DE69934242T2 - Polyketid synthase enzyme und rekombinante dna konstrukte dafür, zur herstellung von mit fk-506 und fk-520 verwandten verbindungen - Google Patents

Polyketid synthase enzyme und rekombinante dna konstrukte dafür, zur herstellung von mit fk-506 und fk-520 verwandten verbindungen Download PDF

Info

Publication number
DE69934242T2
DE69934242T2 DE69934242T DE69934242T DE69934242T2 DE 69934242 T2 DE69934242 T2 DE 69934242T2 DE 69934242 T DE69934242 T DE 69934242T DE 69934242 T DE69934242 T DE 69934242T DE 69934242 T2 DE69934242 T2 DE 69934242T2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
pks
module
recombinant
domain
coa
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
DE69934242T
Other languages
English (en)
Other versions
DE69934242D1 (de
Inventor
Christopher Orinda REEVES
Daniel Santa Clara CHU
Chaitan Palo Alto KHOSLA
Daniel San Francisco SANTI
Kai Foster City WU
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kosan Biosciences Inc
Original Assignee
Kosan Biosciences Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kosan Biosciences Inc filed Critical Kosan Biosciences Inc
Application granted granted Critical
Publication of DE69934242D1 publication Critical patent/DE69934242D1/de
Publication of DE69934242T2 publication Critical patent/DE69934242T2/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D498/00—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D498/12—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms in which the condensed system contains three hetero rings
    • C07D498/18—Bridged systems
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1205—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. protein kinases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
    • C12P17/188—Heterocyclic compound containing in the condensed system at least one hetero ring having nitrogen atoms and oxygen atoms as the only ring heteroatoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
    • C12P19/30—Nucleotides
    • C12P19/32—Nucleotides having a condensed ring system containing a six-membered ring having two N-atoms in the same ring, e.g. purine nucleotides, nicotineamide-adenine dinucleotide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)

