の部分の言及を含む。
【００３２】 従って、本発明は、単離された形態（すなわち、純粋ではないが、天然におい
て見出されないアバンダンスおよび／または濃度で調製物中に存在する）および
精製された形態（すなわち、混入物質が実質的にないか、または対応するＤＮＡ
と共に天然に見出される物質が実質的にない）のＤＮＡ分子を提供する。これら
のＤＮＡ分子は、オレアンドライドＰＫＳ遺伝子クラスターの１つ以上のＯＲＦ
の１つ以上のモジュールの１つ以上のドメイン（またはこのようなドメインのフ
ラグメント）をコードする、１つ以上の配列を含む。このようなドメインの例は
、オレアンドマイシンＰＫＳ遺伝子の３つのＯＲＦによりコードされる、６つの
拡張モジュールおよびローディングモジュールのうちの少なくとも１つの、ＫＳ
ドメイン、ＡＴドメイン、ＤＨドメイン、ＫＲドメイン、ＥＲドメイン、ＡＣＰ
ドメイン、およびＴＥドメインを含む。
【００３３】 １つの実施形態において、このＤＮＡ分子は、Ｓｗａｎら（前出）に記載され
るＯＲＦＢ以外のＯＲＦを含むか、またはこのＯＲＦＢに加えてＯＲＦを含む；
このＯＲＦＢは、本明細書中のｏｌｅＡＩＩＩ遺伝子ＯＲＦに対応する。モジュ
ールは、ＯＲＦＢの拡張モジュール５および／またはモジュール６以外のモジュ
ールであるか、あるいはＯＲＦＢの拡張モジュール５および／またはモジュール
６に加えたモジュールである；そしてドメインは、ＯＲＦＢのモジュール５およ
び／もしくはモジュール６のドメインまたはＯＲＦＡのモジュール４のＡＣＰド
メイン以外のドメインであるか、あるいはこれらのドメインに加えたドメインで
ある。特に好ましい実施形態において、このＤＮＡ分子は、組換えＤＮＡ発現ベ
クターまたはプラスミドである。このようなベクターは、宿主細胞の細胞質にお
いて複製するか、または宿主細胞の染色体ＤＮＡに組み込まれ得るかのいずれか
であり得る。いずれの場合においても、このベクターは、安定なベクターであり
得る（すなわち、このベクターは、選択圧のみを用いた場合でさえも、多くの細
胞分裂にわたって存在し続ける）し、または一過性ベクターであり得る（すなわ
ち、このベクターは、細胞分裂の数の増加に伴い宿主細胞によって徐々に失われ
る）。
【００３４】 オレアンドライド（ｏｌｅａｎｄｏｌｉｄｅ）ＰＫＳ（８，８ａ−デオキシオ
レアンドライドシンターゼとしても知られる）は、３つのＯＲＦ（ｏｌｅＡＩ、
ｏｌｅＡＩＩおよびｏｌｅＡＩＩＩ）によってコードされる。各ＯＲＦは、この
ＰＫＳの２つの拡張モジュールをコードする；第１のＯＲＦはまた、ローディン
グモジュールをコードする。各モジュールは、少なくともＫＳドメイン、ＡＴド
メインおよびＡＣＰドメインから構成される。これらのＯＲＦの種々のコード領
域の位置は、図２に示され、そして以下の配列情報に関して記載される。
【００３５】 ＯＲＦ１は、８，８ａ−デオキシオレアンドライドシンターゼＩをコードし、
そして以下の配列において、ヌクレオチド５７７２で始まり、そしてヌクレオチ
ド１８２２４で終結する。ＯＲＦ１は、ローディングモジュール（ヌクレオチド
５７９９〜８８７３によってコードされる）をコードし、このモジュールは、Ｋ
ＳQドメイン（ヌクレオチド５７９９〜７０５５によってコードされる）、マロ
ニル特異的ＡＴドメイン（ヌクレオチド７４５８〜８５６３によってコードされ
る）およびＡＣＰドメイン（ヌクレオチド８６３４〜８８７３によってコードさ
れる）から構成される。ＯＲＦ１はまた、拡張モジュール１（ヌクレオチド８９
５５〜１３３４９によってコードされる）（このモジュールは、ＫＳドメイン（
ＫＳ１、ヌクレオチド８９５５〜１０２０５によってコードされる）、ＡＴドメ
イン（ＡＴ１、ヌクレオチド１０５１２〜１１５４９によってコードされる）、
ＫＲドメイン（ＫＲ１、ヌクレオチド１２２５８〜１２８１８によってコードさ
れる）およびＡＣＰドメイン（ＡＣＰ１、ヌクレオチド１３０９２〜１３３４９
によってコードされる）から構成される）、ならびに拡張モジュール２（ヌクレ
オチド１３４０７〜１７９６６によってコードされる）（このモジュールは、Ｋ
Ｓドメイン（ＫＳ２、ヌクレオチド１３４０７〜１４６９０によってコードされ
る）、ＡＴドメイン（ＡＴ２、ヌクレオチド１４９９７〜１６０３１によってコ
ードされる）、ＫＲドメイン（ＫＲ２、ヌクレオチド１６８７２〜１７４２３に
よってコードされる）およびＡＣＰドメイン（ＡＣＰ２、ヌクレオチド１７７０
９〜１７９９６によってコードされる）から構成される）をコードする。
【００３６】 ＯＲＦ２は、８，８ａ−デオキシオレアンドライドシンターゼ２をコードし、
そして以下の配列において、ヌクレオチド１８２６７で始まり、そしてヌクレオ
チド２９７１７で終結する。ＯＲＦ２は、拡張モジュール３（ヌクレオチド１８
３５７〜２２９８５によってコードされる）（このモジュールは、ＫＳドメイン
（ＫＳ３、ヌクレオチド１８３５７〜１９６４３によってコードされる）、ＡＴ
ドメイン（ＡＴ３、ヌクレオチド１９９６５〜２０９９９によってコードされる
）、不活性ＫＲドメイン（ＫＲ３、ヌクレオチド２１８９７〜２２４４９によっ
てコードされる）およびＡＣＰドメイン（ＡＣＰ３、ヌクレオチド２２７２８〜
２２９８５によってコードされる）から構成される）、ならびに拡張モジュール
４（ヌクレオチド２３０４６〜２９３９６によってコードされる）（このモジュ
ールは、ＫＳドメイン（ＫＳ４、ヌクレオチド２３０４６〜２４３２９によって
コードされる）、ＡＴドメイン（ＡＴ４、ヌクレオチド２４６４５〜２５６８２
によってコードされる）、ＤＨドメイン（ＤＨ４、ヌクレオチド２５７１９〜２
６２５６によってコードされる）、ＥＲドメイン（ＥＲ４、ヌクレオチド２７４
２９〜２８３０１によってコードされる）、ＫＲドメイン（ＫＲ４、ヌクレオチ
ド２８３１４〜２８８６２によってコードされる）およびＡＣＰドメイン（ＡＣ
Ｐ４、ヌクレオチド２９１４７〜２９３９６によってコードされる）から構成さ
れる）をコードする。
【００３７】 ＯＲＦ３は、８，８ａ−デオキシオレアンドライドシンターゼ３をコードし、
そして以下の配列において、ヌクレオチド２９７８７で始まり、そしてヌクレオ
チド４０３４６で終結する。この配列は、Ｓｗａｎら（前出）によって以前に報
告されている。ＯＲＦ３は、拡張モジュール５（ヌクレオチド２９８８６〜３４
４７８によってコードされる）（このモジュールは、ＫＳドメイン（ＫＳ５、ヌ
クレオチド２９８８６〜３１１８４によってコードされる）、ＡＴドメイン（Ａ
Ｔ５、ヌクレオチド３１４９４〜３２５３１によってコードされる）、ＫＲドメ
イン（ＫＲ５、３３３８４〜３３９３５によってコードされる）およびＡＣＰド
メイン（ＡＣＰ５、３４２２１〜３４４７８によってコードされる）から構成さ
れる）、ならびに拡張モジュール６（ヌクレオチド３４８４５〜３９４４０によ
ってコードされる）（このモジュールは、ＫＳドメイン（ＫＳ６、ヌクレオチド
３４８４５〜３６１３１によってコードされる）、ＡＴドメイン（ＡＴ６、ヌク
レオチド３６４４７〜３７４８４によってコードされる）、ＫＲドメイン（ＫＲ
６、ヌクレオチド３８３５２〜３８９０３によってコードされる）およびＡＣＰ
ドメイン（ＡＣＰ６、ヌクレオチド３９１８３〜３９４４０によってコードされ
る）から構成される）をコードする。ＯＲＦ３はまた、ヌクレオチド３９６５７
〜４０３４３でＴＥドメインをコードする。
【００３８】 以下のＤＮＡ配列はまた、オレアンドマイシン遺伝子クラスター（ｏｌｅＩ（
ヌクレオチド１５２〜１４２６）、ｏｌｅＮ２（ヌクレオチド１５２８〜２６３
７）、ｏｌｅＲ（ヌクレオチド２６５８〜４９６７）、ｏｌｅＰｌ（ヌクレオチ
ド４０６２５〜４１８３０）、ｏｌｅＧｌ（ヌクレオチド４１８７８〜４３１５
８）、ｏｌｅＧ２（ヌクレオチド４３１６３〜４４４４３）、ｏｌｅＭ１（ヌク
レオチド４４４３３〜４５１７３）、ｏｌｅＹ（ヌクレオチド４５２５１〜４６
４１１）、ｏｌｅＰ（ヌクレオチド４６４９１〜４７７１４）およびｏｌｅＢ（
ヌクレオチド４７８０８〜４９５１７）を含む）における多くのテイラーリング
（ｔａｉｌｏｒｉｎｇ）酵素遺伝子の配列を含む。
【００３９】 上記のオレアンドマイシン遺伝子クラスターの一部の配列は、以下の通りであ
る。
【００４０】
【化２】 上記のＤＮＡ配列は、以下の８，８ａ−デオキシオレアンドライドシンターゼ
タンパク質をコードする。
【００４１】
【化３】 このオレアンドライドＰＫＳタンパク質またはその一部をコードする本発明の
組換えＤＮＡ化合物は、種々の適用において有用である。これらの適用の多くは
、このオレアンドライドＰＫＳの異種発現またはハイブリッドＰＫＳの構築に関
連するが、多くの有用な適用は、天然のオレアンドマイシンプロデューサーＳｔ
ｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓを含む。
【００４２】 例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓにおける相同
組換えによってｏｌｅＡＩ、ｏｌｅＡＩＩまたはｏｌｅＡＩＩＩ遺伝子を破壊す
るために、本発明の組換えＤＮＡ化合物が、使用され得る。得られる宿主細胞は
、オレアンドマイシンと同様の様式において、酸化、ヒドロキシル化およびグリ
コシル化によって改変されたポリケチドを産生するために好ましい宿主細胞であ
る。なぜなら、これらの反応を実行するタンパク質をコードする遺伝子が、この
宿主細胞中に存在するからである。このような宿主細胞はまた、目的のポリケチ
ドの生成または精製を妨げ得るいかなるオレアンドマイシンも、天然には生成し
ない。
【００４３】 本発明によって提供される１つの例示的な組換え宿主細胞は、組換えオレアン
ドライドＰＫＳを発現し、このＰＫＳにおいて、そのモジュール１ ＫＳドメイ
ンは、欠失または他の変異によって不活化される。好ましい実施形態において、
この不活化は、ＫＳドメインが基質を結合し得ないようにする、ＫＳドメインに
おける変化によって媒介される（ＫＳ１o変異）。特に好ましい実施形態におい
て、この不活化は、そのコドンを別のコドン（例えば、アラニンコドン）に変化
する、活性部位システインについてのコドンにおける変異によって与えられる。
このような構築物は、オレアンドライドの拡張モジュール１および２または別の
ＰＫＳの対応するモジュールを有する、翻訳リーディングフレームにおいて配置
される場合に、特に有用である。これらの構築物の有用性は、それによってコー
ドされるタンパク質を含むＰＫＳを発現する宿主細胞、またはこのＰＫＳを含む
無細胞抽出物が、目的のポリケチドを調製するために前駆体分子のＮ−アシルシ
ステアミンチオエステルを与えられ得るかまたは供給され得ることである。米国
特許出願番号６０／１１７，３８４（１９９９年１月２７日出願）、およびＰＣ
Ｔ特許公開番号ＵＳ９９／０３９８６（これらの両方は、本明細書中で参考とし
て援用される）を参照のこと。本発明のこのようなＫＳ１o構築物は、Ｓｔｒｅ
ｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ宿主細胞における１３−置換型−
オレアンドマイシン化合物の生成において有用である。本発明の好ましい化合物
は、１３位での置換基がプロピル、ビニル、プロパルギル、他の低級アルキル、
および置換アルキルである化合物を含む。
【００４４】 本発明の化合物はまた、本発明の組換え宿主細胞を構築するために使用され得
、この宿主細胞において、オレアンドライドＰＫＳの１つ以上のドメインまたは
モジュールについてのコード配列は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｎｔｉｂｉ
ｏｔｉｃｕｓ染色体ＤＮＡとの相同組換えによって欠失されている。当業者は、
染色体ＤＮＡの位置の欠失あるいは変更という意図される機能に起因して、この
ような化合物が、染色体ＤＮＡとの相同性によって特徴付けられること、および
機能的タンパク質をコードすることによって特徴付けられないことを、理解する
。この適用および種々の他の適用について、本発明の化合物は、機能的タンパク
質をコードするＤＮＡ化合物のみならず、オレアンドライドＰＫＳ遺伝子の任意
の位置に相補的であるかまたは同一であるＤＮＡ化合物を含む。
【００４５】 従って、本発明は、種々の改変Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｎｔｉｂｉｏｔ
ｉｃｕｓ宿主細胞を提供し、この宿主細胞において、オレアンドライドＰＫＳ遺
伝子クラスター中の１つ以上の遺伝子は、変異されているかまたは破壊されてい
る。これらの細胞は，破壊された機能を組換え発現ベクターによって発現される
遺伝子産物で置換することが所望される場合に、特に有用である。本発明のこの
ような発現ベクターが以下の節でより詳細に記載される一方、当業者は、このベ
クターがＳ．ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓに対しても同様の適用を有することを理
解する。このようなＳ．ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ宿主細胞は、本発明のオレア
ンドライド誘導体を発現するための好ましい宿主細胞であり得る。この型の特に
好ましい宿主細胞としては、ローディングモジュールについてのコード配列が変
異または破壊されているもの、１つ以上の任意のＰＫＳ遺伝子ＯＲＦが変異また
は破壊されているもの、および／あるいは１つ以上のオレアンドライド改変酵素
（グリコシル化、エポキシ化）についての遺伝子が変異または破壊されているも
のが挙げられる。
【００４６】 本発明は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓに対する適
用を有する多くの有用な化合物、およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｎｔｉｂ
ｉｏｔｉｃｕｓ由来の組換え宿主細胞を提供するが、本発明の多くの重要な適用
は、以下の節に記載されるように、Ｓ．ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ以外の細胞に
おける、オレアンドライド遺伝子の全てまたは一部の異種発現に関する。
【００４７】 （第ＩＩ節：オレアンドライドＰＫＳの異種発現） １つの重要な実施形態において、本発明は、１つ以上のオレアンドライドＰＫ
Ｓ遺伝子の異種発現のための方法、およびその方法において有用な組換えＤＮＡ
発現ベクターを提供する。本発明の目的のために、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ以外のすべての宿主細胞は、異種宿主細胞である。従
って、オレアンドライドＰＫＳのドメイン、モジュール、またはタンパク質をコ
ードする単離された核酸に加えて、本発明の範囲内に含まれるのは、そのような
核酸を含む組換え発現ベクターである。用語、発現ベクターは、宿主細胞または
無細胞転写および翻訳系へ導入され得る核酸をいう。発現ベクターは、細胞中（
その細胞中または任意の細胞区画（例えば、細胞質中の複製ベクター）中の染色
体または他のＤＮＡの一部であろうとそうではなかろうと）で永続的にまたは一
過的に維持され得る。発現ベクターはまた、ＲＮＡの発現を駆動するプロモータ
ーを含み、このＲＮＡは、細胞または細胞抽出物中でポリペプチドへと翻訳され
る。ＲＮＡのタンパク質への効率的な翻訳のために、この発現ベクターはまた、
代表的に、発現されるべき遺伝子のコード配列の開始コドンの上流に位置するリ
ボソーム結合部位配列を含む。他のエレメント（例えば、エンハンサー、分泌シ
グナル配列、転写終結配列、ならびにこのベクターを含む宿主細胞が同定および
／または選択され得る１つ以上のマーカー遺伝子）もまた、発現ベクター中に存
在し得る。選択マーカー（すなわち、抗生物質耐性または感受性を付与する遺伝
子）が好ましく、そしてこれは、細胞が適切な選択培地中で増殖される場合に、
形質転換された細胞に対して選択可能な表現型を付与する。
【００４８】 発現ベクターの種々の成分は、このベクターの意図される用途、特に、このベ
クターが発現を複製するかまたは駆動することが意図される宿主細胞に依存して
、広範に変化し得る。遺伝子の発現ならびにＥ．ｃｏｌｉ、酵母、Ｓｔｒｅｐｔ
ｏｍｙｃｅｓ、および他の一般に使用される細胞におけるベクターの維持に適切
な発現ベクター成分は、広範に知られており、そして市販されている。例えば、
本発明の発現ベクターにおいて含むために適切なプロモーターは、真核生物宿主
細胞または原核生物宿主細胞において機能するプロモーターを含む。プロモータ
ーは、宿主細胞の増殖に対して発現の調節を可能にするか、または化学的刺激も
しくは物理的刺激に応答してオンまたはオフになる遺伝子の発現を生じる、調節
性配列を含み得る。Ｅ．ｃｏｌｉおよび特定の他の細菌性宿主細胞について、生
合成酵素、抗生物質耐性付与酵素、およびファージタンパク質についての遺伝子
に由来するプロモーターが使用され得、そしてこのようなプロモーターとしては
、例えば、ガラクトースプロモーター、ラクトース（ｌａｃ）プロモーター、マ
ルトースプロモーター、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター、β−ラクタマ
ーゼ（ｂｌａ）プロモーター、バクテリオファージλＰＬプロモーター、および
Ｔ５プロモーターが挙げられる。さらに、合成プロモーター（例えば、ｔａｃプ
ロモーター（米国特許第４，５５１，４３３号））もまた、使用され得る。
【００４９】 従って、組換え発現ベクターは、少なくとも１つの発現系（これは、順に、プ
ロモーターに作動可能に連結された、オレアンドライドＰＫＳコード配列の少な
くとも一部、および、必要に応じて、適合性宿主細胞中のコード配列の発現をも
たらすように作動する末端配列から構成される）を含む。この宿主細胞は、染色
体外エレメントとしてかまたは染色体中に組み込まれてかのいずれかで発現系配
列を含むように、本発明の組換えＤＮＡ発現ベクターを用いる形質転換によって
改変される。得られる本発明の宿主細胞は、ＰＫＳおよびＰＫＳ後（ｐｏｓｔ−
ＰＫＳ）テイラーリング酵素、ならびにポリケチドおよび抗生物質およびそれら
由来の他の有用な化合物を生成するための方法において有用である。
【００５０】 本発明の発現ベクターについてベクター成分を選択する目的のために好ましい
宿主細胞としては、真菌宿主細胞（例えば、酵母）ならびに原核生物宿主細胞（
例えば、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）が挙げられるが、哺乳
動物細胞培養物もまた、使用され得る。宿主（例えば、通常にはモジュール型ポ
リケチド合成酵素を生成しない酵母、植物、または哺乳動物細胞）において、ま
た代表的には組換え手段によって、組換え的に生成されたＰＫＳを機能性へと変
換するために適切なホロＡＣＰシンターゼを提供することが必要であり得る。こ
のような酵素の提供は、例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ ９７／１３８４５および
同９８／２７２０３（これらの各々は、本明細書中で参考として援用される）に
記載される。本発明の目的のために特に好ましい宿主細胞は、以下でより詳細に
議論されるような、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓおよびＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙ
ｓｐｏｒａ宿主細胞である。
【００５１】 好ましい実施形態において、本発明の発現ベクターは、本発明の組換えＰＫＳ
を発現する異種組換えＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ宿主細胞を構築するために使用
される。Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓは、ポリケチドを発現するための簡便な宿主
である。なぜなら、ポリケチドは、特定のＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ種において
