CN109161559A - 一种高效的链霉菌基因组精简系统的构建及应用 - Google Patents

一种高效的链霉菌基因组精简系统的构建及应用 Download PDF

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CN109161559A CN201811027547.5A CN201811027547A CN109161559A CN 109161559 A CN109161559 A CN 109161559A CN 201811027547 A CN201811027547 A CN 201811027547A CN 109161559 A CN109161559 A CN 109161559A
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Abstract

本发明提供一种高效的链霉菌基因组精简系统的构建及应用，本发明的链霉菌基因组精简系统是在全基因组比对分析大片段冗余基因区的基础上，组合了同源重组系统和高效的位点特异性重组系统(Cre/loxP系统)进行靶向大片段缺失。同源重组系统中采用了基于自杀载体的同源重组策略，大大提高了敲除的靶向性和效率，用于一次性缺失约700Kb的冗余基因区时效率高达100％。本发明方法操作简单、高效、靶向性强、正确率高。本发明为构建链霉菌底盘细胞奠定了理论基础，有利于实现合成生物学底盘细胞的高效构建，为药物产业化和新药研发提供强大支撑。

Description

一种高效的链霉菌基因组精简系统的构建及应用
技术领域
本发明属于微生物基因工程领域，涉及一种高效的链霉菌基因组精简系统构建及应用，尤其是一种基于同源重组系统与位点特异性重组系统相结合的大片段冗余基因敲除系统，
背景技术
链霉菌是一种革兰氏阳性细菌，数十年来，链霉菌一直是新型抗生素研发的主要来源，众多链霉菌来源的次级代谢产物被用作药物先导化合物，开发出了临床上广泛使用的治疗性药物如免疫抑制剂、抗癌药物、抗生素、抗真菌药物、抗病毒药物及抗高血压药物等等。链霉菌作为许多重要抗生素的工业生产菌，具有合成多种多样复杂天然产物的能力，链霉菌基因组大小一般在6-10Mb之间，庞大的基因组中除了含有正常生长发育相关的必需基因以外，主要是各种类型的次级代谢生物合成基因簇基因。次级代谢生物合成基因簇一般是微生物在对抗外界不良环境的压力下进化出来的或者是通过水平基因转移获得的，所以一般认为在实验室培养条件下次级代谢生物合成基因簇相关基因为非必需基因。链霉菌基因组中含有大量的内源次级代谢生物合成基因簇，内源基因簇的表达一方面会与外源合成途径竞争前体和能量，另一方面会产生大量副产物，影响目标代谢产物的产量及下游分离纯化，通过消除副产物的产生可以实现目标产物的优质高产。
随着生物信息学分析技术和合成生物学使能技术的飞速发展，对链霉菌基因组进行深度分析可以发现其基因组中存在大量冗余基因，并且许多冗余基因集中分布在亚端粒区形成大片段的冗余基因区，冗余基因的表达将会消耗细胞大量的能量如DNA复制、转录、翻译能耗，严重降低了能量的有效利用率，同时会产生大量的副产物如非目标次级代谢产物、氨基酸、糖等等影响目标代谢产物的产量及下游分离纯化工程。因此，通过高效的基因编辑技术对冗余基因进行大规模的删减，既可以实现链霉菌基因组的精简，也可以降低内在能耗，使菌株代谢谱更加简单、清晰。基因组精简的链霉菌也可以作为底盘细胞实现外源天然产物或者药物的高效生物合成。
发明内容
本发明的目的是提供一种高效的链霉菌基因组精简系统的构建方法，基于比较基因组学分析大片段冗余基因区，组合利用同源重组系统和高效的位点特异性重组系统实现大片段基因区的高效编辑，从而精简链霉菌基因组的方法。这是一种基于生物信息学分析数据，高效构建链霉菌底盘细胞的新技术。
本发明构建方法通过以下步骤实现：
(1)将测序的链霉菌的全基因组序列与NCBI中公知的天蓝色链霉菌Streptomycescoelicolor A3(2)(保藏号CGMCC 4.7168)全基因组序列(序列编号GenBank:NC_003888.3)和阿维链霉菌 Streptomyces avermitilis MA-4680(保藏号CGMCC 4.3588)全基因组序列(序列编号GenBank: NC_003155.5)共同提交至全基因组比对分析软件Mauve进行比对分析；
(2)分析(1)中获得的全基因组比对数据，依据所有比对基因组中都保守存在的基因区为必需基因区，只在一种或两种基因组中存在的基因区为非必需基因区的理论，对链霉菌基因组进行区域划分为必需基因区和非必需基因区；
