CN106086056A - 一种恶臭假单胞菌基因敲除和基因组精简系统 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种恶臭假单胞菌基因敲除和基因组精简系统，属于微生物基因工程领域。本发明的恶臭假单胞菌基因敲除系统和基因组精简系统巧妙结合了自杀质粒敲除系统和位点特异性重组系统，大大提高了二轮筛选正确率，高达90％以上，在用于长达69个基因的基因簇的敲除时仍然表现出90％以上正确率。本发明实现基因簇的连续敲除，操作简便，高效，正确率高，成本低。本发明为精简优化恶臭假单胞菌基因组奠定了分子基础，有利于实现合成生物学底盘细胞的高效构建。
Description
技术领域
本发明涉及一种恶臭假单胞菌基因敲除和基因组精简系统，特别是一种基于同源重组与特异位点重组相结合的敲除系统，属于微生物基因工程领域。
背景技术
恶臭假单胞菌是一类革兰氏阴性菌，主要应用于生产聚羟基脂肪酸酯(PHA)，即广泛用于生物塑料及高附加值等医学材料的生产。为了改善菌株本身生产特性，除了常规的代谢工程改造外，优化其基因组势在必行。从合成生物学角度出发，精简优化该菌株的基因组是优化其作为生产底盘细胞的重要手段，因此构建一套高效、快捷、准确地基因簇连续敲除系统显得尤为重要。
随着恶臭假单胞菌生理学，生物化学和遗传学知识的积累，及恶臭假单胞菌全基因组的测序，基因工程手段在精简优化其基因组中地位越来越重要，也为构建优良的恶臭假单胞菌底盘细胞奠定了基础。从合成生物学角度出发，大范围连续地敲除其基因组上的非必需基因簇序列是必经之路，而利用现有的恶臭假单胞菌的传统基因敲除方法就显得力不从心。目前应用广泛的恶臭假单胞菌敲除载体为pK18mobsacB，传统的敲除质粒构建过程中，同源臂连接到一起，进行二轮筛选，但其由于第二轮交换回复为野生型的概率非常大，为敲除筛选带来很大麻烦，正确率很低，并且二轮筛选只能通过PCR验证，造成很高的经济成本。这种传统的自杀质粒敲除方法不适用于恶臭假单胞菌的基因组精简。
发明内容
本发明提供了一种恶臭假单胞菌基因敲除和基因组精简系统及其构建方法，通过此敲除系统1)成功敲除恶臭假单胞菌KT2442基因PP5288；2)完成恶臭假单胞菌KT2442中基因簇PP3126-PP3142、PP1277-PP1290和PP4329-PP4397的连续敲除。
本发明构建的敲除系统包括：1)核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的模板质粒pWJW101，用于扩增两端带有变异loxL/R位点的Gm抗性片段，作为二轮筛选的抗性标记；2)核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示的表达质粒pWJW102、pWJW103，用于位点特异性重组，其中，表达质粒pWJW102携带编码Cre重组酶和蔗糖果聚糖酶SacB的基因，Kan抗性；表达质粒pWJW103携带编码Cre重组酶和蔗糖果聚糖酶SacB的基因，Gm抗性；表达质粒pWJW102和pWJW103都是组成型表达Cre酶，强启动子PlacM用于SacB表达，用于蔗糖平板筛选培养来丢失质粒。
所述模版质粒pWJW101的构建方法包括以下步骤：
第一步：以pBBR1MCS-5为模板，PCR扩增得到gm基因，并在其两端均引入SmaI酶切位点，经过酶切纯化后，备用；以pDTW202质粒为模板，PCR扩增得到含有loxL/R位点的线性pBSloxL/R质粒片段，并在两端均引入SmaI酶切位点，经过酶切纯化后，备用；
第二步：将已经处理好的gm片段和pBSloxL/R质粒片段连接，得到pWJW101。
所述表达质粒pWJW102、pWJW103的构建方法包括以下步骤：
第一步：以pSH47为模板，以相应引物扩增重组酶Cre可移阅读框，并在扩增片段的5′和3′末端引入EcoRI和XbaI酶切位点，Cre片段经过EcoRI和XbaI酶切纯化后备用；以质粒pDXW-3为模板，以相应引物扩增带有强启动子的PlacM-sacB片段，片段5′和3′末端分别引入XbaI和SacI限制性内切酶切点，酶切纯化后备用；
第二步：酶切纯化的片段Cre和PlacM-sacB与经过EcoRI和XbaI酶切纯化的质粒pBBR1MCS-2连接，得到pWJW102；
第三步：酶切纯化的片段Cre和PlacM-sacB与经过EcoRI和XbaI酶切纯化的质粒pBBR1MCS-5连接，得到pWJW103。
本发明还提供一种应用上述敲除系统敲除恶臭假单胞菌KT2442的基因或基因簇的方法，如附图4和附图5所示，分别以恶臭假单胞菌自杀质粒为例进行说明。两者所阐述的基因敲除和基因簇敲除方法包括以下步骤：