Description

  • Fachgebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Polyketide und die Polyketidsynthase-(PKS)-Enyzme, die diese produzieren. Die Erfindung betrifft außerdem allgemein Gene, die PKS-Enzyme codieren, und rekombinante Wirtszellen, die diese Gene enthalten und in denen die Expression dieser Gene zu der Produktion der Polyketide führt. Die vorliegende Erfindung betrifft auch Verbindungen, die als Medikamente mit immunsuppressiver und/oder neurotrophischer Aktivität nützlich sind. Somit betrifft die Erfindung die Gebiete der Chemie, Molekularbiologie, als auch der Agrikultur-, Medizin- und Veterinärtechnologie.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Polyketide stellen eine Klasse von Verbindungen dar, die aus 2-Kohlenstoffe-Einheiten durch eine Reihe von Kondensationen und anschließenden Modifikationen synthetisiert werden. Polyketide kommen in vielen Arten von Organismen vor, einschließlich Pilzen und Myzelbakterien, insbesondere den Actinomyceten. Polyketide sind biologisch aktive Moleküle mit einer breiten Vielfalt von Strukturen, wobei die Klasse zahlreiche Verbindungen mit verschiedenartigen Aktivitäten umfasst. Tetracyclin, Erythromycin, Epothilon, FK-506, FK-520, Narbomycin, Picromycin, Rapamycin, Spinocyn und Tylosin sind Beispiele für Polyketide. In Anbetracht der Schwierigkeit, Polyketid-Verbindungen mittels einer traditionellen chemischen Methodologie zu produzieren und der typischerweise geringen Produktion an Polyketiden in Wildtyp-Zellen, hat ein beträchtliches Interesse daran bestanden, verbesserte oder alternative Methoden zur Herstellung von Polyketid-Verbindungen zu finden.
  • Dieses Interesse hat zur Klonierung, Analyse und Manipulation mittels rekombinanter DNA-Technologie von Genen geführt, die PKS-Enzyme kodieren. Die resultierende Technologie erlaubt die Manipulation eines bekannten PKS-Genclusters, um entweder das mittels jener PKS synthetisierte Polyketid in höheren Mengen zu produzieren, als sie in der Natur oder in Wirten vorkommen, die ansonsten das Polyketid nicht produzieren. Die Technologie erlaubt auch die Herstellung von Molekülen, die strukturell verwandt, jedoch unterschiedlich zu den Polyketiden sind, die von bekannten PKS-Genclustern produziert werden. Siehe z.B. PCT-Veröffentlichung Nrn. WO 93/13663; 95/08548; 96/40968; 97/02358; 98/27203 und 98/49315; US-Patent Nrn. 4.874.748; 5.063.155; 5.098.837; 5.149.639; 5.672.491; 5.712.146; 5.830.750 und 5.843.718; und Fu et al. 1994, Biochemistry 33: 9321–9326; McDaniel et al., 1993, Science 262: 1546–1550; und Rohr, 1995, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 34(8): 881–888, von denen jede hierin durch Bezugnahme mitaufgenommen ist.
  • Polyketide werden in der Natur durch PKS-Enzyme synthetisiert. Diese Enzyme, welche Komplexe aus vielen großen Proteinen sind, sind den Synthasen ähnlich, die die Kondensation der 2-Kohlenstoffe-Einheiten in der Biosynthese von Fettsäuren katalysieren. PKS katalysieren die Biosynthese von Polyketiden durch wiederholte, decarboxylative Claisen-Kondensationen zwischen Acylthioester-Bausteinen. Die zur Bildung komplexer Polyketide verwendeten Bausteine sind typischerweise Acylthioester, wie etwa Acetyl-, Butyryl-, Propionyl-, Malonyl-, Hydroxymalonyl-, Methylmalonyl- und Ethylmalonyl-CoA. Zu weiteren Bausteinen zählen Aminosäuren wie Acylthioester. PKS-Enzyme, die diese Bausteine einbauen, enthalten eine Aktivität, die als eine Aminosäure-Ligase (eine AMP-Ligase) oder als eine nicht-ribosomale Peptidsynthetase (NRPS) wirkt. Zwei Haupttypen von PKS-Enzymen sind bekannt; diese weichen hinsichtlich ihrer Zusammensetzung und Art und Weise der Synthese des synthetisierten Polyketids ab. Diese beiden Haupttypen von PKS-Enzymen werden gewöhnlich als Typ I oder "moduläre" und Typ II oder "iterative" PKS-Enzyme bezeichnet.
  • Bei der Typ I- oder modulären PKS-Enzymgruppe existiert ein Satz separater katalytischer Aktivstellen (jede Aktivstelle wird als eine "Domäne" bezeichnet, und ein Satz davon wird als ein "Modul" bezeichnet) für jeden Zyklus der Kohlenstoffketten- Verlängerung und -Modifikation im Polyketid-Syntheseweg. Die typische moduläre PKS setzt sich aus mehreren großen Polypeptiden zusammen, die von den Amino- zu den Carboxy-Termini in ein Lademodul, multiple Extendermodule und eine Freisetzungs-(oder Thioesterase)-Domäne unterteilt werden können. Das als 6-Desoxyerythronolid-B-Synthase (DEBS) bekannte PKS-Enzym ist eine Typ I-PKS. In DEBS gibt es ein Lademodul, sechs Extendermodule und eine Thioesterase-(TE)-Domäne. Das Lademodul, sechs Extendermodule und die TE von DEBS sind auf drei separaten Proteinen vorhanden (bezeichnet als DEBS-1, DEBS-2 und DEBS-3, bei zwei Extendermodulen pro Protein). Jedes der DEBS-Polypeptide ist durch einen separaten offenen Leserahmen (ORF) oder Gen codiert; diese Gene sind als eryAI, eryAII und eryAII bekannt. Siehe Caffrey et al, 1992, FEBS Letters 304: 205 und US-Patent Nr. 5.824.513, die jeweils hierin durch Bezugnahme mitaufgenommen sind.
  • Allgemein ist das Lademodul für die Bindung des ersten Bausteins, der zum Synthetisieren des Polyketids verwendet wird, und dessen Transfer zum ersten Extendermodul verantwortlich. Das Lademodul von DEBS besteht aus einer Acyltransferase-(AT)-Domäne und einer Acyl-Trägerprotein-(ACP)-Domäne. Eine andere Art von Lademodul verwendet eine inaktivierte Ketosynthase-(KS)-Domäne und AT- und ACP-Domänen. Diese inaktivierte KS ist in einigen Fällen als KSQ bezeichnet, wobei der hochgestellte Buchstabe die Abkürzung für die Aminosäure, Glutamin, ist, die anstelle des Aktivstellen-Cysteins vorhanden ist, das für die Ketosynthase-Aktivität erforderlich ist. In anderen PKS-Enzymen, einschließlich der KF-506-PKS, beinhaltet das Lademodul eine ungewöhnliche Startereinheit und setzt sich aus einer CoA-Ligase-artigen Aktivitätsdomäne zusammen. In jedem Falle erkennt das Lademodul ein bestimmtes Acyl-CoA (gewöhnlich Acetyl oder Propionyl, aber manchmal Butyryl oder ein anderes Acyl-CoA) und überträgt es als ein Thiolester auf das ACP des Lademoduls.
  • Die AT an jedem der Extendermodule erkennt ein bestimmtes Extender-CoA (Malonyl oder alpha-substituiertes Malonyl, d.h. Methylmalonyl, Ethylmalonyl und 2-Hydroxymalonyl) und überträgt es auf das ACP jenes Extendermoduls, um ein Thioester zu bilden. Jedes Extendermodul ist für das Annehmen einer Verbindung von einem vorherigen Modul, Binden eines Bausteins, Anlagern des Bausteins an die Verbindung von dem vorangegangenen Modul, wahlweise Erfüllen einer oder mehrerer zusätzlicher Funktionen und Transfer der resultierenden Verbindung zu dem nächsten Modul verantwortlich.
  • Jedes Extendermodul einer modulären PKS enthält eine KS, AT, ACP, und null, eins, zwei oder drei Domänen, die den Beta-Kohlenstoff der wachsenden Polyketidkette modifizieren. Ein typisches (nicht-ladendes) minimales Typ I PKS-Extendermodul ist veranschaulicht durch Extendermodul Drei von DEBS, welche eine KS-Domäne, eine AT-Domäne und eine ACP-Domäne enthält. Diese drei Domänen sind ausreichend, um eine 2-Kohlenstoff-Extendereinheit zu aktivieren und sie an das wachsende Polyketidmolekül zu binden. Das nächste Extendermodul wiederum ist verantwortlich für die Anlagerung des nächsten Bausteins und den Transfer der wachsenden Verbindung zu dem nächsten Extendermodul, bis die Synthese vollständig ist.
  • Ist die PKS einmal mit Acyl- und Malonyl-ACPs geprimt, so wird die Acylgruppe des Lademoduls übertragen, um einen Thiolester (Transveresterung) an der KS des ersten Extendermoduls zu bilden; in diesem Stadium besitzt Extendermodul Eins eine Acyl-KS und eine Malonyl-(oder substituierte Malonyl)-ACP. Die von dem Lademodul stammende Acylgruppe wird dann kovalent an den Alpha-Kohlenstoff der Malonylgruppe gebunden, um eine Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindung zu bilden, angetrieben durch eine begleitende Decarboxylierung, wobei ein neues Acyl-ACP erzeugt wird, das ein um zwei Kohlenstoffe längeres Rückgrat aufweist als der Lade-Baustein (Elongation oder Extension).
  • Die um zwei Kohlenstoffe pro Extendermodul wachsende Polyketidkette wird sequenziell als ein kovalent gebundener Thiolester von Extendermodul zu Extendermodul in einem fließbandartigen Prozess weitergereicht. Die lediglich mittels dieses Prozesses erzeugte Kohlenstoffkette würde ein Keton an jedem zweiten Kohlenstoffatom aufweisen, was ein Polyketon erzeugt, aus dem der Name Polyketid entstanden ist. Am häufigsten jedoch modifizieren zusätzliche enzymatische Aktivitäten die Beta-Ketogruppe jeder Zwei-Kohlenstoffe-Einheit, unmittelbar nachdem sie an die wachsende Polyketidkette addiert worden ist, doch bevor sie auf das nächste Modul übertragen wird.
  • Daher können über das minimale Modul hinaus, dass die zur Bildung der Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindung erforderliche KS, AT und ACP-Domänen, und wie oben angemerkt, weitere Domänen enthalten, die die Beta-Carbonylkomponente modifizieren, vorhanden sein. Somit können die Module eine Ketoreduktase-(KR)-Domäne enthalten, die die Ketogruppe zu einem Alkohol reduziert. Die Module können auch eine KR-Domäne plus einer Dehydratase-(DH)-Domäne enthalten, die den Alkohol zu einer Doppelbindung dehydratisiert. Die Module können auch eine KR-Domäne, eine DH-Domäne und eine Enoylreduktase-(ER)-Domäne enthalten, die das Doppelbindungsprodukt zu einer gesättigten Einfachbindung unter Verwendung des Beta-Kohlenstoffs als einer Methylenfunktion umwandelt. Ein Extendermodul kann auch weitere enzymatische Aktivitäten enthalten, wie zum Beispiel eine Methylase- oder Dimethylase-Aktivität.
  • Hat das Polyketid das letzte Extendermodul durchquert, so trifft es auf eine freisetzende Domäne, die das Polyketid von der PKS abspaltet und typischerweise das Polyketid zyklisiert. Zum Beispiel wird die abschließennde Synthese von 6-dEB durch eine TE-Domäne reguliert, die am Ende des Extendermoduls Sechs lokalisiert ist. Bei der Synthese von 6-dEB katalysiert die TE-Domäne die Zyklisierung des Makrolid-Rings durch Bildung einer Esterverknüpfung. Bei FK-506, FK-520, Rapamycin und ähnlichen Polyketiden ist die TE-Aktivität durch eine RapP- (für Rapamycin) oder RapP-artige Aktivität ersetzt, die eine Verknüpfung unter Einbau eines Pipecolatsäure-Rests herstellt. Die enzymatische Aktivität, die diesen Einbau für das Rapamycin-Enzym katalysiert, ist als RapP, codiert durch das rapP-Gen, bekannt. Das Polyketid kann durch Tailoring-Enzyme weiter modifiziert werden; diese Enzyme fügen Kohlehydratgruppen oder Methylgruppen an oder nehmen andere Modifikationen, d.h. eine Oxidation oder Reduktion, am Polypeptid-Core-Molekül vor. Zum Beispiel wird bei der Synthese von Erythromycin A 6-dEB bei C-6 und C-12 hydroxyliert und bei C-3 und C-5 glykosyliert.
  • Bei Typ I PKS-Polypeptiden ist die Reihenfolge der katalytischen Domänen konserviert. Sind alle Beta-Keto-prozessierenden Domänen in einem Modul vorhanden, so ist die Reihenfolge der Domänen in jenem Modul vom N- zum C-Terminus immer KS, AT, DH, ER, KR und ACP. Einige oder alle der Beta-Keto-prozessierenden Domänen können in bestimmten Modulen fehlen, doch bleibt die Reihenfolge der in einen Modul vorhandenen Domänen dieselbe. Die Reihenfolge der Domänen innerhalb der Module wird für die korrekte Faltung der PKS-Polypeptide zu einem aktiven Komplex für wichtig erachtet. Von Bedeutung ist die beträchtliche Flexibilität in PKS-Enzymen, die die gentechnische Konstruktion neuer katalytischer Komplexe erlaubt. Die Konstruktion dieser Enzyme wird durch Modifizieren, Addieren oder Deletieren von Domänen, oder ihr Austauschen gegen solche, die aus anderen Typ I PKS-Enzymen entnommen sind, erreicht. Sie wird auch durch Deletieren, Austauschen oder Addieren ganzer Module durch solche, die aus anderen Quellen entnommen sind, erreicht. Ein gentechnisch konstruierter PKS-Komplex sollte selbstverständlich die Fähigkeit aufweisen, die Synthese des aus den vorgenommenen genetischen Alterationen prädizierten Produkts zu katalysieren.
  • Alignments der vielen verfügbaren Aminosäuresequenzen für Typ I PKS-Enzyme haben die Grenzen der verschiedenen katalytischen Domänen annähernd definiert. Sequenz-Alignments haben auch Linkerregionen zwischen den katalytischen Domänen und an den N- und C-Termini der einzelnen Polypeptide aufgezeigt. Die Sequenzen dieser Linkerregionen sind weniger gut konserviert als jene für die katalytischen Domänen, auf der Grundlage wessen die Linkerregionen zum Teil identifiziert werden. Linkerregionen können für eine korrekte Assoziation zwischen den Domänen und zwischen den individuellen Polypeptiden, die den PKS-Komplex umfassen, wichtig sein. Somit können Linker und Domänen zusammen genommen als ein Gerüst schaffend betrachtet werden, in welchem die Domänen und Module in der korrekten Orientierung positioniert sind, um aktiv zu sein. Diese Organisation und Positionierung, sofern erhalten, erlaubt PKS-Domänen von unterschiedlichen oder identischen Substrat-Spezifitäten, zwischen PKS-Enzymen mittels verschiedener verfügbarer Methodologien substituiert zu werden (gewöhnlich auf der DNA-Ebene). Bei der Auswahl der Grenzen zum Beispiel eines AT-Austauschs kann somit der Austausch so vorgenommen werden, dass die Linker der Empfänger-PKS beibehalten bleiben oder dass sie durch die Linker der Donor-PKS-AT-Domäne ersetzt werden, oder vorzugsweise beide Konstrukte vorgenommen werden, um sicherzugehen, dass die korrekten Linkerregionen zwischen den KS- und AT-Domänen in zumindest eines der konstruierten Enzyme aufgenommen worden sind. Somit besteht beträchtliche Flexibilität hinsichtlich des Designs neuer PKS-Enzyme, mit dem Ergebnis, dass bekannte Polypeptide effizienter produziert werden können und dass neue Polyketide, die als Pharmazeutika oder für andere Zwecke nützlich sind, geschaffen werden können.
  • Chen. et al. (J. Antibiot 45: 118–123 und 577–580) berichten von der Desmethylierung von FK506 und FR900520 durch Actinoplanes sp. ATCC 53771 bzw. Actinomycete sp. ATCC 53828. Shafiee et al. (J. Antibiot 46: 1397–1405) verwendete 31-O-Desmethylimmunomycin O: Methyltransferase (DIMT), um drei Analoga von FR900520 zu synthetisieren.
  • Durch die geeignete Anwendung der rekombinanten DNA-Technologie kann eine breite Vielfalt von Polyketiden in einer Vielzahl unterschiedlicher Wirtszellen hergestellt werden, vorausgesetzt, dass der Zugang zu Nukleinsäure-Verbindungen besteht, die PKS-Proteine und Polyketid-Modifikationsenzyme codieren. Die vorliegende Erfindung ist darin hilfreich, den Bedarf an solchen Nukleinsäure-Verbindungen zu decken, indem sie rekombinante Vektoren bereitstellt, die das FK-520 PKS-Enzym und verschiedene FK-520-Modifikationsenzyme codieren. Zwar weisen die FK-506- und FK-620-Polyketide darüber hinaus viele nützliche Aktivitäten auf, doch bleibt ein Bedarf nach Verbindungen mit ähnlich nützlichen Aktivitäten, doch mit einem besseren pharmakokinetischen Profil und Metabolismus und weniger Nebenwirkungen bestehen. Die vorliegende Erfindung ist auch darin hilfreich, den Bedarf an diesen Verbindungen zu decken.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die Erfindung betrifft Verbindungen, die hinsichtlich ihrer Struktur zu FK-520 oder FK-506 verwandt sind, die in der Behandlung einer medizinischen Bedingung nützlich sind. Zu diesen Verbindungen zählen Verbindungen, in denen die C-13- Methoxygruppe durch eine Komponente ersetzt ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, Methyl- und Ethyl-Komponenten. Diese Verbindungen sind weniger anfällig für den hauptsächlichen in vivo-Weg des Abbaus von FK-520 und FK-506 und verwandter Verbindungen und zeigen somit ein verbessertes pharmakokinetisches Profil. Die Verbindungen der Erfindung umfassen auch Verbindungen, in denen die C-15-Methoxygruppe durch eine Komponente ersetzt ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, Methyl- und Ethyl-Komponenten. Die Verbindungen der Erfindung umfassen auch die obigen Verbindungen, die durch eine chemische Methodologie weiter modifiziert sind, um Derivate zu erzeugen, wie zum Beispiel, ohne darauf beschränkt zu sein, die C-18-Hydroxyl-Derivate, die potente neurotrophische, jedoch nicht immunsuppressive Aktivitäten aufweisen.
  • Somit stellt die Erfindung Polyketide mit der folgenden Struktur bereit:
    Figure 00080001
    worin R1 Wasserstoff, Methyl, Ethyl oder Allyl ist; R2 Wasserstoff oder Hydroxyl ist, vorausgesetzt, dass dann, wenn R2 Wasserstoff ist, eine Doppelbindung zwischen C-20 und C-19 vorliegt; R3 Wasserstoff oder Hydroxyl ist; R4 Methoxyl, Wasserstoff, Methyl oder Ethyl ist; und R5 Methoxyl, Wasserstoff, Methyl oder Ethyl ist; wobei wenigstens eines von R4 und R5 nicht Methoxy ist. Hierzu zählen nicht FK-506, FK-520, 18-Hydroxy-FK-520 und 18-Hydroxy-FK-506. Die Erfindung stellt diese Verbindungen in gereinigter Form und in einer pharmazeutischen Zusammensetzung bereit.
  • In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung eine Verbindung der Erfindung zur Verwendung in der Therapie bereit. Die Verbindungen der Erfindung können verabreicht werden, um eine Immunsuppression oder die Stimulierung des Nervenwachstums und -regeneration zu erreichen.
  • Rekombinante DNA-Vektoren können alle oder einen Teil des FK-520 PKS-Enzyms codieren. Zu veranschaulichenden Vektoren zählen Cosmid-pKOS034-120, pKOS034-124, pKOS065-C31, pKOS065-C3, pKOS065-M27 und pKOS065-M21. Nukleinsäure-Verbindungen können die verschiedenen Domänen der FK-520-PKS codieren, d.h. die KS-, AT-, ACP-, KR-, DH- und ER-Domänen. Diese Verbindungen können ohne weiteres einzeln oder in Kombination mit Nukleinsäuren verwendet werden, die andere FK-520- oder Nicht-FK-520-PKS-Domänen codieren, als Intermediate in der Konstruktion rekombinanter Vektoren, die alle oder einen Teil der PKS-Enzyme codieren, die neue Polyketide erbringen.
  • Isolierte Nukleinsäuren können alle oder einen Teil von ein oder mehreren Modulen der FK-520-PKS codieren, wobei jedes Modul eine Ketosynthase-Aktivität, eine Acyltransferase-Aktivität und eine Acyl-Trägerprotein-Aktivität umfasst. Eine isolierte Nukleinsäure kann ein oder mehrere offene Leserahmen von FK-520-PKS-Genen codieren, wobei die offenen Leserahmen Codierungssequenzen für eine CoA-Ligase-Aktivität, eine NRPS-Aktivität oder zwei oder mehrere Extendermodule umfassen. Rekombinante Expressionsvektoren können diese Nukleinsäuren enthalten.
  • Isolierte Nukleinsäuren können alles oder einen Teil einer PKS codieren, die wenigstens ein Modul enthält, in welchem wenigstens eine der Domänen im Modul eine Domäne von einer Nicht-FK-520-PKS ist und mindestens eine Domäne von der FK-520-PKS ist. Die Nicht-FK-520-PKS-Domäne oder das Modul stammt aus der Rapamycin-PKS, der FK-506-PKS, DEBS oder einer anderen PKS. Rekombinante Expressionsvektoren können diese Nukleinsäuren enthalten.
  • Ein Polyketid kann mittels eines Verfahrens hergestellt werden, umfassend das Transformieren einer Wirtszelle mit einem rekombinanten DNA-Vektor, der wenigstens ein Modul einer PKS codiert, welches Modul wenigstens eine FK-520-PKS-Domäne umfasst, und Kultivieren der Wirtszelle unter solchen Bedingungen, dass die PKS produziert und die Synthese dieses Polyketids katalysiert wird. Das Verfah ren kann mit einer Streptomyces-Wirtszelle ausgeführt werden. Das erzeugte Polyketid kann FK-520 sein. Das erzeugte Polyketid kann ein Polyketid sein, das strukturell zu FK-520 verwandt ist. Das erzeugte Polyketid kann ein Polyketid sein, das strukturell zu FK-506 oder Rapamycin verwandt ist.
  • Ein Satz von Genen in rekombinanter Form kann für die Synthese von Ethylmalonyl-CoA in einer heterologen Wirtszelle ausreichend sein. Diese Gene und die hierin beschriebenen Verfahren erlauben die Schaffung rekombinanter Wirtszellen mit der Fähigkeit, Polyketide und andere Verbindungen zu erzeugen, die Ethylmalonyl-CoA für die Biosynthese erfordern. Rekombinante Nukleinsäuren können für Ethylmalonyl-CoA spezifische AT-Domänen codieren. Somit können die hierin beschriebenen Verbindungen zur Erzeugung von Polyketiden, die Ethylmalonyl-CoA erfordern, in Wirtszellen verwendet werden, die ansonsten zur Erzeugung solcher Polyketide unfähig sind.
  • Ein Satz von Genen in rekombinanter Form kann für die Synthese von 2-Hydroxymalonyl-CoA und 2-Methoxymalonyl-CoA in einer heterologen Wirtszelle ausreichend sein. Diese Gene und die hierin beschriebenen Verfahren ermöglichen die Schaffung rekombinanter Wirtszellen mit der Fähigkeit, Polyketide und andere Verbindungen zu erzeugen, die 2-Hydroxymalonyl-CoA für die Biosynthese erfordern. Rekombinante Nukleinsäuren können AT-Domänen codieren, die für 2-Hydroxymalonyl-CoA und 2-Methoxymalonyl-CoA spezifisch sind. Somit können die hierin beschriebenen Verbindungen zur Erzeugung von Polyketiden, die 2-Hydroxymalonyl-CoA oder 2-Methoxymalonyl-CoA erfordern, in Wirtszellen verwendet werden, die ansonsten zur Erzeugung solcher Polyketide unfähig wären.
  • Diese und weitere Ausführungsformen und Aspekte der Erfindung werden nach Betrachtung der beiliegenden Zeichnungen und ihrer nachstehenden kurzen Beschreibung, zusammen mit der ausführlichen Beschreibung, den Beispielen und den Ansprüchen im Anhang umfassender verständlich werden.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1 zeigt ein Diagramm des biosynthetischen FK-520-Genclusters. Die obere Linie zeigt eine Skala in Kilobasenpaaren (kb). Die zweite Linie zeigt eine Restriktionskarte mit den angegebenen ausgewählten Restriktionsenzym-Erkennungssequenzen. K ist KpnI; X ist XhoI, S ist SacI; P ist PstI; und E ist EcoRI. Die dritte Linie gibt die Position von FK-520-PKS und verwandten Genen an. Die Gene sind durch eine Einbuchstaben-Bezeichnung abgekürzt, d.h. C ist fkbC. Unmittelbar unter der dritten Linie befinden sich nummerierte Segmente, die zeigen, wo das Lademodul (L) und zehn verschiedene Extendermodule (beziffert mit 1–10) auf den verschiedenen gezeigten Genen codiert sind. Unten in der Figur sind DNA-Inserte der verschiedenen Cosmiden der Erfindung (d.h. 34–124 ist Cosmid pKOS034-124) im Alignment mit dem biosynthetischen FK-520-Gencluster gezeigt.
  • 2 zeigt das Lademodul (Lade), die zehn Extendermodule und die Peptidsynthetase-Domäne der FK-520-PKS, zusammen mit, in der obersten Linie, den Genen, die die verschiedenen Domänen und Module codieren. Ebenfalls gezeigt sind die verschiedenen Intermediate in der FK-520-Biosynthese, als auch die Struktur von FK-520, mit der Nummerierung der Kohlenstoffe 13, 15, 21 und 31. Die verschiedenen Domänen jedes Moduls und Subdomänen des Lademoduls sind ebenfalls gezeigt. Die dunklen Kreise, die die DH-Domänen in Modulen 2, 3 und 4 zeigen, geben an, dass die Dehydratase-Domäne nicht als eine Dehydratase funktionell ist; diese Domäne kann die Stereochemie an der entsprechenden Position im Polyketid beeinflussen. Die Substituenten an der FK-520-Struktur, die aus der Tätigkeit von Nicht-PKS-Enzymen resultieren, sind ebenfalls als Pfeile gezeigt, zusammen mit den Typen von Enzymen oder den Genen, die für die Enzyme codieren, welche die Tätigkeit vermitteln. Obschon die Methyltransferase als an den C-13- und C-15-Hydroxylgruppen nach Freisetzung des Polyketids aus der PKS agierend gezeigt ist, kann die Methyltransferase am 2-Hydroxymalonyl-Substrat vor oder zeitgleich mit ihrem Einbau durch die Polyketid-Synthese wirken.
  • 3 zeigt eine Nahansicht des linken Endes des FK-520-Genclusters, welches mindestens zehn zusätzliche Gene enthält. Die Ethyl-Seitenkette am Kohlenstoff 21 von FK-520 (2) stammt von einer Ethylmalonyl-CoA-Extendereinheit, die durch eine Ethylmalonyl-spezifische AT-Domäne im Extendermodul 4 der PKS eingebaut ist. Mindestens vier der Gene in dieser Region codieren für Enzyme, die an der Ethylmalonyl-Biosynthese beteiligt sind. Die Polyhydroxybutyrat-Depolymerase ist an der Erhaltung von Hydroxybutyryl-CoA-Pools während der FK-520-Produktion beteiligt. Polyhydroxybutyrat reichert sich während des vegetativen Wachstums an und verschwindet während der stationären Phase in anderen Streptomyces (Ranade und Vining, 1993, Can. J. Microbiol. 39: 377). Offene Leserahmen mit einer unbekannten Funktion sind durch ein Fragezeichen angegeben.
  • 4 zeigt einen Biosyntheseweg für die Biosynthese von Ethylmalonyl-CoA aus Acetoacetyl-CoA in Übereinstimmung mit der Funktion, die vier der Gene im in 3 gezeigten FK-520-Gencluster zugeordnet ist.
  • 5 zeigt eine Nahansicht des rechten Endes des FK-520-PKS-Genclusters (und der Sequenzen auf Cosmid pKOS065-C31). Die gezeigten Gene umfassen fkbD, fkbM (eine Methyltransferase, die die Hydroxylgruppe auf C-31 von FK-520 methyliert), fkbN (ein Homologon eines Gens, das als ein Regulator der Cholesteroloxidase beschrieben ist und das für einen Transkriptionsaktivator gehalten wird), fkbQ (eine Typ II-Thioesterase, die die Polyketid-Produktionsmengen erhöhen kann) und fkbS (eine Crotonyl-CoA-Reduktase, die an der Biosynthese von Ethylmalonyl-CoA beteiligt ist).
  • 6 zeigt den vorgeschlagenen Abbauweg für den Tacrolimus-(FK-506)-Metabolismus.
  • 7 zeigt einen schematischen Prozess für die Konstruktion der rekombinanten PKS-Gene der Erfindung, die PKS-Enzyme codieren, die die 13-Desmethoxy-FK-506- und FK-520-Polyketide der Erfindung produzieren, wie in nachstehendem Beispiel 4 beschrieben.
  • 8 zeigt in Teilen A und B bestimmte Verbindungen der Erfindung, die für die dermale Applikation in Teil A bevorzugt sind, und einen Syntheseweg zur Herstellung dieser Verbindungen in Teil B.
  • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • Im Hinblick auf die wertvollen pharmazeutischen Eigenschaften der Polyketide besteht ein Bedarf an Verfahren und Reagenzien zur Herstellung großer Mengen der Polyketide, als auch zur Herstellung verwandter Verbindungen, die in der Natur nicht gefunden werden. Diese Methoden und Reagenzien sind hierin mit spezieller Anwendung auf Verfahren und Reagenzien für die Produktion der Polyketide beschrieben, die als FK-520 bekannt sind und außerdem als Ascomycin oder L-683,590 bezeichnet werden (siehe Holt et al., 1993, JACS 115:9925) und FK-506, auch bekannt als Tacrolimus. Tacrolimus ist ein Makrolid-Immunsuppressivum, das zur Verhütung oder Behandlung einer Abstoßung eines transplantierten Herzens, Niere, Leber, Lunge, Bauchspeicheldrüse und Dünndarm-Transplantaten verwendet wird. Der Wirkstoff ist auch zur Verhütung und Behandlung einer Transplantat-gegen-Wirt-Erkrankung bei Patienten nützlich, die Knochenmarkstransplantate erhalten, und zur Behandlung einer schweren, refraktorischen Uveitis. Es hat weitere Berichte über die nicht genehmigte Verwendung von Tacrolimus für andere Zustände gegeben, einschließlich Alopecia universalis, autoimmune chronisch-aktive Hepatitis, entzündliche Darmerkrankung, Multiple Sklerose, primäre biliäre Zirrhose und Sklerodermia. Die Verfahren und Reagenzien zur Herstellung der neuen Polyketide, die strukturell zu FK-520 und FK-506 verwandt sind, und strukturell verwandter Polyketide wie Rapamycin sind hierin beschrieben.
  • Die FK-506- und Rapamycin-Polyketide sind potente Immunsuppressiva, deren chemische Strukturen nachstehend gezeigt sind.
  • Figure 00140001
  • FK-520 weicht von FK-506 darin ab, dass ihm die Allylgruppe bei C-21 von FK-506, das in die Allylgruppe bei C-21 von FK-506 fehlt und es stattdessen eine Ethylgruppe an jener Position aufweist, wobei es aber eine ähnliche Aktivität wie FK-506 besitzt, wennauch eine verminderte immunsuppressive Aktivität.
  • Diese Verbindungen agieren mittels einer anfänglichen Bildung eines intermediären Komplexes mit Protein-"Immunophilinen", bekannt FKBPs (FK-506-bindende Proteine), einschließlich FKBP-12. Immunophiline stellen eine Klasse von zytosolischen Proteinen dar, die Komplexe mit Molekülen wie FK-506, FK-520 und Rapamycin bilden, welche wiederum als Liganden für andere zelluläre Ziele dienen, die an der Signalübertragung beteiligt sind, Die Bindung von FK-506, FK-520 und Rapamycin an FKBP erfolgt durch die strukturell ähnlichen Segmente der Polyketid-Moleküle, bekannt als der "FKBP-bindenden Domäne" (wie allgemein, doch nicht präzise durch die gepunkteten Regionen in den obigen Strukturen angegeben). Der FK-506-FKBP-Komplex bindet dann an Calcineurin, wohingegen der Rapamycin-FKBP-Komplex an ein Protein bindet, das als RAFT-1 bekannt ist. Die Bindung des FKBP-Polyketid-Komplexes an diese zweiten Proteine erfolgt durch die ungleichen Regionen des Wirkstoffs, bekannt als den "Effektor"-Domänen.
  • Figure 00150001
  • Der dreikomponentige FKBP-Polyketid-Effektor-Komplex ist für die Signalübertragung und die anschließende immunsuppressive Aktivität von FK-506, FK-520 und Rapamycin erforderlich. Modifikationen in den Effektordomänen von FK-506, FK-520 und Rapamycin, die die Bindung an die Effektorproteine (Calcineurin oder RAFT) zerstören, führen zu einem Verlust der immunsuppressiven Aktivität, obschon die FKBP-Bindung unbeeinträchtigt bleibt. Weiterhin antagonisieren solche Analoga die immunsuppressiven Wirkungen der Ausgangs-Polyketide, da sie um FKBP konkurrieren. Solche nicht-immunsuppressiven Analoga zeigen auch eine reduzierte Toxizität (siehe Dumont et al., 1992, Journal of Experimental Medicine 176, 751–760), was anzeigt, dass ein Großteil der Toxizität dieser Wirkstoffe nicht an die FKBP-Bindung geknüpft ist.
  • Über die immunsuppressive Aktivität hinaus weisen FK-520, FK-506 und Rapamycin eine neurotrophische Aktivität auf. Im zentralen Nervensystem und in den peripheren Nerven werden Immunophiline als "Neuroimmunophiline" bezeichnet. Das Neuroimmunophilin FKBP ist im zentralen Nervensystem und in den peripheren Nerven deutlich angereichert. Moleküle, die an das Neuroimmunophilin FKBP binden, wie FK-506 und FK-520, weisen die bemerkenswerte Wirkung auf, das Nervenwachstum zu stimulieren. In vitro agieren sie als Neurotrophine, d.h. sie fördern das Neuritenwachstum in NGF-behandelten PC12-Zellen und in sensorischen neuronalen Kulturen, und bei gesunden Tieren fördern sie das Nachwachsen von beschädigten Gesichts- und Ischiasnerven und reparieren verletzte Serotonin- und Dopamin- Neuronen im Gehirn. Siehe Gold et al., Jun. 1999, J. Pharm. Exp. Ther. 289(3): 1202–1210; Lyons et al., 1994, Proc. National Academy of Science 91: 3191–3195; Gold et al., 1995, Journal of Neuroscience 15: 7509–7516; und Steiner et al., 1997, Proc. National Academy of Science 94: 2019–2024. Weiterhin scheinen die wiederhergestellten zentralen und peripheren Neuronen funktional zu sein.
  • Verglichen zu neurotrophischen Proteinmolekülen (BNDF, NGF, etc.) weisen die kleinmoleküligen Neurotrophine, wie FK-506, FK-520 und Rapamycin, unterschiedliche, und oftmals vorteilhafte, Eigenschaften auf. Zunächst zeigen, während Proteinneurotrophine schwer an ihre vorgesehene Wirkstelle zu transportieren sind und eine intrakraniale Injektion erforderlich machen können, die kleinmoleküligen Neurotrophine eine ausgezeichnete Bioverfügbarkeit; sie sind aktiv, wenn sie subkutan und oral verabreicht werden. Zweitens weisen, während Proteinneurotrophine recht spezifische Wirkungen zeigen, die kleinmoleküligen Neurotrophine eher breite Wirkungen auf. Schließlich induzieren, während Proteinneurotrophine oftmals Wirkungen auf normale Sinnesnerven zeigen, die kleinmoleküligen Neurotrophine keine atypische Entwicklung der normalen neuronalen Prozesse und scheinen spezifisch beschädigte Nerven zu beeinflussen. Neuroimmunophilin-Liganden weisen einen potenziellen therapeutischen Nutzen bei einer Vielzahl von Störungen auf, einschließlich der Nervendegeneration (z.B. Multiple Sklerose, Parkinson-Krankheit, Alzheimer Krankheit, Hirnschlag, traumatische Rückenmarks- und Gehirnverletzung, periphere Neuropathien).
  • Jüngere Studien haben gezeigt, dass die immunsuppressive und Neuritenwachstums-Aktivität von FK-506, FK-520 und Rapamycin getrennt werden kann; die neuroregenerative Aktivität in Abwesenheit der immunsuppressiven Aktivität wird durch Agenzien beibehalten, die an FKBP binden, doch nicht an die Effektorproteine Calcineurin oder RAFT. Siehe Steiner et al., 1997, Nature Medicine 3: 421–428.
  • Figure 00160001
  • Die verfügbaren Struktur-Aktivitäts-Daten zeigen, dass die wichtigen Merkmale für die neurotrophische Aktivität von Rapamycin, FK-520 und FK-506 innerhalb der gewöhnlichen, benachbarten Segmente des Makrolid-Rings liegen, die an FKBP binden. Dieser Abschnitt des Moleküls ist bezeichnet als die "FKBP-bindende Domäne" (siehe VanDuyne et al., 1993, Journal of Molecular Biology 229: 105–124). Nichts desto trotz tragen die Effektordomänen der Ausgangs-Makrolide zur konformationellen Starrheit der Bindungsdomäne bei, und tragen somit indirekt zur FKBP-Bindung bei.
  • Figure 00170001
    „FKBP-bindende Domäne"
  • Es gibt eine Anzahl weiterer berichteter Analoga von FK-506, FK-520 und Rapamycin, die an FKBP binden, doch nicht das Effektor-Protein Calcineurin oder RAFT. Diese Analoga zeigen Wirkungen auf die Nervenregeneration ohne immunsuppressive Effekte.
  • Zu natürlich vorkommenden FK-520- und FK-506-Analoga zählen die Antascomycine, welches FK-506-artige Makrolide sind, denen die funktionellen Gruppen von FK-506, die an Calcineurin binden, fehlen (siehe Fehr et al., 1996, The Journal of Antibiotics 49: 230–233). Diese Moleküle binden FKBP ebenso wirksam wie FK-506; sie wirken den Effekten sowohl von FK-506 als auch Rapamycin entgegen, doch fehlt ihnen die immunsuppressive Aktivität.
  • Figure 00180001