自然に生成され、そしてＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ細胞は、一般に、所望のポリ
ケチドを形成するために必要な前駆体を生成するからである。当業者は、Ｓｔｒ
ｅｐｔｏｍｙｃｅｓ宿主細胞が、ＰＫＳ酵素の任意の部分を生成するかまたはポ
リケチド改変酵素を精製する場合に、組換えベクターが、所望のＰＫＳ酵素の残
りまたは他のポリケチド改変酵素を構成する遺伝子のみの発現を駆動する必要が
あることを認識する。従って、このようなベクターは単一のＯＲＦのみを含み得
、ＰＫＳを構成するポリケチドの所望の残りは、宿主細胞染色体ＤＮＡ上の遺伝
子によって提供される。Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓまたは他の宿主細胞が、通常
、ポリケチドを生成する場合に、本発明の組換えＰＫＳを発現するためのその使
用の前に内因性ポリケチドの生成を妨げるようにこの宿主を改変することが、望
ましくあり得る。このような改変宿主としては、Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ Ｃ
Ｈ９９９および同様に改変されたＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓ（米国特許第５，６７２
，４９１号ならびにＰＣＴ公開番号ＷＯ ９５／０８５４８および同ＷＯ ９６
／４０９６８（本明細書中で参考として援用される）に記載される）が、挙げら
れる。このような宿主において、組換え的に生成されたＰＫＳを構成する酵素の
所望の翻訳後改変の全てについて酵素的活性を提供することは、必要ではないか
もしれない。なぜなら、この宿主は、このような酵素を天然に発現するからであ
る。特に、これらの宿主は、一般に、ＰＫＳの機能性について必要なパントテニ
ル（ｐａｎｔｏｔｈｅｉｎｙｌ）残基を提供するホロＡＣＰシンターゼを含む。
【００５２】 本発明は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓにおける使用のための広範な種々の発現
ベクターを提供する。本発明の複製発現ベクターとしては、例えば、非限定的に
、低コピー数ベクター（例えば、ＳＣＰ２*（Ｈｏｐｗｏｏｄら、Ｇｅｎｅｔｉ
ｃ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ：Ａ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（Ｔｈｅ Ｊｏｈｎ Ｉｎｎｅｓ Ｆｏｕｎｄａ
ｔｉｏｎ，Ｎｏｒｗｉｃｈ，Ｕ．Ｋ．，１９８５）；Ｌｙｄｉａｔｅら、１９８
５，Ｇｅｎｅ ３５：２２３−２３５；ならびにＫｉｅｓｅｒおよびＭｅｌｔｏ
ｎ、１９８８，Ｇｅｎｅ ６５：８３−９１を参照のこと（これらの各々は本明
細書中に参考として援用される））、ＳＬＰ１．２（本明細書中に参考として援
用される、Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、１９８２，Ｇｅｎｅ ２０：５１−６２）、な
らびにｐＳＧ５（ｔｓ）（Ｍｕｔｈら、１９８９、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ
．２１９：３４１−３４８、およびＢｉｅｒｍａｎら、１９９２、Ｇｅｎｅ １
１６：４３−４９（これらの各々は本明細書中に参考として援用される））また
は高コピー数ベクター（例えば、ｐＩＪ１０１およびｐＪＶ１（例えば、Ｋａｔ
ｚら、１９８３、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１２９：２７０３−２７１
４；Ｖａｒａら、１９８９，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７１：５７８２−５７
８１；およびＳｅｒｖｉｎ−Ｇｏｎｚａｌｅｚ、１９９３、Ｐｌａｓｍｉｄ ３
０：１３１−１４０を参照のこと（これらの各々は本明細書中に参考として援用
される））由来の複製起点を含む複製発現ベクターが挙げられる。しかし、高コ
ピー数ベクターは一般的に、大きな遺伝子または同義遺伝子の発現については好
ましくない。非複製ベクターおよび組み込みベクターについては、そして一般的
に任意のベクターについては、例えば、ｐＵＣ、ｐ１Ｐ、Ｐ１Ｉ、およびｐＢＲ
由来のＥ．ｃｏｌｉの複製起点を少なくとも含むことが有用である。ファージに
基づくベクターについては、ファージｐｈｉＣ３１およびその誘導体ＫＣ５１５
が利用され得る（Ｈｏｐｗｏｏｄら、前出を参照のこと）。また、プラスミドｐ
ＳＥＴ１５２、プラスミドｐＳＡＭ、プラスミドｐＳＥ１０１およびｐＳＥ２１
１（これらのすべてがＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓの染色体ＤＮＡに部位特異的に組み
込まれる）が、本発明の目的のために用いられ得る。
【００５３】 本発明のＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ組換え発現ベクターは代表的には、ｅｒｍ
Ｅ（エリスロマイシンおよびリンコマイシンに対する耐性を付与する）、ｔｓｒ
（チオストレプトンに対する耐性を付与する）、ａａｄＡ（スペクチノマイシン
（ｓｐｅｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）およびストレプトマイシンに対する耐性を付与
する）、ａａｃＣ４（アプラマイシン（ａｐｒａｍｙｃｉｎ）、カナマイシン、
ゲンタマイシン、ジェネティシン（Ｇ４１８）、およびネオマイシンに対する耐
性を付与する）、ｈｙｇ（ハイグロマイシンに対する耐性を付与する）、ならび
にｖｐｈ（バイオマイシンに対する耐性を付与する）耐性付与遺伝子からなる群
より選択される、抗生物質耐性を付与する遺伝子を含む１つ以上の選択マーカー
を含む。あるいは、いくつかのポリケチドが自然に着色しており、そしてこの特
徴は、細胞を同定するための組込み型マーカーを提供し得る。
【００５４】 本発明の好ましいＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ宿主細胞／ベクターの組み合わせ
としては、ポリケチドであるアクチノロジンを産生しないように改変されたＳ．
ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ ＣＨ９９９およびＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓ Ｋ４−１１４
宿主細胞およびＫ４−１５５宿主細胞、ならびにｐＲＭ１およびｐＲＭ５ベクタ
ー由来の発現ベクターが挙げられる（米国特許第５，８３０，７５０号、ならび
に１９９７年３月３１日に出願された米国特許出願番号０８／８２８，８９８、
および１９９８年１０月２８日に出願された同０９／１８１，８３３に記載され
た通り（これらの各々は本明細書中に参考として援用される））。これらのベク
ターは、これらが、多数でかつ多様なＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．と適
合性のプロモーターを含むという点で特に好ましい。Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
宿主細胞に特に有用なプロモーターとしては、二次代謝産物としてのポリケチド
の生成をもたらすＰＫＳ遺伝子クラスター由来のプロモーター（芳香族（ＩＩ型
）ＰＫＳ遺伝子クラスター由来のプロモーターを含む）が挙げられる。ＩＩ型Ｐ
ＫＳ遺伝子クラスタープロモーターの例は、ａｃｔ遺伝子プロモーターおよびｔ
ｃｍ遺伝子プロモーターであり；Ｉ型ＰＫＳ遺伝子クラスタープロモーターの例
は、スピラマイシンＰＫＳおよびＤＥＢＳ遺伝子のプロモーターである。本発明
はまた、オレアンドライド（ｏｌｅａｎｄｏｌｉｄｅ）ＰＫＳ遺伝子プロモータ
ーを組換え形態で提供する。ｏｌｅＡ遺伝子についてのプロモーターは、本発明
のコスミドｐＫＯＳ０５５−５上のｏｌｅＡＩ遺伝子の上流に位置する。このプ
ロモーターは、ｏｌｅＡＩコード配列の上流の約１ｋｂのセグメントに含まれ、
そしてオレアンドライドＰＫＳまたは目的の任意の他のコード配列の発現を、こ
のプロモーターが機能する宿主細胞（特にＳ．ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓおよび
一般に任意のＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ種）において駆動するために用いられ得
る。
【００５５】 上記のように、特に有用な制御配列は、単独でまたは適切な調節系とともに、
栄養菌糸において増殖期から静止期までの推移の間に発現を活性化する制御配列
である。上記のプラスミドｐＲＭ５、すなわちａｃｔＩ／ａｃｔＩＩＩプロモー
ター対およびａｃｔＩＩ−ＯＲＦ４アクチベーター遺伝子に含まれるプロモータ
ーが特に好ましい。他の有用なＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓプロモーターとしては
、構成的に作用する、ｅｒｍＥ遺伝子およびｍｅｌＣ１遺伝子、ならびにいずれ
かの増殖段階で誘導され得るｔｉｐＡ遺伝子およびｍｅｒＡ遺伝子に由来するプ
ロモーターが挙げられるがこれらに限定されない。さらに、Ｔ７ ＲＮＡポリメ
ラーゼ系は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓに移入され、そして本発明のべクターお
よび宿主細胞において利用され得る。この系において、Ｔ７ ＲＮＡポリメラー
ゼについてのコード配列は、染色体のニュートラルな部位に挿入されるか、また
は誘導性ｍｅｒＡプロモーターの制御下にあるベクター中に挿入され、そして目
的の遺伝子は、Ｔ７プロモーターの制御下に配置される。上記のように、１つ以
上のアクチベーター遺伝子もまた、プロモーター配列における転写開始を活性化
するために用いられ得る。上記のａｃｔＩＩ−ＯＲＦ４遺伝子に加えて、アクチ
ベーター遺伝子は、ｄｎｒＩ遺伝子、ｒｅｄＤ遺伝子、およびｐｔｐＡ遺伝子を
含む（米国特許出願番号０９／１８１，８３３、前出を参照のこと）。
【００５６】 本発明の目的のために好ましい宿主細胞およびベクターを提供するために、オ
レアンドライドＰＫＳ遺伝子を、実施例４に記載されるように、非マクロライド
産生宿主Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ Ｋ４−１１４に移入さ
れた組換え発現ベクター上に配置した。Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ Ｋ４−１１４（
株Ｋ４−１５５もまた用いられ得る）のこの発現ベクターでの形質転換は、ＬＣ
／ＭＳによる抽出物の分析によって決定されるような検出可能な量の８，８ａ−
デオキシオレアンドライドを産生する株を生じた。
【００５７】 さらに、そして上記の節で留意されるように、本発明はまた、コードされるオ
レアンドライドモジュール１ ＫＳドメインが、不活化されるかまたは全く存在
しない組換えＤＮＡ化合物を提供する。以下の実施例４は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙ
ｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓへの、ＫＳ１°ドメインを有するオレアンドライドＰ
ＫＳをコードする本発明の組換え発現ベクターの導入を記載する。得られる宿主
細胞には、オレアンドライド誘導体を調製するために前駆体分子のＮ−アシルシ
ステアミンチオエステルが提供または供給され得る。本発明のこのような細胞は
、組換え宿主細胞における１３−置換−６−デオキシエリトロノライドＢ化合物
の生成において特に有用である。本発明の好ましい化合物としては、１３位での
置換基が、プロピル、ビニル、プロパルギル、他の低級アルキルおよび置換アル
キルである化合物が挙げられる。Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ Ｋ４−１１４またはＫ
４−１５５において生成される改変されていないポリケチド（マクロライドアグ
リコン（ｍａｃｒｏｌｉｄｅ ａｇｌｙｃｏｎｅ）と呼ばれる）は、必要な修飾
酵素を含む、株の発酵物（例えば、Ｓ．ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓまたはＳａｃ
ｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｅｒｙｔｈｒａｅａなど）に対して付加するこ
とにより、ヒドロキシル化およびグリコシル化され得る。
【００５８】 マクロライドアグリコンを改変して、有用な活性を有する化合物または有用な
活性を有するように容易に改変され得る化合物を提供し得る広範な種々の多様な
生物が存在する。例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｅｒｙｔｈｒ
ａｅａは、６−ｄＥＢおよびオレアンドライドを種々の有用な化合物に変換し得
る。エリトロノライド６−ｄＥＢは、ｅｒｙＦ遺伝子産物によってエリトロノラ
イドＢへと変換され、これは次いで、ｅｒｙＢ遺伝子産物によってグリコシル化
されて、３−Ｏ−ミカロシレルエリトロノライドＢ（３−Ｏ−ｍｙｃａｒｏｓｙ
ｌｅｒｙｔｈｒｏｎｏｌｉｄｅ Ｂ）が得られ、これは、Ｃ−３にＬ−ミカロー
ス（ｍｙｃａｒｏｓｅ）を含む。次いで、酵素ｅｒｙＣ遺伝子産物は、この化合
物を、Ｃ−５でのＤ−デスオサミン（Ｄ−ｄｅｓｏｓａｍｉｎｅ）を用いたグリ
コシル化によってエリスロマイシンＤへと変換する。それゆえ、エリスロマイシ
ンＤは、グリコシル化を通して、およびＣ−６でのヒドロキシル基の付加によっ
て６−ｄＥＢとは異なる。エリスロマイシンＤは、Ｃ−３でのＬ−ミカロース残
基をメチル化することにより、ｅｒｙＧ遺伝子産物によって触媒される反応にお
いてエリスロマイシンＢへと変換され得る。エリスロマイシンＤは、ｅｒｙＫ遺
伝子産物によって触媒される反応においてＣ−１２でのヒドロキシル基の付加に
よってエリスロマイシンＣへと変換される。エリスロマイシンＡは、ｅｒｙＧ遺
伝子産物によって触媒される反応におけるミカロース残基のメチル化によってエ
リスロマイシンＣから得られる。
【００５９】 本発明によって提供された改変されていないオレアンドライド化合物（例えば
、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓにおいて生成されるオレアンド
ライドなど）は、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｅｒｙｔｈｒａｅａの
培養物に提供され得、そして以下の実施例６に提供される手順に従ってエリスロ
マイシンＡ、Ｂ、ＣおよびＤの対応する誘導体へと変換され得る。所望の化合物
のみが生成されることを確実にするために、６−ｄＥＢを生成することができな
いが所望の変換を依然として実施し得るＳ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ ｅｒｙＡ変異
体を用い得る（Ｗｅｂｅｒら，１９８５，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６４（１
）：４２５−４３３）。また、他の変異株（例えば、ｅｒｙＢ変異体、ｅｒｙＣ
変異体、ｅｒｙＧ変異体および／もしくはｅｒｙＫ変異体）または同義遺伝子に
変異を有する変異株を、好ましい化合物を蓄積するために用い得る。変換はまた
、商業的生成のために大きな発酵槽において実施され得る。
【００６０】 さらに、本発明の化合物をヒドロキシル化および／またはグリコシル化するた
めに用いられ得る他の有用な生物が存在する。上記のように、生物は、その生物
において通常生成されるポリケチドを生成し得ない変異体であり得、発酵をプレ
ート上でまたは大量発酵槽において実施し得、そして生成された化合物を発酵後
に化学的に変更し得る。従って、ピクロマイシン（ｐｉｃｒｏｍｙｃｉｎ）を生
成するＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅは、デソサミニル基を
、Ｃ−１２位のＣ−５ヒドロキシル基およびヒドロキシル基へと転位し得る酵素
を含む。さらに、Ｓ．ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅは、デソサミン糖の２’−ヒドロキ
シル基をグルコシル化するグルコシル化活性を含む。この後者の改変は、抗生物
質活性を低減させるが、グルコシル残基は細胞酵素作用によって除去される。別
の生物Ｓ．ｎａｒｂｏｎｅｎｓｉｓは、Ｃ−１２ヒドロキシラーゼ以外はＳ．ｖ
ｅｎｅｚｕｅｌａｅと同じ修飾酵素を含む。従って、本発明は、Ｓ．ｎａｒｂｏ
ｎｅｎｓｉｓおよびＳ．ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅに内在性の酵素の作用によって本
発明のマクロライドアグリコンのヒドロキシル化およびグリコシル化によって生
成される化合物を提供する。
【００６１】 本発明の化合物を作製するに適切な他の生物としては、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃ
ｅｓ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ（先の節において考察される）、Ｍｉｃｒｏｍ
ｏｎｏｓｐｏｒａ ｍｅｇａｌｏｍｉｃｅａ、Ｓ．ｆｒａｄｉａｅおよびＳ．ｔ
ｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓが挙げられる。Ｍ．ｍｅｇａｌｏｍｉｃｅａは、メ
ガロマイシン（ｍｅｇａｌｏｍｉｃｉｎ）を生成し、そしてＣ−６位およびＣ−
１２位をヒドロキシル化し、そしてＣ−３ヒドロキシルをミカロースで、Ｃ−５
ヒドロキシルをデソサミンで、そしてＣ−６ヒドロキシルをメゴサミン（ｍｅｇ
ｏｓａｍｉｎｅ）（ロドサミン（ｒｈｏｄｏｓａｍｉｎｅ）としても公知）でグ
リコシル化し、そして種々の位置でアシル化する酵素を含む。抗生物質活性に加
えて、Ｍ．ｍｅｇａｌｏｍｉｃｅａ酵素での処理によって生成される本発明の化
合物は、駆虫活性もまた有し得る。Ｓ．ｆｒａｄｉａｅは、Ｃ−５ヒドロキシル
をミカミノース（ｍｙｃａｍｉｎｏｓｅ）でグリコシル化し、次いでミカミノー
スの４’−ヒドロキシルをミカロースでグリコシル化して二糖を形成する酵素を
含む。Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓは、アシル化活性と同じ活性を含む。
従って、本発明は、Ｓ．ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ、Ｍ．ｍｅｇａｌｏｍｉｃｅ
ａ、Ｓ．ｆｒａｄｉａｅおよびＳ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓに内在性の酵
素の作用による本発明のマクロライドアグリコンのヒドロキシル化およびグリコ
シル化によって生成される化合物を提供する。
【００６２】 本発明はまた、グリコシル化および／またはヒドロキシル化された本発明の化
合物を目的の宿主細胞において直接生成するための方法および遺伝構築物を提供
する。従って、１以上の欠失および／または挿入（異種ＰＫＳ遺伝子由来の遺伝
子フラグメントによるｏｌｅＡ遺伝子フラグメントの置換を含む（次の節で考察
する通り））を有する組換えｏｌｅＡＩ遺伝子、ｏｌｅＡＩＩ遺伝子およびｏｌ
ｅＡＩＩＩ遺伝子を含む、本発明の組換え遺伝子は、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙ
ｓｐｏｒａ ｅｒｙｔｈｒａｅａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｎｔｉｂｉｏ
ｔｉｃｕｓ、Ｓ．ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ、Ｓ．ｎａｒｂｏｎｅｎｓｉｓ、Ｍｉｃ
ｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｍｅｇａｌｏｍｉｃｅａ、Ｓ．ｆｒａｄｉａｅおよび
Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓにおいてコードされた遺伝子産物の発現に適
切な発現ベクター中に含まれ得る。Ｓ．ｅｒｙｔｈｒａｅａの多数のエリスロマ
イシン高生成株が開発されており、そして好ましい実施形態では、オレアンドラ
イドＰＫＳ遺伝子は、このような株（またはそのエリスロマイシン非生成変異体
）に導入されて、対応する改変されたオレアンドライド化合物を高収量で提供す
る。
【００６３】 さらに、さらなる組換え遺伝子産物は、宿主細胞中で発現されて、所望のポリ
ケチドの生成を改善し得る。非限定的な、しかし１つの例として、本発明の特定
の組換えＰＫＳタンパク質は、予想されるポリペプチド以外のポリケチドまたは
予想されるポリケチドに加えて他のポリケチドを生成し得る。なぜなら、ポリケ
チドは、ＰＫＳに対する他のドメインによってプロセシングされる前にモジュー
ル６におけるチオエステラーゼ（ＴＥ）ドメインによって（特に、モジュール６
における任意のＫＲドメイン、ＤＨドメインおよび／またはＥＲドメインによっ
て）ＰＫＳから切断されるからである。予想されるポリケチドの生成を、ＴＥド
メインコード配列を遺伝子から欠失させ、そして必要に応じてＴＥドメインを別
個のタンパク質として発現させることにより、このような例において増加させ得
る。本明細書中に参考として援用される、Ｇｏｋｈａｌｅら，１９９９年２月，
「Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｔｅ
ｒｍｉｎａｌ ｔｈｉｏｅｓｔｅｒａｓｅ ｄｏｍａｉｎ ｆｒｏｍ ｔｈｅ
ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ」，Ｃｈ
ｅｍ．＆ Ｂｉｏｌ．６：１１７−１２５を参照のこと。
【００６４】 従って、１つの重要な局面では、本発明は、オレアンドライドならびにオレア
ンドライドのヒドロキシル化およびグリコシル化誘導体の生成を異種宿主細胞に
おいて可能にする、方法、発現ベクターおよび組換え宿主細胞を提供する。本発
明はまた、以下の節に記載されるように、オレアンドライドＰＫＳに一部誘導さ
れる広範な種々のポリケチドの作製方法を提供する。
【００６５】 （第ＩＩＩ節：ハイブリッドＰＫＳ遺伝子） 本発明は、オレアンドライドＰＫＳの各モジュールの各々のドメインをコード
する組換えＤＮＡ化合物を提供する。これらの化合物の利用可能性により、異種
ＰＫＳのすべてまたは一部と融合しているかまたはこれらと組合せて発現される
、オレアンドライドＰＫＳの所望の部分の生成のための組換え手順におけるこれ
らの化合物の使用が可能である。次いで、得られるハイブリッドＰＫＳは、宿主
細胞において発現されて、所望のポリケチドを生成し得る。
【００６６】 従って、本発明の方法に従って、特定の活性をコードするオレアンドライドＰ
ＫＳコード配列の一部が、単離および操作され得、例えば、異なるモジュール型
ＰＫＳ中の対応する領域を置換し得る。さらに、ＰＫＳの個々のモジュールのコ
ード配列は、適切な発現系に連結され得、そして使用されてコードされたタンパ
ク質部分を生成し得る。得られるタンパク質は単離および精製され得るか、また
はインサイチュで使用されてポリケチド合成をもたらし得る。ドメイン、モジュ
ール、タンパク質またはタンパク質の組合せの組換え生成のための宿主に依存し
て、適切な制御配列（例えば、プロモーター、終結配列、エンハンサーなど）が
、先の節に記載されるように、発現ベクターの構築において、所望のタンパク質
をコードするヌクレオチド配列に連結される。
【００６７】 従って、１つの重要な実施形態において、本発明は、ハイブリッドＰＫＳ酵素
、およびそれらのハイブリッドＰＫＳ酵素をコードする対応する組換えＤＮＡ化
合物を提供する。本発明の目的のために、ハイブリッドＰＫＳは組換えＰＫＳで
あり、これは、第１のＰＫＳの１つ以上の拡張モジュール、ローディングモジュ
ール、および／またはチオエステラーゼ／シクラーゼドメインのすべてまたは一
部、ならびに第２のＰＫＳの１つ以上の拡張モジュール、ローディングモジュー
ル、および／またはチオエステラーゼ／シクラーゼドメインのすべてまたは一部
を含む。１つの好ましい実施形態において、第１のＰＫＳはほとんど（しかしす
べてではない）のオレアンドライドＰＫＳであり、そして第２のＰＫＳは非オレ
アンドライドＰＫＳの一部のみまたはすべてである。このようなハイブリッドＰ
ＫＳの例示的な例は、オレアンドライドＰＫＳのローディングモジュールが別の
ＰＫＳのローディングモジュールで置換されているオレアンドライドＰＫＳを含
む。このようなハイブリッドＰＫＳの別の例は、拡張モジュール３のＡＴドメイ
ンが、マロニルＣｏＡのみを結合するＡＴドメインで置換されているオレアンド
ライドＰＫＳである。別の好ましい実施形態において、第１のＰＫＳは、ほとん
ど（しかしすべてではない）の非オレアンドライドＰＫＳであり、そして第２の
ＰＫＳはオレアンドライドＰＫＳの一部のみまたはすべてである。このようなハ
イブリッドＰＫＳの例示的な例は、メチルマロニルＣｏＡに特異的なＡＴがメチ
ルマロニルＣｏＡに特異的なオレアンドライドＰＫＳ由来のＡＴで置換されてい
るラパマイシンＰＫＳを含む。本発明の他の例示的なハイブリッドＰＫＳは、以
下に記載される。
【００６８】 当業者は、本発明のハイブリッドＰＫＳ中の第１または第２いずれかのＰＫＳ
のすべてまたは一部は、天然に存在する供給源から単離される必要がないことを
認識する。例えば、ＡＴドメインの小さい部分のみがその特異性を決定する。Ｐ
ＣＴ特許出願番号ＷＯ ＵＳ９９／１５０４７およびＬａｕら（下記）（これら
は本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。ＤＮＡ合成における当該
技術の水準は、当業者が、ＰＫＳモジュールまたはドメインの有用な部分を構築
するに十分なサイズの新規ＤＮＡ化合物を構築するのを可能にする。従って、所
望の誘導体コード配列は、Ｊａｙｅら、１９８４、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２
５９：６３３１に記載されるような標準的固相合成法を用いて合成され得、そし
て自動化合成のための装置が、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ
，Ｉｎｃ．から市販されている。本発明の目的のために、このような合成ＤＮＡ
化合物は、ＰＫＳの一部であると見なされる。
【００６９】 本発明のハイブリッドＰＫＳに関する一般的背景に関して、当業者は、オレア
ンドライドＰＫＳを含む個々のドメイン、モジュール、およびタンパク質をコー
ドする本発明のＤＮＡ化合物により提供される利益を、より良好に理解し得る。
上記のように、オレアンドライドＰＫＳは、ローディングモジュール、６つの拡
張モジュール（ＫＳドメイン、ＡＴドメイン、ＡＣＰドメイン、およびＫＲドメ
イン、ＤＨドメイン、およびＥＲドメインから構成される）、ならびにチオエス
テラーゼドメインから構成される。これらのドメインを個々にかまたは組合せて
コードする本発明のＤＮＡ化合物は、本発明のＤＮＡ化合物をコードするハイブ
リッドＰＫＳの構築に有用である。
【００７０】 オレアンドライドＰＫＳのローディングモジュールをコードする本発明の組換
えＤＮＡ化合物、およびこれによってコードされる対応するポリペプチドは、種
々の適用に有用である。１つの実施形態において、オレアンドライドＰＫＳロー
ディングモジュールをコードする配列を含むＤＮＡ化合物が、異種ＰＫＳタンパ
ク質またはその部分のコード配列を含むＤＮＡ化合物中に挿入される。生じる構
築物（異種ＰＫＳのローディングモジュールのコード配列が、オレアンドライド
ＰＫＳローディングモジュールのコード配列によって置換されている）は、新規
なＰＫＳを提供する。例としては、６−デオキシエリスロノライドＢ ＰＫＳタ
ンパク質コード配列、ラパマイシンＰＫＳタンパク質コード配列、ＦＫ−５０６
ＰＫＳタンパク質コード配列、ＦＫ−５２０ ＰＫＳタンパク質コード配列、
ＦＫ−５２０ ＰＫＳタンパク質コード配列、リファマイシンＰＫＳタンパク質
コード配列、およびアベルメクチンＰＫＳタンパク質コード配列が挙げられる。
別の実施形態において、オレアンドライドＰＫＳローディングモジュールをコー
ドする配列を含むＤＮＡ化合物が、オレアンドライドＰＫＳのコード配列か、ま
たはオレアンドライド誘導体を生成する組換えオレアンドライドＰＫＳのコード
配列を含むＤＮＡ化合物中に挿入される。
【００７１】 別の実施形態において、ローディングモジュールコード配列の一部が、異種コ
ード配列と組合せて利用される。この実施形態において、本発明は、例えば、マ
ロニルＣｏＡ（アセチルＣｏＡ）特異的ＡＴを、プロピオニルＣｏＡ（メチルマ
ロニル）特異的ＡＴ、ブチリルＣｏＡ（エチルマロニル）特異的ＡＴ、または他
のＣｏＡ特異的ＡＴで置換することを提供する。さらに、ＫＳQおよび／または
ＡＣＰが、別の不活化ＫＳおよび／または別のＡＣＰにより置換され得る。ある
いは、ローディングモジュールのＫＳQ、およびＡＴは、ＤＥＢＳのローディン
グモジュールのようなローディングモジュールのＡＴにより置換され得る。生じ
る異種ローディングモジュールコード配列は、オレアンドライド、オレアンドラ
イド誘導体、または別のポリケチドを合成するＰＫＳのコード配列と組合せて利
用され得る。
【００７２】 オレアンドライドＰＫＳの第１の拡張モジュールをコードする本発明の組換え
ＤＮＡ化合物、およびそれによりコードされる対応するポリペプチドは、種々の
適用に有用である。１つの実施形態において、オレアンドライドＰＫＳの第１の
拡張モジュールをコードする配列を含むＤＮＡ化合物が、異種ＰＫＳのコード配
列を含むＤＮＡ化合物中に挿入される。生じる構築物（異種ＰＫＳのモジュール
のコード配列が、オレアンドライドＰＫＳの第１の拡張モジュールのコード配列
により置換されるか、またはオレアンドライドＰＫＳの第１の拡張モジュールの
コード配列が異種ＰＫＳのモジュールのコード配列に単に付加されるかのいずれ
かである）は、新規なＰＫＳコード配列を提供する。別の実施形態において、オ
レアンドライドＰＫＳの第１の拡張モジュールをコードする配列を含むＤＮＡ化
合物が、オレアンドライドＰＫＳのコード配列か、またはオレアンドライド誘導
体を生成する組換えオレアンドライドＰＫＳのコード配列を含むＤＮＡ化合物中
に挿入される。
【００７３】 別の実施形態において、第１の拡張モジュールコード配列の一部または全てが
、他のＰＫＳコード配列と組合せて利用されて、ハイブリッドモジュールを生成
する。この実施形態において、本発明は、例えば、メチルマロニルＣｏＡ特異的
ＡＴを、マロニルＣｏＡ特異的ＡＴ、エチルマロニルＣｏＡ特異的ＡＴ、または
２−ヒドロキシマロニルＣｏＡ特異的ＡＴにより置換すること；ＫＲを欠失する
こと（不活性化することを含む）；ＤＨ、またはＤＨおよびＥＲを挿入すること
；ならびに／あるいはこのＫＲを別のＫＲ、（ＤＨおよびＫＲ）、または（ＤＨ
、ＫＲ、およびＥＲ）により置換することを提供する。さらに、このＫＳおよび
／またはＡＣＰは、別のＫＳおよび／またはＡＣＰにより置換され得る。これら
の置換または挿入の各々において、異種ＫＳ、ＡＴ、ＤＨ、ＫＲ、ＥＲ、または
ＡＣＰのコード配列は、このオレアンドライドＰＫＳの別のモジュールのコード
配列、オレアンドライド以外のポリケチドを生成するＰＫＳの遺伝子、または化
学合成に由来し得る。生じた異種の第１の拡張モジュールコード配列は、オレア
ンドライド、オレアンドライド誘導体、または別のポリケチドを合成するＰＫＳ
の、コード配列と組合せて利用され得る。
【００７４】 しかし、当業者は、モジュール１のＫＲドメインの欠失、またはモジュール１
へのＤＨドメインの挿入もしくはＤＨドメインおよびＫＲドメインの挿入は、こ
のようなハイブリッドモジュールが、ハイブリッドＰＫＳ中で第１の拡張モジュ
ールとして使用されるか、さもなければ環化が生じるポリケチドの部分を生成す
ることに関与する場合、ＫＲにより作製されたヒドロキシル基で、ポリケチドの
代表的環化を妨げることを認識する。しかし、このような欠失または挿入は、直
鎖状分子を生成するか、または分子の別の部位で環化を誘導するために有用であ
り得る。
【００７５】 上記のように、本発明はまた、組換えＰＫＳ、および組換えＤＮＡ化合物、お
よび第１の拡張モジュールのＫＳドメインが不活性化されているＰＫＳタンパク
質をコードする。このような構築物は、オレアンドライドＰＫＳまたはオレアン
ドライド誘導体ＰＫＳ、ハイブリッドＰＫＳ、または異種ＰＫＳの残りのモジュ
ールおよびドメインとともに翻訳リーディングフレーム中に配置された場合に、
特に有用である。これらの構築物の有用性は、これらによりコードされるＰＫＳ
を発現する宿主細胞、またはこのようなＰＫＳを含む無細胞抽出物に、前駆体モ
ジュールのＮ−アシルシステアミンチオエステルが与えられるか、または供給さ
れて、オレアンドライド誘導体化合物を調製し得ることである。米国特許出願第
６０／１１７，３８４号（１９９９年１月２７日出願）、ならびにＰＣＴ公開第
ＷＯ９９／０３９８６号および同ＷＯ９７／０２３５８号（これらの各々は本明
細書中で参考として援用される）を参照のこと。
【００７６】 オレアンドライドＰＫＳの第２の拡張モジュールをコードする本発明の組換え
ＤＮＡ化合物、およびこれによりコードされる対応するポリペプチドは、種々の
適用に有用である。１つの実施形態において、オレアンドライドＰＫＳの第２の
拡張モジュールをコードする配列を含むＤＮＡ化合物が、異種ＰＫＳのコード配
列を含むＤＮＡ化合物中に挿入される。生じる構築物（異種ＰＫＳのモジュール
のコード配列が、このオレアンドライドＰＫＳの第２の拡張モジュールのコード
配列によって置換されているか、または、このオレアンドライドＰＫＳの第２の
拡張モジュールのコード配列が異種ＰＫＳのモジュールのコード配列に単に付加
されているかのいずれかである）は、新規なＰＫＳを提供する。別の実施形態に
おいて、このオレアンドライドＰＫＳの第２の拡張モジュールをコードする配列
を含むＤＮＡ化合物が、オレアンドライドＰＫＳのコード配列またはオレアンド
ライド誘導体を生成する組換えオレアンドライドＰＫＳのコード配列を含むＤＮ
Ａ化合物中に挿入される。
【００７７】 別の実施形態において、第２の拡張モジュールコード配列の一部または全てが
、他のＰＫＳコード配列と組合せて利用されて、ハイブリッドモジュールを生成
する。この実施形態において、本発明は、例えば、メチルマロニルＣｏＡ特異的
ＡＴを、マロニルＣｏＡ特異的ＡＴ、エチルマロニルＣｏＡ特異的ＡＴ、または
２−ヒドロキシマロニルＣｏＡ特異的ＡＴにより置換すること；ＫＲを欠失（ま
たは不活性化）すること；このＫＲを、ＫＲ、ＫＲおよびＤＨ、またはＫＲ、Ｄ
ＨおよびＥＲにより置換すること；ならびに／あるいはＤＨまたはＤＨおよびＥ
Ｒを挿入することを提供する。さらに、このＫＳおよび／またはＡＣＰは、別の
ＫＳおよび／またはＡＣＰにより置換され得る。これらの置換または挿入の各々
において、異種ＫＳ、ＡＴ、ＤＨ、ＫＲ、ＥＲ、またはＡＣＰのコード配列は、
このオレアンドライドＰＫＳの別のモジュールのコード配列、オレアンドライド
以外のポリケチドを生成するＰＫＳのコード配列、または化学合成に由来し得る
。生じた異種の第２の拡張モジュールコード配列は、オレアンドライド、オレア
ンドライド誘導体、または別のポリケチドを合成するＰＫＳ由来のコード配列と
組合せて利用され得る。
【００７８】 オレアンドライドＰＫＳの第３の拡張モジュールをコードする本発明の組換え
ＤＮＡ化合物、およびこれによりコードされる対応するポリペプチドは、種々の
適用に有用である。１つの実施形態において、オレアンドライドＰＫＳの第３の
拡張モジュールをコードする配列を含むＤＮＡ化合物が、異種ＰＫＳのコード配
列を含むＤＮＡ化合物中に挿入される。生じる構築物（異種ＰＫＳのモジュール
のコード配列が、このオレアンドライドＰＫＳの第３の拡張モジュールのコード
配列によって置換されているか、または、このオレアンドライドＰＫＳの第３の
拡張モジュールのコード配列が異種ＰＫＳのモジュールのコード配列に単に付加
されているかのいずれかである）は、新規なＰＫＳを提供する。別の実施形態に
おいて、このオレアンドライドＰＫＳの第３の拡張モジュールをコードする配列
を含むＤＮＡ化合物が、オレアンドライドＰＫＳのコード配列またはオレアンド
ライド誘導体を生成する組換えオレアンドライドＰＫＳのコード配列を含むＤＮ
Ａ化合物中に挿入される。
【００７９】 別の実施形態において、第３の拡張モジュールコード配列の一部または全てが
、他のＰＫＳコード配列と組合せて利用されて、ハイブリッドモジュールを生成
する。この実施形態において、本発明は、例えば、メチルマロニルＣｏＡ特異的
ＡＴを、マロニルＣｏＡ特異的ＡＴ、エチルマロニルＣｏＡ特異的ＡＴ、または
２−ヒドロキシマロニルＣｏＡ特異的ＡＴにより置換すること；不活性ＫＲを欠
失すること；ならびに／あるいはＫＲを、活性ＫＲ、またはＫＲおよびＤＨ、ま
たはＫＲ、ＤＨ、およびＥＲで置換することを提供する。さらに、このＫＳおよ
び／またはＡＣＰは、別のＫＳおよび／またはＡＣＰにより置換され得る。これ
らの置換または挿入の各々において、異種ＫＳ、ＡＴ、ＤＨ、ＫＲ、ＥＲ、また
はＡＣＰのコード配列は、このオレアンドライドＰＫＳの別のモジュールのコー
ド配列、オレアンドライド以外のポリケチドを生成するＰＫＳの遺伝子、または
化学合成に由来し得る。生じる異種の第３の拡張モジュールコード配列は、オレ
アンドライド、オレアンドライド誘導体、または別のポリケチドを合成する、Ｐ
ＫＳのコード配列と組合せて利用され得る。
【００８０】 オレアンドライドＰＫＳの第４の拡張モジュールをコードする本発明の組換え
ＤＮＡ化合物、およびこれによりコードされる対応するポリペプチドは、種々の
適用に有用である。１つの実施形態において、オレアンドライドＰＫＳの第４の
拡張モジュールをコードする配列を含むＤＮＡ化合物が、異種ＰＫＳのコード配
列を含むＤＮＡ化合物中に挿入される。得られた構築物（異種ＰＫＳのモジュー
ルのコード配列が、このオレアンドライドＰＫＳの第４の拡張モジュールのコー
ド配列によって置換されているか、または、このオレアンドライドＰＫＳの第４
の拡張モジュールのコード配列が異種ＰＫＳのモジュールのコード配列に単に付
加されているかのいずれかである）は、新規なＰＫＳを提供する。別の実施形態
において、このオレアンドライドＰＫＳの第４の拡張モジュールをコードする配
列を含むＤＮＡ化合物が、オレアンドライドＰＫＳのコード配列またはオレアン
ドライド誘導体を生成する組換えオレアンドライドＰＫＳのコード配列を含むＤ
ＮＡ化合物中に挿入される。
【００８１】 別の実施形態において、第４の拡張モジュールコード配列の一部が、他のＰＫ
Ｓコード配列と組合せて利用されて、ハイブリッドモジュールを生成する。この
実施形態において、本発明は、例えば、メチルマロニルＣｏＡ特異的ＡＴを、マ
ロニルＣｏＡ特異的ＡＴ、エチルマロニルＣｏＡ特異的ＡＴ、または２−ヒドロ
キシマロニルＣｏＡ特異的ＡＴにより置換すること；ＥＲ、ＤＨ、およびＫＲの
うちのいずれか１つ、２つ、または３つ全てを欠失または不活性化すること；な
らびに／あるいはＥＲ、ＤＨ、およびＫＲのうちのいずれか１つ、２つ、または
３つ全てを、ＫＲ、ＤＨおよびＫＲ、またはＫＲ、ＤＨ，およびＥＲのいずれか
により置換することを提供する。さらに、このＫＳおよび／またはＡＣＰは、別
のＫＳおよび／またはＡＣＰにより置換され得る。これらの置換または挿入の各
々において、異種ＫＳ、ＡＴ、ＤＨ、ＫＲ、ＥＲ、またはＡＣＰのコード配列は
、このオレアンドライドＰＫＳの別のモジュールのコード配列（ＤＨドメインお
よびＥＲドメインを除く）、オレアンドライド以外のポリケチドを生成するＰＫ
Ｓのコード配列、または化学合成に由来し得る。生じる異種の第４の拡張モジュ
ールコード配列は、オレアンドライド、オレアンドライド誘導体、または別のポ
リケチドを合成する、ＰＫＳのコード配列と組合せて利用され得る。
【００８２】 オレアンドライドＰＫＳの第５の拡張モジュールをコードする本発明の組換え