(3)选取(2)中划分出的一个非必需基因区中，生物合成基因簇比较集中的区域，为候选的大片段冗余基因区；
(4)敲除质粒和自杀质粒的构建，以pHAH质粒为模板，设计特异性引物扩增lox66片段(ATAACTTCGTATA GCATACAT TATACGAAcggta)，并在其两端引入XbaI和EcoRV酶切位点，酶切纯化后用T4DNA连接酶于16℃连接XbaI和EcoRV双酶切处理的pKC1139质粒，获得链霉菌敲除质粒pKClox66。pSET152载体用HindIII单酶切，回收较大的DNA片段，加入T4DNA连接酶于16℃连接，自连环化后获得pSET153质粒，然后pSET153质粒用SacI 单酶切，回收较大的DNA片段，以pIJ779为模板，设计特异引物扩增壮观基因aadA片段，并在其两端引入SacI酶切位点，经过酶切纯化后，用T4DNA连接酶于16℃连入SacI单酶切并用碱性磷酸酶去磷酸化的pSET153质粒，获得pSET154质粒。以pHAH为模板，设计特异引物扩增lox71(taccgTTCGTATAGCATACAT TATACGAAGTTAT)片段，并在其两端引入 HindIII和XbaI酶切位点，酶切纯化后，用T4DNA连接酶于16℃连入HindIII和XbaI双酶切处理的pSET154质粒，获得链霉菌自杀质粒pSETlox71。以pALCre为模板，设计特异引物扩增Cre基因片段，并在其两端引入NdeI和HindIII酶切位点，酶切纯化后用T4DNA连接酶于16℃连入NdeI和HindIII双酶切处理的pIJ8668-nit-pIJ101ori-MCS质粒，获得链霉菌表达质粒pNitCre。根据步骤(3)中所述的大片段冗余基因区的序列设计同源臂，5’-端设计两个同源臂，分别引入酶切位点HindIII/XbaI和EcoRV/EcoRI，3’-端设计一个同源臂，引入酶切位点EcoRV/EcoRI，长度一般为1000bp-1500bp，将同源臂PCR扩增后分别用HindIII/XbaI 和EcoRV/EcoRI酶切回收，将5’-端两个同源臂片段依次连接入链霉菌敲除质粒pKClox66中，构成敲除质粒；3’-端一个同源臂PCR扩增后用EcoRV/EcoRI酶切后连接于链霉菌自杀质粒 pSETlox71，构成自杀质粒；
(5)步骤(4)中获得的敲除质粒通过转化导入大肠杆菌感受态细胞ET12567/pUZ8002或S17-1 或ET12567/pUB307中；
(6)通过大肠杆菌-链霉菌属间接合转导将步骤(5)中的敲除质粒导入到链霉菌中；
(7)敲除质粒的单交换，将步骤(6)中的转化子在大于34℃的温度下(一般为39℃)，进行阿泊拉霉素抗性筛选，能够在含阿泊拉霉素抗性和39℃下生长的菌株为发生单交换的突变株；
(8)敲除质粒的双交换，将步骤(7)中获得的单交换突变株挑入无抗性TSB液体培养基中 39℃培养36h，再转接无抗性TSB液体培养基39℃培养24h，再转接无抗性TSB液体培养基30℃培养24h，取100μL菌液在无抗性平板上划单克隆；
(9)对步骤(8)中长出的单克隆进行影印筛选，同一个单克隆同时划在两块平板的对应位置，一块平板为不含抗生素的平板，另一块为含有阿泊拉霉素的抗性平板，挑取在抗性平板上不生长，在无抗性平板上正常生长的单克隆至TSB液体培养基中，培养36-48h后取适量菌液抽提基因组DNA进行PCR验证，筛选出阳性单克隆；
(10)步骤(9)中获得的阳性单克隆划线于链霉菌固体产孢培养基，培养适当时间，单克隆产生孢子，收集孢子并加入灭菌甘油至终浓度为20％，-80℃保存，备用；
(11)步骤(4)中获得的自杀质粒通过转化导入大肠杆菌感受态细胞ET12567/pUZ8002或 S17-1或ET12567/pUB307中；
(12)通过大肠杆菌-链霉菌属间接合转导将步骤(11)中的自杀质粒导入到步骤(10)获得的链霉菌突变体孢子中；
(13)自杀质粒的单交换，将步骤(12)中的转化子在30℃的温度下，进行壮观霉素抗性筛选，能够在含壮观霉素抗性平板上正常生长的菌株为发生单交换的突变株，突变株转接至TSB 液体培养基中，培养36-48h后取适量菌液抽提基因组DNA进行PCR验证，筛选出阳性单克隆；
(14)步骤(13)中获得的阳性单克隆划线于链霉菌固体产孢培养基，培养适当时间，单克隆产生孢子，收集孢子并加入灭菌甘油至终浓度为20％，-80℃保存，备用；