    Antascomycin A
  • Weitere Analoga können durch chemische Modifikation von FK-506, FK-520 oder Rapamycin erzeugt werden. Ein Ansatz zum Erhalt von Neuroimmunophilin-Liganden besteht in der Zerstörung der Effektor-bindenden Region von FK-506, FK-520 oder Rapamycin durch chemische Modifikation. Zwar sind die an den Ausgangs-Verbindungen zugelassenen chemischen Modifikationen recht beschränkt, doch existieren einige nützliche, chemisch modifizierte Analoga. Das FK-520-Analogon L-685,818 (ED50 = 0,7 nM für die FKBP-Bindung; siehe Dumont et al., 1992) und das Rapamycin-Analogon WAY-124,466 (IC50 = 12,5 nM; siehe Ocain et al., 1993, Biochemistry Biophysical Research Communications 192: 1340–134693) sind etwa ebenso wirksam wie FK-506, FK-520 und Rapamycin in der Förderung des Neuritenwachstums in Sinnesneuronen (siehe Steiner et al., 1997).
  • Figure 00180002
  • Eine der wenigen Positionen von Rapamycin, die ohne weiteres für eine chemische Modifikation zugänglich sind, ist die allylische 16-Methoxygruppe; diese reaktive Gruppe lässt sich durch Säure-katalysierte nukleophile Substitution ohne weiteres austauschen. Der Austausch der 16-Methoxygruppe von Rapamycin gegen eine Vielfalt von sterisch anspruchsvollen Gruppen hat Analoga erbracht, die einen selektiven Verlust der immunsuppressiven Aktivität unter Beibehaltung der FKBP-Bindung zeigen (siehe Luengo et al., 1995, Chemistry & Biology 2: 471–481). Eine der besten Verbindungen, nachstehendes 1, zeigt einen vollständigen Verlust der Aktivität im Splenozyten-Proliferationsassay bei einer lediglich 10-fachen Reduktion der Bindung an FKBP.
  • Figure 00190001
  • Es gibt auch synthetische Analoga der FKBP-bindenden Domänen. Diese Verbindungen spiegeln einen Ansatz zum Erhalt von Neuroimmunophilin-Liganden wieder, der auf "rational designten" Molekülen basiert, die die FKBP-bindende Region in einer geeigneten Konformation für die Bindung an FKBP beibehalten, doch die nicht die Effektor-bindenden Regionen besitzen. In einem Beispiel wurden die Enden der FKBP-bindenden Domäne durch Kohlenwasserstoffketten angebunden (siehe Holt et al., 1993, Journal of the American Chemical Society 115: 9925–9938); das beste Analogon, untenstehendes 2, bindet an FKBP etwa ebenso gut wie FK-506. Bei einem ähnlichen Ansatz wurden die Enden der FKBP-bindenden Domäne durch ein Tripeptid angebunden, was nachstehendes Analogon 3 ergab, welches an FKBP etwa 20-mal schlechter als FK-506 bindet. Von diesen Verbindungen wird angenommen, dass sie eine Neuroimmunophilin-bindende Aktivität aufweisen.
  • Figure 00200001
  • In einem Primaten-MPTP-Modell der Parkinson-Krankheit brachte die Verabreichung des FKBP-Liganden GPI-1046 Gehirnzellen zum Regenerieren und Verhaltenskriterien zur Besserung. MPTP ist ein Neurotoxin, welches bei Verabreichung an Tiere nigrale/striatale Dopamin-Neuronen im Gehirn selektiv schädigt, was die durch Parkinson-Krankheit bewirkte Schädigung nachahmt. Während die Tiere vor der Behandlung zum Einsatz der betroffenen Gliedmaßen unfähig waren, stellte der FKBP-Ligand die Fähigkeit der Tiere, sich selbst zu ernähren, wieder her und ergab Verbesserungen bei den Kriterien der lokomotorischen Aktivität, des neurologischen Outcome und der feinmotorischen Kontrolle. Es lagen ebenso entsprechende Zunahmen beim Neuwachstum der geschädigten Nervenendigungen vor. Diese Ergebnisse weisen den Nutzen der FKBP-Liganden für die Behandlung von Erkrankungen des ZNS nach.
  • Aus der obigen Beschreibung können zwei generelle Ansätze hinsichtlich des Designs von nicht-immunsuppressiven Neuroimmunophilin-Liganden erkannt werden. Der erste bezieht die Konstruktion von eingeschränkten zyklischen Analoga von FK-506 ein, in denen die FKBP-bindende Domäne in einer für die Bindung an FKBP optimalen Konformation fixiert ist. Die Vorteile dieses Ansatzes sind die, dass die Konformation der Analoga mittels computerisierter Methoden akkurat modelliert und vorhergesagt werden kann, und dass die Analoga den Ausgangs-Molekülen, die nachgewiesene pharmakologische Eigenschaften aufweisen, stark ähneln. Ein Nachteil ist der, dass die komplizierte Chemie die Anzahl und Typen von Verbindungen, die präpariert werden können, einschränkt. Der zweite Ansatz bezieht die Trial-and- Error-Konstruktion azyklischer Analoga der FKBP-bindenden Domäne durch herkömmliche medizinische Chemie ein. Die Vorteile dieses Ansatzes sind, dass die Chemie für die Produktion der zahllosen Verbindungen geeignet ist, die für solche interaktiven Chemie-Bioassay-Ansätze erforderlich sind. Die Nachteile sind, dass die molekularen Typen von Verbindungen, die entstanden sind, keine bekannte Geschichte der entsprechenden pharmakologischen Eigenschaften vorweisen können, sie eher labile funktionale Estergruppen aufweisen und sie konformationell zu mobil sind, um eine akkurate Vorhersage der konformationellen Eigenschaften vornehmen zu können.
  • Nützliche Verfahren und Reagenzien bezüglich des ersten Ansatzes, doch mit signifikanten Vorteilen, sind hierin beschrieben. Rekombinante PKS-Gene können eine breite Vielfalt von Polyketiden erzeugen, die ansonsten alleine mittels chemischer Methodologie nicht ohne weiteres synthetisiert werden können. Darüber hinaus können die Polyketide entweder eine oder beide der gewünschten immunsuppressiven und neurotrophischen Aktivitäten aufweisen, von denen einige lediglich durch Fermentation erzeugt werden und von denen andere mittels Fermentation und chemischer Modifikation erzeugt werden. Somit binden in einem Aspekt die Verbindungen optimal an FKBP, binden aber nicht an die Effektor-Proteine.
  • Die hierin beschriebenen Verfahren und Reagenzien können zur Herstellung zahlreicher eingeschränkter zyklischer Analoga von FK-520 verwendet werden, bei denen die FKBP-bindende Domäne in einer für die Bindung an FKBP optimalen Konformation fixiert ist. Solche Verbindungen werden eine Neuroimmunophilin-Bindung (neurotrophisch) zeigen, doch keine immunsuppressiven Effekte. Dies erlaubt auch eine direkte Manipulation von FK-520 und verwandter chemischer Strukturen über die gentechnische Konstruktion der an der Biosynthese von FK-520 (als auch verwandter Verbindungen, wie etwa FK-506 und Rapamycin) beteiligten Enzyme; ähnliche chemische Modifikationen sind aufgrund der Komplexität der Strukturen schlicht und einfach nicht möglich. Diese Erfindung kann auch zur Einführung "chemischer Griffe" in normalerweise inerte Positionen verwendet werden, die anschließende chemische Modifikationen erlauben.
  • Mehrere allgemeine Ansätze, um die Entwicklung neuer Neuroimmunophilin-Liganden zu erzielen, werden durch die hierin beschriebenen Verfahren und Reagenzien erleichtert. Ein Ansatz besteht im Vornehmen von "Punktmutationen" der funktionalen Gruppen der FK-520-Ausgangsstruktur, die an die Effektormoleküle binden und somit deren Bindungspotenzial ausschalten. Diese Arten von strukturellen Modifikationen sind schwerlich durch chemische Modifikation vorzunehmen, doch können mittels der hierin beschriebenen Verfahren und Reagenzien ohne weiteres erzielt werden.
  • Ein zweiter, umfassenderer Ansatz, der durch die vorliegende Erfindung erleichtert wird, besteht in der Ausnutzung des molekularen Modellings zur Vorhersage optimaler Strukturen ab initio, die an FKBP binden, doch nicht an Effektor-Moleküle. Unter Verwendung der verfügbaren Röntgen-Kristallstruktur von FK-520 (oder FK-506) in Bindung an FKBP kann das molekulare Modelling eingesetzt werden, um Polyketide vorherzusagen, die optimal an FKBP binden sollten, doch nicht an Calcineurin. Verschiedene Makrolid-Strukturen können durch Verknüpfen der Enden der FKBP-bindenden Domäne mit "allen möglichen" Polyketidketten von variablen Längen- und Substitutionsmustern, die durch genetische Manipulation des FK-520- oder FK-506-PKS-Genclusters gemäß der hierin beschriebenen Verfahren hergestellt werden können, erzeugt werden. Die Grundzustands-Konformationen der virtuellen Bibliothek können bestimmt werden, und Verbindungen, die Bindungsdomänen besitzen, die höchstwahrscheinlich gut an FKBP binden, können präpariert und getestet werden.
  • Ist eine Verbindung gemäß der obigen Ansätze einmal identifiziert, so kann eine fokussierte Bibliothek der Analoga um den Lead-Kandidaten herum erzeugt werden, um die Verbindung auf die optimalen Eigenschaften "feinabzustimmen". Schließlich können die hierin beschriebenen gentechnischen Verfahren auf die Erzeugung "chemischer Griffe" gerichtet werden, die es medizinischen Chemikern möglich machen, die Positionen der Moleküle, die zuvor inert gegenüber chemischen Modifikationen waren, zu modifizieren. Dies eröffnet den Weg zu einer zuvor verhinderten chemischen Optimierung der Lead-Verbindungen durch zeiterprobte Ansätze.
  • Weiterhin werden hierin Polyketid-Verbindungen und die rekombinanten Gene für die PKS-Enzyme beschrieben, die die Verbindungen mit ihren signifikanten Vorteilen gegenüber FK-506 und FK-520 und deren Analoga produzieren. Der Metabolismus und die Pharmakokinetik von Tacrolimus ist umfassend untersucht worden, und FK-520 wird als in diesen Bereichen ähnlich erachtet. Die Absorption von Tacrolimus aus dem Magen-Darm-Trakt ist schnell, variabel und unvollständig (Harrison's Principles of Internal Medicine, 14. Auflage, 1998, McGraw Hill, 14, 20, 21, 64–67). Die mittlere Bioverfügbarkeit der oralen Dosierungsform beträgt 27 % (Bereich 5 bis 65 %). Das auf Plasma basierende Volumen der Verteilung (VolD) beträgt 5 bis 65 l pro kg Körpergewicht (l/kg) und ist viel höher als das VolD basierend auf Vollblut-Konzentrationen, wobei die Differenz die Bindung von Tacrolimus an rote Blutzellen wiederspiegelt. Die Vollblut-Konzentrationen können das 12- bis 67-fache der Plasmakonzentrationen betragen. Die Proteinbindung ist hoch (75 bis 99 %), in erster Linie an Albumin und Alpha1-Säure-Glykoprotein. Die Halbwertszeit für die Verteilung beträgt 0,9 Stunden; die Eliminierung ist zweiphasig und variabel: terminal – 11,3 Std. (Bereich 3,5 bis 40,5 Stunden). Die Zeit bis zur Spitzenkonzentration beträgt 0,5 bis 4 Stunden nach oraler Verabreichung.
  • Tacrolimus wird primär durch Zytochrom P450 3A-Enzyme in der Leber und im Dünndarm metabolisiert. Der Wirkstoff wird umfassend metabolisiert und zu weniger als 1 % unverändert im Harn ausgeschieden. Da eine hepatische Dysfunktion die Ausscheidung von Tacrolimus herabsetzt, müssen die Dosen bei primärer Transplantat-Nichtfunktion beträchtlich herabgesetzt werden, besonders bei Kindern. Außerdem reduzieren Wirkstoffe, die die Zytochrom P450 3A-Enyzme induzieren, die Tacrolimusmengen, wohingegen Wirkstoffe, die diese P450s hemmen, die Tacrolimusmengen erhöhen. Die Bioverfügbarkeit von Tacrolimus verdoppelt sich bei gleichzeitiger Verabreichung von Ketoconazol, einem Wirkstoff, der P450 3A hemmt. Siehe Vincent et al., 1992, In vitro metabolism of FK-506 in rat, rabbit, and human liver microsomes: Identification of a major metabolite and of cytochrome P450 3A as the major enzymes responsible for its metabolism, Arch. Biochem. Biophys. 294: 454–460; Iwasaki et al., 1993, Isolation, identification, and biological activities of oxidative metabolites of FK-506, a potent immunosuppressive macrolide lactone, Drug Metabolism & Disposition 21: 971–977; Shiraga et al., 1994, Metabolism of FK-506, a potent immunosuppressive agent, by cytochrome P450 3A enzymes in rat, dog, and human liver microsomes, Biochem. Pharmacol. 47: 727–735; und Iwasaki et al., 1995, Further metabolism of FK-506 (Tacrolimus); Identification and biological activities of the metabolites oxidized at multiple sites of F-506, Drug Metabolism & Disposition 23:28–34. Die Zytochrom P450 3A-Unterfamilie der Isozyme ist als bei diesem Abbauprozess wichtig impliziert worden.
  • Strukturen der acht isolierten Metaboliten, die durch Lebermikrosome gebildet werden, sind in 6 gezeigt. Vier Metabolite von FK-506 beziehen die Demethylierung der Sauerstoffatome an Kohlenstoffen 13, 15 und 31 und die Hydroxylierung des Kohlenstoffs 12 ein. Die 13-demethylierten (Hydroxy) Verbindungen vollziehen Zyklisierungen des 13-Hydroxy bei C-10 und ergeben MI, MVI und MVII, und der 12-Hydroxy-Metabolit bei C-10 ergibt I. Weitere durch Oxidation der oben genannten vier Metaboliten gebildete vier Metaboliten wurden durch Lebermikrosome aus Dexamethason-behandelten Ratten isoliert. Drei von diesen sind Metabolite, die an den Methoxygruppen an Kohlenstoffen 15 und 31 (M-V), 13 und 31 (M-VI) und 13 und 15 (M-VII) doppelt demethyliert sind. Der vierte, M-VIII, war der nach Demethylierung der 31-Methoxygruppe, gefolgt von der Bildung eines fusionierten Ringsystems durch weitere Oxidation, erzeugte Metabolit. Von den acht Metaboliten weist M-II eine immunsuppressive Aktivität auf, die der von FK-506 vergleichbar ist, wohingegen die anderen Metaboliten schwache oder vernachlässigbare Aktivitäten zeigen. Bedeutsamerweise ist der Hauptmetabolit von Menschen-, Hunde- und Rattenleber-Mikrosomen der 13-demethylierte und zyklisierte FK-506 (M-I).
  • Somit verläuft der Hauptmetabolismus von FK-506 über die 13-Demethylierung, gefolgt von der Zyklisierung zu dem inaktiven M-I, wobei dies etwa 90 % der Stoffwechselprodukte nach einer 10-minütigen Inkubation mit Lebermikrosomen ausmacht. Analoga von Tacrolimus, die keine C-13-Methoxygruppe besitzen, wären nicht für die erste und wichtigste Biotransformation im destruktiven Metabolismus von Tacrolimus (d.h. Zyklisierung von 13-Hydroxy zu C-10) empfänglich. Somit sollte ein 13-Desmethoxy-Analogon von FK-506 eine längere Halbwertszeit im Körper aufweisen als FK-506. Die C-13-Methoxygruppe wird als für die Bindung an FKBP oder Calcineurin nicht erforderlich erachtet. Das C-13-Methoxy ist an der identischen Po sition von Rapamycin, welche an FKBP mit äquipotenter Affinität wie Tacrolimus bindet, nicht vorhanden. Auch zeigt die Analyse der 3-dimensionalen Struktur des FKBP-Tacrolimus-Calcineurin-Komplexes, dass das C-13-Methoxy keine Interaktion mit FKBP und eine lediglich geringfügige Interaktion mit Calcineurin zeigt. Die vorliegende Erfindung stellt C-13-Desmethoxy-Analoga von FK-506 und FK-520 bereit, als auch die rekombinanten Gene, die die PKS-Enzyme, die deren Synthese katalysieren, codieren, und Wirtszellen, die die Verbindungen produzieren.
  • Diese Verbindungen zeigen, relativ zu ihren natürlich vorkommenden Pendants, eine längere immunsuppressive Wirkung in vivo, wobei sie eine niedrigere Dosierung und/oder verminderte Häufigkeit der Verabreichung ermöglichen. Die Dosierung ist vorhersagbarer, da die Variabilität in der FK-506-Dosierung großteils auf die Schwankung der Stoffwechselrate zurückzuführen ist. Die FK-506-Mengen im Blut können in Abhängigkeit von Wechselwirkungen mit Wirkstoffen, die Zytochrom P450 3A induzieren oder inhibieren, breit variieren (zusammengefasst in USP Drug Information for the Health Care Professional). Von besonderer Bedeutung sind die zahlreichen Wirkstoffe, die CYP 3A inhibieren oder darum konkurrieren, da sie die FK-506-Blutspiegel erhöhen und zu Toxizität führen (Prograf-Packungsbeilage, Fujisawa☐US, Rev 4/97, Rec 6/97). Ebenfalls von Bedeutung sind die Wirkstoffe, die P450 3A (z.B. Dexamethason) induzieren, da sie die FK-506-Blutspiegel senken und die Wirksamkeit vermindern. Da der Hauptort der CYP 3A-Wirkung auf FK-506 in den durch die vorliegende Erfindung bereitgestellten Analoga entfernt ist, sind diese Analoga weniger empfänglich für Wirkstoff-Interaktionen als die natürlich vorkommenden Verbindungen.
  • Hyperglykämie, Nephrotoxizität und Neurotoxizität sind die signifikantesten Nebenwirkungen, die aus der Verwendung von FK-506 resultieren, und werden für FK-520 als ähnlich angenommen. Da diese Wirkungen primär mittels desselben Mechanismus wie die immunsuppressive Wirkung (d.h. FKBP-Calcineurin-Interaktion) aufzutreten scheinen, mag die intrinsische Toxizität der Desmethoxy-Analoga ähnlich zu FK-506 sein. Die Toxizität von FK-506 ist jedoch dosisabhängig und korreliert mit hohen Blutspiegeln des Wirkstoffs (Prograf-Packungsbeilage, Fujisawa☐US, Rev 4/97, Rec. 6/97). Da die Mengen der durch die vorliegende Erfindung bereitgestellten Verbindungen kontrollierbarer sein sollten, sollte das Auftreten von Toxizität mit dem 13-Desmethoxy-Analoga signifikant herabgesetzt sein. Einige Berichte zeigen, dass bestimmte FK-506-Metaboliten toxischer sind als FK-506 selbst, wobei dies einen zusätzlichen Grund für die Erwartung liefert, dass ein CYP 3A-resistentes Analogon eine geringere Toxizität und einen höheren therapeutischen Index aufweisen kann.
  • Somit stellt die vorliegende Erfindung neue Verbindungen bereit, die strukturell dem FK-506 und FK-520 verwandt sind, doch verbesserte Eigenschaften aufweisen. Diese Verbindungen können durch Fermentation rekombinanter Wirtszellen hergestellt werden. Die rekombinanten Wirtszellen, die rekombinanten Vektoren in diesen Wirtszellen und die durch diese Vektoren codierten rekombinanten Proteine sind hierin beschrieben. Weitere wertvolle Materialien, die in der Konstruktion dieser rekombinanten Vektoren nützlich sind, haben außerdem viele weitere wichtige Anwendungen. Insbesondere werden die FK-520-PKS-Gene hierin beschrieben, als auch bestimmte, an der Biosynthese von FK-520 in rekombinanter Form beteiligte Gene.
  • FK-520 wird in relativ geringen Mengen in den natürlich vorkommenden Zellen, Streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus, worin es erstmals identifiziert wurde, produziert. Somit ist ein weiterer, durch die rekombinante FK-520-PKS und verwandte Gene gebotener Nutzen die Möglichkeit, FK-520 in größeren Mengen in den hierin beschriebenen rekombinanten Wirtszellen zu produzieren. Die Verfahren zur Herstellung der neuen FK-520-Analoga sind ebenfalls hierin beschrieben, zusätzlich zu den oben beschriebenen Desmethoxy-Analoga und Derivaten in rekombinanten Wirtszellen eines beliebigen Ursprungs.
  • Die Biosynthese von FK-520 bezieht die Wirkung mehrerer Enzyme ein. Das FK-520-PKS-Enzym, welches sich aus den fkbA, fkbB, fkbC und fkbP-Genprodukten zusammensetzt, synthetisiert die Core-Struktur des Moleküls. Es findet auch eine Hydroxylierung bei C-9 statt, vermittelt durch die P450-Hydroxylase, die das fkbD-Genprodukt darstellt und die durch das fkbO-Genprodukt oxidiert wird, was zur Bildung einer Ketogruppe bei C-9 führt. Es findet außerdem eine Methylierung bei C-31 statt, die durch eine O-Methyltransferase vermittelt ist, welche das fkbM-Genprodukt darstellt. Ebenso finden Methylierungen an den C-13- und C-15-Positionen durch eine Methyltransferase, die angenommenermaßen durch das fkbG-Gen codiert wird, statt; diese Methyltransferase kann an den Hydroxymalonyl-CoA-Substraten vor der Bindung des Substrats an die AT-Domänen der PKS während der Polyketid-Synthese agieren. Die Gene, die diese Enzyme in rekombinanter Form codieren, sind hierin beschrieben. Die Gene, die die an der Ethylmalonyl-CoA- und 2-Hydroxymalonyl-CoA-Biosynthese beteiligten Enzyme in rekombinanter Form codieren, sind ebenfalls hierin beschrieben. Darüber hinaus sind rekombinante Streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus-Wirtszellen, denen eines oder mehrere dieser Gene fehlen, in der Produktion nützlicher Verbindungen von Nutzen.
  • Die Zellen sind für die Produktion in vielfältiger Weise nützlich. Erstens stellen bestimmte Zellen eine nützliche FK-520-verwandte Verbindung lediglich als Folge der Inaktivierung eines oder mehrerer der FK-520-Biosynthese-Gene dar. Daher wird durch Inaktivierung des C-31-O-Methyltransferase-Gens in Streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus eine Wirtszelle geschaffen, die ein Desmethyl (bei C-31)-Derivat von FK-520 ergibt. Zweitens sind andere Zellen zur Produktion von FK-520 oder FK-520-verwandten Verbindungen aufgrund einer Inaktivierung eines oder mehrerer der PKS-Gene unfähig. Diese Zellen sind in der Produktion anderer, durch PKS-Enzyme erzeugter Polyketide nützlich, die auf rekombinanten Expressionsvektoren codiert und in die Wirtszelle eingeführt sind.
  • Ist darüber hinaus lediglich ein PKS-Gen inaktiviert, so wird die Möglichkeit, eine FK-520- oder eine FK-520-Derivat-Verbindung herzustellen, durch Einführung eines rekombinanten Expressionsvektors wiederhergestellt, der das funktionelle Gen in einer modifizierten oder unmodifizierten Form enthält. Das eingeführte Gen produziert ein Genprodukt, das zusammen mit den anderen endogenen und funktionalen Genprodukten die gewünschte Verbindung erzeugt. Diese Methodologie erlaubt die Herstellung von FK-520-Derivat-Verbindungen, ohne dass es erforderlich wäre, dass alle der Gene für das PKS-Enzym auf einem oder mehreren Expressionsvektoren vorhanden sind. Weitere Anwendungen und Nutzen dieser Zellen und der Methodologie werden für Fachleute des Gebiets auf die Betrachtung dessen hin ohne weiteres erkennbar werden, wie die rekombinanten Gene isoliert und in der Konstruktion der Verbindungen der Erfindung eingesetzt wurden.
  • Die biosynthetischen FK-520-Gene wurden anhand der folgenden Verfahrensweise isoliert. Genomische DNA wurde aus Streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus (ATCC 14891) unter Verwendung des Lysozym/Proteinase K-Protokolls, beschrieben in Genetic Manipulation of Streptomyces – A Laboratory Manual (Hopwood et al., 1986), isoliert. Die mittlere Größe der DNA wurde auf zwischen 80–129 kb durch Elektrophorese auf 0,3 % Agarosegelen geschätzt. Eine Bibliothek wurde im SuperCosTM-Vektor entsprechend den Anweisungen des Herstellers und mit den im handelsüblichen Kit (Stratagene) bereitgestellten Reagenzien konstruiert. Kurz dargestellt wurden 100 μg der genomischen DNA mit vier Einheiten Sau3A I für 20 min. in einem Reaktionsvolumen von 1 ml teilverdaut, und die Fragmente wurden dephosphoryliert und an SuperCos-Vektorarme ligiert. Die ligierte DNA wurde verpackt und zur Infizierung von XL1-BlueMR-Zellen in der log-Phase verwendet. Eine Bibliothek von etwa 10.000 unabhängigen Cosmid-Klonen wurde erhalten.
  • Basierend auf der vor kurzem veröffentlichten Sequenz von dem FK-506-Cluster (Motamedi und Shafiee, 1998, Eur. J. Biochem. 256: 528) wurde eine Sonde für das fbkO-Gen aus ATCC 14891 unter Anwendung der PCR mit degenerierten Primern isoliert. Mit dieser Sonde wurde ein als PKOS034-124 bezeichnetes Cosmid aus der Bibliothek isoliert. Mit Sonden, die aus den Enden des Cosmids pKOS034-124 erhalten waren, wurde ein zusätzliches Cosmid, bezeichnet als pKOS034-120, isoliert. Von diesen Cosmiden (pKOS034-124 und pKOS034-120) wurde gezeigt, dass sie DNA-Inserte enthalten, die miteinander überlappen. Initial erstellte Sequenzdaten von diesen beiden Cosmiden erbrachten Sequenzen ähnlich den Sequenzen aus den FK-506- und Rapamycin-Clustern, was darauf hinweist, dass die Inserte von dem FK-520-PKS-Gencluster waren. Zwei EcoRI-Fragmente wurden aus Cosmiden pKOS034-124 und pKOS-034-120 subkloniert. Diese Subklone wurden zur Herstellung von Shotgun-Bibliotheken durch Teilverdau mit Sau3AI, Gelreinigung der Fragmente zwischen 1,5 kb und 3 kb in der Größe und Ligation in den pLitmus28-Vektor (New England Biolabs) verwendet. Diese Bibliotheken wurden unter Verwendung von Farbstoff-markierten Kettenabbruchmolekülen (Dye Terminators) auf einem Beckmann CEQ2000 Kapillarelektrophorese-Sequenzierer gemäß den Protokollen des Herstellers sequenziert.
  • Zum Erhalt von Cosmiden, die Sequenz auf der linken und rechten Seite der oben beschriebenen sequenzierten Region enthielten, wurde eine neue Cosmid-Bibliothek von ATCC 14891-DNA im Wesentlichen wie oben beschrieben präpariert. Diese neue Bibliothek wurde mit einer neuen fkbM-Sonde gescreent, die unter Verwendung von DNA von ATCC 14891 isoliert war. Eine Sonde, die das fkbP-Gen am Ende des Cosmids pKOS034-124 darstellte, wurde ebenfalls verwendet. Mehrere zusätzliche Cosmide auf der rechten Seite der zuvor sequenzierten Region wurden identifiziert. Cosmide pKOS065-C31 und pKOS065-C3 wurden identifiziert und dann mit Restriktionsenzymen kartiert. Die initial erstellten Sequenzen von diesen Cosmiden waren mit der erwarteten Organisation des Clusters in dieser Region übereinstimmend. Eine umfangreichere Sequenzierung zeigte, dass beide Cosmide, zusätzlich zu den gewünschten Sequenzen, weitere Sequenzen enthielten, die nicht benachbart zu den gewünschten Sequenzen auf der chromosomalen Wirtszell-DNA waren. Eine Sondierung zusätzlicher Cosmid-Bibliotheken identifizierte zwei weitere Cosmide, pKOS065-M27 und pKOS065-M21, die die gewünschten Sequenzen in einem benachbarten Segment der chromosomalen DNA enthielten. Cosmide pKOS034-124, pKOS034-120, pKOS065-M27 und pKOS065-M21 sind bei der American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA, hinterlegt worden. Die vollständige Nukleotidsequenz der Codierungssequenzen der Gene, die die Proteine der FK-520-PKS codieren, sind nachstehend gezeigt, doch können auch aus den bei der ATCC hinterlegten Cosmiden unter Anwendung einer standardmäßigen Methodolo gie bestimmt werden.
  • Bezugnehmend auf 1 und 3, setzt sich der FK-520-PKS-Gencluster aus vier offenen Leserahmen, bezeichnet als fkbB, fkbC, fkbA und fkbP, zusammen. Der offene Leserahmen fkbB codiert das Lademodul und die ersten vier Extendermodule der PKS. Der offene Leserahmen fkbC codiert Extendermodule fünf und sechs der PKS. Der offene Leserahmen fkbA codiert Extendermodule sieben, acht, neun und zehn der PKS. Der offene Leserahmen fkbP codiert die NRPS der PKS. Jedes dieser Gene kann aus den oben beschriebenen Cosmiden isoliert werden. Die DNA-Sequenzen dieser Gene sind unten wiedergegeben, wobei dem die folgende Tabelle vorangeht, die die Start- und Stoppcodons der offenen Leserahmen jedes Gens und die darin enthaltenen Module und Domänen identifiziert.
  • Figure 00300001
  • Figure 00310001
  • Figure 00320001
  • Figure 00330001
  • Figure 00340001
  • Figure 00350001
  • Figure 00360001
  • Figure 00370001
  • Figure 00380001
  • Figure 00390001
  • Figure 00400001
  • Figure 00410001
  • Figure 00420001
  • Figure 00430001
  • Figure 00440001
  • Figure 00450001
  • Figure 00460001
  • Figure 00470001
  • Figure 00480001
  • Figure 00490001
  • Figure 00500001
  • Figure 00510001
  • Figure 00520001
  • Figure 00530001
  • Fachleute des Gebiets werden erkennen, dass aufgrund der degenerativen Natur des genetischen Codes eine Vielzahl von DNA-Verbindungen, die in ihren Nukleotidsequenzen abweichen, zur Codierung einer gegebenen Aminosäuresequenz verwendet werden können. Die native DNA-Sequenz, die FK-520-PKS von Streptomyces hygroscopicus codiert, ist hierin lediglich zur Veranschaulichung einer bevorzugten Ausführungsform gezeigt, wobei DNA-Verbindungen einer beliebigen Sequenz, die die Aminosäuresequenzen der Polypeptide und Proteine codieren, verwendet werden können. In ähnlicher Weise kann ein Polypeptid typischerweise ein oder mehrere Aminosäure-Substitutionen, -Deletionen und -Insertionen in seiner Aminosäuresequenz ohne Verlust oder wesentlichen Verlust einer gewünschten Aktivität tolerieren. Solche Polypeptide können alternierende Aminosäuresequenzen aufweisen, wobei die gezeigten Aminosäuresequenzen lediglich bevorzugte Ausführungsformen veranschaulichen.
  • Die hierin beschriebenen rekombinanten Nukleinsäuren, Proteine und Peptide sind zahlreich und vielfältig. Um das Verständnis der Erfindung und der hierin bereitgestellten vielfältigen Verbindungen und Verfahren zu erleichtern, wird die folgende allgemeine Beschreibung der FK-520-PKS-Gene und der dadurch codierten Module der PKS-Proteine bereitgestellt. Dieser allgemeinen Beschreibung folgt eine ausführlichere Beschreibung der verschiedenen Domänen und Module der FK-520-PKS, die in den Verbindungen der Erfindung enthalten und durch diese codiert sind. In dieser Beschreibung bezieht sich ein Verweis auf eine heterologe PKS auf jegliche PKS außer der FK-520-PKS. Sofern nicht anders angegeben, umfasst die Bezugnahme auf eine PKS die Bezugnahme auf einen Abschnitt einer PKS. Darüber hinaus beinhaltet die Bezugnahme auf eine Domäne, Modul oder PKS die Bezugnahme auf die Nukleinsäuren, die dieselben codieren und umgekehrt, da die Verfahren und Reagenzien der Erfindung ermöglichen oder einen befähigen, die Proteine und die Nukleinsäuren, die sie codieren, herzustellen.
  • Die FK-520-PKS setzt sich aus drei Proteinen zusammen, die durch drei Gene, bezeichnet als fkbA, fkbB und fkbC, codiert sind. Der fkbA-ORF codiert Extendermodule 7–10 der PKS. Der fkbB-ORF codiert das Lademodul (die CoA-Ligase) und Extendermodule 1–4 der PKS. Der fkbC-ORF codiert Extendermodule 5–6 der PKS. Der fkbP-ORF codiert die NRPS, welche die Pipecolinsäure anlagert und das FK-520-Polyketid zyklisiert.
  • Das Lademodul der FK-520-PKS umfasst eine CoA-Ligase, eine ER-Domäne und eine ACP-Domäne. Der Starter-Baustein oder -Einheit für FK-520 wird als eine Dihydroxycyclohexancarboxylsäure angenommen, die von Shikimat abgeleitet ist. Die rekombinanten DNA-Verbindungen, die das Lademodul der FK-520-PKS codieren und die entsprechenden, dadurch codierten Polypeptide sind bei einer Vielzahl von Verfahren und in einer Vielzahl von Verbindungen nützlich. Eine DNA-Verbindung, umfassend eine Sequenz, die das FK-520-Lademodul codiert, kann in eine DNA-Verbindung eingeführt werden, die die Codierungssequenz für eine heterologe PKS umfasst. Das resultierende Konstrukt, in welchem die Codierungssequenz für das Lademodul der heterologen PKS durch die Codierungssequenz für das FK-520-Lademodul ersetzt ist, liefert eine neue PKS-Codierungssequenz. Beispiele der hete rologen PKS-Codierungssequenzen umfassen das Rapamycin, FK-506, Rifamycin und Avermectin-PKS-Codierungssequenzen. Eine DNA-Verbindung, die eine Sequenz umfasst, die das FK-520-Lademodul codiert, kann in eine DNA-Verbindung eingeführt werden, die die Codierungssequenz für die FK-520-PKS oder eine rekombinante FK-520-PKS, die ein FK-520-Derivat produziert, umfasst.
  • Ein Abschnitt der Lademodul-Codierungssequenz kann in Verbindung mit einer heterologen Codierungssequenz verwendet werden. Bei dieser Ausführungsform beispielsweise kann entweder die CoA-Ligase durch eine unterschiedliche CoA-Ligase ersetzt, die ER deletiert oder die ER durch eine unterschiedliche ER ersetzt werden. Außerdem, oder alternativ, kann das ACP durch ein anderes ACP ersetzt werden. In ähnlicher Weise können die entsprechenden Domänen in einem anderen Lade- oder Extendermodul durch ein oder mehrere Domänen der FK-520-PKS ersetzt werden. Die resultierende heterologe Lademodul-Codierungssequenz kann in Verbindung mit einer Codierungssequenz für eine PKS verwendet werden, die FK-520, ein FK-520-Derivat oder ein anderes Polyketid synthetisiert.
  • Das erste Extendermodul der FK-520-PKS enthält eine KS-Domäne, eine AT-Domäne, die für Methylmalonyl-CoA spezifisch ist, eine DH-Domäne, eine KR-Domäne und eine ACP-Domäne. Die rekombinanten DNA-Verbindungen, die das erste Extendermodul der FK-520-PKS codiert, und die entsprechenden, dadurch codierten Polypeptide, sind für eine Vielzahl von Anwendungen nützlich. Eine DNA-Verbindung, umfassend eine Sequenz, die das erste FK-520-Extendermodul codiert, kann in eine DNA-Verbindung eingeführt werden, die die Codierungssequenz für eine heterologe PKS umfasst. Das resultierende Konstrukt, in welchem die Codierungssequenz für ein Modul der heterologen PKS entweder durch die für das erste Extendermodul der FK-520-PKS ersetzt ist oder die letztere lediglich den Codierungssequenzen für Module der heterologen PKS hinzuaddiert ist, liefert eine neue PKS-Codierungssequenz. Alternativ kann eine DNA-Verbindung, umfassend eine Sequenz, die das erste Extendermodul der FK-520-PKS codiert, in eine DNA-Verbindung inseriert werden, die den Rest der Codierungssequenz für die FK-520-PKS oder eine rekombinante FK-520-PKS, die ein FK-520-Derivat produziert, umfasst.
  • Alles oder lediglich ein Abschnitt der Codierungssequenz des ersten Extendermoduls kann in Verbindung mit anderen PKS-Codierungssequenzen verwendet werden, um ein Hybrid-Modul zu schaffen. Beispielsweise kann entweder die Methylmalonyl-CoA-spezifische AT durch eine Malonyl-CoA-, Ethylmalonyl-CoA- oder 2-Hydroxymalonyl-CoA-spezifische AT ersetzt werden; entweder die DH oder KR oder beides deletiert werden; die DH oder KR oder beides durch eine andere DH oder KR ersetzt werden; und/oder eine ER inseriert werden. Beim Austauschen oder Inserieren von KR-, DH- und ER-Domänen ist es oftmals von Vorteil, die bestehenden KR-, DH- und ER-Domänen gegen den kompletten Satz an Domänen auszutauschen, der von einem anderen Modul gewünscht wird. Wird also gewünscht, eine ER-Domäne auszutauschen, so können einfach die existierenden KR- und DH-Domänen durch einen Satz von KR-, DH- und ER-Domänen aus einem Modul, das diese Domänen enthält, ersetzt werden. Außerdem kann die KS und/oder das ACP durch eine andere KS und/oder ACP ersetzt werden. Bei jedem dieser Austäusche oder Insertionen kann die heterologe KS-, AT-, DH-, KR-, ER- oder ACP-Codierungssequenz von einer Codierungssequenz für ein anderes Modul der FK-520-PKS, von einem Gen für eine PKS, die ein anderes Polyketid als FK-520 produziert, oder aus der chemischen Synthese stammen. Die resultierende heterologe Codierungssequenz des ersten Extendermoduls kann in Verbindung mit einer Codierungssequenz für eine PKS verwendet werden, die FK-520, ein FK-520-Derivat oder ein anderes Polyketid synthetisiert. In ähnlicher Weise können die entsprechenden Domänen in einem Modul einer heterologen PKS durch ein oder mehrere Domänen des ersten Extendermoduls der FK-520-PKS ersetzt werden.
