CN106010999A

CN106010999A - 基因工程菌株、培养方法及该基因工程菌株的用途

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Publication number: CN106010999A
Application number: CN201610325977.XA
Authority: CN
Inventors: 胡洪波; 李帆; 李一帆; 赵嘉; 张雪洪
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2016-05-16
Filing date: 2016-05-16
Publication date: 2016-10-12

Abstract

本发明提供了一种基因工程菌株、培养方法及该基因工程菌株的用途，该基因工程菌株包括如下两种形式中一种：a、敲除了绿针假单孢菌中DHHA异构酶phzF基因；b、在敲除了绿针假单孢菌中DHHA异构酶phzF基因的基础上进一步敲除了绿针假单胞菌基因组中的pykF基因。该培养方法为无痕敲除绿针假单孢菌中DHHA异构酶phzF基因或绿针假单胞菌基因组中的pykF基因。该基因工程菌株可以用于2,3‑二氢‑3‑羟基邻氨基苯甲酸中的制备。与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：1、用于生产DHHA的菌株为绿针假单胞菌，至今未有致病性的报道，因此其环境友好，安全可靠；2、DHHA为GP72的天然代谢中间体，无需外源基因的引入，因此更加安全可靠。

Description

基因工程菌株、培养方法及该基因工程菌株的用途

技术领域

本发明涉及一种基因工程菌株、培养方法及该基因工程菌株的用途，属于生物工程领域。

背景技术

2,3-二氢-3-羟基邻氨基苯甲酸(Trans-2,3-dihydro-3-hydroxyanthranilicacid,DHHA)，也叫(5S,6S)-6-氨基-5-羟基-1,3-环己二烯甲酸((5S,6S)-6-amino-5-hydroxy-cyclohexa-1,3-dienecarboxylic acid，2,3-trans-CHA)，CAS编号38127-17-2，分子式C₇H₉NO₃，结构式如下，

是一种重要的通过分支酸途径的中间代谢产物。

DHHA由McCormick等人在1962年报道，在一株低产四环素的金色链霉菌(Streptomycesaureofaciens)NRRL 2209中分离得到，并通过化学分析，确认产物结构为2,3-二氢-3-羟基邻氨基苯甲酸(DHHA)。DHHA最早被认为是四环素合成的重要中间产物，但由同位素最终实验，证实DHHA并非四环素合成的中间产物。2001年，M.McDonald等人在荧光假单胞菌的分支酸衍生物合成途径(2-羟基吩嗪以及吩嗪-1-羧酸)的一种中间代谢产物，由分支酸经过PhzE及PhzD基因表达的酶催化后产生。2009年，R.Bujnicki通过在删除了完整的芳香族氨基酸竞争途径，从而改善了分支酸供应量的大肠杆菌中，通过异源表达phzD，phzE两个基因，在2升发酵规模，限定L-酪氨酸的分批补料的发酵条件下，得到12g/L的DHHA。

而近年来，DHHA也被越来越多的用于化学研究中。Steel等人2003年的研究中发现，外消旋的DHHA，可被立体选择性的氧化，此外，DHHA及其衍生物已经被利用于环加成的反应中，具有一定的化学用途。

于此同时，作为环状β氨基酸家族的一员，DHHA具有作为非天然的肽合成的起始材料，目前已经引起了越来越多人的兴趣。此外，DHHA还可作为手性催化剂用于不对称合成反应中，如脯氨酸等α氨基酸的合成。利用Zn²⁺-DHHA的复合物作为在水溶液中的催化剂，可以成功将4-硝基苯甲醛和丙酮转化成相应的醛醇缩合产物，具有较高的选择反应性。

2,3-二氢-3-羟基邻氨基苯甲酸(DHHA)现在已被大量关注，其作为吩嗪合成途径的中间代谢产物，可以在绿针假单胞菌中被自然的合成，然后再通过PhzF等酶的作用，最终转化为PCA。已有研究通过大肠杆菌生产DHHA，如欧洲专利EP1728872 A1公开了一种(5S,6S)-6-氨基-5-羟基-1,3-环己二烯甲酸(2,3-CHA)的生物合成。其在技术上是通过异源表达假单胞菌基因phzE、phzD从而在大肠杆菌KB532生产DHHA，其工程菌株的构建更为繁琐，副产物成分更加复杂。而绿针假单胞菌是非致病菌，对人体无害，且只需要通过缺失phzF基因即可生产DHHA，无需异源表达其他基因，构造更为简便快捷，发酵产物成分较简单，因此是生产DHHA最佳天然菌株。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种基因工程菌株、培养方法及该基因工程菌株的用途，该方案可填补利用绿针假单胞菌生产DHHA的空白。