(15)链霉菌表达质粒的导入，链霉菌表达质粒pNitCre通过转化导入大肠杆菌感受态细胞 ET12567/pUZ8002或S17-1或ET12567/pUB307中，通过大肠杆菌-链霉菌属间接合转导将链霉菌表达质粒pNitCre导入到步骤(14)获得的链霉菌孢子中，进行阿泊拉霉素抗性筛选，挑取能够在阿泊拉霉素抗性平板上正常生长的单克隆转接至TSB液体培养基中，培养36-48h 后取适量菌液抽提基因组DNA进行PCR验证，筛选出阳性单克隆；
(16)步骤(15)中获得的阳性单克隆划线于链霉菌固体产孢培养基，培养适当时间，单克隆产生孢子，收集孢子并加入灭菌甘油至终浓度为20％，-80℃保存，备用；
(17)Cre酶的表达，取100μL步骤(16)获得的链霉菌孢子接入TSB液体培养基中，振荡培养24h后，加入诱导剂ε-己内酰胺(终浓度为1％)，继续培养10h后，取100μL菌液稀释 1000倍后涂布在固体平板上，倒置培养数天，待单克隆长出；
(18)挑取步骤(17)获得的单克隆进行影印筛选，同一个单克隆同时划在两块平板的对应位置，一块平板为不含抗生素的平板，另一块为含有壮观霉素的抗性平板。挑取在抗性平板上不生长，在无抗性平板上正常生长的单克隆至TSB液体培养基中，培养36-48h后取适量菌液抽提基因组DNA进行PCR验证，筛选出阳性单克隆；
(19)步骤(18)中获得的阳性单克隆划线于链霉菌固体产孢培养基，培养适当时间，单克隆产生孢子，收集孢子并加入灭菌甘油至终浓度为20％，-80℃保存，备用；
(20)链霉菌表达质粒的丢失，取100μL步骤(19)中冻存的孢子，稀释1000倍后涂布无抗性平板，培养适当时间后单克隆长出，挑取单克隆划线于无抗性平板，获得的单克隆进行影印筛选，同一个单克隆同时划在两块平板的对应位置，一块平板为不含抗生素的平板，另一块为含有阿泊拉的抗性平板，在抗性平板上不生长，在无抗性平板上正常生长的单克隆为表达质粒丢失的突变株；
(21)步骤(20)中获得的阳性单克隆即为最终基因组精简的链霉菌底盘细胞，将其划线于链霉菌固体产孢培养基，培养适当时间，单克隆产生孢子，收集孢子并加入灭菌甘油至终浓度为20％，-80℃保存；
(22)步骤(21)中获得的链霉菌底盘细胞接种发酵培养基如TSB培养基、YEME培养基，进行以下评估：生长周期评估、代谢谱评估、外源蛋白表达能力评估、外源次级代谢产物生产能力评估。
本发明的另一个目的是提供所述方法在构建基因组精简的链霉菌高版本底盘细胞中的应用。本发明根据多个链霉菌全基因组比对结果，分析并定位保守性低的大片段冗余基因区作为候选的敲除区域。根据敲除区域设计同源臂连入链霉菌敲除质粒和链霉菌自杀质粒，构建敲除质粒和自杀质粒，将lox66和lox71位点引入到敲除区域两端，通过诱导表达Cre介导大片段冗余基因区的高效缺失，从而构建基因组精简的链霉菌高版本底盘细胞。通过生物量测定、代谢谱分析、外源蛋白表达分析及外源次级代谢途径表达分析确定基因组精简的链霉菌高版本底盘细胞具有更加优良的性能，便于用于微生物药物的高效生物合成和工业化生产。
本发明方法成功的用于构建了一种基因组精简的恰塔努加链霉菌基因工程菌株，分类命名为：恰塔努加链霉菌L321(Streptomyces chattanoogensis L321)，已经在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，该菌株所具有的基因组被遗传改造成比其原始出发菌株基因组减少约8.1％，并表现出了一系列优良性能如更强的外源蛋白表达能力、更简单的代谢谱、更强的外源次级代谢产物生产能力。
所述的应用是根据多个链霉菌全基因组比对结果，分析并定位保守性低的大片段冗余基因区作为候选的敲除区域。
所述的应用是根据敲除区域设计同源臂连入链霉菌敲除质粒和链霉菌自杀质粒，构建敲除质粒和自杀质粒，将lox66和lox71位点引入到敲除区域两端，通过诱导表达Cre介导大片段冗余基因区的高效缺失，从而构建基因组精简的链霉菌高版本底盘细胞。
所述的应用是通过生物量测定、代谢谱分析、外源蛋白表达分析及外源次级代谢途径表达分析确定基因组精简的链霉菌高版本底盘细胞具有更加优良的性能，便于用于微生物药物的高效生物合成和工业化生产。
本发明方法是根据在进化上必需基因具有高度保守性，非必需基因保守性低的理论定位基因组中大片段的冗余基因区。本发明方法通过改造链霉菌通用敲除载体和自杀载体，构建具有普遍适用性的同源重组系统和位点特异性重组系统，用于loxP突变位点lox66和lox71 在链霉菌基因组上靶向整合和大片段缺失。本发明方法是利用同源重组系统将位点特异性重组酶的识别位点整合到大片段的冗余基因区两侧，通过高效的位点特异性重组系统，靶向缺失大片段冗余基因区，从而构建出基因组精简的链霉菌底盘细胞。