1)敲除质粒的构建，根据需要敲除的基因或基因簇的序列设计其同源臂，长度一般为1000bp左右，将同源臂扩增后酶切回收，同时扩增带有loxL/R的抗性标记基因，将上游同源臂，抗性标记基因，下游同源臂依次连接于恶臭假单胞菌自杀质粒上，构成敲除质粒；
2)敲除质粒的第一轮交换，制备恶臭假单胞菌感受态，将1)中敲除质粒电转入感受态中，复苏涂布后，对长出的转化子进行蔗糖抗性筛选，有蔗糖致死的为一轮交换正确转化子；
3)敲除第二轮交换，将一轮交换正确转化子挑入Kan抗性LB培养基中培养12h，再转接无抗LB培养基培养12h，即可稀释100倍涂布具有同源臂中间连接的抗性标记的抗性的蔗糖平板，培养20h；对长出的单菌落进行抗性验证，即无出发自杀质粒自身抗性的转化子为第二轮敲除正确转化子，并进一步通过PCR验证确定1-2个转化子即可；
4)去除抗性标记，将第二轮敲除正确转化子制备成电转感受态，电转入表达质粒pWJW102或pWJW103，在表达质粒相应的抗性平板培养20h，对长出的单菌落进行抗性验证，无二轮交换抗性的单菌落为正确转化子，并进一步通过PCR验证确定1-2个转化子即可；
5)表达质粒的去除，将抗性标记去除成功的菌落挑入LB培养基中培养12h，稀释100倍 涂布于含有15g/100mL的蔗糖平板上培养20h，对所长出的单菌落进行抗性验证，无表达质粒抗性的单菌落为最终正确突变株，进一步PCR验证确定1-2个转化子即可。
在本发明的一种实施方式中，所述自杀质粒可以是pK18mobsacB或pZJD29c。
本发明所要解决的另一个技术问题是应用所构建的基因敲除系统和基因组精简系统1)敲除KT2442中PP5288；2)KT2442的基因簇PP3126-PP3142，PP1277-PP1290和PP4329-PP4397的连续敲除，即KT2442的基因组精简。利用pWJW101和pK18mobsacB构建了PP5288的敲除载体pWJW201，敲除了KT2442中的PP5288；利用pDTW202和pZJD29c分别构建了基因簇PP3126-PP3142、PP1277-PP1290和PP4329-PP4397的敲除载体pWJW202、pWJW203和pWJW204，敲除了KT2442中的基因簇PP3126-PP3142、PP1277-PP1290和PP4329-PP4397；获得菌株KT2442ΔPP5288和KT2442ΔPP3126-PP3142；并完成KT2442中基因簇PP3126-PP3142、PP1277-PP1290和PP4329-PP4397的连续敲除，获得菌株KT2442ΔPP3126-PP3142ΔPP1277-PP1290ΔPP4329-PP4397。
本发明很好地解决了传统敲除方法的弊端，首先构建了一种基于自杀质粒同源重组与特异位点重组相结合的敲除系统。自杀质粒同源重组主要是依赖于敲除质粒与目标基因组存在一定相同的同源DNA序列，经过同源区的配对产生一轮交换，完成敲除质粒重组到基因组的过程；再经过二轮筛选，不仅用蔗糖复筛，同时用同源臂中间引入的抗性筛选来获得正确敲除突变株，避免了传统的二轮交换中回复野生的重组，大大提高了正确突变的概率。通过自杀质粒同源重组，我们在抗性标记两侧引入loxL/R位点，利用Cre/lox特异重组系统去除抗性标记。
用于恶臭假单胞菌传统的敲除方法在第二轮交换中回复野生概率极大，突变株筛选正确率很低，且只能通过PCR验证突变基因型。本发明构建的敲除系统同时利用自杀质粒同源重组及带有变异loxL/R位点的位点特异性重组，结合两者优势克服传统自杀质粒敲除系统的缺陷，可用于恶臭假单胞菌的基因敲除和基因组精简；敲除过程首先通过自杀质粒同源重组到基因组上，然后通过蔗糖负筛和抗性标记筛选出被删除目的基因的转化子，该步较传统方法的正确率大大提高，再通过位点特异重组去除基因组上抗性基因，操作简便高效；可用于同一菌株中多个基因簇连续敲除；敲除完成后被改造菌株不携带任何抗性。适用于有序精简恶臭假单胞菌的基因组。本发明在第二轮交换中尤其体现了很高的筛选优势，正确率极高，通过菌落抗性验证即可初步筛选突变基因型，大大降低了成本。此外，本发明敲除系统也可以实现基因簇的连续高效敲除，随着目的基因簇的增长，其正确率仍然很高，并维持在90％以上，从而很好地实现恶臭假单胞菌KT2442的基因组精简。
附图说明
图1模板质粒pWJW101的物理图谱。
图2表达载体pWJW102和pWJW103的物理图谱，分别为图2a和图2b所示。
图3PP5288，PP3126-PP3142，PP1277-PP1290和PP4329-PP4397的敲除质粒pWJW201，pWJW202，pWJW203和pWJW204的物理图谱，分别为图3a，3b，3c和3d。