ＤＮＡ化合物、およびこれによりコードされる対応するポリペプチドは、種々の
適用に有用である。１つの実施形態において、オレアンドライドＰＫＳの第５の
拡張モジュールをコードする配列を含むＤＮＡ化合物は、異種ＰＫＳのコード配
列を含むＤＮＡ化合物中に挿入される。得られた構築物（異種ＰＫＳのモジュー
ルのコード配列が、このオレアンドライドＰＫＳの第５の拡張モジュールのコー
ド配列によって置換されているか、または、このオレアンドライドＰＫＳの第５
の拡張モジュールのコード配列が異種ＰＫＳのモジュールのコード配列に単に付
加されているかのいずれかである）は、新規なＰＫＳを提供する。別の実施形態
において、このオレアンドライドＰＫＳの第５の拡張モジュールをコードする配
列を含むＤＮＡ化合物は、オレアンドライドＰＫＳのコード配列またはオレアン
ドライド誘導体を生成する組換えオレアンドライドＰＫＳのコード配列を含むＤ
ＮＡ化合物中に挿入される。
【００８３】 別の実施形態において、第５の拡張モジュールコード配列の一部または全てが
、他のＰＫＳコード配列と組合せて利用されて、ハイブリッドモジュールを生成
する。この実施形態において、本発明は、例えば、メチルマロニルＣｏＡ特異的
ＡＴを、マロニルＣｏＡ特異的ＡＴ、エチルマロニルＣｏＡ特異的ＡＴ、または
２−ヒドロキシマロニルＣｏＡ特異的ＡＴにより置換すること；ＫＲを欠失する
こと（または不活性化すること）；ＤＨ、またはＤＨおよびＥＲを挿入すること
；ならびに／あるいはこのＫＲを別のＫＲ、（ＤＨおよびＫＲ）、または（ＤＨ
、ＫＲ、およびＥＲ）により置換することを提供する。さらに、このＫＳおよび
／またはＡＣＰは、別のＫＳおよび／またはＡＣＰにより置換され得る。これら
の置換または挿入の各々において、異種ＫＳ、ＡＴ、ＤＨ、ＫＲ、ＥＲ、または
ＡＣＰのコード配列は、このオレアンドライドＰＫＳの別のモジュールのコード
配列、オレアンドライド以外のポリケチドを生成するＰＫＳのコード配列、また
は化学合成に由来し得る。生じた異種の第５の拡張モジュールコード配列は、オ
レアンドライド、オレアンドライド誘導体、または別のポリケチドを合成する、
ＰＫＳのコード配列と組合せて利用され得る。
【００８４】 オレアンドライドＰＫＳの第６の拡張モジュールをコードする本発明の組換え
ＤＮＡ化合物、およびこれによりコードされる対応するポリペプチドは、種々の
適用に有用である。１つの実施形態において、オレアンドライドＰＫＳの第６の
拡張モジュールをコードする配列を含むＤＮＡ化合物が、異種ＰＫＳのコード配
列を含むＤＮＡ化合物中に挿入される。生じる構築物（異種ＰＫＳのモジュール
のコード配列が、このオレアンドライドＰＫＳの第６の拡張モジュールのコード
配列によって置換されているか、または、このオレアンドライドＰＫＳの第６の
拡張モジュールのコード配列が異種ＰＫＳのモジュールのコード配列に単に付加
されているかのいずれかである）は、新規なＰＫＳを提供する。別の実施形態に
おいて、このオレアンドライドＰＫＳの第６の拡張モジュールをコードする配列
を含むＤＮＡ化合物が、オレアンドライドＰＫＳのコード配列またはオレアンド
ライド誘導体を生成する組換えオレアンドライドＰＫＳのコード配列を含むＤＮ
Ａ化合物中に挿入される。
【００８５】 別の実施形態において、第６の拡張モジュールコード配列の一部または全てを
、他のＰＫＳコード配列と組み合わせて使用して、ハイブリッドモジュールを作
製する。この実施形態において、本発明は、例えば、メチルマロニルＣｏＡ特異
的ＡＴをマロニルＣｏＡ特異的ＡＴ、エチルマロニルＣｏＡ特異的ＡＴまたは２
−ヒドロキシグリコリルＣｏＡ特異的ＡＴと置換すること；ＫＲを欠失または不
活性化することあるいはＫＲを別のＫＲ、ＫＲおよびＤＨ、またはＫＲ、ＤＨ、
およびＥＲと置換すること、ならびに／あるいはＤＨまたはＤＨおよびＥＲを挿
入することを提供する。さらに、このＫＳおよび／またはＡＣＰは、別のＫＳお
よび／またはＡＣＰで置換され得る。これらの置換または挿入の各々において、
異種のＫＳ、ＡＴ、ＤＨ、ＫＲ、ＥＲまたはＡＣＰのコード配列は、オレアンド
ライドＰＫＳの別のモジュールのコード配列、オレアンドライド以外のポリケチ
ドを産生するＰＫＳについてのコード配列、または化学合成に由来し得る。得ら
れる異種の第６の拡張モジュールコード配列は、オレアンドライド、オレアンド
ライド誘導体または別のポリケチドを合成するＰＫＳのコード配列と組み合わせ
て利用し得る。
【００８６】 オレアンドライドＰＫＳの第６の拡張モジュールは、チオエステラーゼドメイ
ンの前にある。このドメインは、ポリケチドの環化およびそのＰＫＳからのこの
ドメインの切断に重要である。本発明は、ハイブリッドＰＫＳ酵素をコードする
組換えＤＮＡ化合物を提供する。ここで、オレアンドライドＰＫＳが、異種のチ
オエステラーゼに融合されているか、または異種のＰＫＳが、オレアンドライド
シンターゼチオエステラーゼに融合されている。従って、例えば、別のＰＫＳ遺
伝子由来のチオエステラーゼドメインコード配列は、本発明の組換えＤＮＡ化合
物中の第６の（または他の最終の）拡張モジュールコード配列の末端に挿入され
得るか、またはオレアンドライドＰＫＳチオエステラーゼが同様に異種ＰＫＳに
融合され得る。このチオエステラーゼドメインをコードする組換えＤＮＡ化合物
は、オレアンドライドＰＫＳ、オレアンドライド誘導体を産生するＰＫＳ、およ
びオレアンドライドまたはオレアンドライド誘導体以外のポリケチドを産生する
ＰＫＳをコードする、ＤＮＡ化合物を構築する際に有用である。
【００８７】 従って、本発明のハイブリッドモジュールは、ＰＫＳに取り込まれて本発明の
ハイブリッドＰＫＳを提供する。本発明のハイブリッドＰＫＳは、 （ｉ）その生成物がＰＫＳに組み込まれるＰＫＳ遺伝子中に含まれるハイブリ
ッドモジュールコード配列を産生するための異種ドメイン（ここで異種とは、モ
ジュールが少なくとも２つの異なる天然に存在するモジュール由来であるドメイ
ンを意味する）コード配列の融合、 から生じるのみではなく、 （ｉｉ）その生成物がＰＫＳに組み込まれるＰＫＳ遺伝子中に含まれるハイブ
リッドコード配列を産生するための、異種モジュール（ここで異種モジュールと
は、天然に存在するＰＫＳ酵素中で互いに隣接しない、互いに隣接する２つのモ
ジュールを意味する）コード配列の融合から、 （ｉｉｉ）１つ以上の非オレアンドライドＰＫＳ遺伝子（天然に存在する非オ
レアンドライドＰＫＳ遺伝子および組換え非オレアンドライドＰＫＳ遺伝子の両
方を含む）を伴う１つ以上の非オレアンドライドＰＫＳ遺伝子の発現から、なら
びに、 （ｉｖ）前述の組み合わせ からもまた、生じる。これらの種々の代替を例証する本発明の種々のハイブリッ
ドＰＫＳは、本明細書中に記載される。
【００８８】 融合モジュールを含むハイブリッドＰＫＳの例は、オレアンドライドＰＫＳの
拡張モジュール１および２を伴う、ＤＥＢＳまたはナルボノライドＰＫＳ（本明
細書中で参考として援用されるＰＣＴ特許出願番号ＵＳ９９／１１８１４を参照
のこと）のいずれかのローディングモジュールから生じ、ハイブリッドｏｌｅＡ
Ｉ遺伝子を産生する。ｏｌｅＡＩＩ遺伝子およびｏｌｅＡＩＩＩ遺伝子とのこれ
ら２つのハイブリッドｏｌｅＡＩ遺伝子のいずれか１つの、適切な宿主細胞（例
えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）中での同時発現は、組換
え宿主細胞中での６−デオキシエリスロノライドＢを産生する、本発明のハイブ
リッドＰＫＳの発現を生じる。ｅｒｙＡＩＩ遺伝子およびｅｒｙＡＩＩＩ遺伝子
との、これら２つのハイブリッドｏｌｅＡＩ遺伝子のいずれか１つの同時発現は
、同様に、６−ｄＥＢの産生を生じるが、一方、類似のナルボノライドＰＫＳ遺
伝子（ｐｉｃＡＩＩおよびｐｉｃＡＩＩＩ）との同時発現は、３−ケト−６−ｄ
ＥＢの産生を生じる。
【００８９】 ハイブリッドモジュールを含むハイブリッドＰＫＳの別の例は、ｏｌｅＡＩ遺
伝子およびｏｌｅＡＩＩ遺伝子を、拡張モジュール５をコードするｏｌｅＡＩＩ
Ｉハイブリッド遺伝子とともに同時発現させることによって調製され、そしてオ
レアンドライドＰＫＳの拡張モジュール６のＫＳおよびＡＴは、拡張モジュール
６のＡＣＰおよびナルボノライドＰＫＳのＴＥに融合される。得られる本発明の
ハイブリッドＰＫＳは、３−デオキシ−３−オキソ−８，８ａ−デオキシオレア
ンドライド（３−ケト−オレアンドライド）を産生する。この化合物は、１４−
デスメチルケトライドの生成において有用であり、この化合物は強力な抗細菌活
性を有する。この化合物はまた、本発明の組換えオレアンドライド誘導体ＰＫＳ
によって調製され得、ここで、オレアンドライドＰＫＳのモジュール６のＫＲド
メインは欠失されるか、または不活性ＫＲドメインで置換されている。さらに本
発明は、上記の変化がなされているだけではなく、モジュール６のＡＴドメイン
がまた、マロニル特異的ＡＴで置換されているハイブリッドＰＫＳを提供する。
これらのハイブリッドＰＫＳは、２−デスメチル−３−デオキシ−３−オキソ−
８，８ａ−デオキシオレアンドライド（強力な抗生物質活性を有する化合物であ
る、２，１４−ジデスメチルケトライドの調製における有用な中間体）を産生す
る。
【００９０】 別の例証的なハイブリッドＰＫＳの例には、つい先ほど記載したハイブリッド
ＰＫＳの後者の変化からのみ生じる本発明のハイブリッドＰＫＳが含まれる。従
って、ｏｌｅＡ１遺伝子およびｏｌｅＡＩＩ遺伝子の、モジュール６のＡＴドメ
インがマロニル特異的ＡＴによって置換されているハイブリッドｏｌｅＩＩＩ遺
伝子との同時発現は、組換え宿主細胞中で２−デスメチル−８，８ａ−デオキシ
オレアンドライドを産生するハイブリッドＰＫＳの発現を生じる。この化合物は
、本発明の組換え宿主細胞中で２，１４−ジデスメチルエリスロマイシンを製造
するための中間体として有用である。
【００９１】 上記のハイブリッドＰＫＳの多くは、主としてオレアンドライドＰＫＳタンパ
ク質から構成されるが、当業者は、本発明が多くの異なるハイブリッドＰＫＳ（
オレアンドライドＰＫＳの小さな部分のみからなるものを含む）を提供すること
を理解する。例えば、本発明は、ＤＥＢＳの拡張モジュール１および２に融合さ
れたオレアンドライドローディングモジュールをコードするハイブリッドｏｌｅ
Ａ１遺伝子が、ｅｒｙＡＩＩ遺伝子およびｅｒｙＡＩＩＩ遺伝子とともに同時発
現されるハイブリッドＰＫＳを提供する。得られるハイブリッドＰＫＳは、８，
８ａ−デオキシオレアンドライドを産生する。この構築物が、Ｓａｃｃｈａｒｏ
ｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｅｒｙｔｈｒａｅａ宿主細胞中で発現される（染色体中で
の染色体組み込みを介して、またはハイブリッドＰＫＳをコードするベクターを
介して）場合、得られる本発明の組換え宿主細胞は、１４−デスメチルエリスロ
マイシンを産生する。別の例証的な例は、ｏｌｅＡ１遺伝子産物、ｅｒｙＡＩＩ
遺伝子産物、およびｅｒｙＡＩＩＩ遺伝子産物からなる、本発明のハイブリッド
ＰＫＳである。この構築物はまた、以下の実施例３に記載されるように、Ｓａｃ
ｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｅｒｙｔｈｒａｅａ宿主細胞中で１４−デスメ
チルエリスロマイシンを発現する際に有用である。好ましい実施形態において、
Ｓ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ宿主細胞は、６−デオキシエリスロノライドＢを産生し
ない、ｅｒｙＡＩ変異体である。
【００９２】 別の例は、ｐｉｃＡＩ遺伝子の産物およびｐｉｃＡＩＩ遺伝子の産物（ナルボ
ノライドＰＫＳの、ローディングモジュールおよび拡張モジュール１〜４（両端
を含む）を含む２つのタンパク質）およびｏｌｅＡＩＩＩ遺伝子の産物からなる
本発明のハイブリッドＰＫＳである。得られるハイブリッドＰＫＳは、Ｓｔｒｅ
ｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ宿主細胞中でマクロライドアグリコン３−
ヒドロキシ−ナルボノライドを産生し、そしてＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏ
ｒａ ｅｒｙｔｈｒａｅａ宿主細胞中で対応するエリスロマイシンを産生する。
本発明のこのハイブリッドＰＫＳは、以下の実施例５において記載される。
【００９３】 前述の本発明のハイブリッドＰＫＳ酵素の各々、および本発明のハイブリッド
ＰＫＳ酵素は一般的に、機能的なｏｌｅＰ遺伝子産物をまた発現する宿主細胞中
で発現され得る。このような発現は、Ｃ−８−Ｃ−８ａエポキシドが存在する本
発明の化合物を提供する。
【００９４】 以下の表は、本発明の組換えハイブリッドＰＫＳの構築およびそれらをコード
する対応するＤＮＡ化合物に有用であり得る例示的ＰＫＳ遺伝子および対応する
酵素を記載する参考文献を列挙する。本発明の方法に従って利用し得るテイラー
リング酵素（ｔａｉｌｏｒｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ）および対応する遺伝子の調製
を記載する種々の参考文献もまた提示する。
【００９５】
【表１】 上記の表に例示したように、本発明のハイブリッドＰＫＳコードＤＮＡ化合物
を構築する際に使用のためのＤＮＡおよび配列情報の容易に利用可能な供給源と
して役に立つ、広範な種々のＰＫＳ遺伝子が存在する。ハイブリッドＰＫＳコー
ドＤＮＡ化合物を構築するための方法は、オレアンドライドＰＫＳに関すること
なく以下に記載される：米国特許第５，６７２，４９１号および同第５，７１２
，１４６号ならびにＰＣＴ公開ＷＯ９８／４９３１５（これらの各々は、本明細
書中に参考として援用される）。
【００９６】 本発明のハイブリッドＰＫＳの構築において、特定の一般的な方法が助けとな
り得る。例えば、ハイブリッドＰＫＳを作製するために変更されるモジュールの
枠組みを保持することは、しばしば利点がある。従って、モジュールにＤＨおよ
びＥＲの機能性を付加することが所望される場合、ＤＨドメインおよびＥＲドメ
インを単に挿入する代わりに、しばしば、元々のモジュールのＫＲドメインを、
別のモジュール由来のＫＲドメイン、ＤＨドメインおよびＥＲドメインを含有す
るセグメントと置換することが好ましい。ＫＳドメインを、異なる立体化学の特
徴をもたせるモジュール由来のＫＳドメインで置換することによりモジュールの
立体化学特異性を変化し得る。Ｌａｕら、１９９９、「Ｄｉｓｓｅｃｔｉｎｇ
ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ａｃｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｄｏｍａｉｎｓ
ｏｆ ｍｏｄｕｌａｒ ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅｓ ｉｎ ｔ
ｈｅ ｃｈｏｉｃｅ ａｎｄ ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｆａｔｅ ｏｆ
ｅｘｔｅｎｄｅｒ ｕｎｉｔｓ」Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３８（５）：１
６４３−１６５１（本明細書に参考として援用される）を参照のこと。ＡＴドメ
インの小さなセグメントだけを変えることによりＡＴドメインの特異性を変化し
得る。Ｌａｕら、前出を参照のこと。２つの異なるＰＫＳ由来のモジュールに連
結して、ハイブリッドＰＫＳを作製するために、ＰＫＳタンパク質における公知
のリンカー領域もまたうまく利用し得る。Ｇｏｋｈａｌｅら、１９９９年４月１
６日、「Ｄｉｓｓｅｃｔｉｎｇ ａｎｄ Ｅｘｐｌｏｉｔｉｎｇ Ｉｎｔｅｒｍ
ｏｄｕｌａｒ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ Ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ Ｓ
ｙｎｔｈａｓｅｓ」Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８４：４８２−４８５（本明細書に参考
として援用される）を参照のこと。
【００９７】 本発明のハイブリッドＰＫＳをコードするＤＮＡ化合物は、２つより多くのＰ
ＫＳ遺伝子のハイブリッドであり得、そしてしばしばそのようなハイブリッドで
ある。２つの遺伝子のみが使用された場合でさえ、そのハイブリッド遺伝子には
、しばしば２つ以上のモジュールが存在し、その遺伝子においては、このモジュ
ールの一部もしくは全部は、第２の（または第３の）ＰＫＳ遺伝子から誘導され
る。従って、１つの例示的な例として、本発明は、天然に存在するローディング
モジュール、およびチオエステラーゼドメインならびにオレアンドライド（ｏｌ
ｅａｎｄｏｌｉｄｅ）ＰＫＳの拡張モジュール１、拡張モジュール２、拡張モジ
ュール４、および拡張モジュール６を含み、そしてハイブリッドまたは異種の拡
張モジュール３および５をさらに含むハイブリッドＰＫＳを提供する。ハイブリ
ッドまたは異種の拡張モジュール３および５は、マロニルＣｏＡに特異的なＡＴ
ドメインを含有し、そして例えば、ラパマイシンＰＫＳ遺伝子由来である。
【００９８】 本発明のハイブリッドＰＫＳまたはオレアンドライド誘導体ＰＫＳを構築する
ために、ＰＣＴ公開ＷＯ９８／２７２０３および米国仮特許出願第６０／１２９
，７３１号（９９年４月１６日出願）（本明細書に参考として援用される）に記
載される技術を利用し得る。このＰＣＴ公開において、大きなオレアンドライド
ＰＫＳ遺伝子クラスターは、２つ以上、代表的には、３つのセグメントに分割さ
れ、そして各々のセグメントは、別々の発現ベクター上に配置される。この様式
において、この遺伝子のセグメントの各々は改変され得、そして種々の改変され
たセグメントは、単一の宿主細胞において組み合わされ、本発明の組換えＰＫＳ
遺伝子を提供し得る。この技術は、組換えＰＫＳ遺伝子の大きなライブラリー、
それらの遺伝子を発現するベクター、およびそれらのベクターを含む宿主細胞の
構築をより有効にする。
【００９９】 本発明はまた、ＰＫＳ遺伝子の、ＰＫＳタンパク質の、そして究極的には、ポ
リケチドのライブラリーを提供する。これらは、オレアンドライドＰＫＳにおけ
る改変の生成により構築され、その結果、産生されたこのタンパク質複合体は、
１つ以上の点において改変された活性を有し、従って、ＰＫＳのオレアンドライ
ドの天然の産物以外のポリケチドを産生する。新規なポリケチドがこのように調
製され得、すなわちポリケチドは、一般的に、この方法を使用してより容易に調
製される。天然に存在するＰＫＳ遺伝子クラスター由来の多数の異なる遺伝子ま
たは遺伝子クラスターを提供することにより（この各々は、天然のクラスターと
異なる方法において改変されている）、ポリケチドの有効なコンビナトリアルラ
イブラリーが、これらの活性における複数の変異の結果として産生され得る。以
下にさらに記載されるように、本発明のこの実施形態の境界および範囲が、ポリ
ケチドレベル、タンパク質レベルおよびコードヌクレオチド配列レベルで記載さ
れ得る。
【０１００】 上記のように、オレアンドライドから「誘導される（由来する）」モジュール
型ＰＫＳまたは他の天然に存在するＰＫＳは、天然に存在する遺伝子の利用した
部分の足場（ｓｃａｆｆｏｌｄｉｎｇ）を維持するモジュール型ＰＫＳ（または
その対応するコード遺伝子）を含む。全てのモジュールがこの構築物に含まれる
必要はない；この構築物は、ローディングモジュール、および６、６未満または
６を超える拡張モジュールを含み得る。足場とは対照的に、少なくとも１つの酵
素活性が、変異、欠失、置換、または挿入され、その結果、元々のＰＫＳに比べ
て得られるＰＫＳの活性を変化させる。これらの活性が、欠失されるかまたは活
性の異なるバージョンにより置換される場合、あるいは天然の産物以外のポリケ
チドがこれらの集合的活性から得られるこのような様式において単に変化される
場合に、変異が生じる。これは、ポリケチド産物の対応する位置での、スタータ
ーユニットおよび／もしくは拡張ユニット、立体化学、鎖長または環化、および
／もしくは還元もしくは脱水サイクルの結果生じた変異のために生じる。欠失さ
れた活性が置換される場合、置換の活性の起源は、異なる天然に存在するＰＫＳ
