CN109943545B - 一种酰基转移酶结构域定向改造合成化合物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种酰基转移酶结构域定向改造合成化合物的方法，该方法通过催化合成链霉菌次级代谢产物主链的I型聚酮合酶中专一转移相同底物的酰基转移酶结构域的氨基酸序列比对，从而得到其转移底物的关键氨基酸位点。利用AT结构域与底物的对接模型和分子动力学模拟、AT结构域的点突变和体外生化反应分析验证上述转移底物的关键氨基酸位点。通过替换其他AT结构域转移底物的关键位点，改变其转移的底物，从而发酵产生新型化合物。本发明确定AT结构域中关键氨基酸步骤简单，筛选突变株相对快速，为链霉菌合成新型I型聚酮化合物提供了普遍通用的技术，为链霉菌产生更多的药物提供依据，为产生链霉菌次级代谢新型天然产物提供了一种新的途径。
Description
技术领域
本发明属于微生物合成生物学领域，涉及一种酰基转移酶结构域定向改造合成新型化合物的方法，是利用酰基转移酶(AT)结构域的定向改造合成新型化合物的方法。
背景技术
链霉菌是一种革兰氏阳性菌，由于其在次级代谢过程中能产生丰富的具有重要生物活性的聚酮产物如抗生素和抗肿瘤药物等而具有巨大工业价值。为产生具有重要生物活性的新型聚酮化合物，需要利用合成聚酮化合物的相关关键酶的工程改造，如催化合成聚酮化合物的I型聚酮合酶(PKS)中的关键酶——AT结构域。
链霉菌发酵产生的大量聚酮化合物主链是由I型PKS指导合成，如FK506。I型PKS由模块组成，其中必定含有β-酮酰基硫酯合酶(KS)结构域、AT结构域和酰基受体(ACP)结构域。AT结构域作为PKS中的关键酶，能转运不同功能的酰基基团渗入主链。因此，AT结构域不仅决定主链合成效率，而且决定主链结构多样性。为合成新型聚酮化合物这一目标，设法寻找对AT结构域定向改造的方法。
工业筑波链霉菌L20生产的免疫抑制剂FK506的主链中含有特殊甲氧基基团，其对FK506的生物活性具有重要影响。为产生FK506新型化合物，将AT8FkbA与其他特异性转运MeO的I型ATs进行氨基酸序列比对，利用AT结构域与底物的对接模型和分子动力学模拟(MDs)、AT结构域的点突变和体外生化反应分析验证AT8FkbA中特异性转移MeO的关键氨基酸位点。通过替换AT10FkbA转移底物的关键位点为AT8FkbA中特异性转移MeO的关键位点，改变其转移底物由甲基丙二酰(M)为甲氧基丙二酰(MeO)，从而发酵产生新型化合物。这是一种酰基转移酶结构域定向改造合成新型化合物的新方法。这种方法也可用于去除链霉菌天然产物的同系物、提高天然产物的纯度。
发明内容
本发明的目的是提供一种酰基转移酶结构域定向改造合成化合物的方法，针对的是链霉菌次级代谢产物主链合成途径AT结构域底物选择性的定向改造，提供一种组合生物学合成新型化合物的方法。这是一种基于AT结构域特异性转移底物的关键氨基酸的挖掘，突变关键氨基酸位点，改变其转移的底物，从而发酵产生新型代谢化合物的新技术。
本发明通过以下方法实现：
通过催化合成链霉菌次级代谢产物主链的I型PKS中专一转移相同底物的AT结构域的氨基酸序列比对，得到其转移底物的关键氨基酸位点L75、G169、H160和H161，利用AT结构域与底物的对接模型和MDs、AT结构域的点突变和体外生化反应分析验证上述转移底物的关键氨基酸位点；通过替换其他AT结构域转移底物的关键位点，改变其转移的底物，从而发酵产生新型化合物。
以筑波链霉菌L20中催化合成FK506主链的I型PKS中第8模块特异性转移底物MeO的AT8FkbA为例，利用特异性转移MeO的I型ATs的氨基酸序列比对、MeO-AT8FkbA对接模型和MDs、点突变体外生化反应验证得到AT8FkbA识别MeO的关键氨基酸L75、G169、H160和H161。并将第10模块特异性转移底物M的AT10FkbA上的氨基酸位点突变为V90L-F188G-A179H-K180H，其突变体发酵代谢产物中产生新型FK506化合物9-OCH3-FK506。
本发明方法具体通过以下步骤实现：
(1)根据文献检索查阅得到特异性转移MeO的I型ATs与FK506PKS的所有ATs进行氨基酸序列比对，初步筛选得到AT8FkbA特异性转移MeO的氨基酸位点。