本发明是通过以下技术方案实现的：

第一方面，本发明提供了一种基因工程菌株，该基因工程菌株敲除了绿针假单孢菌中DHHA异构酶phzF基因；

作为优选方案，所述DHHA异构酶phzF基因的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

作为优选方案，所述DHHA异构酶phzF基因的对应蛋白质的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。

第二方面，本发明提供了一种如前述的基因工程菌株的制备方法，其包括如下步骤：

扩增phzF基因上下游同源臂片段；

融合PCR连接上下游同源臂，并插入pK18mobsacB质粒中；

使融合的phzF基因上下游同源臂与GP72基因组发生同源重组，利用蔗糖压力和抗性筛选出阳性克隆，即可；或

扩增pykF基因上下游同源臂片段；

融合PCR连接上下游同源臂，并插入pK18mobsacB质粒中；

使融合的pykF基因上下游同源臂与GP72基因组发生同源重组，利用蔗糖压力和抗性筛选出阳性克隆，即可；

所述pK18mobsacB质粒带有蔗糖致死基因和卡那抗性基因。

作为优选方案，用于敲除phzF基因的上游同源臂的碱基序列如SEQ ID NO.3以及SEQ ID NO.4所示；下游同源臂的碱基序列如SEQ ID NO.5以及SEQ ID NO.6所示。

作为优选方案，用于敲除pykF基因的上下游同源臂的碱基序列如SEQ ID NO.9以及SEQ ID NO.10所示；下游同源臂的碱基序列如SEQ ID NO.11以及SEQ ID NO.12所示。

第三方面，本发明还提供了一种用于培养前述的基因工程菌株的培养基，包括如下组分：甘油、蛋白胨、硫酸镁、磷酸氢二钾、葡萄糖、三氯化铁。

作为优选方案，所述培养基包括按重量份数计的如下组分：

第四方面，本发明也提供了一种如前述的基因工程菌株在制备2,3-二氢-3-羟基邻氨基苯甲酸中的用途。

作为优选方案，所述基因工程菌株在制备2,3-二氢-3-羟基邻氨基苯甲酸时的条件为：好氧培养；温度：26～30℃；pH：6～8；转速150～250rpm。

第五方面，本发明提供了一种提升前述的基因工程菌株产物产量的基因改造菌株，该基因改造菌株是在敲除了绿针假单孢菌中DHHA异构酶phzF基因的基础上进一步敲除了绿针假单胞菌基因组中的pykF基因。

作为优选方案，其中，所述pykF基因的碱基序列如SEQ ID NO.7所示。

作为优选方案，其中，所述pykF基因的对应蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。制备方法，包括如下步骤：

扩增pykF基因上下游同源臂片段；

融合PCR连接上下游同源臂，并插入pK18mobsacB质粒中；

使融合的pykF基因上下游同源臂与GP72基因组发生同源重组，利用蔗糖压力和抗性筛选出阳性克隆，即可。

作为优选方案，用于敲除所述pyzF基因的用于扩增上游同源臂的碱基序列如SEQID NO.9以及SEQ ID NO.10所示；用于扩增下游同源臂的碱基序列如SEQ ID NO.11以及SEQID NO.12所示。

本发明又提供了一种如前述的基因工程菌株在制备2,3-二氢-3-羟基邻氨基苯甲酸中的用途。

所述的用途中，所述基因工程菌株在制备2,3-二氢-3-羟基邻氨基苯甲酸时的条件为,好氧培养；温度26～30℃；pH 6～8；转速150～250rpm；

本发明通过对phzF基因的敲除，阻断DHHA向PCA转化的反应，从而在绿针假单胞菌GP72中富集DHHA，得到一株DHHA的产生菌。同时对pykF进行敲除，可以有效提升DHHA的产量。此外，结合实验室之前对于吩嗪衍生物产量提高的一些经验，进一步提高DHHA的产量，得到可高产DHHA的绿针假单胞菌及适宜发酵条件。而且其原料简单易得，发酵周期短，24h就产生大量DHHA，36h基本可达最高DHHA产量；而且副产物少，易于后续的纯化分离得到DHHA的纯品，因此它是DHHA生产的理想菌种，适合大规模的开发和应用。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