  • Rekombinante PKS und rekombinante DNA-Verbindungen und Vektoren, die solche PKS codieren, in denen die KS-Domäne des ersten Extendermoduls inaktiviert worden ist, werden bereitgestellt. Solche Konstrukte sind besonders nützlich, wenn sie in translationale Leserahmen mit den verbliebenen Modulen und Domänen einer FK-520- oder FK-520-Derivat-PKS eingebracht werden. Der Nutzen dieser Konstrukte besteht darin, dass Wirtszellen, die die dadurch codierte PKS exprimieren, oder zellfreie Extrakte, die diese enthalten, mit N-Acetylcysteaminthioestern der neuen Vorläufer-Moleküle gefüttert oder beliefert werden können, um FK-520-Derivate zu prä parieren. Siehe US-Patentanmeldung der laufenden Nr. 60/117.384, eingereicht am 27. Januar 1999, und PCT-Patentveröffentlichungen Nrn. US97/02358 und US99/03986.
  • Das zweite Extendermodul der FK-520-PKS enthält eine KS, eine für Methylmalonyl-CoA spezifische AT, eine KR, eine inaktive DH und ein ACP. Die rekombinanten DNA-Verbindungen, die das zweite Extendermodul der FK-520-PKS codieren, und die entsprechenden, dadurch codierten Polypeptide sind bei einer Vielzahl von Anwendungen nützlich. Eine DNA-Verbindung, umfassend eine Sequenz, die das zweite FK-520-Extendermodul codiert, kann in eine DNA-Verbindung eingeführt werden, die die Codierungssequenz für eine heterologe PKS umfasst. Das resultierende Konstrukt, in dem die Codierungssequenz für ein Modul der heterologen PKS entweder durch die für das zweite Extendermodul der FK-520-PKS ersetzt ist oder die letztere lediglich den Codierungssequenzen für die Module der heterologen PKS hinzuaddiert ist, liefert eine neue PKS-Codierungssequenz. Eine DNA-Verbindung, umfassend eine Sequenz, die das zweite Extendermodul der FK-520-PKS codiert, kann in eine DNA-Verbindung eingeführt werden, die die Codierungssequenz für den Rest der FK-520-PKS oder eine rekombinante FK-520-PKS, die ein FK-520-Derivat produziert, umfasst.
  • Alles oder ein Abschnitt der Codierungssequenz des zweiten Extendermoduls kann in Verbindung mit anderen PKS-Codierungssequenzen verwendet werden, um ein Hybrid-Modul zu schaffen. Beispielsweise kann entweder die Methylmalonyl-CoA-spezifische AT durch eine Malonyl-CoA, Ethylmalonyl-CoA oder 2-Hydroxymalonyl-CoA-spezifische AT ersetzt werden; die KR und/oder die inaktive DH deletiert werden; die KR durch eine andere KR ersetzt werden; und/oder eine aktive DH oder eine aktive DH und eine ER inseriert werden. Außerdem kann die KS und/oder das ACP durch eine andere KS und/oder ACP ersetzt werden. Bei jedem dieser Austäusche oder Insertionen kann die heterologe KS-, AT-, DH-, KR-, ER- oder ACP-Codierungssequenz von einer Codierungssequenz für ein anderes Modul der FK-520-PKS, von einer Codierungssequenz für eine PKS, die ein anderes Polyketid als FK-520 produziert oder aus der chemischen Synthese stammen. Die resultierende heterologe Codierungssequenz des zweiten Extendermoduls kann in Verbindung mit einer Codierungssequenz von einer PKS verwendet werden, die FK-520, ein FK-520-Derivat oder ein anderes Polyketid synthetisiert. In ähnlicher Weise können die entsprechenden Domänen in einem Modul einer heterologen PKS durch ein oder mehrere Domänen des zweiten Extendermoduls der FK-520-PKS ersetzt werden.
  • Das dritte Extendermodul der FK-520-PKS enthält eine KS, eine für Methylmalonyl-CoA spezifische AT, eine KR, eine inaktive DH und ein ACP. Die rekombinanten DNA-Verbindungen, die das dritte Extendermodul der FK-520-PKS codieren, und die entsprechenden, dadurch codierten Polypeptide sind bei einer Vielzahl von Anwendungen nützlich. Eine DNA-Verbindung, umfassend eine Sequenz, die das dritte FK-520-Extendermodul codiert, kann in eine DNA-Verbindung eingeführt werden, die die Codierungssequenz für eine heterologe PKS umfasst. Das resultierende Konstrukt, in dem die Codierungssequenz für ein Modul der heterologen PKS entweder durch die für das dritte Extendermodul der FK-520-PKS ersetzt ist oder die letztere lediglich den Codierungssequenzen für die Module der heterologen PKS hinzuaddiert ist, liefert eine neue PKS-Codierungssequenz. Eine DNA-Verbindung, umfassend eine Sequenz, die das dritte Extendermodul der FK-520-PKS codiert, kann in eine DNA-Verbindung eingeführt werden, die die Codierungssequenz für den Rest der FK-520-PKS oder eine rekombinante FK-520-PKS, die ein FK-520-Derivat produziert, umfasst.
  • Alles oder ein Abschnitt der Codierungssequenz des dritten Extendermoduls kann in Verbindung mit anderen PKS-Codierungssequenzen verwendet werden, um ein Hybrid-Modul zu schaffen. Beispielsweise kann entweder die Malonyl-CoA-spezifische AT durch eine Methylmalonyl-CoA, Ethylmalonyl-CoA oder 2-Hydroxymalonyl-CoA-spezifische AT ersetzt werden; die KR und/oder die inaktive DH deletiert werden; die KR durch eine andere KR ersetzt werden; und/oder eine aktive DH oder eine aktive DH und eine ER inseriert werden. Außerdem kann die KS und/oder das ACP durch eine andere KS und/oder ACP ersetzt werden. Bei jedem dieser Austäusche oder Insertionen kann die heterologe KS-, AT-, DH-, KR-, ER- oder ACP-Codierungssequenz von einer Codierungssequenz für ein anderes Modul der FK-520-PKS, von einer Codierungssequenz für eine PKS, die ein anderes Polyketid als FK-520 produziert oder aus der chemischen Synthese stammen. Die resultierende heterologe Codierungssequenz des dritten Extendermoduls kann in Verbindung mit einer Codierungssequenz von einer PKS verwendet werden, die FK-520, ein FK-520-Derivat oder ein anderes Polyketid synthetisiert. In ähnlicher Weise können die entsprechenden Domänen in einem Modul einer heterologen PKS durch ein oder mehrere Domänen des zweiten Extendermoduls der FK-520-PKS ersetzt werden.
  • Das vierte Extendermodul der FK-520-PKS enthält eine KS, eine AT, die Ethylmalonyl-CoA bindet, eine inaktive DH und ein ACP. Die rekombinanten DNA-Verbindungen, die das vierte Extendermodul der FK-520-PKS codieren, und die entsprechenden, dadurch codierten Polypeptide sind bei einer Vielzahl von Anwendungen nützlich. Eine DNA-Verbindung, umfassend eine Sequenz, die das vierte FK-520-Extendermodul codiert, kann in eine DNA-Verbindung eingeführt werden, die die Codierungssequenz für eine heterologe PKS umfasst. Das resultierende Konstrukt, in dem die Codierungssequenz für ein Modul der heterologen PKS entweder durch die für das vierte Extendermodul der FK-520-PKS ersetzt ist oder die letztere lediglich den Codierungssequenzen für die Module der heterologen PKS hinzuaddiert ist, liefert eine neue PKS-Codierungssequenz. Eine DNA-Verbindung, umfassend eine Sequenz, die das vierte Extendermodul der FK-520-PKS codiert, kann in eine DNA-Verbindung eingeführt werden, die die Codierungssequenz für den Rest der FK-520-PKS oder eine rekombinante FK-520-PKS, die ein FK-520-Derivat produziert, umfasst.
  • Ein Abschnitt der Codierungssequenz des vierten Extendermoduls kann in Verbindung mit anderen PKS-Codierungssequenzen verwendet werden, um ein Hybrid-Modul zu schaffen. Beispielsweise kann entweder die Ethylmalonyl-CoA-spezifische AT durch eine Malonyl-CoA-, Methylmalonyl-CoA- oder 2-Hydroxymalonyl-CoA-spezifische AT ersetzt werden; und/oder die inaktive DH deletiert werden; eine KR, eine KR und eine aktive DH, oder eine KR, eine aktive DH und eine ER inseriert werden. Außerdem kann die KS und/oder das ACP durch eine andere KS und/oder ACP ersetzt werden. Bei jedem dieser Austäusche oder Insertionen kann die heterologe KS-, AT-, DH-, KR-, ER- oder ACP-Codierungssequenz von einer Codierungssequenz für ein anderes Modul der FK-520-PKS, einer PKS für ein anderes Polyketid als FK-520 oder aus der chemischen Synthese stammen. Die resultierende hete rologe Codierungssequenz des vierten Extendermoduls kann in Verbindung mit einer Codierungssequenz für eine PKS verwendet werden, die FK-520, ein FK-520-Derivat oder ein anderes Polyketid synthetisiert. In ähnlicher Weise können die entsprechenden Domänen in einem Modul einer heterologen PKS durch ein oder mehrere Domänen des vierten Extendermoduls der FK-520-PKS ersetzt werden.
  • Als veranschaulichende Beispiele werden hierin rekombinante Gene, Vektoren und Wirtszellen beschrieben, die aus der Umwandlung der FK-506-PKS zu einer FK-520-PKS und umgekehrt resultieren. Ein rekombinanter Satz von FK-506-PKS-Genen kann bereitgestellt werden, in denen die Codierungssequenzen für das vierte Extendermodul oder wenigstens jene für die AT-Domäne im vierten Extendermodul durch die für die AT-Domäne des vierten Extendermoduls der FK-520-PKS ersetzt worden sind. Diese rekombinante PKS kann zur Produktion von FK-520 in rekombinanten Wirtszellen verwendet werden. Ein rekombinanter Satz von FK-520-PKS-Genen kann bereitgestellt werden, in denen die Codierungssequenzen für das vierte Extendermodul oder wenigstens jene für die AT-Domäne im vierten Extendermodul durch die für die AT-Domäne des vierten Extendermoduls der FK-506-PKS ersetzt worden sind. Diese rekombinante PKS kann zur Produktion von FK-506 in rekombinanten Wirtszellen verwendet werden.
  • Weitere Beispiele der Hybrid-PKS-Enzyme umfassen solche, bei denen die AT-Domäne des Moduls 4 durch eine Malonyl-spezifische AT-Domäne ersetzt worden ist, um eine PKS bereitzustellen, die 21-Desethyl-FK520 produziert, oder durch eine Methylmalonyl-spezifische AT-Domäne, um eine PKS bereitzustellen, die 21-Desethyl-21-methyl-FK520 produziert. Eine weitere Hybrid-PKS wird präpariert, indem die AT und inaktive KR-Domäne des FK-520-Extendermoduls 4 durch eine Methylmalonyl-spezifische AT und eine aktive KR-Domäne ersetzt wird, so dass beispielsweise aus Modul 2 der DEBS- oder Oleandolid-PKS-Enzyme ersetzt wird, um 21-Desethyl-21-methyl-22-desoxo-22-hydroxy-FK520 zu produzieren. Diese mittels dieser Hybrid-PKS-Enzyme produzierten Verbindungen sind Neurotrophine.
  • Das fünfte Extendermodul der FK-520-PKS enthält eine KS, eine AT, die Methylmalonyl-CoA bindet, eine DH, eine KR und ein ACP. Die rekombinanten DNA- Verbindungen, die das fünfte Extendermodul der FK-520-PKS codieren, und die entsprechenden, dadurch codierten Polypeptide sind bei einer Vielzahl von Anwendungen nützlich. Eine DNA-Verbindung, umfassend eine Sequenz, die das fünfte FK-520-Extendermodul codiert, kann in eine DNA-Verbindung eingeführt werden, die die Codierungssequenz für eine heterologe PKS umfasst. Das resultierende Konstrukt, in dem die Codierungssequenz für ein Modul der heterologen PKS entweder durch die für das fünfte Extendermodul der FK-520-PKS ersetzt ist oder die letztere lediglich den Codierungssequenzen für die Module der heterologen PKS hinzuaddiert ist, liefert eine neue PKS. Eine DNA-Verbindung, umfassend eine Sequenz, die das fünfte Extendermodul der FK-520-PKS codiert, kann in eine DNA-Verbindung eingeführt werden, die die Codierungssequenz für die FK-520-PKS oder eine rekombinante FK-520-PKS, die ein FK-520-Derivat produziert, umfasst.
  • Ein Abschnitt der Codierungssequenz des fünften Extendermoduls kann in Verbindung mit anderen PKS-Codierungssequenzen verwendet werden, um ein Hybrid-Modul zu schaffen. Beispielsweise kann entweder die Methylmalonyl-CoA-spezifische AT durch eine Malonyl-CoA-, Ethylmalonyl-CoA- oder 2-Hydroxymalonyl-CoA-spezifische AT ersetzt werden; irgendeine oder beides von DH und KR deletiert werden; irgendeine oder beides von DH und KR durch entweder eine KR und/oder eine DH ersetzt werden; und/oder eine ER inseriert werden. Außerdem kann die KS und/oder das ACP durch eine andere KS und/oder ACP ersetzt werden. Bei jedem dieser Austäusche oder Insertionen kann die heterologe KS-, AT-, DH-, KR-, ER- oder ACP-Codierungssequenz von einer Codierungssequenz für ein anderes Modul der FK-520-PKS, von einer Codierungssequenz für eine PKS, die ein anderes Polyketid als FK-520 produziert, oder aus der chemischen Synthese stammen. Die resultierende heterologe Codierungssequenz des fünften Extendermoduls kann in Verbindung mit einer Codierungssequenz für eine PKS verwendet werden, die FK-520, ein FK-520-Derivat oder ein anderes Polyketid synthetisiert. In ähnlicher Weise können die entsprechenden Domänen in einem Modul einer heterologen PKS durch ein oder mehrere Domänen des fünften Extendermoduls der FK-520-PKS ersetzt werden.
  • In einer anschaulichen Ausführungsform wird hierin ein Satz rekombinanter FK-520-PKS-Gene beschrieben, worin die Codierungssequenzen für die DH-Domäne des fünften Extendermoduls deletiert oder mutiert worden sind, um die DH nicht-funktional zu machen. Bei einem solchen mutierten Gen sind die KR- und DH-Codierungssequenzen durch solche ersetzt, die lediglich eine KR-Domäne von einem anderen PKS-Gen codieren. Die resultierenden PKS-Gene codieren für die Expression einer FK-520-PKS, die ein FK-520-Analogon produziert, dem die C-19- bis C-20-Doppelbindung von FK-520 fehlt und das eine C-20-Hydroxylgruppe aufweist. Solche Analoga sind bevorzugte Neurotrophine, da sie wenig oder keine immunsuppressive Aktivität aufweisen. Diese rekombinante Codierungssequenz des fünften Extendermoduls kann mit anderen Codierungssequenzen kombiniert werden, um weitere Verbindungen herzustellen. In einer anschaulichen Ausführungsform wird hierin eine rekombinante FK-520-PKS beschrieben, die sowohl dieses fünfte Extendermodul als auch das oben beschriebene rekombinante vierte Extendermodul enthält, das die Codierungssequenz für die AT-Domäne des vierten Extendermoduls der FK-506-PKS umfasst. Ebenfalls beschrieben sind rekombinante Wirtszellen, die von FK-506-produzierenden Wirtszellen abgeleitet sind, die mutiert worden sind, um die Produktion von FK-506 zu verhindern, doch die diese rekombinante PKS exprimieren und so das entsprechende FK-506-Derivat (dem die C-19- bis C-20-Doppelbindung der FK-506 fehlt und das eine C-20-Hydroxylgruppe aufweist) synthetisieren. Ebenfalls beschrieben ist eine rekombinante FK-506-PKS, in der die DH-Domäne des Moduls 5 deletiert oder anderweitig inaktiv gemacht worden ist, und die somit dieses neue Polyketid produziert.
  • Das sechste Extendermodul der FK-520-PKS enthält eine KS, eine für Methylmalonyl-CoA spezifische AT, eine KR, eine DH und ein ACP. Die rekombinanten DNA-Verbindungen, die das sechste Extendermodul der FK-520-PKS codieren, und die entsprechenden, dadurch codierten Polypeptide sind bei einer Vielzahl von Anwendungen nützlich. Eine DNA-Verbindung, umfassend eine Sequenz, die das sechste FK-520-Extendermodul codiert, kann in eine DNA-Verbindung eingeführt werden, die die Codierungssequenz für eine heterologe PKS umfasst. Das resultierende Konstrukt, in dem die Codierungssequenz für ein Modul der heterologen PKS entweder durch die für das sechste Extendermodul der FK-520-PKS ersetzt ist oder die letzte re lediglich den Codierungssequenzen für die Module der heterologen PKS hinzuaddiert ist, liefert eine neue PKS-Codierungssequenz. Eine DNA-Verbindung, umfassend eine Sequenz, die das sechste Extendermodul der FK-520-PKS codiert, kann in eine DNA-Verbindung eingeführt werden, die die Codierungssequenz für den Rest der FK-520-PKS oder eine rekombinante FK-520-PKS, die ein FK-520-Derivat produziert, umfasst.
  • Ein Abschnitt der Codierungssequenz des sechsten Extendermoduls kann in Verbindung mit anderen PKS-Codierungssequenzen verwendet werden, um ein Hybrid-Modul zu schaffen. Beispielsweise kann entweder die Methylmalonyl-CoA-spezifische AT durch eine Malonyl-CoA, Ethylmalonyl-CoA oder 2-Hydroxymalonyl-CoA-spezifische AT ersetzt werden; irgendeine, zwei oder alle drei von KR, DH und ER deletiert werden; und/oder irgendeine, zwei oder alle drei von KR, DH und ER durch eine andere KR, DH und ER ersetzt werden. Außerdem kann die KS und/oder das ACP durch eine andere KS und/oder ACP ersetzt werden. Bei jedem dieser Austäusche kann die heterologe KS-, AT-, DH-, KR-, ER- oder ACP-Codierungssequenz von einer Codierungssequenz für ein anderes Modul der FK-520-PKS, von einer Codierungssequenz für eine PKS, die ein anderes Polyketid als FK-520 produziert oder aus der chemischen Synthese stammen. Die resultierende heterologe Codierungssequenz des sechsten Extendermoduls kann in Verbindung mit einer Codierungssequenz von einer PKS verwendet werden, die FK-520, ein FK-520-Derivat oder ein anderes Polyketid synthetisiert. In ähnlicher Weise können die entsprechenden Domänen in einem Modul einer heterologen PKS durch ein oder mehrere Domänen des sechsten Extendermoduls der FK-520-PKS ersetzt werden.
  • In einer anschaulichen Ausführungsform wird hierin ein Satz rekombinanter FK-520-PKS-Gene beschrieben, worin die Codierungssequenzen für die DH- und ER-Domänen des sechsten Extendermoduls deletiert oder mutiert worden sind, um sie nicht-funktional zu machen. Bei einem solchen mutierten Gen sind die KR-, ER- und DH-Codierungssequenzen durch solche ersetzt, die lediglich eine KR-Domäne von einem anderen PKS-Gen codieren. Dies kann durch einfaches Ersetzen der Codierungssequenzen für Extendermodul Sechs durch solche für ein Extendermodul mit einer Methylmalonyl-spezifischen AT und lediglich einer KR-Domäne von einem he terologen PKS-Gen, wie zum Beispiel den Codierungssequenzen für Extendermodul Zwei, das durch das eryAI-Gen codiert ist, erreicht werden. Die resultierenden PKS-Gene codieren für die Expression einer FK-520-PKS, die ein FK-520-Analogon produziert, das eine C-18-Gruppe aufweist. Solche Analoga sind bevorzugte Neurotrophine, da sie wenig oder keine immunsuppressive Aktivität aufweisen. Diese rekombinante Codierungssequenz des sechsten Extendermoduls kann mit anderen Codierungssequenzen kombiniert werden, um weitere Verbindungen herzustellen. In einer anschaulichen Ausführungsform wird hierin eine rekombinante FK-520-PKS beschrieben, die sowohl dieses sechste Extendermodul als auch das oben beschriebene rekombinante vierte Extendermodul enthält, das die Codierungssequenz für die AT-Domäne des vierten Extendermoduls der FK-506-PKS umfasst. Ebenfalls beschrieben sind rekombinante Wirtszellen, die von FK-506-produzierenden Wirtszellen abgeleitet sind, die mutiert worden sind, um die Produktion von FK-506 zu verhindern, doch die diese rekombinante PKS exprimieren und so das entsprechende FK-506-Derivat (mit einer C-18-Hydroxylgruppe) synthetisieren. Ebenfalls beschrieben ist eine rekombinante FK-506-PKS, in der die DH- und ER-Domänen des Moduls 6 deletiert oder anderweitig inaktiv gemacht worden sind, und die somit dieses neue Polyketid produziert.
  • Das siebte Extendermodul der FK-520-PKS enthält eine KS, eine für 2-Hydroxymalonyl-CoA spezifische AT, eine KR, eine DH, eine ER und ein ACP. Die rekombinanten DNA-Verbindungen, die das siebte Extendermodul der FK-520-PKS codieren, und die entsprechenden, dadurch codierten Polypeptide sind bei einer Vielzahl von Anwendungen nützlich. Eine DNA-Verbindung, umfassend eine Sequenz, die das siebte FK-520-Extendermodul codiert, kann in eine DNA-Verbindung eingeführt werden, die die Codierungssequenz für eine heterologe PKS umfasst. Das resultierende Konstrukt, in dem die Codierungssequenz für ein Modul der heterologen PKS entweder durch die für das siebte Extendermodul der FK-520-PKS ersetzt ist oder die letztere lediglich den Codierungssequenzen für die Module der heterologen PKS hinzuaddiert ist, liefert eine neue PKS-Codierungssequenz. Eine DNA-Verbindung, umfassend eine Sequenz, die das siebte Extendermodul der FK-520-PKS codiert, kann in eine DNA-Verbindung eingeführt werden, die die Codierungssequenz für den Rest der FK-520-PKS oder eine rekombinante FK-520-PKS, die ein FK-520-Derivat produziert, umfasst.
  • Ein Abschnitt oder alles der Codierungssequenz des siebten Extendermoduls kann in Verbindung mit anderen PKS-Codierungssequenzen verwendet werden, um ein Hybrid-Modul zu schaffen. Beispielsweise kann entweder die 2-Hydroxymalonyl-CoA-spezifische AT durch eine Methylmalonyl-CoA, Ethylmalonyl-CoA oder Malonyl-CoA-spezifische AT ersetzt werden; die KR, die DH und/oder die ER deletiert werden; und/oder die KR, DH und/oder ER ersetzt werden. Außerdem kann die KS und/oder das ACP durch eine andere KS und/oder ACP ersetzt werden. Bei jedem dieser Austäusche oder Insertionen kann die heterologe KS-, AT-, DH-, KR-, ER- oder ACP-Codierungssequenz von einer Codierungssequenz für ein anderes Modul der FK-520-PKS, von einer Codierungssequenz für eine PKS, die ein anderes Polyketid als FK-520 produziert oder aus der chemischen Synthese stammen. Die resultierende heterologe Codierungssequenz des siebten Extendermoduls kann in Verbindung mit einer Codierungssequenz für eine PKS verwendet werden, die FK-520, ein FK-520-Derivat oder ein anderes Polyketid synthetisiert. In ähnlicher Weise können die entsprechenden Domänen in einem Modul einer heterologen PKS durch ein oder mehrere Domänen des siebten Extendermoduls der FK-520-PKS ersetzt werden.
  • In einer anschaulichen Ausführungsform wird hierin ein Satz rekombinanter FK-520-PKS-Gene beschrieben, worin die Codierungssequenzen für die AT-Domäne des siebten Extendermoduls durch solche ersetzt worden sind, die eine AT-Domäne für Malonyl-, Methylmalonyl- oder Ethylmalonyl-CoA von einem anderen PKS-Gen codieren. Die resultierenden PKS-Gene codieren für die Expression einer FK-520-PKS, die ein FK-520-Analogon produziert, dem die C-15-Methoxygruppe fehlt und es statt dessen eine Wasserstoff-, Methyl- bzw. Ethylgruppe an jener Position aufweist. Solche Analoga sind bevorzugt, da sie langsamer metabolisiert werden als FK-520. Diese rekombinante Codierungssequenz des siebten Extendermoduls kann mit anderen Codierungssequenzen kombiniert werden, um weitere Verbindungen herzustellen. In einer anschaulichen Ausführungsform wird hierin eine rekombinante FK-520-PKS beschrieben, die sowohl dieses siebte Extendermodul als auch das oben beschrie bene rekombinante vierte Extendermodul enthält, das die Codierungssequenz für die AT-Domäne des vierten Extendermoduls der FK-506-PKS umfasst. Ebenfalls beschrieben sind rekombinante Wirtszellen, die von FK-506-produzierenden Wirtszellen abgeleitet sind, die mutiert worden sind, um die Produktion von FK-506 zu verhindern, doch die diese rekombinante PKS exprimieren und so das entsprechende (C-15-Desmethoxy) FK-506-Derivat synthetisieren. Ebenfalls beschrieben ist eine rekombinante FK-506-PKS, in der die AT-Domäne des Moduls 7 ersetzt worden ist, und die somit dieses neue Polyketid produziert.
  • In einer anderen anschaulichen Ausführungsform wird hierin eine Hybrid-PKS beschrieben, worin die AT- und KR-Domänen des Moduls 7 der FK-520-PKS durch eine Methylmalonyl-spezifische AT-Domäne und eine inaktive KR-Domäne, wie zum Beispiel die AT- und KR-Domänen des Extendermoduls 6 der Rapamycin-PKS, ersetzt sind. Die resultierende Hybrid-PKS produziert 15-Desmethoxy-15-methyl-16-oxo-FK-520, eine Neurotrophin-Verbindung.
  • Das achte Extendermodul der FK-520-PKS enthält eine KS, eine für 2-Hydroxymalonyl-CoA spezifische AT, eine KR und ein ACP. Die rekombinanten DNA-Verbindungen, die das achte Extendermodul der FK-520-PKS codieren, und die entsprechenden, dadurch codierten Polypeptide sind bei einer Vielzahl von Anwendungen nützlich. Eine DNA-Verbindung, umfassend eine Sequenz, die das achte FK-520-Extendermodul codiert, kann in eine DNA-Verbindung eingeführt werden, die die Codierungssequenz für eine heterologe PKS umfasst. Das resultierende Konstrukt, in dem die Codierungssequenz für ein Modul der heterologen PKS entweder durch die für das achte Extendermodul der FK-520-PKS ersetzt ist oder die letztere lediglich den Codierungssequenzen für die Module der heterologen PKS hinzuaddiert ist, liefert eine neue PKS-Codierungssequenz. Eine DNA-Verbindung, umfassend eine Sequenz, die das achte Extendermodul der FK-520-PKS codiert, kann in eine DNA-Verbindung eingeführt werden, die die Codierungssequenz für den Rest der FK-520-PKS oder eine rekombinante FK-520-PKS, die ein FK-520-Derivat produziert, umfasst.
  • Ein Abschnitt der Codierungssequenz des achten Extendermoduls kann in Verbindung mit anderen PKS-Codierungssequenzen verwendet werden, um ein Hybrid-Modul zu schaffen. Beispielsweise kann entweder die 2-Hydroxymalonyl-CoA-spezifische AT durch eine Methylmalonyl-CoA, Ethylmalonyl-CoA oder Malonyl-CoA-spezifische AT ersetzt werden; die KR deletiert oder ersetzt werden, und/oder eine DH oder eine DH und eine ER inseriert werden. Außerdem kann die KS und/oder das ACP durch eine andere KS und/oder ACP ersetzt werden. Bei jedem dieser Austäusche oder Insertionen kann die heterologe KS-, AT-, DH-, KR-, ER- oder ACP-Codierungssequenz von einer Codierungssequenz für ein anderes Modul der FK-520-PKS, von einer Codierungssequenz für eine PKS, die ein anderes Polyketid als FK-520 produziert oder aus der chemischen Synthese stammen. Die resultierende heterologe Codierungssequenz des achten Extendermoduls kann in Verbindung mit einer Codierungssequenz für eine PKS verwendet werden, die FK-520, ein FK-520-Derivat oder ein anderes Polyketid synthetisiert. In ähnlicher Weise können die entsprechenden Domänen in einem Modul einer heterologen PKS durch ein oder mehrere Domänen des achten Extendermoduls der FK-520-PKS ersetzt werden.
  • In einer anschaulichen Ausführungsform wird hierin ein Satz rekombinanter FK-520-PKS-Gene beschrieben, worin die Codierungssequenzen für die AT-Domäne des achten Extendermoduls durch solche ersetzt worden sind, die eine AT-Domäne für Malonyl-, Methylmalonyl- oder Ethylmalonyl-CoA von einem anderen PKS-Gen codieren. Die resultierenden PKS-Gene codieren für die Expression einer FK-520-PKS, die ein FK-520-Analogon produziert, dem die C-13-Methoxygruppe fehlt und es statt dessen eine Wasserstoff-, Methyl- bzw. Ethylgruppe an jener Position aufweist. Solche Analoga sind bevorzugt, da sie langsamer metabolisiert werden als FK-520. Diese rekombinante Codierungssequenz des achten Extendermoduls kann mit anderen Codierungssequenzen kombiniert werden, um weitere Verbindungen der Erfindung herzustellen. In einer anschaulichen Ausführungsform wird hierin eine rekombinante FK-520-PKS beschrieben, die sowohl dieses achte Extendermodul als auch das oben beschriebene rekombinante vierte Extendermodul enthält, das die Codierungssequenz für die AT-Domäne des vierten Extendermoduls der FK-506-PKS umfasst. Ebenfalls beschrieben sind rekombinante Wirtszellen, die von FK-506-produzierenden Wirtszellen abgeleitet sind, die mutiert worden sind, um die Produktion von FK- 506 zu verhindern, doch die diese rekombinante PKS exprimieren und so das entsprechende (C-13-Desmethoxy) FK-506-Derivat synthetisieren. Ebenfalls beschrieben ist eine rekombinante FK-506-PKS, in der die AT-Domäne des Moduls 8 ersetzt worden ist, und die somit dieses neue Polyketid produziert.
  • Das neunte Extendermodul der FK-520-PKS enthält eine KS, eine für Methylmalonyl-CoA spezifische AT, eine KR, eine DH, eine ER und ein ACP. Die rekombinanten DNA-Verbindungen, die das neunte Extendermodul der FK-520-PKS codieren, und die entsprechenden, dadurch codierten Polypeptide sind bei einer Vielzahl von Anwendungen nützlich. Eine DNA-Verbindung, umfassend eine Sequenz, die das neunte FK-520-Extendermodul codiert, kann in eine DNA-Verbindung eingeführt werden, die die Codierungssequenz für eine heterologe PKS umfasst. Das resultierende Konstrukt, in dem die Codierungssequenz für ein Modul der heterologen PKS entweder durch die für das neunte Extendermodul der FK-520-PKS ersetzt ist oder die letztere lediglich den Codierungssequenzen für die Module der heterologen PKS hinzuaddiert ist, liefert eine neue PKS-Codierungssequenz. Eine DNA-Verbindung, umfassend eine Sequenz, die das neunte Extendermodul der FK-520-PKS codiert, kann in eine DNA-Verbindung eingeführt werden, die die Codierungssequenz für den Rest der FK-520-PKS oder eine rekombinante FK-520-PKS, die ein FK-520-Derivat produziert, umfasst.
  • Ein Abschnitt der Codierungssequenz des neunten Extendermoduls kann in Verbindung mit anderen PKS-Codierungssequenzen verwendet werden, um ein Hybrid-Modul zu schaffen. Beispielsweise kann entweder die Methylmalonyl-CoA-spezifische AT durch eine Malonyl-CoA, Ethylmalonyl-CoA oder 2-Hydroxymalonyl-CoA-spezifische AT ersetzt werden; irgendeine, zwei oder alle drei von KR, DH und ER deletiert werden; und/oder irgendeine, zwei oder alle drei von KR, DH und ER durch eine andere KR, DH und/oder ER ersetzt werden. Außerdem kann die KS und/oder das ACP durch eine andere KS und/oder ACP ersetzt werden. Bei jedem dieser Austäusche oder Insertionen kann die heterologe KS-, AT-, DH-, KR-, ER- oder ACP-Codierungssequenz von einer Codierungssequenz für ein anderes Modul der FK-520-PKS, von einer Codierungssequenz für eine PKS, die ein anderes Polyketid als FK-520 produziert oder aus der chemischen Synthese stammen. Die resul tierende heterologe Codierungssequenz des neunten Extendermoduls kann in Verbindung mit einer Codierungssequenz für eine PKS verwendet werden, die FK-520, ein FK-520-Derivat oder ein anderes Polyketid synthetisiert. In ähnlicher Weise können die entsprechenden Domänen in einem Modul einer heterologen PKS durch ein oder mehrere Domänen des neunten Extendermoduls der FK-520-PKS ersetzt werden.
  • Das zehnte Extendermodul der FK-520-PKS enthält eine KS, eine für Malonyl-CoA spezifische AT und ein ACP. Die rekombinanten DNA-Verbindungen, die das zehnte Extendermodul der FK-520-PKS codieren, und die entsprechenden, dadurch codierten Polypeptide sind bei einer Vielzahl von Anwendungen nützlich. Eine DNA-Verbindung, umfassend eine Sequenz, die das zehnte FK-520-Extendermodul codiert, kann in eine DNA-Verbindung eingeführt werden, die die Codierungssequenz für eine heterologe PKS umfasst. Das resultierende Konstrukt, in dem die Codierungssequenz für ein Modul der heterologen PKS entweder durch die für das zehnte Extendermodul der FK-520-PKS ersetzt ist oder die letztere lediglich den Codierungssequenzen für die Module der heterologen PKS hinzuaddiert ist, liefert eine neue PKS-Codierungssequenz. Eine DNA-Verbindung, umfassend eine Sequenz, die das zehnte Extendermodul der FK-520-PKS codiert, kann in eine DNA-Verbindung eingeführt werden, die die Codierungssequenz für den Rest der FK-520-PKS oder eine rekombinante FK-520-PKS, die ein FK-520-Derivat produziert, umfasst.
  • Ein Abschnitt oder alles der Codierungssequenz des zehnten Extendermoduls kann in Verbindung mit anderen PKS-Codierungssequenzen verwendet werden, um ein Hybrid-Modul zu schaffen. Beispielsweise kann entweder die Malonyl-CoA-spezifische AT durch eine Methylmalonyl-CoA, Ethylmalonyl-CoA oder 2-Hydroxymalonyl-CoA-spezifische AT ersetzt werden; und/oder eine KR, eine KR und DH, oder eine KR, DH und eine ER inseriert. Außerdem kann die KS und/oder das ACP durch eine andere KS und/oder ACP ersetzt werden. Bei jedem dieser Austäusche oder Insertionen kann die heterologe KS-, AT-, DH-, KR-, ER- oder ACP-Codierungssequenz von einer Codierungssequenz für ein anderes Modul der FK-520-PKS, von einer Codierungssequenz für eine PKS, die ein anderes Polyketid als FK-520 produziert oder aus der chemischen Synthese stammen. Die resultierende heterologe Codierungssequenz des zehnten Extendermoduls kann in Verbindung mit einer Codierungssequenz für eine PKS verwendet werden, die FK-520, ein FK-520-Derivat oder ein anderes Polyketid synthetisiert. In ähnlicher Weise können die entsprechenden Domänen in einem Modul einer heterologen PKS durch ein oder mehrere Domänen des zehnten Extendermoduls der FK-520-PKS ersetzt werden.
  • Der durch die Tätigkeit des zehnten Extendermoduls der PKS erzeugte FK-520-Polyketid-Vorläufer wird dann an Pipecolinsäure gebunden und zum Erhalt von FK-520 zyklisiert. Das Enzym FkbP ist das NRPS-artige Enzym, das diese Reaktionen katalysiert. FkbP umfasst auch die Thioesterase-Aktivität, die das entstehende FK-520-Polyketid von der NRPS abspaltet. Hierin beschrieben sind rekombinante DNA-Verbindungen, die das fkbP-Gen codieren, und somit werden rekombinante Verfahren für die Expression des fkbP-Genprodukts in rekombinanten Wirtszellen bereitgestellt. Die hierin beschriebenen rekombinanten fkbP-Gene umfassen jene, in denen die Codierungssequenz für die Adenylierungsdomäne mutiert oder durch Codierungssequenzen von anderen NRPS-artigen Enzymen ersetzt worden sind, so dass das resultierende rekombinante FkbP eine andere Komponente als Pipecolinsäure einbaut. Für die Konstruktion der Wirtszellen, die nicht natürlicherweise Pipecolinsäure produzieren, können rekombinante DNA-Verbindungen verwendet werden, die die Enzyme exprimieren, die zumindest einen Teil der Biosynthese der Pipecolinsäure katalysieren (siehe Nielsen et al., 1991, Biochem. 30: 5789–96). Das fkbL-Gen codiert ein Homologon von RapL, eine Lysincyclodeaminase, die zum Teil für die Produktion der Pipecolat-Einheit verantwortlich ist, die dem Ende der Polyketidkette hinzugefügt wird. Die rekombinanten fkbB- und fkbL-Gene können in heterologen Wirten verwendet werden, um Verbindungen wie FK-520 zu produzieren, oder um in Verbindung mit anderen PKS- oder NRPS-Genen bekannte oder neue Polyketide und nicht-ribosomale Peptide zu erzeugen.