图4以pK18mobsacB为自杀质粒的基因敲除过程示意图。
图5以pZJD29c为自杀质粒的基因簇敲除过程示意图。
图6实施例2-4中第二轮交换平板抗性验证图。
图7基因型验证图；a，实施例2-5中，采用本发明基因敲除和基因簇敲除系统的敲除转化子PCR验证；图b，对照实施例2中采用pK18mobsacB传统敲除方法敲除转化子PCR验证图。
具体实施方式
实施例1模板质粒pWJW101及表达质粒pWJW102和pWJW103的构建
(1)用于扩增两端有同向的loxL/R位点的Gm抗性片段的模板质粒pWJW101的构建：第一步：以pBBR1MCS-5(Kovach,M.E.et al.Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBR1MCS,carrying different antibiotic-resistancecassettes.Gene 166,175-176(1995).)为模板，以gm-F/gm-R引物对作为模板，PCR扩增得到gm基因，并在其两端均引入SmaI酶切位点，经过酶切纯化后，备用；以pDTW202(Hu J,TanY,LiY,Hu X,Xu D,Wang X.Construction and application of an efficientmultiple-gene-deletion system in Corynebacterium glutamicum.Plasmid,2013,70(3):303-313)质粒为模板，以pBSloxL-F和pBSloxR-R引物作为模板，PCR扩增得到含有loxL/R位点的线性pBSloxL/R质粒片段，并在两端均引入SmaI酶切位点，经过酶切纯化后，备用。
第二步：将已经处理好的gm片段和pBSloxL/R质粒片段连接，转化JM109，新质粒命名为pWJW101。
用于基因或基因簇敲除的gm盒模板扩增的引物gm-F/gm-R位于重组位点外侧，扩增产物两端带有变异loxL/R位点的Gm抗性片段，称为gm盒，便于后续的位点特异重组。
(2)Cre重组酶和蔗糖果聚糖酶SacB表达载体pWJW102和pWJW103的构建方法，两质粒分别为Km抗性和Gm抗性，分别用于去除敲除质粒二轮交换的Gm抗性标记和Km抗性标记。
表达载体pWJW102和pWJW103的构建步骤如下：
第一步：以pSH47(Guldener U,Heck S,Fielder T,et al.A new efficient genedisruption cassette for repeated use in budding yeast.Nucleic Acids Res,1996,24(13):2519-2524)为模板，以引物cre-F/cre-R扩增重组酶Cre可移阅读框，并在扩增片段的5′和3′末端引入EcoRI和XbaI酶切位点，Cre片段经过EcoRI和XbaI酶切纯化后备用；以质粒pDXW-3(Tan Y,Xu D,LiY,Wang X.Construction of a novel sacB-based system formarker-free gene deletion in Corynebacterium glutamicum.Plasmid,2012,67(1):44-52)为模板，以PlacM-sacB-F/sacB-R扩增带有强启动子的PlacM-sacB片段，片段5′和3′末端分别引入XbaI和SacI限制性内切酶切点，酶切纯化后备用。
第二步：酶切纯化的片段Cre和PlacM-sacB与经过EcoRI和XbaI酶切纯化的质粒pBBR1MCS-2(Kovach,M.E.et al.Four new derivatives ofthe broad-host-rangecloning vector pBBR1MCS,carrying different antibiotic-resistancecassettes.Gene 166,175-176(1995).)连接，转化JM109，新质粒定名为pWJW102。
第三步：酶切纯化的片段Cre和PlacM-sacB与经过EcoRI和XbaI酶切纯化的质粒pBBR1MCS-5连接，转化JM109，新质粒定名为pWJW103。
Cre/lox重组系统发现于P1噬菌体，包括重组酶和重组位点两部分，其中，Cre是隶属于λInt酶超基因家族的重组酶，可以接到重组位点间的基因序列被删除或重组；loxp位点是可供Cre重组酶识别作用的重组位点，当两个loxp位点位于一条DNA链上并且方向相同时，Cre重组酶能切除两个loxp位点间的序列。loxL/loxR为突变loxp位点，两个重组位点经过Cre酶重组后，产生一个不能再被Cre重组酶识别的位点loxL/R，该位点不再参与位点重组。