本发明具有明显优点：
1.本发明能够利用通用的全基因组比对技术准确定位链霉菌基因组中大片段的冗余基因组区。
2.本发明构建了链霉菌通用型敲除质粒和自杀质粒及位点特异性重组酶表达质粒，既可用于单个基因或基因簇的敲除，也可用于大片段冗余基因区的无缝缺失。
3.本发明在构建高效的链霉菌底盘细胞中应用广泛，所有全基因组已测序的链霉菌都可以使用本发明方法进行大片段冗余基因区的高效编辑。
本发明提供一种高效的链霉菌基因组精简系统的构建方法。本发明方法操作简单、高效、靶向性强、正确率高，具有普遍适用性。本发明为构建链霉菌底盘细胞奠定了理论基础，有利于实现合成生物学底盘细胞的高效构建，为药物产业化和新药研发提供强大支撑。
附图说明
图1为恰塔努加链霉菌L10全基因组与天蓝色链霉菌、阿维链霉菌全基因组比对结果，恰塔努加链霉菌L10基因组中存在2个保守性较低的非必需基因区，选取位于7994797bp—8731201bp区间的序列为候选的大片段冗余基因区。
图2为恰塔努加链霉菌L10敲除质粒pKClox66LF、自杀质粒pSETlox71LR及表达质粒pNitCre图谱。
图3为同源重组系统组合位点特异性重组系统对恰塔努加链霉菌L10基因组中候选的大片段冗余基因区进行靶向敲除的策略。
图4为恰塔努加链霉菌L10基因组中候选的大片段冗余基因区敲除效率分析及PCR验证。
图5为恰塔努加链霉菌突变株L321与野生型菌株L10的生长曲线。
图6为恰塔努加链霉菌突变株L321与野生型菌株L10中分别表达eGFP蛋白，通过Western Blot检测不同时期蛋白表达强度差异。
图7为恰塔努加链霉菌突变株L321与野生型菌株L10在不同发酵培养基中代谢谱差异。
图8为恰塔努加链霉菌突变株L321与野生型菌株L10分别表达异源次级代谢生物合成基因簇能力差异。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例作进一步详细描述。
实施例1
以使用本方法精简恰塔努加链霉菌L10基因组为例，详细描述本发明。
具体实施步骤如下：
(1)将测序的恰塔努加链霉菌L10的全基因组序列与NCBI中公布的天蓝色链霉菌全基因组序列和阿维链霉菌全基因组序列共同提交至全基因组比对分析软件Mauve进行比对分析；具体为：将测序的恰塔努加链霉菌L10的全基因组序列与NCBI中公知的天蓝色链霉菌Streptomyces coelicolor A3(2)(保藏号CGMCC 4.7168)全基因组序列(序列编号GenBank: NC_003888.3)和阿维链霉菌Streptomyces avermitilis MA-4680(保藏号CGMCC4.3588)全基因组序列(序列编号GenBank:NC_003155.5)共同提交至全基因组比对分析软件Mauve进行比对分析；
(2)分析(1)中获得的全基因组比对数据，依据所有比对基因组中都保守存在的基因区为必需基因区，只在一种或两种基因组中存在的基因区为非必需基因区的理论，对恰塔努加链霉菌L10基因组进行区域划分为必需基因区和非必需基因区；
(3)选取(2)中划分出的恰塔努加链霉菌L10基因组中一个非必需基因区，且生物合成基因簇比较集中的区域，位于7994797bp—8731201bp区间的序列为候选的大片段冗余基因区 (见附图1)。所述恰塔努加链霉菌L10，分类命名为：Streptomyces chattanoogensisL10，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCC No.2644，保藏日：2008 年8月27日，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中国科学院微生物研究所，邮编： 100101；
(4)lox66位点敲入恰塔努加链霉菌L10基因组中，以链霉菌敲除质粒pKClox66为出发质粒，连接大片段冗余基因区5’端的两个同源臂，转化E.coli TG1感受态细胞，构建敲除质粒pKClox66LF(见附图2和3)；
(5)大肠杆菌-链霉菌属间接合转移，将(4)中敲除质粒从E.coli TG1中提取，化学转化E.coli ET12567/pUZ8002，涂布于含有阿泊拉霉素(50μg/mL)、卡那霉素(50μg/mL)、氯霉素(25μg/mL)的LB固体平板上，37℃倒置培养16h；