  • Ebenfalls hierin beschrieben sind rekombinante DNA-Verbindungen, die die P450-Oxidase- und Methyltransferase-Gene codieren, die an der Biosynthese von FK-520 beteiligt sind. 2 zeigt die verschiedenen Stellen auf der FK-520-Polyketid-Core-Struktur, an denen diese Enzyme agieren. Durch Bereitstellung dieser Gene in re kombinanter Form können rekombinante Wirtszellen erhalten werden, die FK-520 produzieren können. Dies wird durch Einführung der rekombinanten PKS, P450-Oxidase- und Methyltransferase-Gene in eine heterologe Wirtszelle erreicht. Vorzugsweise ist die heterologe Wirtszelle Streptomyces coelicolor CH999 oder Streptomyces lividans K4-114, wie in US-Patent Nr. 5.830.750 und US-Patentanmeldung der laufenden Nrn. 08/828.898, eingereicht am 31. März 1997, und 09/181.833, eingereicht am 28. Oktober 1998, beschrieben. Außerdem können durch Bereitstellung rekombinanter Wirtszellen, die lediglich ein Subset dieser Gene exprimieren, Verfahren zur Herstellung von FK-520-Vorläufer-Verbindungen bereitgestellt werden, die mittels anderer Methoden nicht ohne weiteres erhältlich sind.
  • Bei einem verwandten Aspekt werden hierin rekombinante DNA-Verbindungen und Vektoren beschrieben, die in der Erzeugung, mittels homologer Rekombination, von rekombinanten Wirtszellen nützlich sind, die CFK-520-Vorläufer-Verbindungen produzieren. In diesem Aspekt wird eine native Wirtszelle, die FK-520 produziert, mit einem Vektor (wie etwa einem von SCP2* abgeleiteten Vektor für Streptomyces-Wirtszellen) transformiert, der ein oder mehrere ausgeschaltete Gene codiert (d.h. eine Hydroxylase, eine Methyltransferase oder beides) oder lediglich flankierende Regionen von diesen Genen. Wenn sich der Vektor durch homologe Rekombination integriert, wird das native, funktionale Gen deletiert oder durch das nicht-funktionale rekombinante Gen ersetzt, und somit produziert die resultierende Wirtszelle einen FK-520-Vorläufer. Solche Wirtszellen können auch durch die Einführung einer modifizierten Form des deletierten oder mutierten nicht-funktionalen Gens komplementiert werden, um eine neue Verbindung zu produzieren.
  • Bei einer wichtigen Ausführungsform werden hierin eine Hybrid-PKS und die entsprechenden rekombinanten DNA-Verbindungen, die diese Hybrid-PKS-Enzyme codieren, beschrieben. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung ist eine Hybrid-PKS eine rekombinante PKS, die alles oder einen Teil von ein oder mehreren Modulen und die Thioesterase/Cyclase-Domäne einer ersten PKS und alles oder einen Teil von ein oder mehreren Modulen, das Lademodul und die Thioesterase/Cyclase-Domäne einer zweiten PKS umfassen. Vorzugsweise ist die erste PKS alles oder ein Teil der FK-520-PKS, und ist die zweite PKS lediglich ein Abschnitt oder alles einer Nicht-FK-520-PKS.
  • Ein Beispiel der bevorzugten Ausführungsform ist eine FK-520-PKS, in der die AT-Domäne des Moduls 8, welche eine Hydroxymalonyl-CoA spezifiziert und von der die C-13-Methoxygruppe von FK-520 abgeleitet ist, durch eine AT-Domäne ersetzt, die ein Malonyl-, Methylmalonyl- oder Ethylmalonyl-CoA spezifiziert. Zu Beispielen solcher Austausch-AT-Domänen zählen die AT-Domänen von Modulen 3, 12 und 13 der Rapamycin-PKS und von Modulen 1 und 2 der Erythromycin-PKS. Solche Austäusche, die auf der Ebene des Gens für die PKS durchgeführt sind, sind in den nachstehenden Beispielen veranschaulicht. Ein anderes anschauliches Beispiel solch einer Hybrid-PKS umfasst eine FK-520-PKS, in der das natürliche Lademodul durch ein Lademodul einer anderen PKS ersetzt worden ist. Ein anderes Beispiel solch einer Hybrid-PKS ist eine FK-520-PKS, in der die AT-Domäne des Moduls Drei durch eine AT-Domäne ersetzt ist, die Methylmalonyl-CoA bindet.
  • Bei einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist die erste PKS großteils, doch nicht insgesamt eine Nicht-FK-520-PKS, und ist die zweite PKS lediglich ein Abschnitt oder alles der FK-520-PKS. Ein anschauliches Beispiel für solch eine Hybrid-PKS umfasst eine Erythromycin-PKS, in der eine für Methylmalonyl-CoA spezifische AT durch eine AT von der für Malonyl-CoA spezifischen FK-520-PKS ersetzt ist.
  • Fachleute des Gebiets werden erkennen, dass nicht alles oder ein Teil entweder der ersten oder der zweiten PKS in einer Hybrid-PKS aus einer natürlich vorkommenden Quelle isoliert werden muss. Beispielsweise bestimmt lediglich ein kleiner Abschnitt einer AT-Domäne ihre Spezifität. Siehe vorläufige US-Patentanmeldung der laufenden Nr. 60/091.526. Der Stand der Technik in der DNA-Synthese erlaubt dem Fachmann die de novo-Konstruktion von DNA-Verbindungen von ausreichender Größe, um einen nützlichen Abschnitt eines PKS-Moduls oder -Domäne zu konstruieren. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung werden solche synthetischen DNA-Verbindungen als ein Abschnitt einer PKS erachtet.
  • Somit werden die Hybrid-Module in eine PKS eingebaut, um eine Hybrid-PKS bereitzustellen. Eine Hybrid-PKS kann nicht nur resultieren aus:
    • (i) Fusionen von Codierungssequenzen einer heterologen Domäne (wobei heterolog bedeutet, dass die Domänen in jenem Modul von mindestens zwei unterschiedlichen, natürlich vorkommenden Modulen sind), um eine Hybrid-Modul-Codierungssequenz, die in einem PKS-Gen enthalten ist, zu produzieren, deren Produkt in eine PKS eingebaut wird, sondern auch:
    • (ii) Fusionen von Codierungssequenzen eines heterologen Moduls (wobei heterologes Modul bedeutet, dass zwei Module aneinander angrenzen, die in natürlich vorkommenden PKS-Enzymen nicht aneinander angrenzen), um eine Hybrid-Codierungssequenz, die in einem PKS-Gen enthalten ist, zu produzieren, deren Produkt in eine PKS eingebaut wird,
    • (iii) der Expression eines oder mehrerer FK-520-PKS-Gene mit ein oder mehreren Nicht-FK-520-PKS-Genen, einschließlich sowohl natürlich vorkommender als auch rekombinanter Nicht-FK-520-PKS-Genen, und
    • (iv) Kombinationen der vorangegangenen.
  • Verschiedene Hybrid-PKSs, die diese verschiedenen Alternativen veranschaulichen, sind hierin beschrieben.
  • Beispiele der Produktion einer Hybrid-PKS durch Coexpression der PKS-Gene aus der FK-520-PKS und einer anderen Nicht-FK-520-PKS umfassen Hybrid-PKS-Enzyme, die durch Coexpression von FK-520- und Rapamycin-PKS-Genen erzeugt sind. Vorzugsweise werden solche Hybrid-PKS-Enzyme in rekombinanten Streptomyces-Wirtszellen produziert, die FK-520 oder FK-506 erzeugen, doch die mutiert worden sind, um das Gen zu inaktivieren, dessen Funktion durch das Rapamycin-PKS-Gen ersetzt werden soll, das zur Erzeugung der Hybrid-PKS eingeführt wird. Zu spezifischen Beispielen zählen (i) der Austausch des fbkC-Gens gegen das rapB- Gen; und (ii) der Austausch des fkbA-Gens gegen das rapC-Gen. Die letztere Hybrid-PKS erzeugt 13,15-Didesmethoxy-FK-520, wenn die Wirtszelle eine FK-520-produzierende Wirtszelle ist, und 13,15-Didesmethoxy-FK-506, wenn die Wirtszelle eine FK-506-produzierende Wirtszelle ist. Die mittels dieser Hybrid-PKS-Enzyme erzeugten Verbindungen sind Immunsuppressiva und Neurotrophine, doch lassen sich ohne weiteres modifizieren, um lediglich als Neurotrophine zu agieren, wie im unten stehenden Beispiel 6 beschrieben.
  • Weitere anschauliche Hybrid-PKS-Enzyme werden durch Austauschen des fkbA-Gens einer FK-520- oder FK-506-produzierenden Wirtszelle gegen ein Hybrid-fkbA-Gen hergestellt, worin:
    • (a) die Codierungssequenzen des Extendermoduls 8 bis 10 einschließlich durch die Codierungssequenzen für Extendermodule 12 bis 14 einschließlich der Rapamycin-PKS ersetzt worden sind; und
    • (b) die Codierungssequenzen des Moduls 8 durch die Codierungssequenz des Moduls 8 der Rifamycin-PKS ersetzt worden sind. Wenn mit den anderen, natürlich vorkommenden FK-520- oder FK-506-PKS-Genen und den Genen der Modifikationsenzyme exprimiert, produzieren die resultieren die Hybrid-PKS-Enzyme jeweils: (a) 13-Desmethoxy-FK-520 oder 13-Desmethoxy-FK-506; und (b) 13-Desmethoxy-13-methyl-FK-520 oder 13-Desmethoxy-13-methyl-FK-506. Bei einer bevorzugten Ausführungsform werden diese rekombinanten PKS-Gene in die produzierende Wirtszelle durch einen Vektor wie pHU204 eingeführt, welcher ein Plasmid-pRM5-Derivat ist, der das wohlcharakterisierte SCP2*-Replikon, das colE1-Replikon, die tsr- und bla-Resistenzgene und ein cos-Stelle aufweist. Dieser Vektor kann zur Einführung des rekombinanten fkbA-Austausch-Gens in eine FK-520- oder FK-506-produzierende Wirtszelle (oder eine davon abgeleitete Wirtszelle, in der das endogene fkbA-Gen inaktiv gemacht worden ist durch Mutation, Deletion oder homologe Rekombination mit dem Gen, das es ersetzt) verwendet werden, um die gewünschte Hybrid-PKS zu erzeugen.
  • Bei der Konstruktion der Hybrid-PKSs können bestimmte allgemeine Verfahren hilfreich sein. So ist es beispielsweise oftmals von Vorteil, das Framework des zu verändernden Moduls zum Erhalt der Hybrid-PKS beizubehalten. Ist etwa die Hinzufü gung von DH- und ER-Funktionalitäten zu einem Modul erwünscht, so ist es oftmals bevorzugt, die KR-Domäne des ursprünglichen Moduls durch ein KR-, DH- und ER-Domäne-enthaltendes Segment aus einem anderen Modul zu ersetzen, anstatt lediglich DH- und ER-Domänen einzuführen. Die stereochemische Spezifität eines Moduls kann durch Austausch der KS-Domäne gegen eine KS-Domäne von einem Modul verändert werden, das eine unterschiedliche Stereochemie spezifiziert. Siehe Lau et al., 1999, "Dissecting the role of acyltransferase domains of modular polyketide synthases in the choice and stereochemical fate of extender units," Biochemistry 38(5): 1643–1651. Die Stereochemie kann auch durch Austausch der KR-Domäne verändert werden. Außerdem kann die Spezifität einer AT-Domäne durch Austausch lediglich eines kleinen Segments der Domäne verändert werden. Siehe Lau et al, supra. Es kann auch Nutzen aus bekannten Linkerregionen in PKS-Proteinen zur Verknüpfung von Modulen aus zwei unterschiedlichen PKS gezogen werden, um eine Hybrid-PKS zu schaffen. Siehe Gokhale et al., 16. Apr. 1999, "Dissecting and Exploiting Intermodular Communication in Polyketide Synthases," Science 284: 482–485.
  • In der folgenden Tabelle sind die Literaturstellen aufgelistet, die anschauliche PKS-Gene und entsprechende Enzyme beschreiben, die in der Konstruktion der rekombinanten PKS und der entsprechenden DNA-Verbindungen, die sie codieren, genützt werden können. Ebenfalls angegeben sind verschiedene Literaturstellen, die Tailoring-Enzyme und entsprechende Gene beschreiben, die gemäß der hierin beschriebenen Verfahren verwendet werden können.
  • Avermectin
    • US-Patent Nr. 5.252.474 an Merck
    • MacNeil et al., 1993, Industrial Microorganisms: Basic and Applied Molecular Genetics, Baltz, Hegeman, & Skatrud, Hrsg. (ASM), S. 245–256, A Comparison of the Genes Encoding the Polyketide Synthases for Avermectin, Erythromycin and Nemadectin.
    • MacNeil et al., 1992, Gene 115:119–125, Complex Organization of the Streptomyces avermitilis genes encoding the avermectin polyketide synthase.
    • Ikeda et al., Aug. 1999, Organization of the biosynthetic gene cluster for the polyketide anthelmintic macrolide avermectin in Streptomyces avermitilis, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 9509–9514.
  • Candicidin (FR008)
    • Hu et al., 1994, Mol. Microbiol. 14:163–172.
  • Epothilon
    • US-Pat.Anm. der laufenden Nr. 60/130.560, eingereicht am 22. April 1999.
  • Erythromycin
    • PCT-Veröff. Nr. 93/13663 an Abbott.
    • US-Pat. Nr. 5.824.513 an Abbott.
    • Donadio et al., 1991, Science 252:675–9.
    • Cortes et al., 8. Nov. 1990, Nature 348: 176–8, An unusually large multifunctional polypeptide in the erythromycin producing polyketide synthase of Saccharopolyspora erythraea.
  • Glykosylierungsenzyme
    • PCT-Pat.Anm. Veröff. Nr. 97/23630 an Abbott.
  • FK-506
    • Motamedi et al., 1998, The biosynthetic gene cluster for the macrolactone ring of the immunosuppressant FK-506, Eur. J. Biochem. 256:528–534.
    • Motamedi et al., 1997, Structural organization of a multifunctional polyketide synthase involved in the biosynthesis of the macrolide immunosuppressant FK-506, Eur. J. Biochem. 244:74–80.
  • Methyltransferase
    • US 5.264.355 , ausgegeben am 23. Nov. 1993, Methylating enzyme from Streptomyces MA6858. 31-O-desmethyl-FK-506 methyltransferase.
    • Motamedi et al., 1996, Characterization of methyltransferase and hydroxylase genes involved in the biosynthesis of the immunosuppressants FK-506 und FK-520, J. Bacteriol. 178: 5243–5248.
  • Streptomyces hygroscopicus
    • US-Patentanmeldung der laufenden Nr. 09/154.083, eingereicht am 16. Sep. 1998.
  • Lovastatin
    • US-Pat. Nr. 5.744.350 an Merck.
  • Narbomycin
    • US-Patentanmeldung der laufenden Nr. 60/107.093, eingereicht am 5. Nov. 1998, und laufende Nr. 60/120.254, eingereicht am 16. Feb. 1999.
  • Nemadectin
    • MacNeil et al., 1993, supra.
  • Niddamycin
    • Kakavas et al., 1997, Identification and characterization of the niddamycin polyketide synthase genes from Streptomyces caelestis, J. Bacteriol. 179: 7515–7522.
  • Oleandomycin
    • Swan et al., 1994, Characterisation of a Streptomyces antibioticus gene encoding a type I polyketide synthase which has an unusual coding sequence, Mol. Gen. Genet. 242: 358–362.
    • US-Patentanmeldung der laufenden Nr. 60/120.254, eingereicht am 16. Feb. 1999. Olano et al., 1998, Analysis of a Streptomyces antibioticus chromosomal region involved in oleandomycin biosynthesis, which encodes two glycosyltransferases responsible for glycosylation of the macrolactone ring, Mol. Gen. Genet. 259(3): 299–308.
  • Picromycin
    • PCT-Patentanmeldung US99/15047, eingereicht am 2. Jul. 1999.
    • Xue et al., 1998, Hydroxylation of macrolactones YC-17 and narbomycin is mediated by the pikC-encoded cytochrome P450 in Streptomyces venezuelae, Chemistry & Biology 5(11): 661–667.
    • Xue et al., Okt. 1998, A gene cluster for macrolide antiobiotic biosynthesis in Streptomyces venezuelae: Architecture of metabolic diversity, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 12111–12116.
  • Platenolid
    • EP Pat.Anm. Veröff. Nr. 791.656 an Lilly.
  • Rapamycin
    • Schwecke et al., Aug. 1995, The biosynthetic gene cluster for the polyketide rapamycin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7839–7843.
    • Aparicio et al., 1996, Organization of the biosynthetic gene cluster for rapamycin in Streptomyces hygroscopicus: analysis of the enzymatic domains in the modular polyketide synthase, Gene 169: 9–16.
  • Rifamycin
    • August et al., 13. Feb. 1998, Biosynthesis of the ansamycin antibiotic rifamycin: deductions from the molecular analysis of the rif biosynthetic gene cluster of Amycolatopsis mediterranei S669, Chemistry & Biology, 5(2): 69–79.
  • Sorangium PKS
    • US Patentanmeldung der laufenden Nr. 09/144.085, eingereicht am 31. Aug. 1998.
  • Soraphen
    • US-Pat. Nr. 5.716.849 an Novartis.
    • Schupp et al., 1995, J. Bacteriology 177: 3673–3679. A Sorangium cellulosum (Myxobacterium) Gene Cluster for the Biosynthesis of the Macrolide Antiobiotic Soraphen A: Cloning, Characterization, and Homology to Polyketide Synthase Genes from Actinomycetes.
  • Spiramycin
    • US-Pat. Nr. 5.098.837 an Lilly.
  • Aktivatorgen
    • US-Pat. Nr. 5.514.544 an Lilly.
  • Tylosin
    • EP-Veröff. Nr. 791.655 an Lilly.
    • US-Pat. Nr. 5.876.991 an Lilly.
    • Kuhstoss et al., 1996, Gene 183:231–6, Production of a novel polyketide through the construction of a hybrid polyketide synthase.
  • Tailoring-Enzyme
  • Merson-Davies and Cundliffe, 1994, Mol. Microbiol. 13: 349–355. Analysis of five tylosin biosynthetic genes from the tylBA region of the Streptomyces fradiae genome.
  • Wie in der obigen Tabelle veranschaulicht, gibt es eine breite Vielfalt von Polyketidsynthase-Genen, die als leicht verfügbare Quellen von DNA und Sequenzinformation zur Verwendung in der Konstruktion der Hybrid-PKS-codierenden DNA-Verbindungen dienen. Verfahren für die Konstruktion von Hybrid-PKS-codierenden DNA-Verbindungen sind beschrieben ohne Bezugnahme auf die FK-520-PKS in der PCT-Patentveröffentlichung Nr. 98/51695; US-Patent Nrn. 5.672.491 und 5.712.146 und US-Patentanmeldungen der laufenden Nrn. 09/073.538, eingereicht am 6. Mai 1998, und 09/141.908, eingereicht am 28. August 1998.
  • Die Hybrid-PKS-codierenden DNA-Verbindungen können sein und sind oftmals Hybride aus mehr als zwei PKS-Genen. Darüber hinaus gibt es oftmals zwei oder mehr Module in der Hybrid-PKS, in der alles oder ein Teil des Moduls von einer zweiten (oder dritten) PKS abgeleitet ist. Somit kann als ein anschauliches Beispiel eine Hybrid-FK-520-PKS bereitgestellt werden, die das natürlich vorkommende Lademodul und FkbP als auch Module Eins, Zwei, Vier, Sechs, Sieben und Acht, Neun und Zehn der FK-520-PKS enthält, und außerdem Hybrid- oder heterologe Module drei und fünf enthält. Hybrid- oder heterologes Modul Drei enthält eine AT-Domäne, die für Methylmalonyl-CoA spezifisch ist und die zum Beispiel von den Erythromycin- oder Rapamycin-PKS-Genen abgeleitet sein kann. Hybrid oder heterologes Modul Fünf enthält eine AT-Domäne, die für Malonyl-CoA spezifisch ist und die zum Beispiel von den Picromycin- oder Rapamycin-PKS-Genen abgeleitet sein kann.
  • Zwar betrifft eine wichtige, hierin beschriebene Ausführungsform Hybrid-PKS-Enzyme und entsprechende Gene, doch können auch rekombinante FK-520-PKS-Gene bereitgestellt werden, in denen keine zweite PKS-Gensequenz vorhanden ist, doch die vom FK-520-PKS-Gen durch eine oder mehrere Deletionen abweichen. Die Deletionen können ein oder mehrere Module umfassen und/oder können auf eine partielle Deletion innerhalb eines oder mehrerer Module beschränkt sein. Umfasst eine Deletion ein gesamtes Modul, so ist das resultierende FK-520-Derivat um wenigstens zwei Kohlenstoffe kürzer als das Gen, von dem es abgeleitet ist. Befindet sich eine Deletion innerhalb eines Moduls, so umfasst die Deletion typischerweise eine KR-, DH- oder ER-Domäne, oder sowohl eine DH- als auch ER-Domäne, oder sowohl eine KR- als auch DH-Domäne, oder alle drei KR-, DH- und ER-Domänen.
  • Um eine Hybrid-PKS oder ein FK-520-Derivat-PKS-Gen zu konstruieren, kann eine Technik angewandt werden, wie beschrieben in PCT Veröff. Nr. 98/27203 und US-Patentanmeldung der laufenden Nr. 08/989.332, eingereicht am 11. Dezember 1997, worin das große PKS-Gen in zwei oder mehr, typischerweise drei Segmente unterteilt ist und jedes Segment auf einem separaten Expressionsvektor platziert ist. In dieser Weise kann jedes der Segmente des Gens verändert werden und können verschiedene veränderte Segmente in einer einzelnen Wirtszelle kombiniert werden, um ein rekombinantes PKS-Gen bereitzustellen. Diese Technik macht die Konstruktion großer Bibliotheken der rekombinanten PKS-Gene, Vektoren für die Exprimierung jener Gene, und Wirtszellen, die diese Vektoren umfassen, effizienter.
  • Somit können die rekombinanten DNA-Verbindungen Expressionsvektoren sein. Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff Expressionsvektor auf jegliche Nukleinsäure, die in eine Wirtszelle oder ein zellfreies Transkriptions- und Translationsmedium eingeführt werden kann. Ein Expressionsvektor kann stabil oder vorübergehend in einer Zelle beibehalten werden, ob nun als Teil der chromosomalen oder einer anderen DNA in der Zelle oder in irgendeinem zellulären Kompartiment, wie etwa einen replizierenden Vektor im Zytoplasma. Ein Expressionsvektor umfasst auch ein Gen, das zur Produktion von RNA dient, die in ein Polypeptid in der Zelle oder dem Zellextrakt translatiert wird. Weiterhin enthalten Expressionsvektoren typischerweise zusätzliche funktionelle Elemente, wie etwa Resistenz-verleihende Gene, um als selektierbarer Marker zu agieren.
  • Die verschiedenen Komponenten eines Expressionsvektors können, in Abhängigkeit von der angestrebten Verwendung des Vektors, breit variieren. Insbesondere hängen die Komponenten von der/n Wirtszelle(n) ab, in der/denen der Vektor verwendet werden wird oder in der/denen er seine Funktion erfüllen soll. Vektor-Komponenten für die Expression und Maintenance von Vektoren in E. coli sind breit bekannt und kommerziell verfügbar, ebenso wie Vektorkomponenten für andere, herkömmlicherweise verwendete Organismen, wie etwa Hefezellen und Streptomyces-Zellen.
  • Die Expressionvektoren können zur Konstruktion von rekombinanten Streptomyces-Wirtszellen verwendet werden, die eine rekombinante PKS der Erfindung exprimieren. Bevorzugte Streptomyces-Wirtszellen/Vektor-Kombinationen umfassen S. coelicolor CH999- und S. lividans K4-114-Wirtszellen, die kein Actinorhodin produzieren, und Expressionvektoren, die von den pRM1- und pRM5-Vektoren abgeleitet sind, wie beschrieben in US-Patent Nr. 5.830.750 und US-Patentanmeldungen der laufenden Nrn. 08/828.898, eingereicht am 31. März 1997, und 09/181.833, eingereicht am 28. Oktober 1998.
  • Hierin beschrieben wird eine breite Vielfalt von Expressionsvektoren zur Verwendung in Streptomyces. Für replizierende Vektoren kann der Replikationsursprung als Beispiel und ohne Beschränkung ein Vektor von geringer Kopienzahl, wie etwa SCP2* sein (siehe Hopwood et al., Genetic Manipulation of Streptomyces: A Laboratory manual (The John Innes Foundation, Norwich, U.K., 1985), Lydiate et al., 1985, Gene 35: 223–235; und Kieser and Melton, 1988, Gene 65: 83–91, SLP1.2 (Thompson of al., 1982, Gene 20:51–62), und SG5(ts) (Muth et al., 1989, Mol. Gen. Genet. 219: 341–348, und Bierman et al., 1992, Gene 116: 43–49), oder ein Vektor von hoher Kopienzahl, wie etwa pIJ101 und pJV1 (siehe Katz et al., 1983, J. Gen. Microbiol. 129: 2703–2714; Vara et al., 1989, J. Bacteriol. 171: 5782–5781; und Servin-Gonzalez, 1993, Plasmid 30: 131–140). Allgemein sind Vektoren einer hohen Kopienzahl jedoch für die Expression von Genen, die auf großen Segmenten der DNA enthalten sind, nicht bevorzugt. Für nicht-replizierende und integrierende Vektoren ist es nützlich, wenigstens einen E. coli-Replikationsursprung, wie etwa von pUC, p1P, p1I und pBR, aufzunehmen. Für Phagen-basierte Vektoren können die Phagen phiC31 und KC515 verwendet werden (siehe Hopwood of al., supra).
  • Typischerweise wird der Expressionsvektor ein oder mehrere Markergene umfassen, durch die Wirtszellen, die den Vektor enthalten, identifiziert und/oder selektiert werden können. Zu nützlichen Antibiotikaresistenz-verleihenden Genen für die Verwendung in Streptomyces-Wirtszellen zählen die ermE-(verleiht Resistenz gegenüber Erythromycin und anderen Makroliden und Lincomycin), tsr-(verleiht Resistenz gegenüber Thiostrepton), aadA-(verleiht Resistenz gegenüber Spectinomycin und Streptomycin), aacC4-(verleiht Resistenz gegenüber Apramycin, Kanamycin, Gen tamicin, Geneticin (G418) und Neomycin), hyg-(verleiht Resistenz gegenüber Hygromycin) und vph-(verleiht Resistenz gegenüber Viomycin)-Resistenz-verleihenden Gene.
  • Das rekombinante PKS-Gen auf dem Vektor wird unter der Kontrolle eines Promotoren sein, typischerweise mit einer begleitenden Ribosomen-Bindungsstellen-Sequenz. Die endogenen Promotoren der FK-520-PKS und verwandter biosynthetischer Gene können in rekombinanter Form bereitgestellt werden, wobei diese Promotoren zur Verwendung in den nativen Wirten und in heterologen Wirten bevorzugt sind, in denen die Promotoren ihre Funktion erfüllen. Ein bevorzugter Promotor ist der fkbO-Genpromotor, der in einer Sequenz von etwa 270 bp zwischen dem Start der offenen Leserahmen der fbkO- und fkbB-Gene enthalten ist. Der fkbO-Promotor wird als bidirektional angenommen, indem er die Transkription der Gene fkbO, fkbP und fkbA in einer Richtung und fkbB, fkbC und fkbL in der anderen Richtung fördert. Somit kann in einem Aspekt ein rekombinanter Expressionsvektor den Promotoren des fkbO-Gens eines FK-520-produzierenden Organismus umfassen, der zum Transkribieren eines anderen Gens als fkbO positioniert ist. Das transkribierte Gen kann ein FK-520-PKS-Gen sein. Das transkribierte Gen kann ein Gen sein, das ein Protein codiert, das in einer Hybrid-PKS enthalten ist.
  • Heterologen Promotoren können ebenfalls verwendet werden und sind zur Verwendung in Wirtszellen bevorzugt, in denen die endogenen FK-520-PKS-Genpromotoren nicht funktionieren oder schlecht funktionieren. Ein bevorzugter heterologer Promotor ist der actI-Promotor und sein begleitendes Aktivatorgen actII-ORF4, welches in den untenstehenden pRM1- und pRM5-Expressionsvektoren bereitgestellt ist. Dieser Promotor wird in der stationären Wachstumsphase aktiviert, wenn normalerweise sekundäre Metaboliten synthetisiert werden. Zu weiteren nützlichen Streptomyces-Promotoren zählen, ohne Beschränkung, jene vom ermE-Gen und dem melC1-Gen, die konstitutiv agieren, und das tipA-Gen und das merA-Gen, die in jedem beliebigen Wachstumsstadium induziert werden können. Außerdem ist das T7-RNA-Polymerasesystem auf Streptomyces übertragen worden und kann in Vektoren und Wirtszellen verwendet werden. Bei diesem System wird die Codierungssequenz der T7-RNA-Polymerase in eine neutrale Stelle des Chromosoms oder in einen Vektor unter der Kontrolle des induzierbaren merA-Promotoren eingeführt, und das Gen von Interesse wird unter die Kontrolle des T7-Promotoren gestellt. Wie oben vermerkt, können auch ein oder mehrere Aktivatorgene verwendet werden, um die Aktivität eines Promotoren zu erhöhen. Zu Aktivatorgenen zählen über die oben erörterten actII-ORF4-Gen hinaus, die dnrI, redD und ptpA-Gene (siehe US-Patentanmeldung der laufenden Nr. 09/181.833, supra), um die Promotoren unter ihrer Kontrolle zu aktivieren.
  • Über die Bereitstellung der rekombinanten DNA-Verbindungen hinaus, die die FK-520-PKS codieren, können auch DNA-Verbindungen, die das in der Synthese von FK-520 verwendete Ethylmalonyl-CoA und 2-Hydroxymalonyl-CoA codieren, bereitgestellt werden. Folglich können rekombinante Wirtszellen die Gene exprimieren, die für die Biosynthese von Ethylmalonyl-CoA und 2-Hydroxymalonyl-CoA erforderlich sind. 3 und 4 zeigen die Lokalisation dieser Gene auf Cosmiden und den Biosyntheseweg, der Ethylmalonyl-CoA produziert.
  • Für die Biosynthese von 2-Hydroxymalonyl-CoA sind die fkbH-, fkbI-, fkbJ- und fkbK-Gene ausreichend, um den Streptomyces-Wirtszellen diese Fähigkeit zu verleihen. Für die Umwandlung von 2-Hydroxymalonyl zu 2-Methoxymalonyl wird auch das fkbG-Gen verwendet. Zwar wird die vollständige Codierungssequenz von fkbH auf den Cosmiden bereitgestellt, doch kann der hierin bereitgestellten Sequenz für dieses Gen ein T-Rest fehlen, basierend auf einem Vergleich, der mit einem ähnlichen Gen vorgenommen wurde, das aus dem Ansamitocin-Gencluster durch Dr. H. Floss kloniert wurde. Wo die hierin gezeigte Sequenz ein T aufweist, können zwei vorhanden sein, was zu einer Verlängerung des fkbH-Leserahmens zur Codierung der folgenden Aminosäuresequenz führt:
  • Figure 00830001
  • Für die Biosynthese von Ethylmalonyl-CoA ist lediglich eine Crotonyl-CoA-Reduktase erforderlich, die durch die Wirtszelle geliefert werden kann, doch die auch durch die rekombinante Expression des fkbS-Gens erhalten werden kann. Um die Ausbeute an Ethylmalonyl-CoA zu erhöhen, können auch die fkbE- und fkbU-Gene exprimiert werden. Zwar kann eine derartige Produktion unter Verwendung lediglich der oben genannten rekombinanten Gene erreicht werden, doch kann diese Produktion auch durch Platzieren in die rekombinante Wirtszelle eines großen Segments der durch die Cosmide bereitgestellten DNA erzielt werden. Somit können für die Biosynthese von 2-Hydroxymalonyl- und 2-Methoxymalonyl-CoA die Zellen einfach mit dem Segment der DNA versehen werden, das auf der linken Seite der FK-520-PKS-Gene lokalisiert ist, wie in 1 gezeigt. Für die Biosynthese von Ethylmalonyl-CoA können die Zellen einfach mit dem Segment der DNA versehen werden, das auf der rechten Seite der FK-520-PKS-Gene lokalisiert ist, wie in 1 gezeigt, oder alternativ sowohl den rechten als auch den linken Segmenten der DNA.
  • Die rekombinanten DNA-Expressionsvektoren, die diese Gene codieren, können zur Konstruktion rekombinanter Wirtszellen verwendet werden, die diese wichtigen Polyketid-Bausteine aus Zellen herstellen können, die ansonsten unfähig sind, diese zu produzieren. Zum Beispiel synthetisieren Streptomyces coelicolor und Streptomyces lividans Ethylmalonyl-CoA oder 2-Hydroxymalonyl-CoA nicht. Verfahren und Vektoren zur Konstruktion von rekombinantem Streptomyces coelicolor und Streptomyces lividans, die zur Synthetisierung von einem oder beidem von Ethylmalonyl-CoA und 2-Hydroxymalonyl-CoA fähig sind, können bereitgestellt werden. Diese Wirtszellen sind somit zur Erzeugung von Polyketiden fähig, nämlich jenen, die diese Substrate erfordern, die ansonsten nicht in diesen Zellen erzeugt werden können.
  • Es können rekombinante Streptomyces-Wirtszellen bereitgestellt werden, wie z.B. S. coelicolor und S. lividans, die mit einem rekombinanten Vektor transformiert worden sind, der für die Expression der biosynthetischen Gene von Ethylmalonyl-CoA codiert. Die resultierenden Wirtszellen produzieren Ethylmalonyl-CoA und sind somit bevorzugte Wirtszellen für die Produktion von Polyketiden, die durch PKS-Enzyme erzeugt werden, die ein oder mehrere für Ethylmalonyl-CoA spezifische AT- Domänen umfassen. Zu anschaulichen PKS-Enzymen dieser Art zählen die FK-520-PKS und eine rekombinante PKS, in der eine oder mehrere AT-Domänen für Ethylmalonyl-CoA spezifisch sind.
  • Bei einer verwandten Ausführungsform können Streptomyces-Wirtszellen bereitgestellt werden, in denen ein oder mehrere der biosynthetischen Ethylmalonyl- oder 2-Hydroxymalonyl-Gene durch homologe Rekombination deletiert oder durch Mutation inaktiv gemacht worden sind. Zum Beispiel kann die Deletion oder Inaktivierung des fkbG-Gens die Bildung der Methoxylgruppen bei C-13 und C-15 der FK-520 (oder, in der entsprechenden FK-506-produzierenden Zelle, des FK-506) verhindern, was zur Produktion von 13,15-Didesmethoxy-13,15-dihydroxy-FK-520 (oder, in der entsprechenden FK-506-produzierenden Zelle, des 13,15-Didesmethoxy-13,15-dihydroxy-FK-506) führt. Agiert das fkbG-Genprodukt an 2-Hydroxymalonyl und ist das resultierende 2-Methoxymalonyl-Substrat für den Einbau durch die PKS erforderlich, so können die AT-Domänen von Modulen 7 und 8 Malonyl-CoA und Methylmalonyl-CoA binden. Dieser Einbau führt zur Produktion eines Gemischs von Polyketiden, in dem die Methoxygruppen bei C-13 und C-15 der FK-520 (oder FK-506) entweder durch Wasserstoff oder Methyl ersetzt sind.
  • Diese Möglichkeit der nicht-spezifischen Bindung resultiert aus der Konstruktion einer Hybrid-PKS, in der die AT-Domäne von Modul 8 der FK-520-PKS die AT-Domäne des Moduls 6 von DEBS ersetzte. Die resultierende PKS produzierte, in Streptomyces lividans, 6-dEB und 2-Desmethyl-6-dEB, was darauf hinweist, dass die AT-Domäne von Modul 8 der FK-520-PKS Malonyl-CoA- und Methylmalonyl-CoA-Substrate binden könnte. Somit könnten möglicherweise auch die 13,15-Didesmethoxy-FK-520- und entsprechenden FK-506-Verbindungen durch Deletieren oder anderweitiges Inaktivieren eines oder mehrerer oder aller der für die Biosynthese von 2-Hydroxymalonyl-CoA erforderlichen Gene, d.h. die fkbH-, fkbI-, fkbJ- und fbkK-Gene, präpariert werden. In jedem Falle verhindert die Deletion oder Inaktivierung eines oder mehrerer der für die Ethylmalonyl- und/oder 2-Hydroxymalonyl-Produktion erforderlichen biosynthetischen Gene die Bildung von Polyketiden, die Ethylmalonyl und/oder 2-Hydroxymalonyl für die Biosynthese erfordern, und die re sultierenden Wirtszellen sind daher für die Produktion von Polyketiden bevorzugt, die diese nicht erfordern.
  • Die Wirtszellen können unter Bedingungen gezüchtet und fermentiert werden, die im Fachgebiet für andere Zwecke bekannt sind, um die Verbindungen der Erfindung zu produzieren. Siehe z.B. US-Patent Nrn. 5.194.378, 5.116.756 und 5.494.820 für geeignete Fermentationsprozesse. Die Verbindungen können aus den Fermentationsbrühen dieser kultivierten Zellen isoliert und mittels standardmäßiger Verfahrensweisen gereinigt werden. Zu bevorzugten Verbindungen der Erfindung zählen die folgenden Verbindungen: 13-Desmethoxy-FK-506; 13-Desmethoxy-FK-520; 13,15-Didesmethoxy-FK-506; 13,15-Didesmethoxy-FK-520; 13-Desmethoxy-18-hydroxy-FK-506; 13-Desmethoxy-18-hydroxy-FK-520; 13,15-Didesmethoxy-18-hydroxy-FK-506; und 13,15-Didesmethoxy-18-hydroxy-FK-520. Diese Verbindungen können weiter modifiziert werden, wie beschrieben für Tacrolimus und FK-520 in US-Patent Nrn. 5.225.403; 5.189.042; 5.164.495; 5.068.323; 4.980.466 und 4.920.218.
  • Weitere Verbindungen sind in 8, Teile A und B, gezeigt. In 8, Teil A, sind anschauliche C-32-substituierte Verbindungen in zwei Spalten unter der Überschrift R gezeigt. Die substituierten Verbindungen sind für die topische Verabreichung bevorzugt und werden auf die Haut für die Behandlung von Leiden wie der Psoriasis aufgetragen. In 8, Teil B, werden anschauliche Reaktionsschemata zur Herstellung der in 8, Teil A, gezeigten Verbindungen bereitgestellt. Im oberen Schema der 8A, Teil B, ist die C-32-Substitution eine Tetrazol-Komponente, was anschaulich für die Gruppen ist, die in der linken Spalte unter R in 8, Teil A, gezeigt sind. Im unteren Schema in 8, Teil B, ist die C-32-Substitution eine disubstituierte Aminogruppe, worin R3 und R4 irgendeine Gruppe ist, die den anschaulichen Gruppen ähnlich ist, die an das Amin in der rechten Spalte unter R in 8, Teil A, angelagert gezeigt sind. 8 zeigt zwar die C-32-substituierten Verbindungen, in denen das C-15-Methoxy vorhanden ist, doch umfasst die Erfindung die C-32-substituierten Verbindungen, in denen C-15 Ethyl, Methyl oder Wasserstoff ist. Außerdem ist zwar C-21 als mit Ethyl oder Allyl substituiert gezeigt, doch umfassen die Verbindungen der Erfindung die C-32-substituierten Verbindungen, in denen C-21 mit Wasserstoff oder Methyl substituiert ist.
  • Um diese C-32-substituierten Verbindungen herzustellen, zeigt 8, Teil B, anschauliche Reaktionsschemata. Somit ergibt eine selektive Reaktion der Ausgangsverbindung (siehe 8, Teil B, für eine anschauliche Ausgangsverbindung) mit Trifluormethansulfonanhydrid in Gegenwart einer Base das C-32-O-Triflat-Derivat, wie im oberen Schema der 8, Teil B, gezeigt. Die Verdrängung des Triflats mit 1H-Tetrazol oder Triazol-Derivaten ergibt das C-32-Tetrazol oder Teiazol-Derivat. Wie in dem unteren Schema der 8, Teil B, gezeigt, ergibt das Umsetzen der Ausgangsverbindung mit p-Nitrophenylchlorformat das entsprechende Carbonat, welches, auf die Verdrängung mit einer Amino-Verbindung hin, das entsprechende Carbamat-Derivat liefert.
  • Die Verbindungen können ohne weiteres zum Erhalt der pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung formuliert werden. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung können in Form eines pharmazeutischen Präparats, zum Beispiel in fester, halbfester oder flüssiger Form, verwendet werden. Dieses Präparat enthält eine oder mehrere der Verbindungen der Erfindung als einen aktiven Inhaltsstoff in Mischung mit einem organischen oder anorganischen Träger oder Exzipienten, der für die externe, enterale oder parenterale Anwendung geeignet ist. Der aktive Inhaltsstoff kann zum Beispiel mit den üblichen nicht-toxischen, pharmazeutisch geeigneten Trägern für Tabletten, Kügelchen, Kapseln, Zäpfchen, Lösungen, Emulsionen, Suspensionen oder jegliche andere Form, die für die Anwendung geeignet ist, vermengt werden. Die geeigneten Formulierungsprozesse und Zusammensetzungen für die Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind bezüglich Tacrolimus in US-Patent Nrn. 5.939.427; 5.922.729; 5.385.907; 5.338.684 und 5.260.301 beschrieben. Viele der Verbindungen der Erfindung enthalten ein oder mehrere chirale Zentren, und alle der Stereoisomere sind innerhalb des Rahmens der Erfindung, als reine Verbindungen als auch als Gemische von Stereoisomeren, enthalten. Somit können die Verbindungen der Erfindung als ein Gemisch von Stereoisomeren in jeglichen Anteilen bereitgestellt werden.
  • Zu den Trägern, die verwendet werden können, zählen Wasser, Glucose, Lactose, Akaziengummi, Gelatine, Mannitol, Stärkepaste, Magnesiumtrisilikat, Talk, Maisstär ke, Keratin, kolloidales Kieselgel, Kartoffelstärke, Harnstoff und andere Träger, die zur Verwendung in der Herstellung der Präparate in fester, halbfester oder flüssiger Form geeignet sind. Außerdem können Hilfsstabilisatoren, Verdickungsmittel und Farbmittel und Duftstoffe verwendet werden. Zum Beispiel können die Verbindungen der Erfindung mit Hydroxypropylmethylcellulose verwendet werden, wie im Wesentlichen beschrieben in US-Patent Nr. 4.916.138, welches hierin durch Bezugnahme mitaufgenommen ist, oder mit einem grenzflächenaktiven Mittel, wie im Wesentlichen beschrieben in EPA-Patentveröffentlichung Nr. 428.169.
  • Orale Dosierungsformen können hergestellt werden, wie im Wesentlichen beschrieben bei Hondo of al., 1987, Transplantation Proceedings XIX, Supp. 6: 17–22. Die Dosierungsformen für die äußere Anwendung können präpariert werden, wie im Wesentlichen beschrieben in EPA-Patentveröffentlichung Nr. 423.714. Die aktive Verbindung wird in die pharmazeutische Zusammensetzung in einer ausreichenden Menge aufgenommen, um die gewünschte Wirkung auf den Krankheitsverlauf oder die Verfassung zu erzielen.
  • Für die Behandlung von Leiden und Erkrankungen, die mit einer Immunsuppression oder neuronalen Schädigung in Verbindung stehen, kann eine Verbindung der Erfindung oral, topisch, parenteral, mittels Inhalationsspray oder rektal in Dosiseinheiten-Formulierungen verabreicht werden, die herkömmliche nicht-toxische pharmazeutisch geeignete Träger, Adjuvanzien und Vehikel enthalten. Der Begriff parenteral, wie hierin verwendet, umfasst subkutane Injektionen und intravenöse, intramuskuläre und intrasternale Injektions- oder Infusionstechniken.
  • Die Dosierungshöhen der Verbindungen der vorliegenden Erfindung liegen in der Größenordnung von etwa 0,01 mg bis etwa 50 mg pro Kilogramm Körpergewicht pro Tag, vorzugsweise von etwa 0,1 mg bis etwa 10 mg pro Kilogramm Körpergewicht pro Tag. Die Dosierungsmengen sind in der Behandlung der oben angegebenen Zustände nützlich (von etwa 0,7 mg bis etwa 3,5 mg pro Patient pro Tag, ausgehend von einem Patienten mit 70 kg). Außerdem können die Verbindungen der vorliegenden Erfindung auf einer intermittierenden Basis, d.h. in halbwöchentlichen, wöchentlichen, halbmonatlichen oder monatlichen Intervallen verabreicht werden.
  • Die Menge des aktiven Inhaltsstoffs, der mit den Trägermaterialien zur Erzeugung einer einzelnen Dosierungsform kombiniert werden kann, wird in Abhängigkeit von dem behandelten Wirt und der jeweiligen Verabreichungsform variieren. Zum Beispiel kann eine für die orale Verabreichung an den Menschen vorgesehene Formulierung von 0,5 mg bis 5 g des Wirkstoffs in Mischung mit einer geeigneten und bequemen Menge an Trägermaterial enthalten, die von etwa 5 % bis 95 % der Gesamtzusammensetzung variieren kann. Die Dosiseinheiten-Formen werden allgemein von etwa 0,5 mg bis etwa 500 mg des aktiven Inhaltsstoffs enthalten. Für die äußere Verabreichung können die Verbindungen der Erfindung innerhalb des Bereichs von beispielsweise 0,00001 % bis 60 Gew.-%, vorzugsweise von 0,001 % bis 10 Gew.-%, und am bevorzugtesten von etwa 0,005 % bis 0,8 Gew.-% formuliert werden. Die Verbindungen und Zusammensetzungen der Erfindung sind in der Behandlung krankhafter Zustände unter Verwendung von Dosen und Verabreichungsschemata nützlich, wie beschrieben für Tacrolimus in US-Patent Nrn. 5.542.436, 5.365.948; 5.348.966 und 5.196.437. Die Verbindungen der Erfindung können als einzelne therapeutische Mittel oder in Kombination mit anderen therapeutischen Mitteln verwendet werden. Zu Arzneimitteln, die sinnvoll mit den Verbindungen der Erfindung kombiniert werden können, zählen ein oder mehrere Immunsuppressiva, wie etwa Rapamycin, Cyclosporin A, FK-506, oder ein oder mehrere neurotrophische Mittel.
  • Es wird jedoch klar sein, dass die spezifische Dosierungsmenge für den jeweiligen Patienten von einer Vielfalt von Faktoren abhängen wird. Zu diesen Faktoren zählen die Aktivität der spezifisch verwendeten Verbindung; das Alter, Körpergewicht, allgemeiner Gesundheitszustand, Geschlecht und Ernährung des Patienten; die Dauer und der Weg der Verabreichung und die Ausscheidungsrate des Arzneimittels; ob eine Wirkstoffkombination bei der Behandlung verwendet wird; und vom Schweregrad der jeweiligen Erkrankung oder Verfassung, für die eine Therapie gewünscht wird.
  • Nachdem im obigen eine ausführliche Beschreibung der Erfindung wiedergegeben worden ist, dienen die folgenden Beispiele dem Zwecke der Veranschaulichung der vorliegenden Erfindung.
  • Beispiel 1
  • Austausch von Methoxyl gegen Wasserstoff oder Methyl bei C-13 von FK-520
  • Die C-13-Methoxylgruppe wird in FK-520 über eine AT-Domäne im Extendermodul 8 der PKS, die für Hydroxymalonyl spezifisch ist, und durch Methylierung der Hydroxylgruppe durch eine S-Adenosylmethionin-(SAM)-abhängige Methyltransferase eingeführt. Der Metabolismus von FK-506 und FK-520 beinhaltet hauptsächlich die Oxidation an der C-13-Position zu einem inaktiven Derivat, das weiter durch Wirts-P450 und andere Enzyme abgebaut wird. Die vorliegende Erfindung stellt Verbindungen bereit, die strukturell zu FK-506 und FK-520 verwandt sind, die die C-13-Methoxygruppe nicht enthalten und die eine größere Stabilität und eine längere Halbwertszeit in vivo zeigen. Diese Verbindungen stellen nützliche Medikamente aufgrund ihrer immunsuppressiven und neurotrophischen Aktivitäten dar, und die Erfindung stellt die Verbindungen in gereinigter Form und als pharmazeutische Zusammensetzungen bereit.
  • Die vorliegende Erfindung stellt außerdem die neuen PKS-Enzyme bereit, die diese neuen Verbindungen produzieren, als auch die Expressionsvektoren und Wirtszellen, die die neuen PKS-Enzyme produzieren. Zu den neuen PKS-Enzymen zählen, unter anderem, jene, die eine entweder für Malonyl-CoA oder Methylmalonyl-CoA in Modul 8 der FK-506- und FK-520-PKS spezifische AT-Domäne enthalten. Dieses Beispiel beschreibt die Konstruktion rekombinanter DNA-Verbindungen, die die neuen FK-520-PKS-Enzyme codieren, und die Transformation von Wirtszellen mit diesen rekombinanten DNA-Verbindungen, die die neuen PKS-Enzyme und die dabei produzierten Polyketide erzeugen.
  • Um eine Expressionskassette zur Durchführung der Austäusche der Modul 8-AT-Domäne in der FK-520-PKS zu konstruieren, wurde ein 4,6 kb SphI-Fragment aus dem FK-520-Gencluster in Plasmid pLitmus 38 (ein von New England Biolabs erhältlicher Klonierungsvektor) kloniert. Das 4,6 kb SphI-Fragment, welches die ACP- Domäne von Modul 7, gefolgt von Modul 8 durch die KR-Domäne, codiert, wurde aus einem Agarosegel nach Verdau des Cosmids pKOS65-C31 mit SphI isoliert. Der Klon, in dem das Insert so orientiert war, dass die einzelne SacI-Stelle dem SpeI-Ende des Polylinkers am nächsten war, wurde identifiziert und als Plasmid pKOS60-21-67 bezeichnet. Um entsprechende Klonierungsstellen zu erzeugen, wurden zwei Linker aufeinanderfolgend wie folgt ligiert. Zunächst wurde ein Linker zwischen die SpeI- und SacI-Stellen ligiert, um eine BglII-Stelle am 5'-Ende der Kassette einzuführen, um dazwischenliegende Polylinker-Stellen zu beseitigen und um die gesamte Insertgröße auf 4,5 kb zu reduzieren (die Grenze des Phagen KC515). Die Ligationsreaktionen enthielten 5 picomolare unphosphorylierte Linker-DNA und 0,1 picomolare Vektor-DNA, d.h. einen 50-fachen molaren Überschuss an Linker gegenüber Vektor. Der Linker wies die folgende Sequenz auf:
    5'-CTAGTGGGCAGATCTGGCAGCT-3'
    3'-ACCCGTCTAGACCG-5'
  • Das resultierende Plasmid wurde als pKOS60-27-1 bezeichnet.
  • Als Nächstes wurde ein Linker der folgenden Sequenz zwischen die nur einmal vorkommenden SphI- und AflII-Stellen des Plasmids pKOS60-27-1 zur Einführung einer NsiI-Stelle am 3'-Ende der Modul 8-Kassette ligiert. Der verwendete Linker war:
    5'-GGGATGCATGGC-3'
    3'-GTACCCCTACGTACCGAATT-5'
  • Das resultierende Plasmid wurde als pKOS60-29-55 bezeichnet.
  • Um in-frame-Insertionen alternativer AT-Domänen zu ermöglichen, wurden die Stellen am 5'-Ende (AvrII oder NheI) und 3'-Ende (XhoI) der AT-Domäne unter Anwendung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wie folgt konstruiert. Plasmid pKOS60-29-55 wurde als einer Template für die PCR verwendet, und die Sequenz 5' zur AT-Domäne wurde mit den Primern SpeBgl-fwd und entweder Avr-rev oder Nhe-rev amplifiziert:
    SpeBgl-fwd 5'-CGACTCACTAGTGGGCAGATCTGG-3'
    Avr-rev 5'-CACGCCTAGGCCGGTCGGTCTCGGGCCAC-3'
    Nhe-rev 5'-GCGGCTAGCTGCTCGCCCATCGCGGGATGC-3'
  • Die PCR umfasste, in einer 50 μl-Reaktion, 5 μl an 10 × Pfu-Polymerasepuffer (Stratagene), 5 μl an 10 × z-dNTP-Gemisch (2 mM dATP, 2 mM dCTP, 2 mM dTTP, 1 mM dGTP, 1 mM 7-deaza-GTP), 5 μl DMSO, 2 μl jedes Primers (10 μM), 1 μl Template-DNA (0,1 μg/μl) und 1 μl klonierte Pfu-Polymerase (Stratagene). Die PCR-Bedingungen waren 95°C für 2 min., 25 Zyklen bei 95°C für 30 sek., 60°C für 30 sek. und 72°C für 4 min., gefolgt von 4 min. bei 72°C und gehalten bei 0°C. Die amplifizierten DNA-Produkte und die Litmus-Vektoren wurden mit den geeigneten Restriktionsenzymen (BglII und AvrII oder SpeI und NheI) geschnitten und jeweils entweder in pLitmus 28 oder pLitmus38 (New England Biolabs) kloniert, um die als pKOS60-37-4 bzw. pKOS60-37-2 bezeichneten Konstrukte zu erzeugen.
  • Plasmid pKOS60-29-55 wurde wiederum als einer Template für die PCR verwendet, um die Sequenz 3' zur AT-Domäne unter Verwendung der Primer BsrXho-fwd und NsiAfl-rev zu amplifizieren:
    BsrXho-fwd 5'-GATGTACAGCTCGAGTCGGCACGCCCGGCCGCATC-3'
    NsiAfl-rev 5'-CGACTCACTTAAGCCATGCATCC-3'
  • Die PCR-Bedingungen waren wie oben beschrieben. Das PCR-Fragment wurde mit BsrGi und AflII geschnitten, gelisoliert und in pKOS60-37-4, geschnitten mit Asp718 und AflII, ligiert und in pKOS60-37-2, geschnitten mit BsrGI und AflII, inseriert, um die Plasmide pKOS60-39-1 bzw. pKOS60-39-13 zu erhalten. Diese beiden Plasmide wurden mit AvrII und XhoI bzw. NheI und XhoI verdaut, um die für Malonyl, Methylmalonyl, Ethylmalonyl und andere Extendereinheiten spezifischen heterologen AT-Domänen einzuführen.
  • Malonyl- und Methylmalonyl-spezifische AT-Domänen wurden aus dem Rapamycin-Cluster unter Anwendung der PCR-Amplifikation mit einem Paar von Primern kloniert, die eine AvrII- oder NheI-Stelle am 5'-Ende und eine XhoI-Stelle am 3'-Ende einführen. Die PCR-Bedingungen waren wie oben angegeben, und die Primersequenzen waren wie folgt:
    RATN1 5'-ATCCTAGGCGGGCRGGYGTGTCGTCCTTCGG-3'
    (3'-Ende der Rap-KS-Sequenz und universell für Malonyl und Methylmalonyl-CoA),
    RATMN2 5'-ATGCTAGCCGCCGCGTTCCCCGTCTTCGCGCG-3'
    (kürzere Rap AT-Version der 5'-Sequenz und spezifisch für Malonyl-CoA),
    RATMMN2 5'-ATGCTAGCGGATTCGTCGGTGGTGTTCGCCGA-3'
    (kürzere Rap AT-Version der 5'-Sequenz und spezifisch für Methylmalonyl-CoA), und
    RATC 5'-ATCTCGAGCCAGTASCGCTGGTGYTGGAAGG-3'
    (Rap DH-5'-Sequenz und universell für Malonyl- und Methylmalonyl-CoA).
  • Figure 00930001
  • Aufgrund der hohen Sequenzähnlichkeit in jedem Modul des Rapamycin-Clusters wurde von jedem Primer erwartet, dass er irgendeine der AT-Domänen primt. PCR-Produkte, die für Malonyl- oder Methylmalonyl-Extender spezifische ATs repräsentierten, wurden durch Sequenzierung individueller klonierter PCR-Produkte identifiziert. Die Sequenzierung bestätigte auch, dass die gewählten Klone keine Klonierungsartefakte enthielten. Beispiele der Hybrid-Module mit den Rapamycin AT12- und AT13-Domänen sind in einer separaten Figur gezeigt.
  • Das AvrII-XhoI-Restriktionsfragment, das Modul 8 der FK-520-PKS codiert, wobei die endogene AT-Domäne durch die AT-Domäne des Moduls 12 der Rapamycin-PKS ersetzt ist, weist die nachstehend gezeigte DNA-Sequenz auf und codiert die nachstehend gezeigte Aminosäuresequenz. Die AT des Rap-Moduls 12 ist für den Einbau von Malonyleinheiten spezifisch.
  • Figure 00940001
  • Figure 00950001
  • Figure 00960001
  • Figure 00970001
  • Das AvrII-XhoI-Restriktionsfragment, das Modul 8 der FK-520-PKS codiert, wobei die endogene AT-Domäne durch die AT-Domäne des Moduls 13 (spezifisch für Methylmalonyl-CoA) der Rapamycin-PKS ersetzt ist, weist die nachstehend gezeigte DNA-Sequenz auf und codiert die nachstehend gezeigte Aminosäuresequenz.
  • Figure 00970002
  • Figure 00980001
  • Figure 00990001
  • Figure 01000001
  • Das NheII-XhoI-Restriktionsfragment, das Modul 8 der FK-520-PKS codiert, wobei die endogene AT-Domäne durch die AT-Domäne des Moduls 12 (spezifisch für Malonyl-CoA) der Rapamycin-PKS ersetzt ist, weist die nachstehend gezeigte DNA-Sequenz auf und codiert die nachstehend gezeigte Aminosäuresequenz.
  • Figure 01000002
  • Figure 01010001
  • Figure 01020001
  • Figure 01030001
  • Das NheII-XhoI-Restriktionsfragment, das Modul 8 der FK-520-PKS codiert, wobei die endogene AT-Domäne durch die AT-Domäne des Moduls 13 (spezifisch für Methylmalonyl-CoA) der Rapamycin-PKS ersetzt ist, weist die nachstehend gezeigte DNA-Sequenz auf und codiert die nachstehend gezeigte Aminosäuresequenz.
  • Figure 01030002
  • Figure 01040001
  • Figure 01050001
  • Figure 01060001
  • Phagen-KC515-DNA wurde unter Anwendung der in Genetic Manipulation of Streptomyces, A Laboratory Manual, herausgegeben von D. Hopwood et al., beschriebenen Verfahrensweise präpariert. Eine aus 10 Platten (100 mm) von konfluenten Plaques der KC515 von S. lividans-TK24 präparierten Phagensuspension ergab generell etwa 3 μg an Phagen-DNA. Die DNA wurde zum Zirkularisieren an der cos-Stelle ligiert, anschließend mit Restriktionsenzymen BamHI und PstI verdaut und mit SAP dephosphoryliert.
  • Jede oben beschriebene Modul 8-Kassette wurde mit Restriktionsenzymen BglII und NsiI ausgeschnitten und in die kompatiblen BamHI- und PstI-Stellen der wie oben beschrieben präparierten KC515-Phagen-DNA ligiert. Das Ligationsgemisch, das KC515 und verschiedene Kassetten enthielt, wurde in Protoplasten von Streptomyces lividans TK24 unter Anwendung der in Genetic Manipulation of Streptomyces, A Laboratoy Manual, herausgegeben von D. Hopwood et al., beschriebenen Verfahrensweise transfiziert und mit TK24-Sporen überzogen. Einzelne Plaques wurden gepickt und in 200 μl Nährbrühe resuspendiert. Die Phagen-DNA wurde mittels der Kochmethode (Hopwood et al., supra) präpariert. Die PCR mit Primern, die die linken und rechten Grenzen des rekombinanten Phagen durchspannten, wurde zur Verifizierung dessen angewendet, dass der korrekte Phase isoliert worden war. In den meisten Fällen enthielten mindestens 80 % der Plaques das erwartete Insert. Um das Vorhandensein des Resistenzmarkers (Thiostrepton) zu bestätigen, wurde ein Spot-Test angewendet, wie beschrieben bei Lomovskaya et al. (1997), bei dem eine Platte mit Spots von Phagen mit Gemischen von Sporen von TK24 und phiC31 TK24-Lysogen überzogen wird. Nach der Übernacht-Inkubation wird die Platte mit Antibiotikum in Weichagar überzogen. Ein Arbeitsbestand aller Phagen-enthaltenden gewünschten Konstrukte wird hergestellt.
  • Streptomyces hygroscopicus ATCC 14891 (siehe US-Patent Nr. 3.244.592, ausgegeben am 5. April 1966, hierin durch Bezugnahme mitaufgenommen) Myzelien wurden mit dem rekombinanten Phagen durch Mischen der Sporen und Phagen (jeweils 1 × 108) infiziert und auf R2YE-Agar (Genetic Manipulation of Streptomyces, A Laboratory Manual, herausgegeben von D. Hopwood et al.) bei 30°C für 10 Tage inkubiert. Rekombinante Klone wurden selektiert und auf Minimal-Medium, das Thio strepton (50 μg/ml) enthielt, ausplattiert, um das Thiostreptonresistenz-verleihende Gen zu selektieren. Primäre Thiostrepton-resistente Klone wurden isoliert und durch eine zweite Runde einer Einzelkolonieisolierung je nach Erfordernissen gereinigt. Um Thiostrepton-sensitive Revertanten zu erhalten, die ein zweites Rekombinationsereignis zum Exmittieren des Phagengenoms vollzogen, wurden primäre Rekombinanten in Flüssigmedium für zwei bis drei Tage in Abwesenheit von Thiostrepton vermehrt und dann auf Agarmedium ohne Thiostrepton zum Erhalt der Sporen ausgesät. Die Sporen wurden zum Erhalt von etwa 50 Kolonien pro Platte ausplattiert, und die Thiostrepton-sensitiven Kolonien wurden durch Replikaplattierung auf Thiostrepton-enthaltendem Agarmedium identifiziert. Die PCR wurde zur Bestimmung dessen angewendet, welche der Thiostrepton-sensitiven Kolonien zum Wildtyp revertierte (Umkehrung des anfänglichen Integrationsereignisses), und welche den gewünschten AT-Austausch bei Modul 8 in den ATCC 14891-abgeleiteten Zellen enthalten. Die verwendeten PCR-Primer amplifizierten entweder die KS/AT-Verbindung (junction) oder die AT/DH-Verbindung des Wildtyps und der gewünschten rekombinanten Stämme. Die Fermentation der rekombinanten Stämme, gefolgt von der Isolierung der Metaboliten und der Analyse durch LCMS, und die NMR werden zur Charakterisierung der neuen Polyketid-Verbindungen angewendet.
  • Beispiel 2
  • Austausch von Methoxyl gegen Wasserstoff oder Methyl bei C-13 von FK-506
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch die 13-Desmethoxy-Derivate von FK-506 und die neuen PKS-Enzyme, die sie produzieren, bereit. Eine Vielzahl von Streptomyces-Stämmen, die FK-506 produzieren, ist im Fachgebiet bekannt, einschließlich S. tsukubaensis Nr. 9993 (FERM BP-927), wie beschrieben in US-Patent Nr. 5.624.852 und hierin durch Bezugnahme mitaufgenommen; S. hygroscopicus subsp. yakushimaensis Nr. 7238, beschrieben in US-Patent Nr. 4.894.366 und hierin durch Bezugnahme mitaufgenommen; S. sp. MA6858 (ATCC 55098), beschrieben in US-Patent Nrn. 5.116.756 und hierin durch Bezugnahme mitaufgenommen; und S. sp. MA 6548, beschrieben in Motamedi et al., 1998, "The biosynthetic gene cluster for the macrolactone ring of the immunosuppressant FK-506," Eur. J. Biochem. 256:528–534, und Motamedi et al., 1997, "Structural organization of a multifunctional polyketide synthase involved in the biosynthesis of the macrolide immunosuppressant FK-506," Eur. J. Biochem. 244: 74–80, die jeweils hierin durch Bezugnahme mitaufgenommen sind.
  • Die vollständige Sequenz des FK-506-Genclusters von Streptomyces sp. MA6548 ist bekannt, und die Sequenzen der entsprechenden Gencluster von anderen FK-506-produzierenden Organismen ist in hohem Maße homogen dazu. Die neuen rekombinanten FK-506-Gencluster der vorliegenden Erfindung weichen von den natürlich vorkommenden Genclustern darin ab, dass die AT-Domäne von Modul 8 der natürlich vorkommenden PKS durch eine AT-Domäne ersetzt ist, die für Malonyl-CoA oder Methylmalonyl-CoA spezifisch ist. Diese Austäusche der AT-Domänen werden auf der DNA-Ebene vorgenommen, gefolgt von der in Beispiel 1 beschriebenen Methodologie.
  • Die natürlich vorkommende Modul 8-Sequenz für den MA6548-Stamm ist nachstehend gezeigt, gefolgt von den zur Veranschaulichung dienenden Hybrid-Modul 8-Sequenzen für die MA6548-Stämme.
  • Figure 01090001
  • Figure 01100001
  • Figure 01110001
  • Figure 01120001
  • Figure 01130001
  • Das AvrII-XhoI-Hybrid-FK-506-PKS-Modul 8, das die AT-Domäne des Moduls 12 von Rapamycin enthält, ist nachstehend gezeigt.
  • Figure 01130002
  • Figure 01140001
  • Figure 01150001
  • Figure 01160001
  • Das AvrII-XhoI-Hybrid-FK-506-PKS-Modul 8, das die AT-Domäne des Moduls 13 von Rapamycin enthält, ist nachstehend gezeigt.
  • Figure 01160002
  • Figure 01170001
  • Figure 01180001
  • Figure 01190001
  • Das NheII-XhoI-Hybrid-FK-506-PKS-Modul 8, das die AT-Domäne des Moduls 12 von Rapamycin enthält, ist nachstehend gezeigt.
  • Figure 01190002
  • Figure 01200001
  • Figure 01210001
  • Figure 01220001
  • Das NheII-XhoI-Hybrid-FK-506-PKS-Modul 8, das die AT-Domäne des Moduls 13 von Rapamycin enthält, ist nachstehend gezeigt.
  • Figure 01220002
  • Figure 01230001
  • Figure 01240001
  • Figure 01250001
  • Figure 01260001
  • Beispiel 3
  • Rekombinante PKS-Gene für 13-Desmethoxy-FK-506 und FK-520
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine Vielzahl rekombinanter PKS-Gene über die in Beispielen 1 und 2 beschriebenen hinaus zur Herstellung von 13-Desmethoxy-FK-506 und FK-520-Verbindungen bereit. Dieses Beispiel liefert die Konstruktionsprotokolle für rekombinante FK-520- und FK-506-(von Streptomyces sp. MA6858 (ATCC 55098), beschrieben in US-Patent Nrn. 5.116.756, hierin durch Bezugnahme aufgenommen)-PKS-Genen, in denen die Modul 8-AT-codierenden Sequenzen entweder durch die Codierungssequenzen für rapAT3 (die AT-Domäne von Modul 3 der Rapamycin-PKS), rapAT12, eryAT1 (die AT-Domäne von Modul 1 der Erythromycin-(DEBS)-PKS) oder eryAT2 ersetzt worden sind. Jedes dieser Konstrukte liefert eine PKS, die das 13-Desmethoxy-13-methyl-Derivat erzeugt, mit Ausnahme des rapAT12-Austauschs, der das 13-Desmethoxy-Derivat liefert, d.h. es weist dort einen Wasserstoff auf, wo die anderen Derivate Methyl aufweisen.
  • 7 zeigt das zur Generierung der AT-Austausch-Konstrukte angewendete Verfahren. Zunächst wurde ein Fragment von ~4,5 kb, das die Modul 8-Codierungssequenzen aus dem FK-520-Cluster von ATCC 14891 enthielt, unter Verwendung der bequemen Restriktionsstellen SacI und SphI kloniert (Schritt A in 1). Die Wahl der Restriktionsstellen, die zur Klonierung eines 4,0–4,5 kb-Fragments, umfassend die Modul 8-Codierungssequenzen von anderen FK-520- oder FK-506-Clustern, verwendet werden, kann in Abhängigkeit von der DNA-Sequenz verschieden sein, doch ist das Gesamtschema identisch. Die nur einmal vorkommenden Restriktionsstellen SacI und SphI an den Enden des FK-520-Modul 8-Fragments wurden dann gegen die nur einmal vorkommenden BglII- und NsiI-Stellen durch Ligation an synthetische Linker ausgetauscht (beschrieben in den vorangegangenen Beispielen, siehe Schritt B der 7). Fragmente, die die Sequenzen 5' und 3' der AT8-Sequenzen enthielten, wurden dann unter Verwendung der oben beschriebenen Primer, die entweder eine AvrII-Stelle oder eine NheI-Stelle an zwei verschiedenen KS/AT-Grenzen und eine XhoI-Stelle an der AT/DH-Grenze einführten, amplifiziert (Schritt C der 7). Heterologe AT-Domänen aus den Rapamycin- und Erythromycin-Genclustern wurden unter Verwendung der oben beschriebenen Primer, die dieselben Stellen wie eben beschrieben einführen, amplifiziert (Schritt D der 7). Die Fragmente wurden ligiert, um Hybrid-Module mit in-frame-Fusionen an den KS/AT- und AT/DH-Grenzen zu erhalten (Schritt E der 7). Schließlich wurden diese Hybrid-Module in die BamHI- und PstI-Stellen des KC515-Vektors ligiert. Der resultierende rekombinante Phage wurde zum Transformieren der FK-506- und FK-520-Produzentenstämme zum Erhalt der gewünschten rekombinanten Zellen verwendet, wie in den vorangegangenen Beispielen beschrieben.
  • Die folgende Tabelle zeigt die Lokalisation und die Sequenzen, die die konstruierte Stelle jeder der verwendeten heterologen AT-Domänen umgeben. Das FK-506-Hybrid-Konstrukt wurde als einer Kontrolle für die erzeugten rekombinanten FK-520-Zellen verwendet, und ein ähnliches FK-520-Hybrid-Konstrukt wurde als einer Kontrolle für die rekombinanten FK-506-Zellen verwendet.
  • Figure 01280001
  • Die unten gezeigten Sequenzen zeigen die Lokalisation der KS/AT-Grenzen, wie in den FK-520-Modul 8-Codierungssequenzen gewählt. Regionen, in denen die AvrII- und NheI-Stellen konstruiert wurden, sind durch Kleinschreibung und Unterstreichung gezeigt.
  • Figure 01290001
  • Die unten gezeigten Sequenzen zeigen die Lokalisation der AT/DH-Grenzen, wie in den FK-520-Modul 8-Codierungssequenzen gewählt. Regionen, in denen die XhoI-Stellen konstruiert wurde, sind durch Kleinschreibung und Unterstreichung gezeigt.
  • Figure 01290002
  • Die unten gezeigten Sequenzen zeigen die Lokalisation der KS/AT-Grenzen, wie in den FK-506-Modul 8-Codierungssequenzen gewählt. Regionen, in denen die AvrII- und NheI-Stellen konstruiert wurden, sind durch Kleinschreibung und Unterstreichung gezeigt.
  • Figure 01290003
  • Die unten gezeigten Sequenzen zeigen die Lokalisation der AT/DH-Grenzen, wie in den FK-506-Modul 8-Codierungssequenzen gewählt. Regionen, in denen die XhoI-Stellen konstruiert wurden, sind durch Kleinschreibung und Unterstreichung gezeigt.
  • Figure 01300001
  • Beispiel 4
  • Austausch von Methoxyl gegen Wasserstoff oder Methyl bei C-15 von FK-506 und FK-520
  • Die Verfahren und Reagenzien der vorliegenden Erfindung liefern auch die neuen FK-506- und FK-520-Derivate, in denen die Methoxygruppe bei C-15 durch einen Wasserstoff oder Methyl ersetzt ist. Diese Derivate werden in rekombinanten Wirtszellen der Erfindung produziert, die rekombinante PKS-Enzyme exprimieren, welche die Derivate produzieren. Diese rekombinanten PKS-Enzyme werden gemäß der Methodologie aus Beispielen 1 und 2 präpariert, mit der Ausnahme, dass die AT-Domäne von Modul 7, anstelle von Modul 8, ausgetauscht wird. Darüber hinaus liefert die vorliegende Erfindung rekombinante PKS-Enzyme, in denen die AT-Domänen sowohl von Modul 7 als auch 8 ausgetauscht worden sind. Die untenstehende Tabelle fasst die verschiedenen, durch die vorliegende Erfindung bereitgestellten Verbindungen zusammen.
  • Figure 01300002
  • Figure 01310001
  • Beispiel 5
  • Austausch von Methoxyl gegen Ethyl bei C-13 und/oder C-15 von FK-506 und FK-520
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch neue FK-506- und FK-520-Derivat-Verbindungen bereit, in denen die Methoxygruppen an einer oder beiden der C-13- und C-15-Positionen durch Ethylgruppen ersetzt sind. Diese Verbindungen werden durch die neuen PKS-Enzyme der Erfindung produziert, in denen die AT-Domänen von Modulen 8 und/oder 7 zu Ethylmalonyl-spezifischen AT-Domänen durch Modifikation des PKS-Gens, das das Modul codiert, umgewandelt sind. Codierungssequenzen für die Ethylmalonyl-spezifische AT-Domäne können zum Beispiel von den FK-520-PKS-Genen, den Niddamycin-PKS-Genen und den Tylosin-PKS-Genen erhalten werden. Die neuen PKS-Gene der Erfindung umfassen nicht nur jene, in denen eine oder beide der AT-Domänen von Modulen 7 und 8 zu Ethylmalonyl-spezifischen AT-Domänen umgewandelt worden sind, sondern auch jene, in denen eines der Module zu einer Ethylmalonyl-spezifischen AT-Domäne umgewandelt ist und das andere zu einer Malonyl-spezifischen oder einer Methylmalonyl-spezifischen AT-Domäne umgewandelt ist.
  • Beispiel 6
  • Neurotrophische Verbindungen
  • Die in Beispielen 1–4 einschließlich beschriebenen Verbindungen weisen eine immunsuppressive Aktivität auf und können als Immunsuppressiva in einer Weise und in Formulierungen ähnlich jenen, die für FK-506 verwendet werden, eingesetzt werden. Die Verbindungen der Erfindung sind generell für die Verhütung einer Organabstoßung bei Patienten, die Organtransplantate erhalten, wirksam und können insbesondere für die Immunsuppression nach einer orthotopen Lebertransplantation ver wendet werden. Diese Verbindungen weisen auch pharmakokinetische Eigenschaften und einen Metabolismus auf, die für bestimmte Anwendungen relativ zu denen von FK-506 oder FK-520 vorteilhafter sind. Diese Verbindungen sind auch neurotrophisch; zur Verwendung als Neurotrophine ist es jedoch wünschenswert, die Verbindungen zu modifizieren, um ihre immunsuppressive Aktivität zu vermindern oder zu beseitigen. Dies lässt sich durch Hydroxylierung der Verbindungen an der C-18-Position unter Anwendung einer etablierten chemischen Methodologie oder der neuen, durch die vorliegende Erfindung bereitgestellten FK-520-PKS-Gene ohne weiteres erreichen.
  • Somit stellt die vorliegende Erfindung in einem Aspekt ein Verfahren für die Stimulierung des Nervenwachstums bereit, das das Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Dosis von 18-Hydroxy-FK-520 umfasst. Bei einer anderen Anwendungsform ist die verabreichte Verbindung ein C-18,20-Dihydroxy-FK-520-Derivat. In einer anderen Anwendungsform ist die verabreichte Verbindung ein C-13-Desmethoxy- und/oder C-15-Desmethoxy-18-hydroxy-FK-520-Derivat. In einer weiteren Anwendungsform ist die verabreichte Verbindung ein C-13-Desmethoxy- und/oder C-15-Desmethoxy-18,20-dihydroxy-FK-520-Derivat. In weiteren Anwendungsformen sind die Verbindungen die entsprechenden Analoga von FK-506. Die 18-Hydroxy-Verbindungen der Erfindung können chemisch hergestellt werden, wie beschrieben in US-Patent Nr. 5.189.042, hierin durch Bezugnahme mitaufgenommen, oder durch die Fermentation einer durch die vorliegende Erfindung bereitgestellten rekombinanten Wirtszelle, die eine rekombinante PKS exprimiert, in welcher die Modul 5-DH-Domäne deletiert oder nicht-funktional gemacht worden ist.
  • Die chemische Methodologie ist wie folgt. Eine Verbindung der Erfindung (~200 mg) wird in 3 ml an trockenem Methylenchlorid gelöst und in 45 μl an 2,6-Lutidin eingebracht und das Gemisch bei Raumtemperatur gerührt. Nach 10 Minuten wird tert-Butyldimethylsilyltrifluormethansulfonat (64 μl) mittels einer Spritze zugegeben. Nach 15 Minuten wird das Reaktionsgemisch mit Ethylacetat verdünnt, mit gesättigtem Bicarbonat gewaschen, mit Salzlösung gewaschen und die organische Phase über Magnesiumsulfat getrocknet. Die Entfernung des Lösungsmittel in vacuo und Flashchromatographie auf Kieselgel (Ethylacetat:Hexan (1:2) plus 1 % Methanol) ergibt die geschützte Verbindung, die in 95 % Ethanol (2,2 ml) gelöst wird, woraufhin dem 53 μl Pyridin, gefolgt von Seleniumdioxid (58 mg), zugesetzt wird. Der Kolben wird mit einem Wasserkondensator ausgestattet und auf einem Mantel auf 70°C erhitzt. Nach 20 Stunden wird das Gemisch auf Raumtemperatur abgekühlt, durch Kieselgur filtriert und das Filtrat in eine gesättigte Natriumbicarbonatlösung gegossen. Dies wird mit Ethylacetat extrahiert, und die organische Phase wird mit Salzlösung gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Die Lösung wird mittels Flashchromatographie auf Kieselgel (Ethylacetat:Hexan (1:2) plus 1 % Methanol) konzentriert und gereinigt, was die geschützte 18-Hydroxy-Verbindung ergibt. Diese Verbindung wird in Acetonitril gelöst und mit wässriger HF behandelt, um die Schutzgruppen zu entfernen. Nach der Verdünnung mit Ethylacetat wird das Gemisch mit gesättigtem Bicarbonat und Salzlösung gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und eingedampft, was die 18-Hydroxy-Verbindung ergibt. Auf diese Weise stellt die vorliegende Erfindung die C-18-Hydroxyl-Derivate der in den Beispielen 1–4 beschriebenen Verbindungen bereit.
  • Fachleute des Gebiets werden erkennen, dass andere geeignete chemische Verfahrensweisen zur Herstellung der neuen 18-Hydroxy-Verbindungen der Erfindung angewendet werden können. Siehe z.B. Kawai et al., Jan. 1993, Structure-acitivity profiles of macrolactam immunosuppressant FK-506 analogues, FEBS Letters 316(2). 107–113, wie hierin durch Bezugnahme mitaufgenommen. Diese Verfahren können zur Herstellung sowohl der C-18-[S]-OH- als auch der C18-[R]-OH-Enantiomere angewendet werden, wobei das R-Enantiomer eine etwas geringere IC50 zeigt, was für einige Anwendungen bevorzugt sein mag. Siehe Kawai et al., supra. Ein anderes bevorzugtes Protokoll ist beschrieben bei Umbreit und Sharpless, 1977, JACS 99(16): 1526–28, obschon es bevorzugt sein mag, jeweils 30 Äquivalente von SeO2 und t-BuOOH anstelle der 0,02 bzw. 3–4 Äquivalente zu verwenden, die in jener Referenz beschrieben sind.