该实施例中所需引物序列如下表1所示。
表1 本实施例涉及的引物序列
实施例2恶臭假单胞菌KT2442中PP5288的敲除
1.敲除质粒pWJW201的获得
以恶臭假单胞菌P.putidaKT2442基因组为模板，分别以相应引物扩增得到PP5288基因的上游片段和下游片段。在上游片段的5′和3′末端分别引入EcoRI和XbaI，在下游片段的5′和3′端分别引入BamHI和HindIII酶切位点。以pWJW101作为模板，以引物
gm-lox-XbaI(+)acctctagaAATACGACTCACTATAGGGCG，
gm-lox-BamHI(-)cgggatccGCGCAATTAACCCTCACTAAAG，
扩增两端含有loxL/R位点的gm盒，在5′和3′末端分别引入XbaI和BamHI酶切位点。将PP5288上游片段经过EcoRI和XbaI酶切纯化，下游片段经过BamHI和HindIII酶切纯化，gm盒片段经过XbaI和BamHI酶切纯化，pK18mobsacB经过EcoRI和HindIII酶切纯化，四个片段连接，转化JM109，新的质粒即为PP5288敲除质粒，命名为pWJW201(如附图2a)；自杀质粒pK18mobsacB可用于多种微生物基因的敲除，为Kan抗性，带有蔗糖果聚糖酶表达基因sacB，可降解蔗糖从而抑制细胞分裂，可用于蔗糖负筛选。
2.敲除感受态的制备及电转化
接种恶臭假单胞菌KT2442菌于LB液体培养基中，30℃，200rpm过夜培养。按2％接种量转接50mL LB液体培养基，30℃，200rpm培养至OD600＝0.7时，将培养液冰浴半小时后转入预冷的50mL离心管中，4℃，8000rpm离心10min收集菌体，沉淀用预冷的10％甘油洗涤3次，最后用0.5mL 10％甘油悬浮，每管80μL分装至预冷的无菌EP管中。
将1000-5000ng敲除质粒pWJW201加入感受态细胞中，混匀，冰浴15min，1.5kv电击5ms，30℃，200rpm孵育1h，涂布30μg/mL卡那霉素的LB固体平板，30℃培养20h；
3.敲除流程
(1)一轮交换
挑取电转转化子于含30μg/mL卡那霉素及15g/100mL蔗糖的LB固体上划线培养20h，筛选菌周围有粘液化透明物质分泌的转化子，并PCR验证确认第一轮交换成功单菌落。
(2)二轮交换
选取验证正确的单菌落，即pWJW201质粒通过同源臂重组与染色体交换使得整个质粒整合到P.putidaKT2442的染色体上，接种于含30μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，30℃培养约12h，转接至LB液体培养基中，30℃培养12h，稀释100倍后涂布于含30μg/mL庆大霉素和15g/100mL蔗糖的LB固体平板，30℃培养约20h；对所长出的单菌落进行Km抗性验证，即划取50个单菌落在Km固体平板上培养20h，不生长的单菌落即为正确敲除转化子，仅有5个转化子生长，正确率达到90％，抗性验证平板见附图6a所示，进一步PCR 验证2个正确单菌落，即P.putidaKT2442ΔPP5288-gm。
(3)抗性标记去除
将PCR验证正确的单菌落接种含30μg/mL庆大霉素的LB液体培养基中，制备感受态，转入pWJW102质粒，涂布于含30μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上培养20h，挑取单菌落验证其抗性，无Gm抗性并PCR验证正确的转化子，即P.putidaKT2442ΔPP5288/pWJW102。
4.pWJW102的去除
将上一步验证正确的P.putidaKT2442ΔPP5288/pWJW102单菌落挑取至LB液体培养基中过夜培养，涂布含有15g/100mL蔗糖的固体平板，30℃培养20h，对单菌落进行Km抗性验证，即将单菌落划线卡那霉素的固体平板，30℃培养20h，不生长且进一步PCR验证正确的菌落即为敲除成功的无抗目的菌株，即P.putidaKT2442ΔPP5288。
表2 基因PP5288敲除的PCR验证引物
结果如图7a基因型验证图：
Lane 1：PP5288U-F/PP5288D-R引物验证P.putidaKT2442ΔPP5288-gm基因型的PCR图，结果正确；
Lane 2：PP5288U-F/PP5288D-R引物验证P.putidaKT2442ΔPP5288无抗突变株基因型的PCR图，结果正确；
Lane 3、4：PP5288-in-test-F/PP5288-in-test-R引物验证P.putidaKT2442ΔPP5288无抗突变株基因型的PCR图，结果正确；