(2)根据文献检索和生物信息学软件建立MeO-AT8FkbA的对接模型，并在其模型上观察步骤(1)中初步筛选得到的氨基酸位点与MeO的作用关系，进一步筛选得到与MeO转移相关的AT8FkbA的氨基酸位点L75、G169和H160-H161。利用MDs，进一步确定上述氨基酸位点对AT8FkbA特异性转移MeO中起关键作用。
(3)根据步骤(1-2)中二次筛选得到的AT8FkbA特异性转移MeO的氨基酸位点分别进行点突变，突变为Ala，并分别将其异源表达、纯化和体外生化反应，筛选和验证得到AT8FkbA特异性转移MeO的氨基酸位点L75、G169和H160-H161。
(4)根据步骤(3)中的体外生化筛选结果，与AT8FkbA氨基酸序列最为相似，且转移非本身底物有效率最高的AT10FkbA进行点突变，即特异性转移底物M的AT10FkbA的关键氨基酸位点突变为AT8FkbA特异性转移MeO的氨基酸位点L75、G169和H160-H161，并将这些点突变体异源表达、纯化和体外生化实验，筛选和验证得到AT10FkbA突变体V90L-F188G-A179H-K180H可特异性转移底物MeO。
(5)设计引物初步筛选得到包含完整FK506基因簇的人类人工染色体文库质粒PAC-B18的大肠杆菌DH10β，并利用蛋白ccdA存在，ccdB蛋白对大肠杆菌无毒性；ccdA不存在，ccdB致死大肠杆菌的原理，标准操作电转含有ccdA基因的温度敏感性质粒pSC101-ccdA-gbaA，LB固体培养基30℃培养得到含有质粒PAC-B18和pSC101-ccdA-gbaA的菌株DH10β。
(6)以质粒p15A-ccdB-amp为模板，设计引物扩增反筛因子ccdB-amp片段且其两侧含有AT10FkbA点突变区域范围的核酸序列，利用标准操作电转上述ccdB-amp片段到步骤(5)筛选得到的DH10β中，LB固体培养基30℃培养得到含有质粒PAC-B18-ccdB-amp和pSC101-ccdA-gbaA的菌株DH10β，以此用ccdB-amp片段替换AT10FkbA中氨基酸位点Val90，Phe188，Ala179和Lys180范围的核酸片段。
(7)根据步骤(4)中AT10FkbA突变体V90L-F188G-A179H-K180H可特异性转移底物MeO的体外生化结果，以此突变体质粒为模板，设计引物扩增包含V90L-F188G-A179H-K180H位点的核酸片段，利用标准操作电转步骤(6)中的DH10β，LB固体培养基30℃培养得到含有质粒PAC-B18-V90L-F188G-A179H-K180H的菌株DH10β，以此用包含V90L-F188G-A179H-K180H位点的AT10FkbA核酸片段替换PAC-B18中含有ccdB-amp的片段，得到原位替换的突变体PAC-B18-V90L-F188G-A179H-K180H。
(8)将步骤(5)中的含有PAC-B18和步骤(7)中的含有PAC-B18-V90L-F188G-A179H-K180H的DH10β与ET12567/pUB307分别进行细菌-细菌的接合转导，LB固体培养基37℃培养分别得到含有质粒PAC-B18、pUB307的菌株ET12567和含有质粒PAC-B18-V90L-F188G-A179H-K180H、pUB307的菌株ET12567。
(9)将步骤(8)中的得到的两个菌株分别与链霉菌进入结合转导，得到突变株若干。
(10)将步骤(9)中的突变体利用引物进行PCR和测序检测，得到含有PAC-B18-V90L-F188G-A179H-K180H的筑波链霉菌突变体。
(11)将步骤(10)中的突变株进行发酵，取各突变株的96h发酵液，并加入等体积的甲醇，超声和离心后收取上清进行LC-MS检测来分析代谢产物的变化。
本发明的另一个目的是提供所述方法在链霉菌次级代谢新型化合物产生中的应用。
1.本发明方法是根据AT结构域的氨基酸序列比对、AT-底物对接模型、MDs及其点突变明确次级代谢产物合成中AT转运底物的关键氨基酸。
2.本发明方法主要针对链霉菌I型聚酮化合物的生物合成过程，AT结构域中关键位点基因定向改造后，通过体外筛选获得对目的合成前体具有选择性的突变菌株，从而产生新型的次级代谢产物。