(6)挑取平板上的单克隆，转接于含5mL LB液体培养基的试管中，培养基中加入阿泊拉霉素(50μg/mL)、卡那霉素(50μg/mL)、氯霉素(25μg/mL)，37℃、220rpm振荡培养16h；
(7)吸取300μL液体培养物转接于含30mL LB液体培养基的三角瓶中，培养基中加入阿泊拉霉素(50μg/mL)、卡那霉素(50μg/mL)、氯霉素(25μg/mL)，37℃、220rpm振荡培养3-4h，至OD600nm＝0.6-0.8；
(8)菌液转移至50mL离心管中，室温、6000rpm离心5min收集菌体，弃去上清；
(9)加入10mL LB液体培养基重悬菌体，室温、6000rpm离心5min收集菌体，弃去上清；
(10)重复步骤(9)两次，最后加入1mL LB液体培养基重悬菌体，备用；
(11)吸取恰塔努加链霉菌L10孢子500μL至1.5mL EP管中，加入500μL LB液体培养基，混匀，室温、6000rpm离心5min收集孢子，弃去上清；
(12)加入1mL LB液体培养基，重悬孢子，室温、6000rpm离心5min收集孢子，弃去上清；
(13)重复步骤(12)两次，最后加入1mL 2XYT液体培养基重悬孢子，置于45℃水浴中热激10min，冷却至室温，备用；
(14)吸取500μL步骤(10)中的大肠杆菌加入到500μL步骤(13)中的孢子中，混匀，室温、6000rpm离心5min，弃去500μL上清，剩余500μL液体重悬菌体和孢子，涂布于MS固体平板上，30℃倒置培养16-18h后涂布阿泊拉霉素(50μg/mL)和萘啶酮酸(25μg/mL)，继续培养4-5天，长出单克隆；
(15)单克隆转接至YMG固体培养基，培养基中含阿泊拉霉素(50μg/mL)，置于37℃培养箱中培养3天；
(16)转接至YMG固体培养基(不含抗生素)，置于37℃培养箱中培养3天；
(17)重复步骤(16)两次，对单克隆进行影印筛选，单克隆划线于两块平板的对应位置：一块为不加抗生素的平板，另一块为加入阿泊拉霉素(50μg/mL)的抗性平板，30℃倒置培养5天；
(18)挑取抗性平板上不生长，无抗性平板上正常生长的单克隆转接至TSB液体培养基，30℃、 220rpm振荡培养36h后，取500μL菌液抽提基因组DNA进行PCR验证，PCR产物纯化后进行测序验证，筛选出lox66位点敲入的阳性单克隆，划线于YMG培养基，培养10天左右，收集孢子，加入终浓度为20％的甘油，-80℃保存，备用；
(19)lox71位点插入到恰塔努加链霉菌突变株基因组中，以链霉菌自杀质粒pSETlox71为出发质粒，连接大片段冗余基因区3’端一个同源臂，转化E.coliTG1感受态细胞，构建自杀质粒pSETlox71LR(见附图2和3)；
(20)进行大肠杆菌-链霉菌属间接合转移，步骤同(5)-(14)，其中阿泊拉霉素替换为壮观霉素，浓度为100μg/mL，链霉菌孢子为步骤(18)冻存的孢子，MS板上长出单克隆后，挑取单克隆划线于YMG固体培养基，培养基中含壮观霉素(100μg/mL)，置于30℃培养箱中培养3天；
(21)单克隆转接至TSB液体培养基，培养基中含壮观霉素(100μg/mL)，30℃、220rpm振荡培养36h后，取500μL菌液抽提基因组DNA进行PCR验证，PCR产物纯化后进行测序验证，筛选出lox71位点插入的阳性单克隆，划线于YMG培养基，培养10天左右，收集孢子，加入终浓度为20％的甘油，-80℃保存，备用；
(22)Cre酶表达质粒的导入与诱导表达，链霉菌表达质粒pNitCre(见附图2)进行大肠杆菌-链霉菌属间接合转移，步骤同(5)-(14)，链霉菌孢子为步骤(21)冻存的孢子，MS板上长出单克隆后，挑取单克隆划线于YMG固体培养基，培养基中含阿泊拉霉素(50μg/mL)，置于30℃培养箱中培养10天左右，收集孢子，加入终浓度为20％的甘油，-80℃保存，备用；
(23)Cre酶的诱导表达，取100μL步骤(22)获得的恰塔努加链霉菌孢子接入TSB液体培养基中，振荡培养24h后，加入诱导剂ε-己内酰胺(终浓度为1％)，继续培养10h后，取100μL菌液稀释1000倍后涂布在YMG固体平板上，倒置培养数天，待单克隆长出；
(24)挑取步骤(23)获得的单克隆进行影印筛选，同一个单克隆同时划在两块平板的对应位置，一块平板为不含抗生素的平板，另一块为含有壮观霉素(100μg/mL)的抗性平板。挑取在抗性平板上不生长，在无抗性平板上正常生长的单克隆至TSB液体培养基中，培养36-48h 后取适量菌液抽提基因组DNA进行PCR验证及测序验证，筛选出基因组中缺失大片段冗余基因区的阳性单克隆，并计算敲除效率(见附图4)；