1、用于生产DHHA的菌株为绿针假单胞菌，至今未有致病性的报道，因此其环境友好，安全可靠；

2、DHHA为GP72的天然代谢中间体，无需外源基因的引入，因此更加安全可靠；

3、绿针假单胞菌的代谢产物种类少，代谢调控机制相对简单，易于进行代谢工程改造；

4、本方法生产成本低：本菌株营养要求简单，原料便宜易得，且发酵液中副产物少，易于分离提取，生产工艺简单易行。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1 phzF基因敲除和phzF基因、pykF基因共敲除的PCR验证结果图；其中，图1a)为通过SEQ ID.3和SEQ ID.6为引物、phzF基因敲除PCR验证结果，L1以GP72菌液为模板，L2以GP72ΔphzF菌液为模板；图1b)为通过SEQ ID.9和SEQ ID.12为引物、pykF基因敲除PCR验证结果图，L3以GP72菌液为模板，L4以GP72ΔphzFΔpykF菌液为模板。

图2为GP72、GP72ΔphzF在平板上的形态对比图，可以见得，在GP72敲除phzF基因后，其自身代谢途径无法继续合成红色的吩嗪类化合物，故GP72在平板上呈现红色而GP72ΔphzF在平板上呈现白色；

图3为绿针假单胞菌GP72培养48小时后的发酵产物HPLC检测图；

图4为绿针假单胞菌GP72ΔphzF培养48小时后的发酵产物HPLC检测图；

图5为绿针假单孢菌GP72ΔphzFΔpykF培养48小时后的发酵产物HPLC检测图；

图6为绿针假单胞菌GP72ΔphzF及绿针假单孢菌GP72ΔphzFΔpykF培养48小时内的生长曲线图；

图7为绿针假单胞菌GP72ΔphzF及绿针假单孢菌GP72ΔphzFΔpykF培养48小时内的DHHA产量变化图；

图8为培养绿针假单胞菌GP72ΔphzF时加入FeCl₃后，48小时内DHHA的产量变化图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。

本发明中的绿针假单胞菌GP72(Pseudomonas chlororaphis GP72)，该菌株已在中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)保藏，保藏单位地址为：中国·武汉·武汉大学，邮编为：430072，保藏日期为：2016年3月28日，保藏编号为：CCTCC M 2016147；

本发明中的绿针假单胞菌GP72△phzF(Pseudomonas chlororaphis GP72△phzF)，该菌株已在中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)保藏，保藏单位地址为：中国·武汉·武汉大学，邮编为：430072，保藏日期为：2016年3月28日，保藏编号为：CCTCC M2016148；

本发明中的绿针假单胞菌GP72△phzF△pykF(Pseudomonas chlororaphis GP72△phzF△pykF)，该菌株已在中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)保藏，保藏单位地址为：中国·武汉·武汉大学，邮编为：430072，保藏日期为：2016年3月28日，保藏编号为：CCTCCM 2016149。

实施例1

phzF基因体外突变体的构建-无痕敲除

根据绿针假单胞菌GP72基因组中phzF及上下游序列设计引物，上游5’-TTCGGATCCGCAAAGCCATTCCCAACC-3’(BamHI,如SEQ ID NO.3)和5’-CCTTGAGCAATTCGGCGTAACACCGCGACCGGATTA-3’(如SEQ ID NO.4)，下游5’-TAATCCGGTCGCGGTGTTACGCCGAATTGCTCAAGG-3’(如SEQ ID NO.5)和5’-CCCGGAATTCCGATTCAAGGCGCAACTCA-3’(EcoRI，如SEQ ID NO.6)，以该基因组DNA为模板，扩增基因组中的相应片段。将上下游PCR产物通过融合PCR连接，并将融合PCR产物与pK18mobsacB载体分别使用BamHI和EcoRI酶切，过柱回收，使用T4连接酶连接，获得体外突变质粒并转化大肠杆菌S17。