Claims (10)

  1. Polyketid mit der Struktur
    Figure 01340001
    worin R1 Wasserstoff, Methyl, Ethyl oder Allal ist; R2 Wasserstoff oder Hydroxyl ist, vorausgesetzt, dass dann, wenn R2 Wasserstoff ist, eine Doppelbindung zwischen C-20 und C-19 vorliegt; R3 Wasserstoff oder Hydroxyl ist; R4 Methoxyl, Wasserstoff, Methyl oder Ethyl ist; und R5 Methoxyl, Wasserstoff, Methyl oder Ethyl ist; wobei wenigstens eines von R4 und R5 nicht Methoxy ist.
  2. Polyketid nach Anspruch 1, welches 13-Desmethoxy-FK-506 ist.
  3. Polyketid nach Anspruch 1, welches 13-Desmethoxy-18-hydroxy-FK-520 ist.
  4. Polyketid nach Anspruch 1, welches 13-Desmethoxy-13-methyl-FK-506, 15-Desmethoxy-FK-506, 15-Desmethoxy-15-methyl-FK-506, 13,15-Didesmethoxy-FK-506, 13,15-Didesmethoxy-13-methyl-FK-506, 13,15-Didesmethoxy-15-methyl-FK-506 oder 13,15-Didesmethoxy-13,15-dimethyl-FK-506 ist.
  5. Polyketid nach Anspruch 1, welches 13-Desmethoxy-FK-520, 13-Desmethoxy-13-methyl-FK-520, 15-Desmethoxy-FK-520, 15-Desmethoxy-15-methyl-FK-520, 13,15-Didesmethoxy-FK-520, 13,15-Didesmethoxy-13-methyl-FK-520, 13,15-Didesmethoxy-15-methyl-FK-520 oder 13,15-Didesmethoxy-13,15-dimethyl-FK-520 ist.
  6. Polyketid nach Anspruch 1, welches 13-Desmethoxy-18-hydroxyl-FK-506, 13-Desmethoxy-13-methyl-18-hydroxyl-FK-506, 15-Desmethoxy-18-hydroxyl-FK-506, 15-Desmethoxy-15-methyl-18-hydroxyl-FK-506, 13,15-Didesmethoxy-18-hydroxyl-FK-506, 13,15-Didesmethoxy-13-methyl-18-hydroxyl-FK-506, 13,15-Didesmethoxy-15-methyl-18-hydroxyl-FK-506 oder 13,15-Didesmethoxy-13,15-dimethyl-18-hydroxyl-FK-506 ist.
  7. Polyketid nach Anspruch 1, welches 13-Desmethoxy-13-methyl-18-hydroxyl-FK-520, 15-Desmethoxy-18-hydroxyl-FK-520, 15-Desmethoxy-15-methyl-18-hydroxyl-FK-520, 13,15-Didesmethoxy-18-hydroxyl-FK-520, 13,15-Didesmethoxy-13-methyl-18-hydroxyl-FK-520, 13,15-Didesmethoxy-15-methyl-18-hydroxyl-FK-520 oder 13,15-Didesmethoxy-13,15-dimethyl-18-hydroxyl-FK-520 ist.
  8. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend das Polyketid nach einem der vorangehenden Ansprüche.
  9. Polyketid nach einem der Ansprüche 1 bis 7, zur Anwendung in der Therapie.
  10. Polyketid nach einem der Ansprüche 1 bis 7, zur Anwendung in der Immunsuppression oder der Stimulierung des Nervenwachstums und -regeneration.
DE69934242T 1998-10-02 1999-10-01 Polyketid synthase enzyme und rekombinante dna konstrukte dafür, zur herstellung von mit fk-506 und fk-520 verwandten verbindungen Expired - Fee Related DE69934242T2 (de)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US10274898P 1998-10-02 1998-10-02
US102748P 1998-10-02
US12381099P 1999-03-11 1999-03-11
US123810P 1999-03-11
US13965099P 1999-06-17 1999-06-17
US139650P 1999-06-17
PCT/US1999/022886 WO2000020601A2 (en) 1998-10-02 1999-10-01 Polyketide synthase enzymes and recombinant dna constructs therefor

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE69934242D1 DE69934242D1 (de) 2007-01-11
DE69934242T2 true DE69934242T2 (de) 2007-09-20

Family

ID=27379409

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE69934242T Expired - Fee Related DE69934242T2 (de) 1998-10-02 1999-10-01 Polyketid synthase enzyme und rekombinante dna konstrukte dafür, zur herstellung von mit fk-506 und fk-520 verwandten verbindungen

Country Status (13)

Country Link
US (5) US6503737B1 (de)
EP (1) EP1117801B1 (de)
JP (1) JP2002526114A (de)
KR (1) KR20010085877A (de)
CN (1) CN1329668A (de)
AT (1) ATE346938T1 (de)
AU (2) AU773517B2 (de)
CA (1) CA2343880C (de)
DE (1) DE69934242T2 (de)
IL (1) IL142165A0 (de)
MX (1) MXPA01003376A (de)
NZ (1) NZ510819A (de)
WO (1) WO2000020601A2 (de)

Families Citing this family (60)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4579351B2 (ja) 1996-12-03 2010-11-10 スローン−ケッタリング インスティトュート フォア キャンサー リサーチ エポチロンの合成とその中間体及びその類似物並びにその使用
US6204388B1 (en) 1996-12-03 2001-03-20 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Synthesis of epothilones, intermediates thereto and analogues thereof
DE69934242T2 (de) 1998-10-02 2007-09-20 Kosan Biosciences, Inc., Hayward Polyketid synthase enzyme und rekombinante dna konstrukte dafür, zur herstellung von mit fk-506 und fk-520 verwandten verbindungen
US6569867B2 (en) 1999-10-01 2003-05-27 Kosan Biosciences, Inc. Polyketide derivatives
US6939691B1 (en) 1999-10-13 2005-09-06 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University E. coli and Streptomyces host cells that contain MatBC genes or E. coli host cells that contain pcc genes useful for enhanced polyketide production
ES2335385T3 (es) * 1999-10-13 2010-03-26 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Biosintesis de sustratos de policetido sintasa.
US7011959B1 (en) * 1999-10-27 2006-03-14 Kosan Biosciences, Inc. Heterologous production of polyketides
US6627427B1 (en) * 1999-10-25 2003-09-30 Kosan Biosciences, Inc. Heterologous production of 15-methyl-6-deoxyerthronolide B
AU2748701A (en) 1999-10-29 2001-06-06 Kosan Biosciences, Inc. Rapamycin analogs
WO2001060833A2 (en) 2000-02-18 2001-08-23 Kosan Biosciences, Inc. Motilide compounds
AU6143201A (en) * 2000-05-17 2001-11-26 Kosan Biosciences Inc Novel polyketide derivatives
US20030050692A1 (en) * 2000-12-22 2003-03-13 Avantec Vascular Corporation Delivery of therapeutic capable agents
EP1381672A4 (de) * 2001-02-28 2006-01-25 Trustees Of Board Of Biosynthese von polyketidsynthasesubstraten
FR2825717B1 (fr) 2001-06-08 2005-02-18 Rhodia Chimie Sa Preparation stereoselective de l-acides amines cycliques
US7452692B2 (en) * 2002-02-13 2008-11-18 Teva Gyógyszergyár Zártkörüen Müködö Részvénytársaság Method for extracting a macrolide from biomatter
EP1474404A4 (de) * 2002-02-13 2006-01-11 Biogal Gyogyszergyar Verfahren zur extraktion eines makrolids aus biologischem material
US20030225006A1 (en) * 2002-02-19 2003-12-04 Burns Lesley S Novel spinosyn-producing polyketide synthases
US20030219872A1 (en) 2002-03-29 2003-11-27 Wyeth Non-ribosomal peptide synthetases and associated biosynthetic genes
US7195907B2 (en) 2002-03-29 2007-03-27 Wyeth Non-ribosomal peptide synthetases and associated biosynthetic genes
EP2277898A3 (de) * 2002-07-16 2011-06-01 Biotica Technology Limited Rapamycinähnliche Substanzen
AU2007237187B2 (en) * 2002-07-16 2010-08-05 Biotica Technology Limited Production of polyketides
EP1506203B1 (de) * 2002-08-23 2007-01-03 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Synthese von epothilonen, zwischenprodukte dafür, analoga und deren verwendungen
US6921769B2 (en) 2002-08-23 2005-07-26 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Synthesis of epothilones, intermediates thereto and analogues thereof
US7649006B2 (en) 2002-08-23 2010-01-19 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Synthesis of epothilones, intermediates thereto and analogues thereof
US7799904B2 (en) * 2003-06-13 2010-09-21 University Of Kentucky Research Foundation Gilvocarcin gene cluster, recombinant production and use thereof
CN1886505A (zh) * 2003-11-27 2006-12-27 美露香株式会社 参与大环内酯类化合物的羟化作用的dna
FR2869044B1 (fr) * 2004-04-16 2006-07-14 Korea Advanced Inst Sci & Tech Genes pour la synthese de polyketides fr-008
WO2005116200A2 (en) * 2004-05-05 2005-12-08 Regents Of The University Of Minnesota Nucleic acids and polypeptides involved in the production of cryptophycin
EP1756747B1 (de) * 2004-05-06 2012-06-13 Acco Brands Corporation Verfahren und vorrichtung zur bestimmung einer optimalen ergonomischen einrichtung
US7507752B2 (en) * 2004-06-03 2009-03-24 Wyeth Biosynthetic gene cluster for the production of a complex polyketide
CA2574092C (en) * 2004-07-20 2011-08-23 Eisai R & D Management Co., Ltd. Dna coding for polypeptide participating in biosynthesis of pladienolide
WO2006069333A1 (en) * 2004-12-22 2006-06-29 Teva Gyógyszergyár Zàrtköruen Muködo Rèszvènytàrsasàg Method of purifying macrolides
WO2006083486A1 (en) * 2005-01-05 2006-08-10 TEVA GYÓGYSZERGYÁR ZÁRTKöR..EN M..k..D.. RÉSZVÉNYTÁRSASÁG Amorphous tacrolimus and preparation thereof
TW200716744A (en) * 2005-05-26 2007-05-01 Eisai R&D Man Co Ltd Genetically modified microorganism and process for production of macrolide compound using the microorganism
JP4700022B2 (ja) * 2006-03-15 2011-06-15 アイバックス ファーマシューティカルズ スポレツノスト エス ルチェニム オメゼニム タクロリマスの精製方法
US7566558B2 (en) 2006-07-28 2009-07-28 Regents Of The University Of Michigan Nucleic acids and polypeptides involved in the production of cryptophycin
US8759031B2 (en) * 2007-04-12 2014-06-24 Wisconsin Alumni Research Foundation Type I polyketide synthase extender units
EP2272963A1 (de) 2009-07-09 2011-01-12 LEK Pharmaceuticals d.d. Verfahren zur Herstellung von Tacrolimus
KR101189475B1 (ko) * 2009-12-03 2012-10-15 (주) 제노텍 삼원환 화합물의 생합성을 담당하는 유전자와 단백질
US9428845B1 (en) 2010-12-28 2016-08-30 Warp Drive Bio, Inc. Identifying new therapeutic agents
JP2014508516A (ja) 2011-01-28 2014-04-10 アミリス， インコーポレイテッド ゲルに封入されたマイクロコロニーのスクリーニング
MX2013013065A (es) 2011-05-13 2013-12-02 Amyris Inc Metodos y composiciones para detectar la produccion microbiana de compuestos inmiscibles em agua.
US9487337B2 (en) 2011-09-19 2016-11-08 Dow Global Technologies Llc Layered structures and articles prepared therefrom
CN104540949B (zh) 2012-08-07 2018-05-29 阿迈瑞斯公司 用于稳定乙酰-辅酶a衍生化合物生成的方法
US9121859B2 (en) 2012-12-04 2015-09-01 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Compounds and methods for determination of FKBP-binding immunosuppressant drugs
AU2014227811C1 (en) 2013-03-15 2018-09-27 Amyris, Inc. Use of phosphoketolase and phosphotransacetylase for production of acetyl-coenzyme a derived compounds
CA2918891C (en) 2013-08-07 2023-03-14 Amyris, Inc. Methods for stabilizing production of acetyl-coenzyme a derived compounds
US10533016B2 (en) 2015-01-09 2020-01-14 Revolution Medicines, Inc. Compounds that participate in cooperative binding and uses thereof
WO2016210343A1 (en) 2015-06-25 2016-12-29 Amyris, Inc. Maltose dependent degrons, maltose-responsive promoters, stabilization constructs, and their use in production of non-catabolic compounds
US9989535B2 (en) 2015-10-01 2018-06-05 Warp Drive Bio, Inc. Methods and reagents for analyzing protein-protein interfaces
WO2017180748A1 (en) 2016-04-12 2017-10-19 Warp Drive Bio, Inc. Compositions and methods for the production of compounds
KR102561694B1 (ko) * 2016-10-28 2023-07-28 징코 바이오웍스, 인크. 화합물의 생산을 위한 조성물 및 방법
AU2017350900A1 (en) 2016-10-28 2019-06-13 Ginkgo Bioworks, Inc. Compositions and methods for the production of compounds
KR102109168B1 (ko) * 2018-12-11 2020-05-12 인트론바이오테크놀로지 신규 화합물 및 이를 포함하는 진균감염 치료용 약학적 조성물
CN109943545B (zh) * 2019-03-29 2021-08-03 浙江大学 一种酰基转移酶结构域定向改造合成化合物的方法
US11827837B2 (en) * 2019-04-02 2023-11-28 King Fahd University Of Petroleum And Minerals Water-based drilling, completion, and workover fluid composition with reduced barite sagging
TW202132316A (zh) 2019-11-04 2021-09-01 美商銳新醫藥公司 Ｒａｓ抑制劑
TW202132314A (zh) 2019-11-04 2021-09-01 美商銳新醫藥公司 Ｒａｓ抑制劑
CR20220240A (es) 2019-11-04 2022-08-03 Revolution Medicines Inc Inhibidores de ras
TW202227460A (zh) 2020-09-15 2022-07-16 美商銳新醫藥公司 Ｒａｓ抑制劑

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4894366A (en) * 1984-12-03 1990-01-16 Fujisawa Pharmaceutical Company, Ltd. Tricyclo compounds, a process for their production and a pharmaceutical composition containing the same
US5149639A (en) 1986-03-24 1992-09-22 Abbott Laboratories Biologically pure cultures of streptomyces and use thereof in macrolide antibiotic production
US4874748A (en) 1986-03-24 1989-10-17 Abbott Laboratories Cloning vectors for streptomyces and use thereof in macrolide antibiotic production
AU630866B2 (en) * 1987-12-09 1992-11-12 Fisons Plc Macrocyclic compounds
US5063155A (en) 1988-03-28 1991-11-05 Eli Lilly And Company Method for producing 2"'-o-demethyltylosin
US5098837A (en) 1988-06-07 1992-03-24 Eli Lilly And Company Macrolide biosynthetic genes for use in streptomyces and other organisms
EP0356399A3 (de) * 1988-08-26 1991-03-20 Sandoz Ag Substituierte 4-Azatricyclo (22.3.1.04.9) octacos-18-en-Derivate, Verfahren zu ihrer Herstellung und die sie enthaltenden pharmazeutischen Zusammensetzungen
CA2044846A1 (en) * 1990-06-25 1991-12-26 Thomas R. Beattie Antagonists of immunosuppressive macrolides
WO1993013663A1 (en) 1992-01-17 1993-07-22 Abbott Laboratories Method of directing biosynthesis of specific polyketides
US5824513A (en) 1991-01-17 1998-10-20 Abbott Laboratories Recombinant DNA method for producing erythromycin analogs
US5189042A (en) 1991-08-22 1993-02-23 Merck & Co. Inc. Fluoromacrolides having immunosuppressive activity
US5712146A (en) 1993-09-20 1998-01-27 The Leland Stanford Junior University Recombinant combinatorial genetic library for the production of novel polyketides
WO1998049315A2 (en) 1997-04-30 1998-11-05 Kosan Biosciences, Inc. Combinatorial polyketide libraries produced using a modular pks gene cluster as scaffold
US5672491A (en) 1993-09-20 1997-09-30 The Leland Stanford Junior University Recombinant production of novel polyketides
ES2164713T3 (es) 1993-09-20 2002-03-01 Univ Leland Stanford Junior Produccion recombinante de nuevos poliquetidos.
WO1997002358A1 (en) 1995-07-06 1997-01-23 The Leland Stanford Junior University Cell-free synthesis of polyketides
US6033883A (en) 1996-12-18 2000-03-07 Kosan Biosciences, Inc. Production of polyketides in bacteria and yeast
US5968921A (en) 1997-10-24 1999-10-19 Orgegon Health Sciences University Compositions and methods for promoting nerve regeneration
FR2780774B1 (fr) * 1998-07-03 2001-03-09 Alkan Sa Dispositif d'autoprotection passive pour engin mobile tel qu'un helicoptere
US6150513A (en) 1998-09-16 2000-11-21 Kosan Biosciences, Inc. Polyketide synthase enzymes and recombinant DNA constructs therefor
DE69934242T2 (de) * 1998-10-02 2007-09-20 Kosan Biosciences, Inc., Hayward Polyketid synthase enzyme und rekombinante dna konstrukte dafür, zur herstellung von mit fk-506 und fk-520 verwandten verbindungen

Also Published As

Publication number Publication date
JP2002526114A (ja) 2002-08-20
MXPA01003376A (es) 2002-11-07
NZ510819A (en) 2004-03-26
US20030175901A1 (en) 2003-09-18
AU773517B2 (en) 2004-05-27
US6759536B2 (en) 2004-07-06
US20020010328A1 (en) 2002-01-24
CA2343880C (en) 2008-08-26
CN1329668A (zh) 2002-01-02
CA2343880A1 (en) 2000-04-13
KR20010085877A (ko) 2001-09-07
EP1117801B1 (de) 2006-11-29
IL142165A0 (en) 2002-03-10
ATE346938T1 (de) 2006-12-15
AU1441500A (en) 2000-04-26
EP1117801A2 (de) 2001-07-25
US20090186378A1 (en) 2009-07-23
WO2000020601A3 (en) 2000-10-26
USRE39762E1 (en) 2007-08-07
WO2000020601A9 (en) 2000-08-31
DE69934242D1 (de) 2007-01-11
US6503737B1 (en) 2003-01-07
US6660862B2 (en) 2003-12-09
AU2004202308A1 (en) 2004-06-24
US7714118B2 (en) 2010-05-11
WO2000020601A2 (en) 2000-04-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE69934242T2 (de) Polyketid synthase enzyme und rekombinante dna konstrukte dafür, zur herstellung von mit fk-506 und fk-520 verwandten verbindungen
DE60033965T2 (de) Rapamycin analoge
DE69733416T2 (de) Erythromycine und verfahren zu ihrer herstellung
KR100851418B1 (ko) 에포틸론 및 에포틸론 유도체의 생산을 위한 재조합 방법 및 물질
US6410301B1 (en) Myxococcus host cells for the production of epothilones
DE60114865T2 (de) Heterologe herstellung von polyketiden
DE69434408T2 (de) Recombinante Herstellung aromatischer Polyketiden
DE60315723T2 (de) Herstellung von Polyketiden und anderen natürlichen Produkten
DE69930510T2 (de) Polyketide und ihre herstellung
EP2271666B1 (de) Nrps-pks gencluster und dessen manipulation und verwendung
DE69930515T2 (de) Polyketide, ihre herstellung, und darin benutzte materialien
WO2012089349A2 (en) Novel polyketide compounds and methods of making same
US7807418B2 (en) Method for producing hybrid polyketide synthases
WO2007079715A2 (de) Neue lysolipin derivate
WO2006032232A2 (de) Neuer lysolipin biosynthesegencluster
Lambalot Biosynthesis of the macrolide antibiotics Methymycin and Erythromycin
DE102004047269A1 (de) Neue Lysolipin Biosynthesegencluster
JP2009213479A (ja) ポリケチド類及びそれらの合成

Legal Events

Date Code Title Description
8364 No opposition during term of opposition
8339 Ceased/non-payment of the annual fee