Lane 5：PP5288-in-test-F/PP5288-in-test-R引物验证P.putida KT2442野生菌基因型的PCR图。
对照实施例2恶臭假单胞菌KT2442中PP5288的敲除
1.敲除质粒pK18mobsacB-PP5288的获得
以P.putidaKT2442基因组为模板，分别以相应引物扩增得到PP5288基因的上游片段和下游片段。在上游片段的5′和3′末端分别引入EcoRI和XbaI，在下游片段的5′和3′端分别引入XbaI和HindIII酶切位点。将PP5288上游片段经过EcoRI和XbaI酶切纯化，下游片段经过XbaI和HindIII酶切纯化，pK18mobsacB经过EcoRI和HindIII酶切纯化，三个片 段连接，转化JM109，新的质粒即为PP5288敲除质粒，命名为pK18mobsacB-PP5288。
2.敲除感受态的制备及电转化
同实施例2；
3.敲除流程
(1)一轮交换
同实施例2；
(2)二轮交换
选取验证正确的单菌落，即pK18mobsacB-PP5288质粒通过同源臂重组与染色体交换使得整个质粒整合到P.putidaKT2442的染色体上，接种于含30μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，30℃培养约12h，转接至无抗LB液体培养基中，30℃培养12h，稀释100倍后涂布于含15g/100mL蔗糖的LB固体平板，30℃培养约20h；对所长出的单菌落进行PCR验证，验证50个单菌落，全部为回复野生型，无正确突变型。
表3 PP5288传统方法敲除的PCR验证引物
转化子PCR验证结果均如同图7b基因型验证图：
Lane 1-14：PP5288U-F/PP5288D-R引物验证采用pK18mobsacB传统敲除方法筛选的转化子PP5288基因型的部分PCR图，结果全部为野生型大小。
实施例3恶臭假单胞菌KT2442中基因簇PP3126-PP3142的敲除
1.敲除质粒pWJW202的获得
以P.putidaKT2442基因组为模板，以相应引物扩增得到PP3126-PP3142基因簇的上游片段和下游片段。在上游片段的5′和3′末端分别引入SacI和XbaI，在下游片段的5′和3′端分别引入BamHI和SacI酶切位点。以pDTW202作为模板，以引物
kan-lox-XbaI(+)acctctagaAATACGACTCACTATAGGGCG，
Kan-lox-BamHI(-)cgggatccGCGCAATTAACCCTCACTAAAG，
扩增两端含有loxL/R位点的kan盒，在5′和3′末端分别引入XbaI和BamHI酶切位点。将PP3126-PP3142基因簇的上游片段经过SacI和XbaI酶切纯化，下游片段经过BamHI和SacI酶切纯化，kan盒片段经过XbaI和BamHI酶切纯化，pZJD29c(Yano T,Sanders C,Catalano J,Daldal F.sacB-5-Fluoroorotic acid-pyrE-based bidirectionalselection for integration of unmarked alleles into the chromosome ofRhodobacter capsulatus.Appl Environ Microbiol.2005Jun；71(6): 3014-24.)经过SacI酶切纯化，四个片段连接，转化JM109，新的质粒即为PP3126-PP3142敲除质粒，命名为pWJW202(如附图2b)。pZJD29c质粒为Gm抗性，也带有sacB基因，我们发现该质粒在恶臭假单胞菌中也是不能复制的，可以用于基因敲除或基因组精简。
2.敲除感受态制备及电转
同实施例2，仅将电转质粒换成pWJW202；
3.敲除流程
(1)一轮交换
同实施例2；
(2)二轮交换
选取验证正确的单菌落，即pWJW202质粒通过同源臂重组与染色体交换使得整个质粒整合到P.putidaKT2442的染色体上，接种于含30μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，30℃培养12h，转接LB试管培养12h，稀释100倍后涂布于含30μg/mL卡那霉素和15g/100mL蔗糖的LB固体平板，30℃培养约20h；对所长出的单菌落进行Gm抗性验证，即划取50个单菌落在Gm固体平板上培养20h，不生长的单菌落即为正确敲除转化子，仅4个转化子生长，正确率达到92％，如附图6b所示，进一步PCR验证2个单菌落，正确，即P.putida KT2442ΔPP3126-PP3142-kan。