3.本方法强调利用I型聚酮合酶的AT结构域中关键氨基酸编码基因突变，进行新结构化合物合成。
本发明具有的明显优点：1)本发明确定AT结构域中关键氨基酸步骤简单，筛选突变株相对快速；2)本发明为链霉菌合成新型I型聚酮化合物提供了普遍通用的技术，为链霉菌产生更多的药物提供了依据。
本发明方法高效且具有普适性，为产生链霉菌次级代谢新型天然产物提供了一种新的途径。
附图说明
图1为PAC-B18-V90L-F188G-A179H-K180H的核酸测序验证。A图为突变体V90L-F188G-A179H-K180H的核酸片段测序，B图为野生型的核酸片段序列。
图2为筑波链霉菌L20-01(PAC-B18)和L20-02(PAC-B18-V90L-F188G-A179H-K180H)发酵96h中次级代谢产物产量变化图。(A，B)HPLC检测筑波链霉菌L20(A)及其突变株AT10FkbA-V90L-AK179180HH-F188G(B)的发酵液，(C，D)MS检测HPLC峰1(C)和峰2(D)，(E)FK506的合成途径图，(F)FK506新化合物的推测路径图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例作进一步详细描述。
实施例1
以使用本方法筑波链霉菌L20中FK506基因簇中的AT8FkbA为例，详细描述本发明制备方法，具体实施步骤如下：
(1)根据文献检索查阅得到的特异性转移MeO的I型ATs与FK506PKS的所有ATs进行氨基酸序列比对。所述特异性转移MeO的I型ATs的GenBank编号为：ADX99527.1、T30283、ADU56250.1、WP_131202316.1；FK506PKS的所有ATs的GenBank编号为KJ000382和KJ000383。初步筛选得到AT8FkbA特异性转移MeO的相关氨基酸位点：His9，His52，Thr57，Ile65，Leu75，Leu116，Glu120，Pro128，Ile159，His160，His161，Pro164，Gly169，Pro198，Ala208，His220，Pro225，Gln236，Asp237。所述AT8FkbA所在的菌株为筑波链霉菌L20，分类命名为：Streptomyces tsukubaensis L20，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCC No.11252，保藏日：2015年8月19日，保藏单位地址：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
(2)根据文献检索和生物信息学软件建立MeO-AT8FkbA的对接模型，并在其模型上观察步骤(1)中初步筛选得到的氨基酸位点与MeO的作用关系，进一步筛选得到与MeO转移相关的AT8FkbA的氨基酸位点L75、G169和H160-H161。利用MDs，进一步确定上述氨基酸位点对AT8FkbA特异性转移MeO中起关键作用(见表1)。
表1 MeO-CoA-[KS8][AT8]FkbA和MeO-[KS8][AT8]FkbA及突变体的MM/GBSA计算
| ID | ΔE<sub>vdw</sub> | ΔE<sub>elec</sub> | ΔG<sub>GB</sub> | ΔG<sub>SA</sub> | ΔG<sub>binding</sub> |
| MeO-CoA-[KS8][AT8]<sub>FkbA</sub> | -55.6551 | 1312.427 | -1262.68 | -8.442 | -14.3495 |
| MeO-CoA-[KS8][L582A]<sub>FkbA</sub> | -45.4832 | 1422.747 | -1366.558 | -6.4769 | 4.2292 |
| MeO-CoA-[KS8][G676A]<sub>FkbA</sub> | -56.4777 | 1456.423 | -1384.705 | -8.063 | 7.1776 |