(25)步骤(24)中获得的阳性单克隆划线于YMG固体培养基，培养10天左右至单克隆产生孢子，收集孢子并加入灭菌甘油至终浓度为20％，-80℃保存，备用；
(26)链霉菌表达质粒的丢失，取100μL步骤(25)中冻存的孢子，稀释1000倍后涂布无抗性YMG平板，培养适当时间后单克隆长出，挑取单克隆划线于无抗性平板，获得的单克隆进行影印筛选，同一个单克隆同时划在两块YMG平板的对应位置，一块平板为不含抗生素的平板，另一块为含有阿泊拉霉素的抗性平板。在抗性平板上不生长，在无抗性平板上正常生长的单克隆为表达质粒丢失的突变株；
(27)步骤(26)中获得的阳性单克隆即为最终基因组精简的恰塔努加链霉菌L321，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，划线于YMG固体培养基，培养10天左右至单克隆产生孢子，收集孢子并加入灭菌甘油至终浓度为20％，-80℃保存。
实施例2比较恰塔努加链霉菌突变株L321与野生型菌株L10的生长曲线
(1)恰塔努加链霉菌L321与野生型菌株L10孢子分别接种种子培养基，30℃、220rpm培养 24h；
(2)取种子培养液1mL转接至YEME培养基，30℃、220rpm培养，与不同时间点(间隔 12小时)收集1mL菌液测定干重，绘制生长曲线(见附图5)，结果表明构建的突变株L321 生长周期没有发生明显变化。
实施例3比较恰塔努加链霉菌突变株L321与野生型菌株L10中表达eGFP蛋白的强度
(1)恰塔努加链霉菌L321与野生型菌株L10中分别通过接合转导导入eGFP表达质粒pIJ8668-ermEp*-egfp；
(2)突变株分别接种TSB培养基和YEME培养基，与不同时间点收集1mL菌液，12000rpm离心收集菌体，超声破碎，离心后取上清液进行Bradford蛋白定量，取15μg蛋白进行 SDS-PAGE电泳；
(3)通过Western Blot检测eGFP蛋白的表达，结果表明构建的突变株L321具有更强的外源蛋白表达能力(见附图6)。
实施例4比较恰塔努加链霉菌突变株L321与野生型菌株L10在不同发酵培养基中代谢谱的差异
(1)恰塔努加链霉菌L321与野生型菌株L10分别接种不同发酵培养基(YEME、YSG和YMG)，培养120h后收集500μL菌液加入500μL甲醇，12000rpm离心10min，上清用0.45μm 滤膜过滤；
(2)过滤后上清通过HPLC检测分析代谢谱差异，HPLC条件：色谱柱：C18柱子(Aglient，Eclipse Plus XDB，5um，4.6mm*250mm)；检测波长：全波长扫描；流速：1.00mL/min；进样量：25ul；流动相A相为水，含0.1％甲酸，流动相B相为100％甲醇；HPLC走样程序： 0-20min，5％-95％B相；20-25min，5％B相；。选取常规物质分析检测波长进行分析，结果表明构建的突变株L321内源副产物大幅减少，具有更加简单的代谢背景，适合作为底盘细胞(见附图7)。
实施例5比较恰塔努加链霉菌突变株L321与野生型菌株L10分别表达异源次级代谢生物合成基因簇能力差异
(1)恰塔努加链霉菌L321与野生型菌株L10中分别通过接合转导导入放线紫红素表达质粒 pSET152-act，突变株接种YEME培养基进行发酵，与不同时间点收集1mL菌液；
(2)通过分光光度计检测放线紫红素产量，结果表明构建的突变株L321具有更强的次级代谢产物合成能力(见附图8)。

Claims (7)

1.一种高效的链霉菌基因组精简系统的构建，其特征在于，通过全基因组比对技术分析、定位链霉菌基因组中的大片段冗余基因区，构建链霉菌敲除质粒pKClox6、链霉菌自杀质粒pSETlox71及链霉菌表达质粒pNitCre，其中，敲除质粒pKClox66携带lox66位点，链霉菌温度敏感型复制子pSG5，Apra抗性；自杀质粒pSETlox71携带lox71位点，无链霉菌复制子，Spect抗性；表达质粒pNitCre携带链霉菌密码子优化的Cre重组酶，链霉菌游离型复制子pIJ101，Apra抗性。
2.根据权利要求1所述的一种高效的链霉菌基因组精简系统的构建，其特征在于，通过以下步骤实现：
(1)大片段冗余基因区的确定通过以下步骤实现：
1)将测序的链霉菌的全基因组序列与NCBI中公布的天蓝色链霉菌全基因组序列和阿维链霉菌全基因组序列共同提交至全基因组比对分析软件Mauve进行比对分析；