(3)抗性标记去除
将PCR验证正确的单菌落接种含30μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，制备感受态，转入pWJW103质粒，于含30μg/mL庆大霉素的LB固体培养基上培养20h，挑取单菌落验证其抗性，无Km抗性并PCR验证正确的转化子，即P.putida KT2442ΔPP3126-PP3142/pWJW103。
4.pWJW103的去除
将上一步验证正确的P.putida KT2442ΔPP3126-PP3142/pWJW103单菌落挑取至LB液体培养基中过夜培养，涂布含有15g/100mL蔗糖的固体平板，30℃培养20h，对单菌落进行Gm抗性验证，即将单菌落划线庆大霉素的固体平板，30℃培养20h，不生长且进一步PCR验证正确的菌落即为敲除成功的无抗突变株，即P.putidaKT2442ΔPP3126-PP3142。
表4 基因簇PP3126-PP3142敲除的PCR验证引物
结果如图7a基因型验证图：
Lane 6：PP3126-PP3142-test-F/PP3126-PP3142-test-R引物验证P.putidaKT2442ΔPP3126-PP3142-kan基因型的PCR图，结果正确；
Lane 7：PP3126-PP3142-test-F/PP3126-PP3142-test-R引物验证P.putidaKT2442ΔPP3126-PP3142无抗突变株基因型的PCR图，结果正确；
Lane 8、9：PP3126-PP3142-in-test-F/PP3126-PP3142-in-test-R引物验证P.putida KT2442ΔPP3126-PP3142无抗突变株基因型的PCR图，结果正确；
Lane 10：PP3126-PP3142-in-test-F/PP3126-PP3142-in-test-R引物验证P.putida KT2442野生菌基因型的PCR图。
实施例4恶臭假单胞菌KT2442ΔPP3126-PP3142中基因簇PP1277-PP1290的敲除
1.敲除质粒pWJW203的获得
同实施例3；仅PP1277-PP1290基因簇上游同源臂的酶切位点换作SacI和BamHI，下游同源臂的酶切位点换作XbaI和SacI，中间带有loxL/R位点的kan盒两端酶切位点换作BamHI和XbaI。pWJW203质粒如附图3c。
2.敲除感受态制备及电转
同实施例2，仅将电转质粒换成pWJW203。
3.敲除流程
同实施例3，KT2442ΔPP3126-PP3142ΔPP1277-PP1290：：loxL-kan-loxR命名为KT2442ΔPP3126-PP3142ΔPP1277-PP1290-kan；同样挑取50个单菌落，验证其抗性，5个单菌落生长，正确率为90％，如附图6c所示。
4.pWJW103的去除
同实施例3，KT2442ΔPP3126-PP3142ΔPP1277-PP1290：loxL/R命名为KT2442ΔPP3126-PP3142ΔPP1277-PP1290。
表5 基因簇PP1277-PP1290敲除的PCR验证引物
结果如图7a基因型验证图：
Lane 11：PP1277-PP1290-test-F/PP1277-PP1290-test-R引物验证P.putidaKT2442ΔPP3126-PP3142ΔPP1277-PP1290-kan基因型的PCR图，结果正确；
Lane 12：PP1277-PP1290-test-F/PP1277-PP1290-test-R引物验证P.putidaKT2442ΔPP3126-PP3142ΔPP1277-PP1290无抗突变株基因型的PCR图，结果正确；
Lane 13、14：PP1277-PP1290-in-test-F/PP1277-PP1290-in-test-R引物验证P.putida KT2442ΔPP3126-PP3142ΔPP1277-PP1290无抗突变株基因型的PCR图，结果正确；
Lane 15：PP1277-PP1290-in-test-F/PP1277-PP1290-in-test-R引物验证P.putida KT2442野生菌基因型的PCR图。
实施例5恶臭假单胞菌KT2442ΔPP3126-PP3142ΔPP1277-PP1290中基因簇PP4329-PP4397的敲除
1.敲除质粒pWJW204的获得
同实施例3。pWJW204质粒如附图3d。
2.敲除感受态制备及电转
同实施例2，仅将电转质粒换成pWJW204。
3.敲除流程