将携带重组质粒的S17菌株充分活化，接种于含有卡那霉素50mg/L的LB培养基中，37℃，180转/分培养12h。将充分活化的GP72菌株接种于LB培养基中，26-30℃，180转/分培养12h。5000转/分收集并洗涤两种菌体，LB培养基重悬并以GP72：S17浓度比为3:1的比例混合与EP管中，静置1h；取混合菌液点在LB平板中，28℃培养24h，刮取长出来的混合菌落于LB中重悬，稀释涂布于卡那霉素50mg/L，氨苄霉素100mg/L的LB平板上，28℃培养2至3天后挑取单克隆涂布15％蔗糖平板中，28℃培养1至2天；挑取蔗糖平板上的单克隆，PCR验证；挑取在卡那霉素50mg/L抗性平板上不生长，但在无抗平板上能够正常生长的单菌落，即为同源重组成功的菌落。PCR验证GP72菌株的phzF基因被敲除，并命名为GP72ΔphzF，电泳图如图1a所示。图1a中，基因工程菌GP72ΔphzF(L1)因为被敲除了phzF基因，因此PCR扩增产物比绿针假单胞菌GP72的片段要小接近300bp左右。

图2为GP72以及GP72ΔphzF在平板上形态的对比图。其中，左边呈红色的为原始菌株GP72，主要产物为吩嗪-1-羧酸以及2-羟基吩嗪；右边白色的为绿针假单胞菌GP72ΔphzF，主要产物为DHHA，由于GP72ΔphzF的代谢途径被阻断，无法继续生产红色的吩嗪类化合，而DHHA为白色化合物，故在平板上显乳白色。

实施例2

pykF基因体外突变体的构建-无痕敲除

根据绿针假单胞菌GP72基因组中pykF及上下游序列设计引物，上游5’-CACGAATTCCGCCGGTCCGTGAACATGTCAT-3’(EcoRI,如SEQ ID NO.9)和5’-GCAAAGACTCCTGAGTTCAAGCGCAACGAGAGG-3’(如SEQ ID NO.10)，下游5’-TCAGGAGTCTTTGCGTCCCCCTGATGCAAC-3’(如SEQ ID NO.11)和5’-AAGTCTAGACGAAGGACTGCGACAAGCCGACG-3’(XbaI，如SEQ ID NO.12)，以GP72基因组DNA为模板，扩增基因组中的相应片段。将上下游PCR产物通过融合PCR连接，并将融合PCR产物与pK18mobsacB载体分别使用XbaI和EcoRI酶切，过柱回收，使用T4连接酶连接，获得体外突变质粒并转化大肠杆菌S17。

将携带重组质粒的S17菌株充分活化，接种于含有卡那霉素50mg/L的LB培养基中，37℃，180转/分培养12h。将充分活化的GP72ΔphzF菌株接种于LB培养基中，28℃，180转/分培养12h。5000转/分收集并洗涤两种菌体，LB培养基重悬并以GP72ΔphzF：S17浓度比为3:1的比例混合与EP管中，静置1h；取混合菌液点在LB平板中，28℃培养24h；刮取长出来的混合菌落于LB中重悬，稀释涂布于卡那霉素50mg/L，氨苄霉素100mg/L的LB平板上，28℃培养2至3天后挑取单克隆涂布15％蔗糖平板中，28℃培养1至2天；挑取蔗糖平板上的单克隆，PCR验证；挑取在卡那霉素50mg/L抗性平板上不生长，但在无抗平板上能够正常生长的单菌落，即为同源重组成功的菌落。PCR验证GP72ΔphzF菌株的pykF基因被敲除，并命名为GP72ΔphzFΔpykF，电泳图见图1b。图1b中，左边基因工程菌GP72ΔphzF(L3)因为被敲除了pykF基因，因此PCR扩增产物比绿针假单胞菌GP72ΔphzF的片段要小接近1.5KBp左右。

实施例3

基因工程菌GP72ΔphzF中DHHA的生物合成

GP72ΔphzF可以在LB培养基，成分如下：

酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，氯化钠10g，去离子水1L

将活化后的GP72ΔphzF，分别接种于新鲜的LB培养基中24～30℃进行振荡培养，摇床转速100～300转/分，培养时间为24～72h后收获菌液。12000rpm离心后，上清中即含有DHHA产物。

实施例4

基因工程菌GP72ΔphzF以及GP72ΔphzFΔpykF中DHHA产量的检测

将活化后的GP72株以及其工程菌株GP72ΔphzF以及高产菌株GP72ΔphzFΔpyk，分别接种于KMB培养基(蛋白胨20.0g，甘油15.0ml，K₂HPO₄0.514g和MgSO₄0.732g每升)中，置于28℃的恒温摇床上(180转/分)培养至光密度(OD600)为0.5～2.0之间时，将上述菌液以OD₆₀₀＝0.01～1.0之间，加入到新配制的KMB培养基中，26～30℃进行振荡培养，摇床转速100～300转/分，培养时间为24～72h后收获菌液。取发酵液1mL，12000转/分离心1min，取上清液0.22微米孔径滤膜过滤。使用HPLC检测滤液中DHHA含量。

HPLC检测条件：流动相为0.1％甲酸水溶液及甲醇，色谱柱为Phenyl(5μm；4.6X250mm,GL Science Inc,Japan)，检测波长为278nm，检测条件：0～6min，85％甲酸水溶液-15％甲醇，7-17min，50％甲酸水溶液-50％甲醇，17-18min，10％甲酸水溶液-90％甲醇，18～21min，15％甲酸水溶液-85％甲醇。

检测图见图3～5。图3为绿针假单胞菌GP72培养48小时后的发酵产物HPLC检测图，产物较杂，DHHA没有明显累积；图4为基因工程菌GP72ΔphzF培养48小时后的发酵产物HPLC检测图，产物为DHHA，其保留时间为3.319min；图5为基因工程菌GP72ΔphzFΔpykF培养48小时后的发酵产物HPLC检测图，产物为DHHA，其保留时间为3.288min，其峰面积相比图4更大，产量更高，生产曲线与产量变化对比如图6，图7所示。基因工程菌GP72ΔphzFΔpykF更适合工业上的开发和应用。

实施例5

用于基因工程菌GP72ΔphzFΔpykF生产DHHA的培养基优化

通过对实例4中的培养基添加三氯化铁(0.5～4.0mM，80mg/L～650mg/L)，之后接种基因工程菌GP72ΔphzFΔpykF，发酵液中DHHA的含量会更高。如图8所示。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims

1.一种基因工程菌株，其特征在于，可由如下方法中的一种制备而得：

a、敲除了绿针假单孢菌中DHHA异构酶phzF基因，即得；

或者b、在敲除了绿针假单孢菌中DHHA异构酶phzF基因的基础上进一步敲除了绿针假单胞菌基因组中的pykF基因，即得。

2.如权利要求1所述的基因工程菌株，其特征在于，其中，所述DHHA异构酶phzF基因的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

3.如权利要求1所述的基因工程菌株，其特征在于，其中，所述DHHA异构酶phzF基因的对应蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.一种如权利要求1所述的基因工程菌株的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

扩增phzF基因上下游同源臂片段；

融合PCR连接上下游同源臂，并插入pK18mobsacB质粒中；

扩增pykF基因上下游同源臂片段；

融合PCR连接上下游同源臂，并插入pK18mobsacB质粒中；

使融合的pykF基因上下游同源臂与GP72ΔphzF基因组发生同源重组，利用蔗糖压力和抗性筛选出阳性克隆，即可；

所述pK18mobsacB质粒带有蔗糖致死基因和卡那抗性基因。

5.如权利要求4所述的基因工程菌株的制备方法，其特征在于，其中，用于敲除phzF基因的上游同源臂的碱基序列如SEQ ID NO.3以及SEQ ID NO.4所示；下游同源臂的碱基序列如SEQ ID NO.5以及SEQ ID NO.6所示。

6.如权利要求4所述的基因工程菌株的制备方法，其特征在于，其中，用于敲除pykF基因的上游同源臂的碱基序列如SEQ ID NO.9以及SEQ ID NO.10所示；下游同源臂的碱基序列如SEQ ID NO.11以及SEQ ID NO.12所示。

7.一种用于培养如权利要求1～3中任意一项所述的基因工程菌株的培养基，其特征在于，包括如下组分：甘油、蛋白胨、硫酸镁、磷酸氢二钾、葡萄糖、三氯化铁。

8.如权利要求7所述的培养基，其特征在于，包括按重量份数计的如下组分：

9.一种如权利要求1～3中任意一项所述的基因工程菌株在制备2,3-二氢-3-羟基邻氨基苯甲酸中的用途。

10.如权利要求9所述的用途，其中，所述基因工程菌株在制备2,3-二氢-3-羟基邻氨基苯甲酸时的条件为：好氧培养；温度：26～30摄氏度；pH：6～8；转速150～250rpm。