における対応する活性に起因し得るかまたはオレアンドライドＰＫＳの異なる領
域に起因し得る。オレアンドライドＰＫＳの任意のまたは全ての遺伝子は、含ま
れ得るこれらの任意の誘導体もしくは一部に含まれ得るが、ＰＫＳタンパク質の
足場は、どの誘導体が構築される場合においても保持される。この誘導体は、好
ましくはオレアンドライドまたは別のＰＫＳから誘導されるチオエステラーゼ活
性を含有する。
【０１０１】 従って、オレアンドライドＰＫＳから誘導されるＰＫＳは、オレアンドライド
ＰＫＳの全てまたは一部の骨格を含有するＰＫＳを含む。誘導体ＰＫＳはまた、
機能的である少なくとも２つの拡張モジュール、好ましくは、３つの拡張モジュ
ール、そしてより好ましくは４つ以上の拡張モジュール、ならびに最も好ましく
は６つの拡張モジュールを含有する。誘導体ＰＫＳはまた、オレアンドライドＰ
ＫＳの機能的モジュールの一つ以上の活性の変異、欠失、挿入、または置換を含
有し、その結果、得られたポリケチドの性質がタンパク質レベルおよびＤＮＡ配
列レベルの両方で変化される。特定の好ましい実施形態は、ＫＳドメイン、ＡＴ
ドメイン、またはＡＣＰドメインが、異なるＰＫＳ、または同じＰＫＳ内の別の
位置に由来する活性のバージョンにより、欠失または置換されているものを含む
。少なくとも１つの非縮合環酵素活性（ＫＲ、ＤＨまたはＥＲ）が、欠失または
添加された誘導体、あるいは、これらの活性のいずれかが変異され、その結果、
ＰＫＳにより合成されたポリケチドの構造が変化された誘導体もまた好ましい。
【０１０２】 逆に、オレアンドライドＰＫＳ活性の、少なくとも１つの部分、または２つ以
上の部分が挿入された、機能的な非オレアンドライドＰＫＳモジュールまたはそ
れらのコード遺伝子もまた、オレアンドライドＰＫＳから誘導されるＰＫＳの定
義内に含まれる。マロニルＣｏＡよりむしろメチルマロニルＣｏＡ拡張ユニット
を受けるオレアンドライドＡＴを拡張モジュール２として使用して、別のＰＫＳ
におけるメチルマロニル特異的ＡＴを置換することが、例である。他の例は、Ｄ
ＮＡレベルおよびタンパク質レベルの両方での、異種ＰＫＳ中への非縮合環酵素
活性の部分またはオレアンドライドシンターゼ活性の他の領域の挿入を含む。
【０１０３】 従って、産生されるポリケチドに関して、ハイブリッドＰＫＳを構築するため
に少なくとも５つの自由度が存在する。第１に、ポリケチド鎖長は、ＰＫＳ中の
モジュールの数により決定し、そして本発明は、ローディングモジュール、なら
びに６および６未満または６を超える拡張モジュールを含む、ハイブリッドＰＫ
Ｓを含む。第２に、ＰＫＳの炭素骨格の性質は、各位置の拡張ユニット（例えば
、マロニル、メチルマロニル、エチルマロニルまたは他の置換マロニル）の性質
を決定する、アシルトランスフェラーゼの特異性により決定される。第３に、ロ
ーディングモジュールの特異性もまた、生じるポリケチドの炭素骨格に対して効
果を有する。ローディングモジュールは、異なるスターターユニット（例えば、
プリオピオニル、ブチリルなど）を使用し得る。上記および以下の実施例のよう
に、ローディングモジュールの特異性を変化させる別の方法は、拡張モジュール
１のＫＳ（ＫＳ１）の活性の不活化、および拡張モジュール２について代わりの
基質（ジケチドと呼ばれる、拡張モジュール１のジケチド産物の化学合成された
アナログである）を提供することを含む。このアプローチは、ＰＣＴ公開ＷＯ
９７／０２３５８およびＷＯ ９９／０３９８６（本明細書中に参考として援用
される）に例示された。これらの公開において、ＫＳ１活性は、変異により不活
化された。第４に、ポリケチドの種々の位置での酸化状態は、モジュールのデヒ
ドラターゼ部位およびレダクターゼ部位により決定される。これは、ポリケチド
中のケトン部分およびアルコール部分、ならびにＣ−Ｃ二重結合またはＣ−Ｃ単
結合の存在および位置を決定する。最後に、得られたポリケチドの立体化学は、
シンターゼの３つの局面の関数である。第１の局面は、拡張ユニットとしての置
換されたマロニルと関連するＡＴ／ＫＳ特異性に関する。これは、還元性の環が
欠失される場合、またはケトレダクターゼのみを含む場合にのみ、デヒドラター
ゼがキラリティーを無効にするために立体化学に影響する。第２にケトレダクタ
ーゼの特異性は、任意のβ−ＯＨのキラリティーを決定し得る。最後に、拡張ユ
ニットとしての置換されたマロニルについてのエノイルレダクターゼの特異性は
、利用可能な完全なＫＲ／ＤＨ／ＥＲが存在する場合、立体化学に影響を与え得
る。
【０１０４】 従って、一般にモジュール型ＰＫＳ系、特にオレアンドライドＰＫＳ系は、広
範なポリケチドが合成されることを可能にする。芳香族ＰＫＳ系と比較した場合
、モジュール型ＰＫＳ系は、広範なスターターユニット（脂肪族モノマー（アセ
チル、プロピオニル、ブチリル、イソバレリルなど）、芳香族モノマー（アミノ
ヒドロキシベンゾイル）、脂環式モノマー（シクロヘキサノイル）およびへテロ
環式モノマー（チアゾリル）を含む）を受け入れる。特定のモジュール型ＰＫＳ
は、それらのスターターユニットに対してゆるやかな特異性を有する（Ｋａｏら
、１９９４、Ｓｃｉｅｎｃｅ、前出）。モジュール型ＰＫＳはまた、各縮合環の
拡張ユニットの選択に関してかなりの多様性を示す。縮合反応後のβ−ケト還元
の程度もまた、遺伝的操作により変えられることが示されている（Ｄｏｎａｄｉ
ｏら、１９９１、Ｓｃｉｅｎｃｅ、前出；Ｄｏｎａｄｉｏら、１９９３、Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：７１１９−７１２３）。同様
に、ポリケチド産物の大きさは、適切な数のモジュールを有する変異体の設計に
より変えられ得る（Ｋａｏら、１９９４、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６
：１１６１２−１１６１３）。最後に、モジュール型ＰＫＳ酵素は、高度に制御
された様式で、それらの産物において不斉中心の印象的な範囲を生成するために
特に周知である。本発明の方法により生成されたポリケチドおよび抗生物質およ
び他の化合物は、代表的に、単一の立体異性形態である。本発明の化合物は、立
体異性体の混合物として生じ得るが、個々の立体異性を生成することは、いくつ
かの例において有利であり得る。従って、任意の天然に存在するモジュール型（
例えば、オレアンドライド、ＰＫＳ骨格）に基づくモジュール型ＰＫＳ経路内の
コンビナトリアル能は、実質的に制限されない。
【０１０５】 ハイブリットＰＫＳは、ＰＫＳコード配列の「混在しかつ一致する」部分によ
り、最も良く産生されるが、ＰＫＳをコードするＤＮＡにおける変異を使用して
、コードされるポリペプチドの活性を導入、変化または欠失させ得ることを考慮
した場合、さらに増加される。変異を従来の技術を使用してネイティブの配列に
対してなし得る。変異のための基質は、遺伝子のクラスター全体、またはそれら
の１つもしくは２つのみであり得る；変異のための基質はまた、それらの遺伝子
の１つ以上の部分であり得る。変異のための技術には、変異を含む合成オリゴヌ
クレオチド調製すること、および制限エンドヌクレアーゼ消化を用いて、ＰＫＳ
サブユニットをコードする遺伝子中へ変異された配列を挿入することが挙げられ
る。例えば、Ｋｕｎｋｅｌ、１９８５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．ＵＳＡ ８２：４４８；Ｇｅｉｓｓｅｌｓｏｄｅｒら、１９８７、ＢｉｏＴｅ
ｃｈｎｉｑｕｅｓ ５：７８６を参照のこと。あるいは、変異は、ネイティブの
ヌクレオチド配列にハイブリダイズするミスマッチプライマー（一般的に１０〜
２０ヌクレオチド長）を用いて、そのミスマッチな二重鎖の融解温度より低い温
度で、もたらされ得る。プライマーは、比較的狭い制限内でプライマー長および
塩基組成を維持することにより、ならびに変異塩基を中心に位置するように維持
することにより特異的に作製され得る。ＺｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈ、１９８
３、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００：４６８を参照のこと。プライマ
ーの伸長は、ＤＮＡポリメラーゼを用いて実施され、産物はクローニングされ、
そしてプライマーの伸長された鎖の分離により誘導された変異ＤＮＡを含むクロ
ーンが選択される。同定は、ハイブリダイーゼーションプローブとして変異プラ
イマーを使用することにより達成され得る。この技術はまた、複数の点変異を作
製するためにも適用可能である。例えば、Ｄａｌｂｉｅ−ＭｃＦａｒｌａｎｄら
、１９８２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７９：６４０９
を参照のこと。ＰＣＲ変異誘発もまた使用して、所望の変異をもたらし得る。
【０１０６】 酵素活性をコードするヌクレオチド配列の選択された部分のランダムな変異誘
発はまた、当該分野で公知にいくつかの異なる技術により（例えば、プラスミド
へオリゴヌクレオチドリンカーをランダムに挿入することにより、Ｘ線または紫
外線照射により、インビトロＤＮＡ合成の間に不正確なヌクレオチドを組み込む
ことにより、誤りがちの（ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ）ＰＣＲ変異誘発により、合
成変異を調製することにより、あるいはインビトロで化学薬品でプラスミドＤＮ
Ａに損傷を与えることにより）達成され得る。化学的変異誘発物質としては、例
えば、亜硫酸水素ナトリウム、亜硝酸、ニトロソグアニジン、ヒドロキシルアミ
ン、塩基を損傷するかもしくは除去することにより、正常な塩基対形成を妨げる
薬剤（例えば、ヒドラジンまたはギ酸）、ヌクレオチド前駆体のアナログ（例え
ば、５−ブロモウラシル、２−アミノプリン）またはアクリジンインターカレー
ト試薬（例えば、プロフラビン、アクリフラビン、キナクリンなど）が挙げられ
る。一般に、プラスミドＤＮＡまたはＤＮＡフラグメントは、化学薬品で処理さ
れ、Ｅ．ｃｏｌｉに形質転換され、そして変異プラスミドのプールまたはライブ
ラリーとして増殖される。
【０１０７】 本発明のハイブリッドＰＫＳを構築するにおいて、酵素活性をコードする領域
（すなわち、異なるＰＫＳシンターゼ由来、または同じＰＫＳの異なる位置由来
の対応する活性をコードする領域）は、例えば、適切なプライマーとともにＰＣ
Ｒ技術を使用して回収され得る。領域をコードする「対応する」活性によって、
活性の同じ一般的な型をコードするそれらの領域が意味される。例えば、遺伝子
クラスターの１つの位置でコードされるＫＲ活性は、この遺伝子クラスターまた
は異なる遺伝子クラスターの別の位置における活性をコードするＫＲに「対応す
る」。同様に、完全なレダクターゼサイクルは、対応すると考えられ得る。例え
ば、ＫＲ／ＤＨ／ＥＲは、ＫＲ単独に対応する。
【０１０８】 宿主ＰＫＳ中の特定の標的領域の置換が行われる場合、この置換は、適切な制
限酵素を使用してインビトロで行われ得る。この置換はまた、組換え技術を使用
してインビボでもたらされ得、これは、ドナープラスミドおよびレシピエントプ
ラスミドのレセプター領域における置換遺伝子を構成する相同な配列を含む。こ
のような系は、異なる温度感受性のプラスミドを有利に含むことが記載される（
例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９６／４０９６８、本明細書中に参考として援用さ
れる）。種々の操作を行って、宿主ＰＫＳ遺伝子の酵素活性を置換するか、また
は宿主ＰＫＳ遺伝子のこれらの領域における変異を支持するために使用されるベ
クターは、コード配列の発現が適切な宿主においてもたらされ得るような様式で
、得られたコード配列に作動可能に連結された制御配列を含むように選択され得
る。
【０１０９】 しかし、簡単なクローニングベクターは、同様に使用され得る。クローニング
ベクターを使用して、コードヌクレオチド配列に作動可能に連結された発現のた
めの制御配列を欠如する誘導ＰＫＳをコードするＰＫＳ遺伝子を得る場合、この
ヌクレオチド配列は、適切な発現ベクター中に挿入される。このことは、個々に
行われる必要はないが、単離されたコードヌクレオチド配列のプールは発現ベク
ター中に挿入され得、得られたベクターは、宿主細胞に形質転換またはトランス
フェクトされ、そして得られた細胞は、個々のコロニーにプレートされる。本発
明は、オレアンドライドＰＫＳのドメインおよびモジュールに対する種々のコー
ド配列が、天然に存在しない制限酵素認識部位に隣接される、種々の組換えＤＮ
Ａ化合物を提供する。
【０１１０】 種々のＰＫＳヌクレオチド配列は、別々の制御エレメントとともに、または、
例えば、単一のプロモーターの制御下で個々のカセットとして１つ以上の組換え
ベクター内にクローニングされ得る。領域をコードするＰＫＳサブユニットは、
ハイブリッドＰＫＳが生成され得るように、他のＰＫＳサブユニットコード配列
の容易な欠失および挿入を可能にするために、隣接する制限部位を含み得る。こ
のような独特の制限部位の設計は、当業者に公知であり、そして上記の技術（例
えば、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ）を使用して達成され得る。
【０１１１】 次いで、異なるポリケチドを生成するための種々のＰＫＳ酵素をコードするヌ
クレオチド配列を含有する発現ベクターは、適切な宿主細胞に形質転換され、ラ
イブラリーを構築する。１つの簡便なアプローチにおいて、このようなベクター
の混合物は選択された宿主細胞に形質転換され、そして得られた細胞は個々のコ
ロニーにプレートされ、そして成功した形質転換体を同定するために選択される
。個々のコロニー各々は、特定のＰＫＳシンターゼを生成し、そして最終的に特
定のポリケチドを生成する能力を有する。代表的には、コロニーのいくつか、大
部分または全てにおいて、複製物（ｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎ）が存在する；各々
のメンバーのコロニーにおいて、異なるＰＫＳを含む形質転換コロニーのサブセ
ットは、ライブラリーとみなされ得る。あるいは、発現ベクターを個々に使用し
て、宿主を形質転換し得る。次いで、この形質転換された宿主はライブラリーに
アセンブルされる。種々のストラテジーは、ライブラリー中の各々のコロニーが
、異なるＰＫＳおよび最終的に異なるポリケチドを生成するような、天然に存在
する宿主遺伝子クラスターに由来するＰＫＳ遺伝子クラスターを各々含む多くの
コロニーを得るために利用可能である。ライブラリーにより生成される異なるポ
リケチドの数は、代表的には、少なくとも４つ、より代表的には、少なくとも１
０、そして好ましくは、少なくとも２０、そしてより好ましくは少なくとも５０
であり、これは、異なる改変されたＰＫＳ遺伝子クラスターおよびＰＫＳ遺伝子
産物の同様な数を反映する。ライブラリー中のメンバーの数は、任意に選択され
る；しかし、スターター、拡張ユニット、立体化学、酸化状態、および鎖長の変
化に関する上記で概説した自由度の程度が、非常に大きなライブラリーの生成を
可能にする。
【０１１２】 適切な宿主へ本発明の組換えベクターを導入する方法は、当業者に公知であり
、そして代表的には、ＣａＣｌ2または薬剤（例えば、他の二価カチオン）、リ
ポフェクション、ＤＭＳＯ、ＰＥＧ、プロトプラスト形質転換、感染、トランス
フェクション、およびエレクトロポレーションの使用が挙げられる。ポリケチド
生成コロニーが同定され得、そして公知の技術を使用して単離され得、そして生
成されたポリケチドは、さらに特徴付けられ得る。これらのコロニーにより生成
されたポリケチドは、ライブラリーを表すようにパネルにおいて集合的に使用さ
れ得るか、または活性について個々に評価され得る。
【０１１３】 従って、本発明のライブラリーは、以下の４つのレベルで考えられ得る：（１
）多重したＰＫＳコード配列を有する多くのコロニー；（２）これらのコード配
列により生成されるタンパク質；（３）機能的ＰＫＳにアセンブルされたこれら
のタンパク質から生成されたポリケチド；および（４）これらのポリケチドから
誘導された他の所望な活性を有する抗生物質または化合物。もちろん、組み合わ
せライブラリーもまた、構築され得、ここで、例えば、オレアンドライドＰＫＳ
から誘導されたライブラリーのメンバーは、例えば、ラパマイシンＰＫＳまたは
ＤＥＢＳから誘導されたライブラリーと同じライブラリーの一部としてみなされ
得る。
【０１１４】 ライブラリーにおけるコロニーは、関連するシンターゼを生成し、従って、関
連するポリケチドを生成して、ポリケチドのライブラリーを得るようから誘導さ
れる。培地中に分泌されるか、または他で単離されたポリケチドは、所望の標的
（例えば、レセプター、シグナル伝達タンパク質など）に対する結合についてス
クリーニングされ得る。上清自体は、スクリーニングのために使用され得るか、
またはポリケチドの部分精製もしくは完全精製が最初にもたらされ得る。代表的
には、このようなスクリーニング方法は、レセプターまたは他の標的リガンドに
対する、ライブラリーの各メンバーの結合を検出することを包む。直接的にか、
または競合アッセイによるかのいずれかで、結合が検出され得る。このようなラ
イブラリーを結合についてスクリーニングする手段は、当該分野で周知である。
あるいは、このライブラリーの個々のポリケチドメンバーは、所望の標的に対し
て試験され得る。この事象において、標的の生物学的応答が測定されるスクリー
ニングは、より容易に含まれ得る。抗生物質活性は、Ｌｅｈｒｅｒら、１９９１
、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１３７：１６７−１７３（本明細書中に参考
として援用される）に示されるスクリーニングアッセイ、および以下の実施例７
におけるような代表的なスクリーニングアッセイを使用して確認され得る。
【０１１５】 本発明は、多数のポリケチドを調製するための方法を提供する。これらのポリ
ケチドは、上記のヒドロキシル化およびグリコシル化反応によって抗生物質活性
または他の活性を有する化合物の形成における、有用な中間体である。一般に、
ＰＫＳのポリケチド産物は、抗生物質活性を示すようにさらに改変されるべきで
ある（代表的には、ヒドロキシル化およびグリコシル化による）。ヒドロキシル
化は、Ｃ−６（これは、ｅｒｙＦ遺伝子によりコードされるヒドロキシラーゼを
用いて達成され得る）および／またはＣ１２（これは、ｐｉｃＫ遺伝子もしくは
ｅｒｙＫ遺伝子によりコードされるヒドロキシラーゼを用いて達成され得る）で
のヒドロキシル基を含む、本発明の新規なポリケチドを生じる。また、本発明は
、組換え形態のｏｌｅＰ遺伝子を提供し、このｏｌｅＰ遺伝子を使用して、任意
の宿主細胞においてｏｌｅＰ遺伝子産物を発現させ得る。従って、ｏｌｅＰ遺伝
子を発現するように改変された宿主細胞（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ宿
主細胞またはＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｅｒｙｔｈｒａｅａ宿主細
胞）を使用して、オレアンドマイシンに存在するＣ−８−Ｃ−８ａエポキシドを
含むポリケチドを生成し得る。従って、本発明は、このような改変型ポリケチド
を提供する。これらの位置でのヒドロキシル基の存在は、ヒドロキシル化されな
いその対応物と比較して、得られた化合物の抗生物質活性を増強し得る。
【０１１６】 ポリケチドをグリコシル化するための方法は、一般に、当該分野で公知であり
；グリコシル化は、適切なグリコシル化酵素を提供することによって細胞内でも
たらされ得るか、または本明細書中およびＰＣＴ公開番号ＷＯ９８／４９３１５
（本明細書中に参考として援用される）に記載の化学的合成手段を使用してイン
ビトロでもたらされ得る。好ましくは、デソサミンを用いたグリコシル化は、本
発明の方法に従って、本発明により提供された組換え宿主細胞中でもたらされる
。一般に、グリコシル化をもたらすためのアプローチは、ヒドロキシル化に関す
る上記のアプローチを反映する。天然の供給源から単離されたか、または組換え
生成された、精製された酵素は、インビトロで使用され得る。あるいは、そして
上記のように、グリコシル化は、内因的もしくは組換え生成された細胞内グリコ
シルトランスフェラーゼを使用して細胞内でもたらされ得る。さらに、化学合成
方法が利用され得る。
【０１１７】 抗生物質モジュール型ポリケチドは、任意の多くの異なる糖を含み得るが、Ｄ
−デソサミンまたはそれらの密接なアナログが、最も一般的である。エリスロマ
イシン、ピクロマイシン、ナルボマイシンおよびメチマイシンは、デソサミンを
含む。エリスロマイシンはまた、Ｌ−クラジノース（３−Ｏ−メチルマイカロー
ス（ｍｙｃａｒｏｓｅ））を含む。タイロシンは、マイカミノース（ｍｙｃａｍ
ｉｎｏｓｅ）（４−ヒドロキシデソサミン）、マイカロースおよび６−デオキシ
−Ｄ−アロースを含む。２−アセチル−１−ブロモデソサミンは、ドナーとして
用いられて、ポリケチドをグリコシル化した（Ｍａｓａｍｕｎｅら、１９７５、
Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９７：３５１２−３５１３）。他の明らかにより
安定なドナーとしては、グリコシルフルオライド、チオグリコシド、およびトリ
クロロアセトイミデート（ｔｒｉｃｈｌｏｒｏａｃｅｔｉｍｉｄａｔｅ）が挙げ
られる；Ｗｏｏｄｗａｒｄら、１９８１、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０３
：３２１５；Ｍａｒｔｉｎら、１９９７、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１９
：３１９３；Ｔｏｓｈｉｍａら、１９９５、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１
７：３７１７；Ｍａｔｓｕｍｏｔｏら、１９８８、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌ
ｅｔｔ．２９：３５７５を参照のこと。グリコシル化はまた、先の節に議論され
るように、開始物質としてポリケチドアグリコンを使用して、そして変換を行う
ためにＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｅｒｙｔｈｒａｅａまたはＳｔｒ
ｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅあるいは他の宿主細胞を使用して、
好ましくは、マクロライドを合成できない変異体を使用して、もたらされ得る。
【０１１８】 従って、広範な種々のポリケチドが、本発明のハイブリッドＰＫＳ酵素によっ
て生成され得る。これらのポリケチドは、以下の節において記載されるように、
抗生物質としておよび他の有用な化合物の合成における中間体として有用であり
得る。
【０１１９】 （第ＩＶ節：化合物） 本発明の方法および組換えＤＮＡ化合物は、ポリケチドの生成において有用で
ある。重要な局面において、本発明は、オレアンドマイシンおよびエリスロマイ
シン（両方とも、強力な抗生物質化合物である）に構造的に関連する抗生物質化
合物を作製するための方法を提供する。本発明はまた、細菌の抗生物質耐性株に
対する活性に起因する、重要な目的の強力な抗生物質活性を有するポリケチド化
合物である、新規ケトライド化合物を提供する。Ｇｒｉｅｓｇｒａｂｅｒら、１
９９６、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．４９：４６５−４７７（本明細書中に参考とし
て援用される）を参照のこと。今日までに調製されたケトライドの全てではなく
とも大部分が、中間体としてエリスロマイシンＡ（６−ｄＥＢの誘導体）を使用
して合成されている。本発明は、６−ｄＥＢとは構造が異なるポリケチドを生成
するハイブリッドＰＫＳを提供するが、本発明はまた、伝統的な６−ｄＥＢ由来
およびエリスロマイシン由来のケトライド化合物を調製するにおいて有用な中間
体を作製する方法もまた提供する。
【０１２０】 ６−ｄＥＢは、１３−メチル基に代わって１３−エチル基を含むという点で、
オレアンドライドとは一部異なるので、オレアンドライドＰＫＳに基づく本発明
の新規なハイブリッドＰＫＳ遺伝子は、それらが１３−エチル基に代わって１３
−メチルを有するという点でのみ、公知のケトライドとは異なる多くの新規なケ
トライドを提供する。従って、本発明は、例えば、Ｇｒｉｅｓｇｒａｂｅｒら、
前出；Ａｇｏｕｒｉｄａｓら、１９９８、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４１：４０８
０−４１００、米国特許第５，７７０，５７９号；同第５，７６０，２３３号；
同第５，７５０，５１０号；同第５，７４７，４６７号；５，７４７，４６６号
；同第５，６５６，６０７号；同第５，６３５，４８５号；同第５，６１４，６
１４号；同第５，５５６，１１８号；同第５，５４３，４００号；同第５，５２
７，７８０号；同第５，４４４，０５１号；同第５，４３９，８９０号；同第５
，４３９，８８９号；ならびにＰＣＴ公開番号ＷＯ９８／０９９７８およびＷＯ
９８／２８３１６（これらの各々は、本明細書中に参考として援用される）に記
載される、ケトライドの１３−メチルアナログならびに中間体化合物および前駆
体化合物を提供する。
【０１２１】 上記のように、本発明のハイブリッドＰＫＳ遺伝子は、デソサミン生合成遺伝
子およびデソサミニルトランスフェラーゼ遺伝子ならびに必要とされるヒドロキ
シラーゼ遺伝子を含む宿主細胞において発現され得、これらの遺伝子は、ｐｉｃ
Ｋ（Ｃ−１２位について）またはｅｒｙＫ（Ｃ−１２位について）および／また
はｅｒｙＦ（Ｃ−６位について）のいずれかであり得る。得られる化合物は、上
記で引用される特許公報において記載されるように、抗生物質活性を有するが、
さらに改変されて、改善された特性または他の所望される特性を有する所望の化
合物を生成し得る。あるいは、アグリコン化合物は、組換え宿主細胞において産
生され得、そして所望のグリコシル化工程およびヒドロキシル化工程は、インビ
トロまたはインビボで行われる（後者の場合、変換する細胞にアグリコンを供給
することによる）。
【０１２２】 従って、本発明の化合物は、以下の式（１）において示される、必要に応じて
グリコシル化された形態のポリケチドであり、ここで、Ｃ−６もしくはＣ−１２
のいずれか、または両方でヒドロキシル化される。式（１）の化合物は、本明細
書中に記載されるようなハイブリッド形態で改変または調製された、モジュール
型ＰＫＳのローディングモジュールおよび６つの拡張モジュールを使用して調製
され得る。これらのポリケチドは、以下の式を有し：
【０１２３】
【化４】 そのグリコシル化および単離された立体異性体形態を含み； ここでＲ*は、１〜１５Ｃの直鎖、分枝または環状、飽和または不飽和、置換
または非置換のヒドロカルビル（ｈｙｄｒｏｃａｒｂｙｌ）であり； Ｒ1〜Ｒ6の各々は、独立してＨまたはアルキル（１〜４Ｃ）であり、ここでＲ 1 での任意のアルキルは必要に応じて置換され得； Ｘ1〜Ｘ5の各々は、独立して２つのＨ、ＨおよびＯＨ、または＝Ｏであり；あ
るいは Ｘ1〜Ｘ5の各々は、独立してＨであり、そして式（２）の化合物は、２〜３、
４〜５、６〜７、８〜９および／または１０〜１１で、上記Ｘの位置に隣接する
環において二重結合を含み； ただし： Ｒ1〜Ｒ6のうちの少なくとも２つは、アルキル（１〜４Ｃ）である。
【０１２４】 式２を含む好ましい化合物は、Ｒ1〜Ｒ5のうちの少なくとも３つがアルキル（
１〜４Ｃ）、好ましくはメチルまたはエチルであり；より好ましくは、Ｒ1〜Ｒ5 のうちの少なくとも４つはアルキル（１〜４Ｃ）、好ましくはメチルまたはエチ
ルである化合物である。Ｘ2が２つのＨ、＝Ｏ、もしくはＨおよびＯＨであり、
そして／またはＸ3がＨであり、そして／またはＸ1がＯＨであり、そして／また
はＸ4がＯＨであり、そして／またはＸ5がＯＨである化合物もまた好ましい。Ｒ 1 〜Ｒ5がメチルであり、Ｘ2が＝Ｏであり、そしてＸ1、Ｘ4およびＸ5がＯＨであ
る場合に可変のＲ*を有する化合物もまた好ましい。前述のグリコシル化形態も
また好ましい。上記のグリコシル化形態もまた好ましく；グリコシル残基は、Ｃ
−３、Ｃ−５、および／またはＣ−６に結合され得；エポキシド形態もまた、含
まれる（すなわち、Ｃ−８−Ｃ−８ａでのエポキシド）。
【０１２５】 上記のように、本明細書中に記載されるような化合物を改変して、有用な活性
を有するか、または有用な活性を有するように容易に改変され得る化合物を提供
し得る、広範な種々の異なる生物体が存在する。例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏ
ｌｙｓｐｏｒａ ｅｒｙｔｈｒａｅａは、オレアンドライドおよび６−ｄＥＢを
、種々の有用な化合物に変換し得る。本発明によって提供される化合物は、Ｓａ
ｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｅｒｙｔｈｒａｅａの培養物から提供され得
、そして以下の実施例６に提供される手順に従って、エリスロマイシンＡ、Ｂ、
ＣおよびＤの対応する誘導体に変換され得る。所望の化合物のみが生成されるこ
とを確実にするために、６−ｄＥＢを生成し得ないが、所望の変換をなお行い得
るＳ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ ｅｒｙＡ変異体を使用し得る。（Ｗｅｂｅｒら、１
９８５、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６４（１）：４２５−４３３）。また、他
の変異株（例えば、ｅｒｙＢ、ｅｒｙＣ、ｅｒｙＧおよび／またはｅｒｙＫ変異
体）、または複数の遺伝子において変異を有する変異株を使用して、好適な化合
物を蓄積し得る。この変換はまた、商業生産のための大規模発酵においても行わ
れ得る。エリスロマイシンＡ、Ｂ、ＣおよびＤの各々は、抗生物質活性を有する
が、エリスロマイシンＡが、最も高い抗生物質活性を有する。さらに、これらの
化合物の各々は、穏やかな酸での処理下で、モチライド（ｍｏｔｉｌｉｄｅ）活
性を有するＣ−６〜Ｃ−９のヘミケタールを形成し得る。モチライド活性を有す
るヘミケタールの形成のために、エリスロマイシンＢ、ＣおよびＤが好ましい。
なぜなら、Ｃ−１２ヒドロキシルの存在が、Ｃ−９〜Ｃ−１２の間で形成された
ヘミケタールを有する不活性な化合物の形成を可能にするからである。
【０１２６】 従って、本発明は、Ｓａｃｃｈａｒｐｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｅｒｙｔｈｒａ
ｅａおよびＳ．ｅｒｙｔｈｒａｅａの変異株に内因性の酵素の作用による、本発
明の化合物のヒドロキシル化およびグリコシル化によって生成された化合物を提
供する。このような化合物は、直接的に、または化学修飾後に、抗生物質または
モチライドとして有用である。抗生物質としての使用のために、本発明の化合物
は、さらなる化学修飾を伴わずに直接的に使用され得る。エリスロマイシンＡ、
Ｂ、ＣおよびＤは、全て抗生物質活性を有し、そしてＳａｃｃｈａｒｐｏｐｏｌ
ｙｓｐｏｒａ ｅｒｙｔｈｒａｅａによって修飾されている化合物から生じる本
発明の対応する化合物もまた、抗生物質活性を有する。しかし、これらの化合物
は、化学修飾され、強力な抗生物質活性を有する他の化合物を提供し得る。例え
ば、エリスロマイシンのＣ−６ヒドロキシルでのアルキル化を使用して、強力な
抗生物質（クラリスロマイシンはＣ−６−Ｏメチルである）を生成し得、そして
他の有用な改変は、例えば、Ｇｒｉｅｓｇｒａｂｅｒら、１９９６、Ｊ．Ａｎｔ
ｉｂｉｏｔ．４９：４６５−４７７、Ａｇｏｕｒｉｄａｓら、１９９８、Ｊ．Ｍ
ｅｄ．Ｃｈｅｍ．４１：４０８０−４１００、米国特許第５，７７０，５７９号
；同第５，７６０，２３３号；同第５，７５０，５１０号；同第５，７４７，４
６７号；５，７４７，４６６号；同第５，６５６，６０７号；同第５，６３５，
４８５号；同第５，６１４，６１４号；同第５，５５６，１１８号；同第５，５
４３，４００号；同第５，５２７，７８０号；同第５，４４４，０５１号；同第
５，４３９，８９０号；および同第５，４３９，８８９号；ならびにＰＣＴ公開
番号ＷＯ９８／０９９７８およびＷＯ９８／２８３１６（これらの各々は、本明
細書中に参考として援用される）に記載される。
【０１２７】 モチライドとしての使用のために、本発明の化合物は、さらなる化学修飾を伴
わずに直接的に使用され得る。エリスロマイシンおよび特定のエリスロマイシン
アナログは、モチリンレセプターの強力なアゴニストであり、これは、移動運動
（ｍｉｇｒａｔｉｎｇ ｍｏｔｏｒ）複合体のフェーズＩＩＩを誘導するため、
ＧＥＲＤを罹患する患者において、食道ぜん動およびＬＥＳ圧力を増加させるた
め、胃の不全麻痺を罹患する患者において胃排出を加速するため、ならびに胆石
除去後および自律神経性ニューロパシーを伴う糖尿病患者において、胆嚢収縮を
刺激するための運動原性（ｐｒｏｋｉｎｅｔｉｃ）薬剤として、臨床的に使用さ
れ得る。Ｐｅｅｔｅｒｓ、１９９９、Ｍｏｔｉｌｉｄｅ Ｗｅｂ Ｓｉｔｅ，ｈ
ｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｅｄ．ｋｕｌｅｕｖｅｎ．ａｃ．ｂｅ／ｍｅｄ／ｇｉｈ
／ｍｏｔｉｌｉｄ．ｈｔｍ、およびＯｍｕｒａら、１９８７、Ｍａｃｒｏｌｉｄ
ｅｓ ｗｉｔｈ ｇａｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｍｏｔｏｒ ｓｔｉｍｕｌ
ａｔｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３０：１９４１−３を
参照のこと。Ｓａｃｃｈａｒｐｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｅｒｙｔｈｒａｅａによ
って修飾されている本発明の化合物から生じる本発明の対応する化合物はまた、
モチライド活性を有し、これは、特に、穏やかな酸での処理によってＣ−６〜Ｃ
−９のヘミケタールへの変換（インビボでも生じ得る）後に、モチライド活性を
有する。Ｃ−１２ヒドロキシルを欠失するこれらの化合物は、モチリンアゴニス
トとしての使用に特に好ましい。しかし、これらの化合物はまた、さらに化学修
飾されて、強力なモチライド活性を有する本発明の他の化合物を提供し得る。
【０１２８】 さらに、そしてまた上述のように、本発明の化合物をヒドロキシル化および／
またはグリコシル化するために使用され得る、他の有用な生物体が存在する。上
記のように、生物体は、その生物体において通常産生されるポリケチドを産生し
得ない変異体であり得、発酵は、プレート上または大きな発酵槽において実施さ
れ得、そして産生された化合物は、発酵後に化学的に変更され得る。Ｓａｃｃｈ
ａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｅｒｙｔｈｒａｅａに加えて、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙ
ｃｅｓ ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ、Ｓ．ｎａｒｂｏｎｅｓｉｓ、Ｓ．ａｎｔｉｂｉ
ｏｔｉｃｕｓ、Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｍｅｇａｌｏｍｉｃｅａ、Ｓ．
ｆｒａｄｉａｅおよびＳ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓもまた使用され得る。
抗生物質活性に加えて、Ｍ．ｍｅｇａｌｏｍｉｃｅａ酵素での処理により生成さ
れる本発明の化合物は、同様に駆虫性活性を有し得る。従って、本発明は、Ｓ．
ｅｒｙｔｈｒａｅａ、Ｓ．ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ、Ｓ．ｎａｒｂｏｎｅｓｉｓ、
Ｓ．ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ、Ｍ．ｍｅｇａｌｏｍｉｃｅａ、Ｓ．ｆｒａｄｉ
ａｅおよびＳ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓに対して内在性の酵素の作用によ
るヒドロキシル化およびグリコシル化によって産生される化合物を提供する。
【０１２９】 本発明はまた、目的の宿主細胞において直接的に、本発明のグリコシル化およ
び／またはヒドロキシル化化合物を産生するための、方法および遺伝的構築物を
提供する。従って、本発明の組換え遺伝子（これは、１つ以上の欠失および／ま
たは挿入（異種ＰＫＳ遺伝子由来の遺伝子フラグメントでのｏｌｅＡ遺伝子フラ
グメントの置換を含む）を伴う、組換えｏｌｅＡＩ遺伝子、組換えｏｌｅＡＩＩ
遺伝子、および組換えｏｌｅＡＩＩＩ遺伝子を含む）は、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏ
ｌｙｓｐｏｒａ ｅｒｙｔｈｒａｅａ、Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｍｅｇ
ａｌｏｍｉｃｅａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ、Ｓ
．ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ、Ｓ．ｎａｒｂｏｎｅｓｉｓ、Ｓ．ｆｒａｄｉａｅおよ
びＳ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓにおける、コード遺伝子産物の発現に適切
な発現ベクター上に含まれ得る。
【０１３０】 本発明の多くの化合物は１つ以上のキラル中心を含み、そしてすべての立体異
性体が、純粋な化合物ならびに立体異性体の混合物として、本発明の範囲内に含
まれる。従って、本発明の化合物は、任意の比率の立体異性体の混合物として供
給され得る。
【０１３１】 本発明の化合物は、本発明の宿主細胞を、他のポリケチドの生成について当該
分野において公知の条件下で増殖および発酵させることによって生成され得る。
本発明の化合物は、標準的な手順によって、これらの培養された細胞の発酵ブロ
スから単離され得、そして精製され得る。この化合物は、本発明の薬学的組成物
を提供するように容易に処方され得る。本発明の薬学的組成物は、薬学的製剤の
形態（例えば、固体形態、半固体形態、または液体形態）で使用され得る。この
製剤は、活性成分としての本発明の化合物のうちの１つ以上を、外部適用、腸内
適用または非経口適用に適切な有機または無機のキャリアまたは賦形剤との混合
物において含む。この活性成分は、例えば、錠剤、ペレット、カプセル、坐剤、
溶液、エマルジョン、懸濁液、および使用に適切な任意の他の形態のための通常
の非毒性の薬学的に受容可能なキャリアと混合され得る。
【０１３２】 使用され得るキャリアとしては、固体形態、半固体形態、または液状形態の、
水、グルコース、ラクトース、アカシアゴム、ゼラチン、マンニトール、デンプ
ンペースト、三ケイ酸マグネシウム、タルク、コーンスターチ、ケラチン、コロ
イド状シリカ、ジャガイモデンプン、尿素、および製剤を製造する際の用途に適
切な他のキャリアが挙げられる。さらに、補助安定化剤、肥厚剤（ｔｈｉｃｋｅ
ｎｉｎｇ）、ならびに着色剤および香料が使用され得る。例えば、本発明の化合
物は、本質的に米国特許第４，９１６，１３８号（本明細書中において参考とし
て援用される）中に記載されるようなヒドロキシプロピルメチルセルロースとと
もに、または本質的にＥＰＯ特許公報第４２８，１６９号（本明細書中において
参考として援用される）に記載されるような界面活性剤とともに利用され得る。
【０１３３】 経口投薬形態は、本質的にＨｏｎｄｏら、１９８７、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａ
ｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ＸＩＸ、補遺６：１７〜２２（本明細書中
において参考として援用される）によって記載されるように調製され得る。外部
適用のための投薬形態は、本質的にＥＰＯ特許公報第４２３，７１４号（本明細
書中において参考として援用される）中に記載されるように調製され得る。活性
化合物は、疾患のプロセスまたは状態に対する所望の効果を生じるに十分な量で
、薬学的組成物中に含まれる。
【０１３４】 感染によって引き起こされる状態および疾患の処置のために、本発明の化合物
は、従来の非毒性の薬学的に受容可能なキャリア、アジュバントおよびビヒクル
を含む投薬量単位処方物において、経口的に、局所的に、非経口的に、吸入スプ
レーによって、または直腸的に投与され得る。本明細書中で使用される場合、用
語非経口には、皮下注射、ならびに静脈内、筋肉内、および胸骨内への注射また
は注入技術が含まれる。
【０１３５】 本発明の化合物の投薬量レベルは、１日あたり体重１ｋｇあたり約０．０１ｍ
ｇ〜約５０ｍｇ、好ましくは１日あたり体重１ｋｇあたり約０．１ｍｇ〜約１０
ｍｇのオーダーである。投薬量レベルは、上記状態の処置において有用である（
１日あたり１患者あたり約０．７ｍｇ〜約３．５ｍｇ（７０ｋｇの患者を想定）
）。さらに、本発明の化合物は、周期（ｉｎｔｅｒｍｉｔｔｅｎｔ）に基づいて
、すなわち半週間隔、週間隔、半月間隔または月間隔で投与され得る。
【０１３６】 単回投薬形態を生じるようにキャリア物質と組み合わせられ得る活性成分の量
は、処置される宿主および特定の投与様式に依存して変化する。例えば、ヒトへ
の経口投与が意図される処方物は、０．５ｍｇ〜５ｇの活性剤を含み得、これは
、キャリア物質の適切かつ都合のよい量（これは、全組成物の約５パーセント〜
約９５パーセントで変動し得る）と混合されている。投薬単位形態は、一般には
、約０．５ｍｇ〜約５００ｍｇの活性成分を含む。外部投与のために、本発明の
化合物は、例えば０．００００１重量％〜６０重量％、好ましくは０．００１重
量％〜１０重量％、および最も好ましくは約０．００５重量％〜０．８重量％の
範囲内で処方され得る。
【０１３７】 しかし、任意の特定の患者についての特定の用量レベルは、種々の因子に依存
することが理解される。これらの因子には、以下が挙げられる：使用される特定
の化合物の活性；被験体の年齢、体重、全身の健康状態、性別および常食；投与
の時間および経路ならびに薬物の排出の速度；薬物の組合せがその処置において
使用されるか否か；ならびに治療が求められる特定の疾患または状態の重篤度。
【０１３８】 本発明の化合物は、単一の治療剤としてか、または他の治療剤と組み合わせて
使用され得る。本発明の化合物と通常組み合わせられ得る薬物としては、１つ以
上の抗生物質またはモチライド薬剤が挙げられる。
【０１３９】 本発明の詳細な説明が上記に提供された。以下の実施例は、本発明の例示の目
的のために提供される。そして本発明の範囲すなわち特許請求の範囲に対する限
定として解釈されない。
【０１４０】 （実施例１） （一般的な方法論） （細菌株、プラスミドおよび培養条件） ＷＯ９５／０８５４８（１９９５年
３月３０日公開）に記載されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏ
ｒ ＣＨ９９９、またはＺｉｅｒｍａｎｎおよびＢｅｔｌａｃｈ，９９年１月、
Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ：Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｉｍｐｒｏｖｅｄ
Ｈｏｓｔ Ｓｔｒａｉｎｓ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２６：１０６〜１
１０（本明細書中で参考として援用される）に記載されたＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓ
Ｋ４−１１４またはＫ４−１５５を、発現宿主として使用した。ＤＮＡ操作を
、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ
ｅから入手可能）において行った。Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＣ１０６１もまた、プラス
ミド操作のための宿主としての使用に適切である。プラスミドを、Ｅ．ｃｏｌｉ
ＥＴ１２５６７（ｄａｍ ｄｃｍ ｈｓｄＳ Ｃｍr）（ＭａｃＮｅｉｌ，１
９８８，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７０：５６０７（本明細書中で参考として
援用される））で継代し、Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒまたはＳａｃｃｈａｒｏｐ
ｏｌｙｓｐｏｒａ ｅｒｙｔｈｒａｅａの形質転換前に非メチル化ＤＮＡを生成
した。Ｅ．ｃｏｌｉ株を、標準的な条件下で増殖させた。Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌ
ｏｒ株を、Ｒ２ＹＥアガープレート上で増殖させた（Ｈｏｐｗｏｏｄら、Ｇｅｎ
ｅｔｉｃ ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ．Ａ
ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ．Ｔｈｅ Ｊｏｈｎ Ｉｎｎｅｓ Ｆｏｕ
ｎｄａｔｉｏｎ：Ｎｏｒｗｉｃｈ，１９８５（本明細書中で参考として援用され
る））。
【０１４１】 実施例において例示される本発明の発現ベクターの多くは、ＷＯ９５／０８５
４８（本明細書中において参考として援用される）に記載されるプラスミドｐＲ
Ｍ５に由来する。このプラスミドは、ｃｏｌＥＩレプリコン、適切に短縮化され
たＳＣＰ２*Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓレプリコン、二方向クローニングを可能
にする２つのａｃｔプロモーター（ａｃｔＩおよびａｃｔＩＩＩプロモーター）
、増殖期から定常期への移行の間にａｃｔプロモーターからの転写を誘導するａ
ｃｔＩＩ−ＯＲＦ４アクチベーターをコードする遺伝子、および適切なマーカー
遺伝子を含む。このプラスミド中の操作された制限部位は、天然に存在するＰＫ
Ｓの個々のドメインをコードするカセットから開始する、ＰＫＳ遺伝子クラスタ
ーのコンビナトリアル構築を容易にする。プラスミドｐＲＭ５がＰＫＳの発現の
ために使用される場合、すべての関連する生合成遺伝子がプラスミドで運ばれ得
、従ってＥ．ｃｏｌｉにおける容易な操作および変異誘発を受け入れる。このプ
ラスミドはまた、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ宿主細胞における使用に適切である
。Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓは、遺伝子学的および生理学的に十分に特徴付けら
れており、そしてほとんどのポリケチドのインビボ産生に必要とされる補助的な
活性を発現する。プラスミドｐＲＭ５は、ＰＫＳ遺伝子発現のためにａｃｔプロ
モーターを利用し、その結果、ポリケチドが二次代謝物様の様式で産生され、そ
れによってインビボにおける潜在的な生物活性化合物を合成する毒性効果を軽減
する。
【０１４２】 （ＤＮＡおよび生物の操作）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を、酵素製造業
者によって推奨される条件下で、Ｐｆｕポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ；
Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＣｅｔｕｓからのＴａｑポリメラーゼもまた使用さ
れ得る）を用いて行った。標準的なインビトロ技術を、ＤＮＡ操作のために使用
した（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（現行版））。Ｅ．ｃｏｌｉを、標準的な塩化カ
ルシウムに基づく方法を用いて形質転換した；Ｂｉｏ−Ｒａｄによって提供され
たＢｉｏ−Ｒａｄ Ｅ．ｃｏｌｉパルシング装置およびプロトコルもまた使用さ
れ得た。Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒを、標準的な手順によって形質転換し（Ｈｏ
ｐｗｏｏｄら、Ｇｅｎｅｔｉｃ ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｔｒｅｐ
ｔｏｍｙｃｅｓ．Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ．Ｔｈｅ Ｊｏｈｎ
Ｉｎｎｅｓ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ：Ｎｏｒｗｉｃｈ，１９８５）、そしてい
ずれの選択マーカーを使用したかに依存して、形質転換体を、１ｍＬの１．５ｍ
ｇ／ｍＬチオストレプトンオーバーレイ、１ｍＬの２ｍｇ／ｍＬアプラマイシン
オーバーレイ、または両方を使用して選択した。
【０１４３】 （実施例２） （Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓからのオレアンドマ
イシン生合成遺伝子クラスターのクローニング） ゲノムＤＮＡ（１００μｇ）を、標準的な手順を使用して、Ｓｔｒｅｐｔｏｍ
ｙｃｅｓ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ（ＡＴＣＣ １１８９１）のオレアンドマ
イシン産生株から単離した。ゲノムＤＮＡを、制限酵素Ｓａｕ３ＡＩで部分的に
消化して、約４０ｋｂｐ長のフラグメントを生成し、これを制限酵素ＸｂａＩお
よびＢａｍＨＩで消化した市販のＳｕｐｅｒｃｏｓTMコスミドベクター中にクロ
ーン化して、ゲノムライブラリーを生成した。ＳｕｐｅｒＣｏｓＩTM（Ｓｔｒａ
ｔａｇｅｎｅ）ＤＮＡコスミドアームを、製造業者によって指示されるように調
製した。コスミドライブラリーは、２．５μｇの消化されたゲノムＤＮＡを１．
５μｇのコスミドアームと２０μＬ反応において連結することによって調製され
た。１マイクロリットルの連結混合物を、ＧｉｇａｐａｃｋＩＩＩ ＸＬパッケ
ージング抽出キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ ＸＬ１
−Ｂｌｕｅ ＭＲ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）において増殖させた。
【０１４４】 次いで、オレアンドライドＰＫＳの拡張モジュール５および６から開始すると
仮定されるＫＳドメインの公知の配列に対して相補的なプライマーを使用して、
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓのＤＮＡからＰＣＲによ
り生成された放射性標識化プローブを用いて、このライブラリーを探索した。こ
の探索により約３０個の異なるコロニーが同定された。これをプールし、再プレ
ートし、そして再度探索して、９個のコスミドの同定を得た。これらの後者のコ
スミドを単離し、そして市販のＥ．ｃｏｌｉ株ＸＬ−１ Ｂｌｕｅに形質転換し
た。プラスミドＤＮＡを単離し、そして制限酵素消化によって分析した。これに
より、ＰＫＳ遺伝子クラスターの全体が、同定されたコスミドの２つにおける重
複したセグメントに含まれることが明らかとなった。Ｔ３プライマーを使用する
ＤＮＡ配列分析は、所望のＤＮＡが単離されたことを示した。
【０１４５】 これらのコスミドおよびこのコスミドから調製されたサブクローンのさらなる
分析は、種々のオレアンドライドＰＫＳ ＯＲＦ、これらのＯＲＦにおけるモジ
ュール、およびオレアンドマイシン改変酵素のコード配列の位置の同定を容易に
した。これらの遺伝子およびモジュールの位置を、図１に示す。図１は、完全な
オレアンドライドＰＫＳ遺伝子クラスターが、コスミドｐＫＯＳ０５５−１（約
４３ｋｂの挿入物サイズ）およびｐＫＯＳ０５５−５（約４７ｋｂの挿入物サイ
ズ）の挿入物ＤＮＡ内に含まれることを示す。これらのコスミドの各々を、ブダ
ペスト条約の規定に従って、アメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託し
た（コスミドｐＫＯＳ０５５−１は、受託番号ＡＴＣＣ ２０３７９８の下で入
手可能であり；コスミドｐＫＯＳ０５５−５は、受託番号ＡＴＣＣ ２０３７９
９の下で入手可能である）。従って、本発明の種々のさらなる試薬は、これらの
コスミドから単離され得る。ＤＮＡ配列分析をまた、本明細書中に記載のように
、本発明の種々のサブクローンに対して実施した。
【０１４６】 （実施例３） （Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｅｒｙｔｈｒａｅａにおけるオレア
ンドライド／ＤＥＢＳハイブリッドＰＫＳの発現） 本実施例は、ファージｐｈｉＣ３１接着およびこのプラスミドに存在する組込
み機能に起因してＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｅｒｙｔｈｒａｅａの
染色体中に組込み得、そしてｅｒｍＥ*プロモーターの制御下でｏｌｅＡＩ遺伝
子産物の発現を駆動し得る、発現ベクターであるプラスミドｐＫＯＳ０３９−１
１０の構築を記載する。プラスミドｐＫＯＳ０３９−１１０の制限部位および機
能マップを、添付の図面の図３に示す。天然でｅｒｙＡ遺伝子産物を生成する宿
主細胞におけるｏｌｅＡＩ遺伝子産物の発現は、ｏｌｅＡＩ、ｅｒｙＡＩＩ、お
よびｅｒｙＡＩＩＩ遺伝子産物からなる本発明の機能的ハイブリッドＰＫＳの形
成、および付随する１３−メチルエリスロマイシンの生成を生じる。構築物にお
いて使用される特定のプラスミドおよびベクターを本明細書中に記載するが、当
業者は、本発明の等価な発現ベクターが、公的に利用可能な物質およびＡＴＣＣ
に寄託された本発明のコスミドを含むｏｌｅＡ遺伝子から容易に構築され得るこ
とを認識する。
【０１４７】 プラスミドｐＫＯＳ０３９−９８は、ＰａｃＩについての制限酵素認識部位、
Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列ならびにＮｄｅＩ、ＢｇｌＩＩおよびＨｉｎ
ｄＩＩＩについての制限酵素認識部位を含むポリリンカーオリゴヌクレオチドを
、ｐＵＣ１９誘導体（ｐＫＯＳ２４−４７とよばれる）に挿入することにより構
築された、都合のよい制限部位を含むクローニングベクターである。プラスミド
ｐＫＯＳ０３９−９８（本明細書中に参考として援用される、ＰＣＴ特許出願Ｗ
Ｏ ＵＳ９９／１１８１４号を参照のこと）を、制限酵素ＰａｃＩおよびＥｃｏ
ＲＩで消化し、そして以下の配列：
【０１４８】
【化５】 を有するオリゴヌクレオチドＮ３９−５１およびＮ３９−５２から構成されるポ
リリンカーに連結して（従って、これは、以下に示す順番で以下の制限酵素認識
部位を含む：ＮｄｅＩ−ＮｓｉＩ−ＸｈｏＩ−ＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩ）、プラス
ミドｐＫＯＳ０３９−１０５を得た。
【０１４９】 プラスミドｐＫＯＳ０３９−１０５を、制限酵素ＮｓｉＩおよびＥｃｏＲＩで
消化し、そして得られた大きなフラグメントを、ｏｌｅＡＩ遺伝子を含むコスミ
ドｐＫＯＳ０５５−５の１５．２ ｋｂのＮｓｉＩ−ＥｃｏＲＩ制限フラグメン
トに連結して、プラスミドｐＫＯＳ０３９−１１６を得た。プラスミドｐＫＯＳ
０３９−１１６を、制限酵素ＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、そして得られ
たｏｌｅＡＩ遺伝子を含む１５．２ｋｂのフラグメントを単離し、そしてプラス
ミドｐＫＯＳ０３９−１３４Ｂの６ｋｂ ＮｄｅＩ−ＥｃｏＲＩ制限フラグメン
トに連結して、プラスミドｐＫＯＳ０３９−１１０を得た（図３）。
【０１５０】 プラスミドｐＫＯＳ０３９−１３４Ｂは、ＰＣＴ特許出願ＷＯ ＵＳ９９／１
１８１４（前出）に記載されたｐＫＯＳ０３９−１０４の誘導体であり、これは
、後者を制限酵素ＢｇｌＩＩで消化し、そして約１０．５ｋｂのフラグメントに
連結して、ｐＫＯＳ３９−１０４Ｂを得ることにより調製した。プラスミドｐＫ
ＯＳ３９−１０４Ｂを、制限酵素ＰａｃＩで消化し、そして制限酵素ＸｂａＩで
部分的に消化した。約７．４ｋｂのフラグメントを、制限酵素ＰａｃＩおよびＡ
ｖｒＩＩで処理したＰＣＲ６１Ａ＋６２フラグメントと連結した。ＰＣＲ６１Ａ
＋６２フラグメントを、以下のＰＣＲプライマー：
【０１５１】
【化６】 を用いて生成し、そしてテンプレートは、ｐＷＨＭｌ１０４であった（Ｔａｎｇ
ら，１９９６，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ２２（５）：
８０１−８１３）。
【０１５２】 プラスミドｐＫＯＳ０３９−１１０のＤＮＡを、Ｅ．ｃｏｌｉ ＥＴ細胞を経
て、非メチル化ＤＮＡを得た。次いで、この非メチル化ＤＮＡを用いて、Ｓａｃ
ｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｅｒｙｔｈｒａｅａ細胞を形質転換した。この
Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｅｒｙｔｈｒａｅａ細胞は、ＰＫＳを非
機能性にするＤＥＢＳのモジュール１のＫＳドメインについてのｅｒｙＡＩコー
ド配列において変異を含む。得られた形質転換体は、検出可能な量の１４−デス
メチルエリスロマイシンを生成した。
【０１５３】 （実施例４：Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓにおけるオレアン
ドライド（ｏｌｅａｎｄｏｌｉｄｅ）ＰＫＳの異種発現） この実施例は、発現ベクターであるプラスミドｐＫＯＳ０３９−１３０の構築
を記載する。このプラスミドは、ＳＣＰ２*複製起点を有し、そのため、Ｓｔｒ
ｅｐｔｏｍｙｃｅｓ宿主細胞において複製し得、そしてａｃｔＩプロモーターお
よびａｃｔＩＩ−ＯＲＦ４アクチベーターの制御下でｏｌｅＡＩ、ｏｌｅＡＩＩ
、およびｏｌｅＡＩＩＩの遺伝子産物の発現を駆動し得る。プラスミドｐＫＯＳ
０３９−１３０の制限部位および機能マップを、添付した図面の図４に示す。こ
の宿主細胞におけるｏｌｅＡ遺伝子産物の発現は、ｏｌｅＡＩ、ｏｌｅＡＩＩ、
およびｏｌｅＡＩＩＩの遺伝子産物から構成される機能的オレアンドライドＰＫ
Ｓの形成ならびに８，８ａ−デオキシオレアンドライドの付随する生成を生じる
。構築物中で利用した特定のプラスミドおよびベクターは、本明細書中に記載さ
れるが、当業者は、本発明の等価な発現ベクターが、公的に入手可能な材料およ
びＡＴＣＣに寄託された、本発明のコスミドを含むｏｌｅＡ遺伝子から容易に構
築され得ることを認識する。
【０１５４】 コスミドｐＫＯＳ０５５−５の７．２ｋｂのＮｓｉＩ−ＸｈｏＩ制限フラグメ
ントをｐＫＯＳ３９−１０５にクローニングして、プラスミドｐＫＯＳ０３９−
１０６を得た。コスミドｐＫＯＳ０５５−５の８．０ｋｂ ＸｈｏＩ−ＰｓｔＩ
制限フラグメントを市販のプラスミドｐＬｉｔｍｕｓ２８にクローニングして、
プラスミドｐＫＯＳ０３９−１０７を得た。コスミドｐＫＯＳ０５５−１の１４
ｋｂ ＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＶおよび５．４ｋｂ ＥｃｏＲＶ−ＰｓｔＩの制限
フラグメントを、ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩで消化したｐＬｉｔｍｕｓ２８に連
結して、プラスミドｐＫＯＳ０３９−１１５を得た。プラスミドｐＫＯＳ０３９
−１１５由来の１９．５ｋｂ ＳｐｅＩ−ＸｂａＩ制限フラグメントを、プラス
ミドｐＲＭ５の誘導体であるｐＫＯＳ０３９−７３に挿入して、プラスミドｐＫ
ＯＳ０３９−１２９を得た。プラスミドｐＫＯＳ０３９−１１０の１５．２ｋｂ
ＰａｃＩ−ＥｃｏＲＩ制限フラグメントを、２２ｋｂ ＰａｃＩ−ＥｃｏＲＩ
制限フラグメントを置換することによりｐＫＯＳ０３９−１２９に挿入して、プ
ラスミドｐＫＯＳ０３８−１７４を得た。次いで、プラスミドｐＫＯＳ０３９−
１２９由来の１９ｋｂ ＥｃｏＲＩ制限フラグメントをｐＫＯＳ０３８−１７４
に挿入して、プラスミドｐＫＯＳ０３９−１３０を得た（図４）。これを用いて
、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ Ｋ４−１１４を形質転換した
（Ｋ４−１５５もまた用いられ得る）。得られた形質転換体は、８，８ａ−デオ
キシオレアンドライドを生成した。
【０１５５】 上記のように、本発明は、モジュール１のＫＳドメインについてのコード配列
を変異させて、活性部位のシステインを別のアミノ酸に変化させた（ＫＳ１°変
異）、組換えｏｌｅＡＩ遺伝子を提供する。この遺伝子産物を含む組換えＰＫＳ
酵素は、ＫＳ２またはＫＳ３ドメインに結合し得るジケチド（またはトリケチド
）化合物（ここで、それらは、次いで、ジケチド（またはトリケチド）を含むポ
リケチドを形成するように処理される）を提供しない限り、ポリケチドを生成し
ない。この組換えｏｌｅＡＩ遺伝子をｏｌｅＡＩＩおよびｏｌｅＡＩＩ遺伝子と
ともに用いて、組換えオレアンドライドＰＫＳを作製し得るか、またはそれらの
遺伝子の改変形態または他の天然に存在するかもしくは組換えのＰＫＳ遺伝子と
ともに使用して、ハイブリッドＰＫＳを作製し得る。
【０１５６】 ｏｌｅＡＩにおいてＫＳ１°変異を作製するために、以下のプライマーを調製
した：
【０１５７】
【化７】 これらのプライマーを用いて、ｐＫＯＳ０３９−１０６から調製したテンプレー
トＤＮＡを増幅した。プライマーＮ３９−４７およびＮ３９−４８の増幅産物を
、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＮｈｅＩで消化し、そしてプライマーＮ３９−４９
およびＮ３９−５０の増幅産物を、制限酵素ＮｈｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消
化し、そして得られた制限フラグメントを、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで
消化したプラスミドｐＬｉｔｍｕｓ２８に連結して、プラスミドｐＫＯＳ０３８
−１７９を得た。プラスミドｐＫＯＳ０３８−１７９の１．５ｋｂ ＢｓｒＧＩ
−ＢｂｖＣＩ制限フラグメントをプラスミドｐＫＯＳ０３９−１０６に挿入して
、ｐＫＯＳ０９８−２を得た。次いで、プラスミドｐＫＯＳ０９８−２の７ｋｂ
ＮｓｉＩ−ＸｈｏＩ制限フラグメントおよびプラスミドｐＫＯＳ０３９−１０
７の８ｋｂ ＸｈｏＩ−ＥｃｏＲＩ制限フラグメントを用いて、プラスミドｐＫ
ＯＳ０３９−１１０の１５．２ｋｂ ＮｓｉＩ−ＥｃｏＲＩ制限フラグメントを
置換し、所望の発現ベクターｐＫＯＳ０３９−１１０−ＫＳ１°を得た。このベ
クターは、ｅｒｍＥ*プロモーターの制御下でｏｌｅＡＩ ＫＳ １°遺伝子を
含む。
【０１５８】 組換えｏｌｅＡＩ ＫＳ １°遺伝子産物とともに完全なオレアンドライドＰ
ＫＳをコードする、本発明の発現ベクターを提供するために、ｏｌｅＡＩ ＫＳ
１°遺伝子を、プラスミドｐＫＯＳ０３９−１１０−ＫＳ１°由来のＰａｃＩ
−ＥｃｏＲＩ制限フラグメントとして単離し得、次いで、これを用いて、プラス
ミドｐＫＯＳ０３９−１３０が構築された同じ様式で、発現ベクタープラスミド
ｐＫＯＳ０３９−１３０に類似の発現ベクターを構築した。得られた発現ベクタ
ーを、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ、Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏ
ｒ、および他の適合性の宿主細胞において使用して、本明細書中に参考として援
用される、ＰＣＴ特許公開ＷＯ９９／０３９８６に記載のように、ジケチドを供
給することによりポリケチドを作製し得る。
【０１５９】 （実施例５：オレアンドマイシン／ピクロマイシンハイブリッドＰＫＳの発現
） この実施例は、発現ベクターであるプラスミドｐＫＯＳ０３９−１３３の構築
を記載する。このベクターは、ファージｐｈｉＣ３１接着およびこのプラスミド
に存在する組み込み機能に起因して、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓの染色体に組み
込まれ得、そしてａｃｔＩプロモーターおよびａｃｔＩＩ−ＯＲＦ４アクチベー
ターの制御下でｏｌｅＡＩＩＩ遺伝子産物の発現を駆動し得る。プラスミドｐＫ
ＯＳ０３９−１３３の制限部位および機能マップを、添付した図面の図５に示す
。このプラスミドを、プラスミドｐＫＯＳ０３９−８３（これは、ナルボノライ
ドＰＫＳ遺伝子であるｐｉｃＡＩおよびｐｉｃＡＩＩの発現を駆動する）ととも
にＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓ宿主細胞に導入した（ＰＣＴ特許出願ＷＯ ＵＳ９９／
１１８１４（前出）を参照のこと）。宿主細胞におけるｏｌｅＡＩＩＩならびに
ｐｉｃＡＩおよびｐｉｃＡＩＩ遺伝子産物の発現は、ｏｌｅＡＩＩＩ、ｐｉｃＡ
Ｉ、およびｐｉｃＡＩＩ遺伝子産物から構成される本発明の機能的ハイブリッド
ＰＫＳの形成ならびに３−ヒドロキシ−ナルボノライドの付随する生成を生じる
。この構築物において利用された特定のプラスミドおよびベクターは、本明細書
中に記載されるが、当業者は、本発明の等価な発現ベクターが、公的に入手可能
な材料およびＡＴＣＣに寄託された、本発明のコスミドを含むｏｌｅＡ遺伝子か
ら容易に構築され得ることを認識する。
【０１６０】 以下の２つのオリゴヌクレオチドを、ｐＳＥＴ１５２誘導プラスミドであるｐ
ＫＯＳ０３９−４２に、ｏｌｅＡＩＩＩ遺伝子を挿入するために調製した：
【０１６１】
【化８】 プラスミドｐＫＯＳ０３９−１１５を、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＡｓｃＩで消
化して、約１３．８ｋｂの制限フラグメントを得た。これを、リンカーＮ３９−
５９／Ｎ３９−６０とともに挿入して、プラスミドｐＫＯＳ０３９−１３２を得
た。プラスミドｐＫＯＳ０３９−１３２を、制限酵素ＮｄｅＩおよびＸｂａＩで
消化して、約１０．８ｋｂの制限フラグメントを得た。これを、プラスミドｐＫ
ＯＳ０３９−４２の約９ｋｂ ＮｄｅＩ−ＳｐｅＩ制限フラグメントに連結して
、プラスミドｐＫＯＳ０３９−１３３を得た（図５）。プラスミドｐＫＯＳ０３
９−１３３およびｐＫＯＳ０３９−８３を、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖ
ｉｄａｎｓ Ｋ４−１１４を同時形質転換した（Ｋ４−１５５もまた使用され得
る；ＺｉｅｒｍａｎｎおよびＢｅｔｌａｃｈ、１９９９、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑ
ｕｅｓ ２６、１０６−１１０および米国特許出願第０９／１８１，８３３号（
１９９８年１０月２８日出願）（これらの各々は、本明細書中に参考として援用
される）を参照のこと）。プロトプラストを標準的な手順を用いて形質転換し、
そして形質転換体を抗生物質を含む重層を用いて選択した。この株を、増殖／播
種および生成のために液体Ｒ５培地（２０μｇ／ｍＬ チオストレプトン含有。
Ｈｏｐｗｏｏｄら、Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｔｒ
ｅｐｔｏｍｙｃｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ；Ｊｏｈｎ Ｉ
ｎｎｅｓ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ：Ｎｏｒｗｉｃｈ，ＵＫ，１９８５（本明細書
中に参考として援用される）を参照のこと）で増殖させ、３０℃で培養した。Ｌ
Ｃ／ＭＳによる抽出物の分析により、予測された化合物である３−ヒドロキシナ
ルボノライドとして、ポリケチドの同定を確立した。
【０１６２】 （実施例６：エリスロノライドからエリスロマイシンへの変換） オレアンドライドのサンプル（約５０〜１００ｍｇ）を０．６ｍｌのエタノー
ルに溶解し、そして滅菌水で３ｍｌに希釈した。この溶液を用いて、１００ｍｍ
Ｒ２ＹＥ寒天プレート上で３０℃で増殖させたＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐ
ｏｒａ ｅｒｙｔｈｒａｅａ ＷＨＭ３４（ｅｒｙＡ変異体）の３日間培養物に
重層する。乾燥させた後、このプレートを３０℃で４日間インキュベートする。
この寒天を切り刻んで、次いで、酢酸エチル中１％のトリエチルアミンの１００
ｍｌ部分を用いて３回抽出する。この抽出物を、合わせて、エバポレートする。
粗生成物を分取用ＨＰＬＣ（Ｃ−１８逆相、１％酢酸を含む水−アセトニトリル
勾配）により精製する。画分を質量分析法により分析し、そして純粋な化合物を
含む画分をプールし、トリエチルアミンで中和し、そしてシロップ状になるまで
エバポレートする。このシロップを水に溶解し、そして等量の酢酸エチルで３回
抽出する。有機抽出物を合わせ、飽和ＮａＨＣＯ3水溶液で１回洗浄し、Ｎａ2Ｓ
Ｏ4で乾燥させ、濾過し、そしてエバポレートして、約０．１５ｍｇの生成物を
得た。この生成物は、エリスロマイシンＡ、Ｂ、Ｃ、およびＤに対応する、グリ
コシル化され、かつヒドロキシル化されたオレアンドライドであるが、６−ｄＥ
Ｂとは異なっていれば、オレアンドライドとしてそれらとは異なる。
【０１６３】 （実施例７：抗菌活性の測定） 抗菌活性を、試験生物としてＢａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓを用いたディス
ク拡散アッセイによるか、またはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏ
ｎｉａｅ感受性株および耐性株に対して、液体培養における最小阻止濃度（ＭＩ
Ｃ）の測定によるかのいずれかを用いて測定した。
【０１６４】 今や、本発明は、書面による説明および実施例により記載され、当業者は、本
発明が種々の実施形態において実施され得、そして前述の説明および実施例が例
示目的であり、そして上記の特許請求の範囲を限定するものではないことを認識
する。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、本発明のコスミドｐＫＯＳ０５５−１およびｐＫＯＳ０５５−５中の
インサートＤＮＡの、制限部位および機能地図を示す。種々の制限部位（Ｘｈｏ
Ｉ、ＣｌａＩ、ＥｃｏＲＩ）もまた示される。この図中の斜体の制限部位は、こ
のような部位のうちのすべてが示されているわけではないことを示し、示される
ＥｃｏＲＩ部位は、このＰＫＳ遺伝子セグメントが挿入されたコスミドＤＮＡに
由来する。オレアンドライドＰＫＳのモジュール１〜６のコード配列の位置が、
括弧により示され、その括弧の下に標識されている（すなわち、ｍｏｄ．２はモ
ジュール２である）。そのインサートの種々の部分のサイズ（キロベース（ｋｂ
）対で）もまた、示される。ｏｌｅＡＩ（ｏｌｅＡ１）遺伝子、ｏｌｅＡＩＩ（
ｏｌｅＡ２）遺伝子およびｏｌｅＡＩＩＩ（ｏｌｅＡ３）遺伝子についてのオー
プンリーディングフレームが、転写の方向を示す矢印として示される。
【図２】 図２は、オレアンドマイシン遺伝子クラスターの機能マップを示す。この図の
上半分において、その遺伝子の種々のオープンリーディングフレーム（ｏｌｅＩ
、ｏｌｅＮ２、ｏｌｅＲ、ｏｌｅＡＩなど）が、転写の方向を示す矢印として示
される。すぐ下に、線が、この遺伝子クラスターのサイズを塩基対（ｂｐ）で示
す。このサイズ指示線の下の英数字識別名を備えた棒は、その示した領域のヌク
レオチド配列を提供するＧｅｎＢａｎｋ登録番号を参照する。この配列情報は、
本明細書中に参考として援用される。この棒の斜線部分は、配列情報が本明細書
中に提供される遺伝子クラスターの領域を示す。この図の下半分は、オレアンド
ライドＰＫＳタンパク質が矢印として示され、このＰＫＳのモジュールの位置が
下に示され、そしてこの分子の種々のドメインがこの分子の下に示される。
【図３】 図３は、上記実施例３に記載される、プラスミドｐＫＯＳ０３９−１１０の制
限部位および機能地図を示す。このプラスミドは、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓお
よび他の宿主細胞の染色体に組み込み得る発現ベクターであり（ｐｈｉＣ３１ベ
ースの結合および組み込み機能）、そしてｏｌｅＡＩ遺伝子の発現を駆動するよ
うに配置された、ｅｒｍＥ*プロモーターを含む。
【図４】 図４は、上記実施例４に記載される、プラスミドｐＫＯＳ０３９−１３０の制
限部位および機能地図を示す。このプラスミドは、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ宿
主細胞において複製する発現ベクターであり（ＳＣＰ２*の複製起点）、そして
ｏｌｅＡＩ遺伝子、ｏｌｅＡＩＩ遺伝子およびｏｌｅＡＩＩＩ遺伝子の発現を駆
動するように配置された、ａｃｔＩプロモーターおよびａｃｔＩＩ−ＯＲＦ４ア
クチベーターを含む。
【図５】 図５は、上記実施例５に記載される、プラスミドｐＫＯＳ０３９−１３３の制
限部位および機能地図を示す。このプラスミドは、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓお
よび他の宿主細胞の染色体に組み込み得る発現ベクターであり（ｐｈｉＣ３１ベ
ースの結合および組み込み機能）、そしてｏｌｅＡＩＩＩ遺伝子の発現を駆動す
るように配置された、ａｃｔＩプロモーターおよびａｃｔＩＩ−ＯＲＦ４アクチ
ベーターを含む。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:465） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，Ｊ Ｐ (72)発明者 シャー， サンジェイ クリシュナカント アメリカ合衆国 カリフォルニア 94521， コンコルド， スウィートシュラブ コ ート 4499 (72)発明者 マクダニエル， ロバート アメリカ合衆国 カリフォルニア 94306， パロ アルト， マタデロ アベニュー 698 (72)発明者 タング， リー アメリカ合衆国 カリフォルニア 94404， フォスター シティ， ファスター シ ティ ブールヴァード 1167−３ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA03 BA07 BA67 BA80 CA03 CA09 CA20 DA08 EA04 FA02 GA11 GA25 HA13 HA14 4B064 AF54 CA04 CA19 CC01 CC24 DA02 DA16 4B065 AA50X AA50Y AB01 AC14 BA16 CA18 CA43 CA44

Claims (20)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 オレアンドライドポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）のローデ
    ィングモジュールまたは拡張モジュール１〜４のいずれか１つのドメインについ
    てのコード配列を含む、単離された組換えＤＮＡ化合物。
  2. 【請求項２】 前記ドメインが、チオエステラーゼドメイン、ＫＳQドメイ
    ン、ＡＴドメイン、ＫＳドメイン、ＡＣＰドメイン、ＫＲドメイン、ＤＨドメイ
    ン、およびＥＲドメインからなる群から選択される、請求項１に記載の単離され
    た組換えＤＮＡ化合物。
  3. 【請求項３】 前記オレアンドライドＰＫＳのローディングモジュールなら
    びに拡張モジュール１および２についてのコード配列を含む、請求項２に記載の
    単離された組換えＤＮＡ化合物。
  4. 【請求項４】 前記ローディングモジュールおよび６つすべての拡張モジュ
    ールについてのコード配列を含む、請求項２に記載の単離された組換えＤＮＡ化
    合物。
  5. 【請求項５】 プロモーターに作動可能に連結されたオレアンドライドポリ
    ケチドシンターゼ（ＰＫＳ）のローディングモジュールまたは拡張モジュール１
    〜６のいずれか１つのドメインについてのコード配列を含む、単離された組換え
    ＤＮＡ化合物。
  6. 【請求項６】 前記コード配列が、オレアンドライドＰＫＳのローディング
    モジュールまたは拡張モジュール１〜４のいずれか１つをコードする、請求項５
    に記載の単離された組換えＤＮＡ化合物。
  7. 【請求項７】 複製起点または染色体組み込みを可能にするＤＮＡのセグメ
    ントをさらに含む組換えＤＮＡ発現ベクターである、請求項５に記載の単離され
    た組換えＤＮＡ化合物。
  8. 【請求項８】 Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ宿主細胞におけるＰＫＳの発現を
    コードする、請求項７に記載の組換えＤＮＡ発現ベクター。
  9. 【請求項９】 請求項７に記載の組換えＤＮＡ発現ベクターを含む、Ｓｔｒ
    ｅｐｔｏｍｙｃｅｓ宿主細胞およびＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ宿主細
    胞からなる群から選択される、組換え宿主細胞。
  10. 【請求項１０】 オレアンドライドＰＫＳ遺伝子の少なくとも一部分、およ
    びオレアンドライド以外のマクロライドアグリコンについての第２のＰＫＳ遺伝
    子の少なくとも一部分を含むハイブリッドＰＫＳをコードする、請求項７に記載
    の組換えＤＮＡ発現ベクター。
  11. 【請求項１１】 前記第２のＰＫＳ遺伝子がＤＥＢＳ遺伝子である、請求項
    １０に記載の組換えＤＮＡ化合物。
  12. 【請求項１２】 前記ハイブリッドＰＫＳが、オレアンドライドＰＫＳのロ
    ーディングモジュールおよび拡張モジュール１〜４のいずれか１つ、ならびにＤ
    ＥＢＳの拡張モジュールを含む、請求項１１に記載の組換えＤＮＡ化合物。
  13. 【請求項１３】 前記ハイブリッドＰＫＳが、オレアンドライドＰＫＳのロ
    ーディングモジュールおよび拡張モジュール１〜４のいずれか１つ、ならびにナ
    ルボノライドＰＫＳの拡張モジュールを含む、請求項１０に記載の組換えＤＮＡ
    化合物。
  14. 【請求項１４】 非形質転換状態においてはオレアンドライドを生成しない
    組換え宿主細胞であって、該細胞は請求項１１に記載の組換えＤＮＡ発現ベクタ
    ーを含み、そして該細胞は前記ハイブリッドＰＫＳによって合成されるマクロラ
    イドアグリコンを生成する、組換え宿主細胞。
  15. 【請求項１５】 Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓである、請
    求項１４に記載の組換え宿主細胞。
  16. 【請求項１６】 Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｅｒｙｔｈｒａｅ
    ａである、請求項１４に記載の組換え宿主細胞。
  17. 【請求項１７】 前記オレアンドライドＰＫＳが、拡張モジュール１におい
    て非機能的ＫＳドメインを有する、請求項１３に記載の組換え宿主細胞。
  18. 【請求項１８】 Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒまたは
    Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓである、請求項１７に記載の組換
    え宿主細胞。
  19. 【請求項１９】 Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｅｒｙｔｈｒａｅ
    ａである、請求項１７に記載の組換え宿主細胞。
  20. 【請求項２０】 細胞においてポリケチドを生成する方法であって、該方法
    は、ｏｌｅＡＩ遺伝子、ｏｌｅＡＩＩ遺伝子またはｏｌｅＡＩＩＩ遺伝子の少な
    くとも一部をコードする組換え発現ベクターで、該細胞を形質転換する工程を包
    含する、方法。
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