同实施例3，KT2442ΔPP3126-PP3142ΔPP1277-PP1290ΔPP4329-PP4397：：loxL-kan-loxR命名为KT2442ΔPP3126-PP3142ΔPP1277-PP1290ΔPP4329-PP4397-kan；同样挑取50个单菌落，验证其抗性，4个单菌落生长，其正确率达到92％，如附图6d所示。
4pWJW103的去除
同实施例3，KT2442ΔPP3126-PP3142ΔPP1277-PP1290ΔPP4329-PP4397：：loxL/R命名为KT2442ΔPP3126-PP3142ΔPP1277-PP1290ΔPP4329-PP4397。
表6 基因簇PP4329-PP4397敲除的PCR验证引物
结果如图7a基因型验证图：
Lane 16：PP4329-PP4397-test-F/PP4329-PP4397-test-R引物验证P.putidaKT2442ΔPP3126-PP3142ΔPP1277-PP1290ΔPP4329-PP4397-kan基因型的PCR图，结果正确；
Lane 17：PP4329-PP4397-test-F/PP4329-PP4397-test-R引物验证P.putidaKT2442ΔPP3126-PP3142ΔPP1277-PP1290ΔPP4329-PP4397无抗突变株基因型的PCR图，结果正确；
Lane 18、19：PP4329-PP4397-in-test-F/PP4329-PP4397-in-test-R引物验证P.putida KT2442ΔPP3126-PP3142ΔPP1277-PP1290ΔPP4329-PP4397无抗突变株基因型的PCR图，结果正确；
Lane 20：PP4329-PP4397-in-test-F/PP4329-PP4397-in-test-R引物验证P.putida KT2442野生菌基因型的PCR图。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (8)
1.一种恶臭假单胞菌基因敲除和基因组精简系统，其特征在于，包括：1)核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的模板质粒pWJW101；2)核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示的表达质粒pWJW102、pWJW103；其中，表达质粒pWJW102携带编码Cre重组酶和蔗糖果聚糖酶SacB的基因，Kan抗性；表达质粒pWJW103携带编码Cre重组酶和蔗糖果聚糖酶SacB的基因，Gm抗性。
2.一种构建权利要求1所述的恶臭假单胞菌基因敲除和基因组精简系统的方法，其特征在于，
模板质粒pWJW101的构建方法包括以下步骤：
第一步：以pBBR1MCS-5为模板，PCR扩增得到gm基因，并在其两端均引入SmaI酶切位点，经过酶切纯化后，备用；以pDTW202质粒为模板，PCR扩增得到含有loxL/R位点的线性pBSloxL/R质粒片段，并在两端均引入SmaI酶切位点，经过酶切纯化后，备用；
第二步：将已经处理好的gm片段和pBSloxL/R质粒片段连接，得到pWJW101；
所述表达质粒pWJW102、pWJW103的构建方法包括以下步骤：
第一步：以pSH47为模板，以相应引物扩增重组酶Cre可移阅读框，并在扩增片段的5′和3′末端引入EcoRI和XbaI酶切位点，Cre片段经过EcoRI和XbaI酶切纯化后备用；以质粒pDXW-3为模板，以相应引物扩增带有强启动子的PlacM-sacB片段，片段5′和3′末端分别引入XbaI和SacI限制性内切酶切点，酶切纯化后备用；
第二步：酶切纯化的片段Cre和PlacM-sacB与经过EcoRI和XbaI酶切纯化的质粒pBBR1MCS-2连接，得到pWJW102；
第三步：酶切纯化的片段Cre和PlacM-sacB与经过EcoRI和XbaI酶切纯化的质粒pBBR1MCS-5连接，得到pWJW103。
3.一种应用权利要求1所述的恶臭假单胞菌基因敲除和基因组精简系统敲除恶臭假单胞菌的基因或基因簇的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)敲除质粒的构建，根据需要敲除的基因或基因簇的序列设计其同源臂，长度一般为1000bp左右，将同源臂扩增后酶切回收，同时扩增带有loxL/R的抗性标记基因，将上游同源臂，抗性标记基因，下游同源臂依次连接于恶臭假单胞菌自杀质粒上，构成敲除质粒；
2)敲除质粒的第一轮交换，制备恶臭假单胞菌感受态，将1)中敲除质粒电转入感受态中，复苏涂布后，对长出的转化子进行蔗糖抗性筛选，有蔗糖致死的为一轮交换正确转化子；