2)分析全基因组比对结果，依据所有比对基因组中都保守存在的基因区为必需基因区，只在一种或两种基因组中存在的基因区为非必需基因区的理论，对链霉菌基因组进行区域划分为必需基因区和非必需基因区；
3)选取一个非必需基因区中，生物合成基因簇比较集中的区域，为候选的大片段冗余基因区；
(2)链霉菌敲除质粒pKClox66的构建通过以下步骤实现：
1)以pHAH质粒为模板，设计特异性引物扩增lox66片段，并在其两端引入XbaI和EcoRV酶切位点，酶切纯化后，备用；pKC1139质粒用XbaI和EcoRV双酶切后回收；
2)步骤1)中酶切处理的lox66片段连入酶切处理的pKC1139载体，获得链霉菌敲除质粒pKClox66；
(3)链霉菌自杀质粒pSETlox71的构建通过以下步骤实现：
1)pSET152载体用HindIII单酶切，回收较大的DNA片段；
2)步骤1)中回收的DNA片段，加入T4DNA连接酶自连环化后获得pSET153质粒；
3)步骤2)中获得的pSET153质粒用SacI单酶切，回收较大的DNA片段，备用；
4)以pIJ779为模板，设计特异引物扩增壮观基因片段，并在其两端引入SacI酶切位点，经过酶切纯化后，备用；
5)步骤4)中纯化的DNA片段连入步骤3)中回收的DNA片段，获得pSET154质粒；
6)以pHAH为模板，设计特异引物扩增lox71片段，并在其两端引入HindIII和XbaI酶切位点，酶切纯化后，备用；pSET154质粒用HindIII和XbaI双酶切后回收，备用；
7)步骤6)中酶切处理的lox71片段连入酶切处理的pSET154载体，获得链霉菌自杀质粒pSETlox71；
(4)链霉菌表达质粒pNitCre的构建通过以下步骤实现：
1)以pALCre为模板，设计特异引物扩增Cre基因片段，并在其两端引入NdeI和HindIII酶切位点，酶切纯化后，备用；
2)pIJ8668-nit-pIJ101ori-MCS质粒用NdeI和HindIII双酶切，回收较大的DNA片段，备用；
3)步骤1)中回收的DNA片段与步骤2)中回收的DNA片段连接，获得链霉菌表达质粒pNitCre。
3.根据权利要求2所述的一种高效的链霉菌基因组精简系统的应用，其特征在于，通过以下步骤实现：
(1)将测序的链霉菌的全基因组序列与NCBI中公知的天蓝色链霉菌Streptomycescoelicolor A3(2)，保藏号CGMCC 4.7168，全基因组序列的序列编号GenBank:NC_003888.3，和阿维链霉菌Streptomyces avermitilis MA-4680，其保藏号CGMCC 4.3588，全基因组序列的序列编号GenBank:NC_003155.5，共同提交至全基因组比对分析软件Mauve进行比对分析；
(2)分析(1)中获得的全基因组比对数据，依据所有比对基因组中都保守存在的基因区为必需基因区，只在一种或两种基因组中存在的基因区为非必需基因区的理论，对链霉菌基因组进行区域划分为必需基因区和非必需基因区；
(3)选取(2)中划分出的一个非必需基因区中，生物合成基因簇比较集中的区域，为候选的大片段冗余基因区；
(4)敲除质粒和自杀质粒的构建，根据权利要求1或2中所述的大片段冗余基因区的序列设计同源臂，5’-端设计两个同源臂，3’-端设计一个同源臂，长度一般为1000bp-1500bp，将同源臂PCR扩增后酶切回收，将5’-端两个同源臂片段依次连接入链霉菌敲除质粒pKClox66中，构成敲除质粒；3’-端一个同源臂连接于链霉菌自杀质粒pSETlox71，构成自杀质粒；
(5)步骤(4)中获得的敲除质粒通过转化导入大肠杆菌感受态细胞ET12567/pUZ8002或S17-1或ET12567/pUB307中；
(6)通过大肠杆菌-链霉菌属间接合转导将步骤(4)中的敲除质粒导入到链霉菌中；
(7)敲除质粒的单交换，将步骤(6)中的转化子在大于34℃的温度下(一般为39℃)，进行阿泊拉霉素抗性筛选，能够在含阿泊拉霉素抗性和39℃下生长的菌株为发生单交换的突变株；
(8)敲除质粒的双交换，将步骤(7)中获得的单交换突变株挑入无抗性TSB液体培养基中39℃培养36h，再转接无抗性TSB液体培养基39℃培养24h，再转接无抗性TSB液体培养基30℃培养24h，取100μL菌液在无抗性平板上划单克隆；
(9)对步骤(8)中长出的单克隆进行影印筛选，同一个单克隆同时划在两块平板的对应位置，一块平板为不含抗生素的平板，另一块为含有阿泊拉霉素的抗性平板，挑取在抗性平板上不生长，在无抗性平板上正常生长的单克隆至TSB液体培养基中，培养36-48h后取适量菌液抽提基因组DNA进行PCR验证，筛选出阳性单克隆；
(10)步骤(9)中获得的阳性单克隆划线于链霉菌固体产孢培养基，培养适当时间，单克隆产生孢子，收集孢子并加入灭菌甘油至终浓度为20％，-80℃保存，备用；
(11)步骤(4)中获得的自杀质粒通过转化导入大肠杆菌感受态细胞ET12567/pUZ8002或S17-1或ET12567/pUB307中；
(12)通过大肠杆菌-链霉菌属间接合转导将步骤(7)中的自杀质粒导入到步骤(10)获得的链霉菌突变株孢子中；
(13)自杀质粒的单交换，将步骤(12)中的转化子在30℃的温度下，进行壮观霉素抗性筛选，能够在含壮观霉素抗性平板上正常生长的菌株为发生单交换的突变株，突变株转接至TSB液体培养基中，培养36-48h后取适量菌液抽提基因组DNA进行PCR验证，筛选出阳性单克隆；
(14)步骤(13)中获得的阳性单克隆划线于链霉菌固体产孢培养基，培养适当时间，单克隆产生孢子，收集孢子并加入灭菌甘油至终浓度为20％，-80℃保存，备用；
(15)链霉菌表达质粒的导入，链霉菌表达质粒pNitCre通过转化导入大肠杆菌感受态细胞ET12567/pUZ8002或S17-1或ET12567/pUB307中，通过大肠杆菌-链霉菌属间接合转导将链霉菌表达质粒pNitCre导入到步骤(14)获得的链霉菌突变株孢子中，进行阿泊拉霉素抗性筛选，挑取能够在阿泊拉霉素抗性平板上正常生长的单克隆转接至TSB液体培养基中，培养36-48h后取适量菌液抽提基因组DNA进行PCR验证，筛选出阳性单克隆；
(16)步骤(15)中获得的阳性单克隆划线于链霉菌固体产孢培养基，培养适当时间，单克隆产生孢子，收集孢子并加入灭菌甘油至终浓度为20％，-80℃保存，备用；
(17)Cre酶的诱导表达，取100μL步骤(16)获得的链霉菌突变株孢子接入TSB液体培养基中，振荡培养24h后，加入诱导剂ε-己内酰胺，终浓度为1％，继续培养10h后，取100μL菌液稀释1000倍后涂布在固体平板上，倒置培养数天，待单克隆长出；
(18)挑取步骤(17)获得的单克隆进行影印筛选，同一个单克隆同时划在两块平板的对应位置，一块平板为不含抗生素的平板，另一块为含有壮观霉素的抗性平板。挑取在抗性平板上不生长，在无抗性平板上正常生长的单克隆至TSB液体培养基中，培养36-48h后取适量菌液抽提基因组DNA进行PCR验证，筛选出阳性单克隆；
(19)步骤(18)中获得的阳性单克隆划线于链霉菌固体产孢培养基，培养适当时间，单克隆产生孢子，收集孢子并加入灭菌甘油至终浓度为20％，-80℃保存，备用；
(20)链霉菌表达质粒的丢失，取100μL步骤(19)中冻存的孢子，稀释1000倍后涂布无抗性平板，培养适当时间后单克隆长出，挑取单克隆划线于无抗性平板，获得的单克隆进行影印筛选，同一个单克隆同时划在两块平板的对应位置，一块平板为不含抗生素的平板，另一块为含有阿泊拉的抗性平板。在抗性平板上不生长，在无抗性平板上正常生长的单克隆为表达质粒丢失的突变株；
(21)步骤(20)中获得的阳性单克隆即为最终的基因组精简的链霉菌突变株，划线于链霉菌固体产孢培养基，培养适当时间，单克隆产生孢子，收集孢子并加入灭菌甘油至终浓度为20％，-80℃保存，备用；
(22)步骤(21)获得的突变株进行评估如生长周期评估、代谢谱评估、外源蛋白表达能力评估、外源次级代谢产物生产能力评估。
4.根据权利要求1或2或3所述方法在构建链霉菌高版本底盘细胞中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征是，根据多个链霉菌全基因组比对结果，分析并定位保守性低的大片段冗余基因区作为候选的敲除区域。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征是，根据敲除区域设计同源臂连入链霉菌敲除质粒和链霉菌自杀质粒，构建敲除质粒和自杀质粒，将lox66和lox71位点引入到敲除区域两端，通过诱导表达Cre介导大片段冗余基因区的高效缺失，从而构建基因组精简的链霉菌高版本底盘细胞。
7.根据权利要求4所述的应用，其特征是，通过生物量测定、代谢谱分析、外源蛋白表达分析及外源次级代谢途径表达分析确定基因组精简的链霉菌高版本底盘细胞具有更加优良的性能，便于用于微生物药物的高效生物合成和工业化生产。
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