| MeO-CoA-[KS8][H667A-H668A]<sub>FkbA</sub> | -52.1217 | 1445.535 | -1385.986 | -7.7061 | -0.2781 |
| MeO-[KS8][AT8]<sub>FkbA</sub> | -8.0544 | 325.9977 | -342.7691 | -2.8739 | -27.6997 |
| MeO-[KS8][L582A]<sub>FkbA</sub> | -6.1374 | 321.1118 | -324.2471 | -1.7642 | -11.037 |
| MeO-[KS8][G676A]<sub>FkbA</sub> | -10.7601 | 309.5954 | -314.882 | -2.8419 | -18.8887 |
| MeO-[KS8][H667A-H668A]<sub>FkbA</sub> | -14.5703 | 279.6069 | -276.8559 | -2.7973 | -14.6165 |
(3)根据步骤(1-2)中筛选得到的所有氨基酸位点(见SEQ ID NO：3-4)，利用引物P3-P40分别进行Ala点突变(见SEQ ID NO：5-42)，并分别将其异源表达、纯化和体外生化反应，筛选和验证得到AT8FkbA特异性转移MeO的氨基酸位点L75、G169和H160-H161(表2)。
表2 AT8FkbA及其突变体的自酰化和转酰化反应活性
(4)根据步骤(3)中的体外生化筛选结果，设计引物P41-P48(见SEQ ID NO：43-50)将与AT8FkbA氨基酸序列最为相似，且转移非本身底物有效率最高的AT10FkbA进行点突变，即特异性转移底物M的AT10FkbA的关键氨基酸位点突变为AT8FkbA特异性转移MeO的氨基酸位点L75、G169和H160-H161，并将这些点突变体异源表达、纯化和体外生化实验，筛选和验证得到AT10FkbA突变体V90L-F188G-A179H-K180H可特异性转移底物MeO(表3)。
表3 AT10FkbA及其点突变体的自酰化和转酰化的比率
(5)设计引物P49-54(见SEQ ID NO：51-56)初步筛选得到包含完整FK506基因簇的人类人工染色体文库质粒PAC-B18的大肠杆菌DH10β。利用蛋白ccdA存在，ccdB蛋白对大肠杆菌无毒性；ccdA不存在，ccdB致死大肠杆菌的原理，标准操作电转含有ccdA基因的温度敏感性质粒pSC101-ccdA-gbaA，LB固体培养基30℃培养得到含有质粒PAC-B18和pSC101-ccdA-gbaA的菌株DH10β。
(6)以质粒p15A-ccdB-amp为模板，设计引物P55-56(见SEQ ID NO：57-58)扩增反筛因子ccdB-amp片段且其两侧含有AT10FkbA点突变区域范围的核酸序列，利用标准操作电转上述ccdB-amp片段到步骤(5)筛选得到的DH10β中，LB固体培养基30℃培养得到含有质粒PAC-B18-ccdB-amp和pSC101-ccdA-gbaA的菌株DH10β，以此用ccdB-amp片段替换AT10FkbA中氨基酸位点Val90，Phe188，Ala179和Lys180范围的核酸片段。
(7)根据步骤(4)中AT10FkbA突变体V90L-F188G-A179H-K180H可特异性转移底物MeO的体外生化结果，以此突变体质粒为模板，设计引物P57-58(见SEQ ID NO：59-60)扩增包含V90L-F188G-A179H-K180H位点的核酸片段，利用标准操作电转步骤(6)中的DH10β，LB固体培养基30℃培养得到含有质粒PAC-B18-V90L-F188G-A179H-K180H的菌株DH10β(见附图1)，以此用包含V90L-F188G-A179H-K180H位点的AT10FkbA核酸片段替换PAC-B18中含有ccdB-amp的片段，得到原位替换的突变体PAC-B18-V90L-F188G-A179H-K180H。
(8)将步骤(5)中的含有PAC-B18和步骤(7)中的含有PAC-B18-V90L-F188G-A179H-K180H的DH10β与ET12567/pUB307分别进行细菌-细菌的接合转导，LB固体培养基37℃培养分别得到含有质粒PAC-B18、pUB307的菌株ET12567和含有质粒PAC-B18-V90L-F188G-A179H-K180H、pUB307的菌株ET12567。
(9)将步骤(8)中的得到的两个菌株分别与链霉菌进入结合转导，得到突变株若干。
(10)将步骤(9)中的突变体利用引物进行PCR和测序检测(见附图1，SEQ ID NO：1-2)，得到含有PAC-B18-V90L-F188G-A179H-K180H的筑波链霉菌突变体。
(11)将步骤(10)中的突变株进行发酵，取各突变株的96h发酵液，并加入等体积的甲醇，超声和离心后收取上清进行LC-MS检测来分析代谢产物的变化(见附图2)。
序列表
<110> 浙江大学
<120> 一种酰基转移酶结构域定向改造合成化合物的方法
<160> 60
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 303
<212> DNA
<213> 筑波链霉菌L20(S.tsukubaensis L20)
<400> 1
tccgtcgggg aagtcaccgc ggcccatgcg gcgggggtgc tcacgctcac ggacgccacc 60
aggctgatcg tggcccgtgg ccgggccctg caggccctgc cgccgggggc catgaccgcg 120
gtcgacggca gcctcgcgga ggtcggtgcc ttcaccggct ccaccgatct ggacgtcgcc 180
gcggtcaacg gccccaccgg cgtggtcctc acgggctcac cggacgacgt ggccgcgttc 240
gaacgggagt gggcggcggc cgggcggcgc gcgaaacggc tggacgtcgg gcacgcgttc 300
cac 303
<210> 2
<211> 303
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 2
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gtcgacggca gcctcgcgga ggtcggtgcc ttcaccggct ccaccgatct ggacgtcgcc 180
gcggtcaacg gccccaccgg cgtggtcctc acgggctcac cggacgacgt ggccgcgttc 240
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Claims (3)
1.一种酰基转移酶结构域定向改造合成化合物的方法，其特征在于，通过催化合成链霉菌次级代谢产物主链的I型聚酮合酶PKS中专一转移相同底物的酰基转移酶AT结构域的氨基酸序列比对，得到其转移底物的关键氨基酸位点L75、G169、H160和H161，利用酰基转移酶AT结构域与底物的对接模型和分子动力学模拟MDs、酰基转移酶AT结构域的点突变和体外生化反应分析验证上述转移底物的关键氨基酸位点，通过替换其他酰基转移酶AT结构域转移底物的关键位点，改变其转移的底物，从而发酵产生新型化合物，具体通过以下步骤实现：
（1）根据文献检索查阅得到特异性转移甲氧基丙二酰MeO的I型ATs与FK506 聚酮合酶PKS的所有ATs进行氨基酸序列比对，初步筛选得到催化合成FK506主链的I型PKS中第8模块特异性转移底物MeO的AT8FkbA特异性转移甲氧基丙二酰MeO的氨基酸位点；
（2）根据文献检索和生物信息学软件建立MeO-AT8FkbA的对接模型，并在其模型上观察步骤（1）中初步筛选得到的氨基酸位点与甲氧基丙二酰MeO的作用关系，进一步筛选得到与甲氧基丙二酰MeO转移相关的AT8FkbA的氨基酸位点L75、G169和H160-H161，利用分子动力学模拟MDs，进一步确定上述氨基酸位点对AT8FkbA特异性转移甲氧基丙二酰MeO中起关键作用；
（3）根据步骤（1）和（2）中二次筛选得到的AT8FkbA特异性转移甲氧基丙二酰MeO的氨基酸位点分别进行点突变，突变为Ala，并分别将其异源表达、纯化和体外生化反应，筛选和验证得到AT8FkbA特异性转移甲氧基丙二酰MeO的氨基酸位点L75、G169和H160-H161；
（4）根据步骤（3）中的体外生化筛选结果，与AT8FkbA氨基酸序列最为相似，且转移非本身底物有效率最高的第10模块特异性转移底物M的AT10FkbA进行点突变，即特异性转移底物甲基丙二酰M的AT10FkbA的关键氨基酸位点突变为AT8FkbA特异性转移甲氧基丙二酰MeO的氨基酸位点L75、G169和H160-H161，并将这些点突变体异源表达、纯化和体外生化实验，筛选和验证得到AT10FkbA突变体V90L-F188G-A179H-K180H可特异性转移底物甲氧基丙二酰MeO；
（5）设计引物初步筛选得到包含完整FK506基因簇的人类人工染色体文库质粒PAC-B18的大肠杆菌DH10β，并利用蛋白ccdA存在，ccdB蛋白对大肠杆菌无毒性；ccdA不存在，ccdB致死大肠杆菌的原理，标准操作电转含有ccdA基因的温度敏感性质粒pSC101-ccdA-gbaA，LB固体培养基30oC培养得到含有质粒PAC-B18和pSC101-ccdA-gbaA的菌株DH10β；
（6）以质粒p15A-ccdB-amp为模板，设计引物扩增反筛因子ccdB-amp片段且其两侧含有AT10FkbA点突变区域范围的核酸序列，利用标准操作电转上述ccdB-amp片段到步骤（5）筛选得到的DH10β中，LB固体培养基30oC培养得到含有质粒PAC-B18-ccdB-amp和pSC101-ccdA-gbaA的菌株DH10β，以此用ccdB-amp片段替换AT10FkbA中氨基酸位点Val90，Phe188，Ala179和Lys180范围的核酸片段；
（7）根据步骤（4）中AT10FkbA突变体V90L-F188G-A179H-K180H可特异性转移底物甲氧基丙二酰MeO的体外生化结果，以此突变体质粒为模板，设计引物扩增包含V90L-F188G-A179H-K180H位点的核酸片段，利用标准操作电转步骤（6）中的DH10β，LB固体培养基30℃培养得到含有质粒PAC-B18-V90L-F188G-A179H-K180H的菌株DH10β，以此用包含V90L-F188G-A179H-K180H位点的AT10FkbA核酸片段替换PAC-B18中含有ccdB-amp的片段，得到原位替换的突变体PAC-B18-V90L-F188G-A179H-K180H；
（8）将步骤（5）中的含有PAC-B18和步骤（7）中的含有PAC-B18-V90L-F188G-A179H-K180H的DH10β与ET12567/pUB307分别进行细菌-细菌的接合转导，LB固体培养基37℃培养分别得到含有质粒PAC-B18、pUB307的菌株ET12567和含有质粒PAC-B18- V90L-F188G-A179H-K180H、pUB307的菌株ET12567；
（9）将步骤（8）中的得到的两个菌株分别与筑波链霉菌L20进入结合转导，得到突变株若干；
（10）将步骤（9）中的突变体利用引物进行PCR和测序检测，得到含有PAC-B18-V90L-F188G-A179H-K180H的筑波链霉菌L20突变体；
（11）将步骤（10）中的突变株进行发酵，取各突变株的96 h发酵液，并加入等体积的甲醇，超声和离心后收取上清进行液相色谱质谱联用仪LC-MS检测分析代谢产物的变化；
所述AT8FkbA所在的菌株为筑波链霉菌L20，分类命名为：StreptomycestsukubaensisL20，保藏号：CGMCC No. 11252。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，对酰基转移酶AT结构域的指定位点：AT8FkbA的L75、G169、H160、H161和AT10FkbA的V90、F188、A179、K180，进行定向改造合成的所有新型化合物。
3.根据权利要求1所述方法在链霉菌次级代谢新型化合物产生中的应用。
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