3)敲除第二轮交换，将一轮交换正确转化子挑入Kan抗性LB培养基中培养12h，再转接无抗LB培养基培养12h，即可稀释100倍涂布具有同源臂中间连接的抗性标记的抗性的蔗糖平板，培养20h；对长出的单菌落进行抗性验证，即无出发自杀质粒自身抗性的转化子为第二轮敲除正确转化子，并进一步通过PCR验证确定1-2个转化子即可；
4)去除抗性标记，将第二轮敲除正确转化子制备成电转感受态，电转入表达质粒pWJW102或pWJW103，在表达质粒相应的抗性平板培养20h，对长出的单菌落进行抗性验证，无二轮交换抗性的单菌落为正确转化子，并进一步通过PCR验证确定1-2个转化子即可；
5)表达质粒的去除，将抗性标记去除成功的菌落挑入LB培养基中培养12h，稀释100倍涂布于含有15g/100mL的蔗糖平板上培养20h，对所长出的单菌落进行抗性验证，无表达质粒抗性的单菌落为最终正确突变株，进一步PCR验证确定1-2个转化子即可。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述自杀质粒是pK18mobsacB或pZJD29c。
5.一种应用权利要求1所述的恶臭假单胞菌基因敲除和基因组精简系统敲除恶臭假单胞菌KT2442的PP5288基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)以自杀质粒pK18mobsacB为出发质粒，连接PP5288的同源臂和pWJW101中的gm盒，转化E.coli JM109，构建PP5288敲除质粒；
(2)将(1)中PP5288敲除质粒从E.coli JM109中提取，电转化恶臭假单胞菌KT2442菌株，涂布于含有卡那霉素的固体恢复培养基，30℃培养约20小时；
(3)挑取平板上单菌落，即一轮转化子，进行PCR验证，选取验证正确的单菌落，进行蔗糖平板划线培养，有明显透明粘液的菌为正确的转化子；
(4)挑取上述(3)中验证正确的一轮转化子，接到Kan抗性的LB培养基中，30℃培养12小时，转接LB无抗试管培养12h，稀释100倍，涂布Gm抗性的LB固体平板；
(5)挑取平板上单菌落进行PCR验证，选取验证正确的单菌落；
(6)将(5)所得菌株接种于LB液体培养基，30℃过夜培养，并制备正确单菌落的电转感受态；
(7)从E.coli JM109中提取pWJW102，电转入上述感受态中，30℃培养约20小时，PCR验证转化子，选取验证正确的单菌落；
(8)挑取平板上正确的单菌落入LB液体培养基，30℃培养约12小时，稀释100倍涂布含15g/100mL蔗糖的LB固体平板，30℃培养约20小时；
(9)挑取(8)中单菌落，画格子验证是否有Kan抗性，无Kan抗性的单菌落，再经过PCR验证，选取正确的单菌落，即为敲除无抗突变株。
6.一种应用权利要求1所述的恶臭假单胞菌基因敲除和基因组精简系统敲除恶臭假单胞菌基因簇的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)以自杀质粒pZJD29c为出发质粒，连接目的基因簇的同源臂和kan盒，转化E.coliJM109，构建敲除质粒；
(2)将(1)中敲除质粒从E.coli JM109中提取，电转化要敲除的恶臭假单胞菌，涂布于含有卡那霉素的固体恢复培养基，30℃培养约20小时；
(3)挑取平板上单菌落，即一轮转化子，进行PCR验证，选取验证正确的单菌落，进行蔗糖平板划线培养，有明显透明粘液的菌正确；
(4)挑取上述(3)中验证正确的一轮转化子，接到Kan抗性的LB培养基中，30℃培养12小时，转接LB无抗试管培养12h，稀释100倍，涂布Kan抗性的LB固体平板；
(5)挑取平板上单菌落进行PCR验证，选取验证正确的单菌落；
(6)将上步所示菌株接种于液体培养基，30℃过夜培养，并制备正确单菌落的电转感受态；
(7)从E.coli JM109中提取pWJW103，电转入上述感受态中，30℃培养约20小时，PCR验证转化子，选取验证正确的单菌落；
(8)挑取平板上正确的单菌落入LB液体培养基，30℃培养约12小时，稀释100倍涂布含15g/100mL蔗糖的LB固体平板，30℃培养约20小时；
(9)挑取(8)中单菌落，画格子验证是否有Kan抗性，无Kan抗性的单菌落，再经过PCR，选取正确的单菌落，即为敲除无抗突变株。
7.权利要求1所述的恶臭假单胞菌基因敲除和基因组精简系统在恶臭假单胞菌的基因敲除中的应用。
8.权利要求1所述的恶臭假单胞菌基因敲除和基因组精简系统在恶臭假单胞菌的基因组精简中的应用。
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| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |