CN106635937A - 高产吩嗪‑1‑甲酰胺的基因工程菌株及其构建方法 - Google Patents
高产吩嗪‑1‑甲酰胺的基因工程菌株及其构建方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN106635937A CN106635937A CN201610704406.7A CN201610704406A CN106635937A CN 106635937 A CN106635937 A CN 106635937A CN 201610704406 A CN201610704406 A CN 201610704406A CN 106635937 A CN106635937 A CN 106635937A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- lon
- pars
- strain
- genes
- rpea
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000010276 construction Methods 0.000 title claims abstract description 11
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 title abstract description 44
- KPZYYKDXZKFBQU-UHFFFAOYSA-N phenazine-1-carboxamide Chemical compound C1=CC=C2N=C3C(C(=O)N)=CC=CC3=NC2=C1 KPZYYKDXZKFBQU-UHFFFAOYSA-N 0.000 title abstract description 12
- 101150043276 Lon gene Proteins 0.000 claims abstract description 102
- 101100235786 Rattus norvegicus Lonp1 gene Proteins 0.000 claims abstract description 97
- 101150035521 parS gene Proteins 0.000 claims abstract description 92
- 101100190292 Agarophyton chilensis rpeA gene Proteins 0.000 claims abstract description 43
- 101150089710 cpeA gene Proteins 0.000 claims abstract description 43
- 101150089899 psrA gene Proteins 0.000 claims abstract description 41
- 241001646398 Pseudomonas chlororaphis Species 0.000 claims abstract description 31
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims abstract description 13
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims abstract description 13
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims abstract description 13
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 28
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N formamide Substances NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 17
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 14
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 9
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 8
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 claims description 7
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 claims description 7
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 7
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 claims description 6
- 229940021995 DNA vaccine Drugs 0.000 claims description 6
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 6
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 5
- 239000012467 final product Substances 0.000 claims description 5
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 5
- 230000006798 recombination Effects 0.000 claims description 5
- 238000005215 recombination Methods 0.000 claims description 5
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 claims description 5
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 2
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 abstract 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 48
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 21
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 19
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical class O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 12
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 12
- 241000463496 Pseudomonas chlororaphis HT66 Species 0.000 description 9
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 description 7
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 6
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 6
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 6
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 6
- JGCSKOVQDXEQHI-UHFFFAOYSA-N phenazine-1-carboxylic acid Chemical compound C1=CC=C2N=C3C(C(=O)O)=CC=CC3=NC2=C1 JGCSKOVQDXEQHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 6-methoxy-1,2,3,4-tetrahydroquinoline Chemical compound N1CCCC2=CC(OC)=CC=C21 FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical class N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 3
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N ammonia Natural products N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000007790 scraping Methods 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 241000078280 Escherichia coli S17 Species 0.000 description 2
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 2
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 2
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 2
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 2
- 108700005075 Regulator Genes Proteins 0.000 description 2
- 206010039509 Scab Diseases 0.000 description 2
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 2
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 2
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- -1 2-20min Chemical compound 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 101100246086 Arabidopsis thaliana PUP6 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000031968 Cadaver Diseases 0.000 description 1
- 244000241235 Citrullus lanatus Species 0.000 description 1
- 235000012828 Citrullus lanatus var citroides Nutrition 0.000 description 1
- 244000241257 Cucumis melo Species 0.000 description 1
- 235000015510 Cucumis melo subsp melo Nutrition 0.000 description 1
- 240000008067 Cucumis sativus Species 0.000 description 1
- 235000010799 Cucumis sativus var sativus Nutrition 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 241000427940 Fusarium solani Species 0.000 description 1
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 241001240958 Pseudomonas aeruginosa PAO1 Species 0.000 description 1
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 1
- FJJCIZWZNKZHII-UHFFFAOYSA-N [4,6-bis(cyanoamino)-1,3,5-triazin-2-yl]cyanamide Chemical compound N#CNC1=NC(NC#N)=NC(NC#N)=N1 FJJCIZWZNKZHII-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003905 agrochemical Substances 0.000 description 1
- 230000003385 bacteriostatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 150000002825 nitriles Chemical class 0.000 description 1
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/21—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Pseudomonadaceae (F)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
- C12P17/10—Nitrogen as only ring hetero atom
- C12P17/12—Nitrogen as only ring hetero atom containing a six-membered hetero ring
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一株高产吩嗪‑1‑甲酰胺的基因工程菌株及其构建方法;所述基因工程菌株具体是敲除绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)HT66CCTCC NO:M 2013467基因组的lon基因、parS基因中的一个或两个基因而得到基因工程菌株;或者,敲除绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)HT66CCTCC NO:M 2013467rpeA、psrA单突变株或者双突变株基因组的lon基因、parS基因中的一个或两个基因而得到基因工程菌株;其中,所述单突变株为HT66ΔrpeA、HT66ΔpsrA,双突变株为HT66ΔrpeAΔpsrA。与现有技术相比,本发明从一株绿针假单胞菌出发,将该菌基因组中lon和parS基因删除后,吩嗪‑1‑甲酰胺的发酵产量高达2425mg/L,可以用于吩嗪‑1‑甲酰胺的工业化生产与农业应用。
Description
技术领域
本发明属于基因工程领域,涉及假单胞菌基因工程菌株及其构建方法,尤其是一株高产吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌株及其构建方法。
背景技术
我国常见的农作物病害生物达1600种,每年造成的损失约为1000亿人民币,严重地影响了我国农业的发展。近些年,化学农药的大规模使用导致了病虫害的抗药性不断增强。此外,高浓度和毒性的化学农药的应用,对农田、水环境也造成了很大的污染,严重威胁着我国的粮食安全和生命健康。因此,低毒性、低残留和不易产生抗药性的生物农药获得了各国政府和农药企业的极大关注。
与化学农药相比,生物农药具有毒性低、对环境友好和不易产生抗药性等明显优势,已经吸引了越来越多学者的关注并逐渐应用到生物防治实践当中。其中,上海交通大学彭华松课题组率先利用铜绿假单胞菌株M18开发出了具有广谱、高效、安全和能有效控制真菌性根腐和茎腐的生物农药吩嗪-1-羧酸(phenazine-1-carboxylic acid,简称PCA,CAS号为2538-68-3),定名为“申嗪霉素”,主要用于防治水稻纹枯病、小麦赤霉病、黄瓜和西瓜的枯萎病、甜瓜蔓枯病、辣椒根腐病等,并获得了农业部颁发的新农药药证。
但最近相关研究发现,与PCA相比,另一种吩嗪类抗生素吩嗪-1-甲酰胺(phenazine-1-carboxamide,PCN)具有更好的安全性、稳定性及对植物病原菌的抑菌活性,在防治水稻纹枯病和小麦赤霉病等方面具有重要的应用价值。据报道,目前能合成PCN的微生物菌株有绿针假单胞菌PCL1391,铜绿假单胞菌PAO1,PUPa3,PUP6,MML221等,但由于PCN产率较低,尚未能大规模推广应用。上海交通大学彭华松课题组对筛选的一株绿针假单胞菌HT66进行基因工程改造后,PCN的产量已经达到1800mg/L并申报了中国发明专利(CN201310566864.5),但是该产量距离PCN的工业化应用还存在一定的距离。因此,通过基因工程技术进一步改造该菌株将有利于提高PCN产量,实现其农业应用。
发明内容
针对现有技术中的缺陷,本发明的目的是提供一株高产吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌株及其构建方法,克服现有菌株生产吩嗪-1-甲酰胺产量和效率较低的缺陷,提供一种用于生产吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌株及其用途。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的:
第一方面,本发明涉及一株高产吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌株,具体是敲除绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)HT66 CCTCC NO:M 2013467基因组的lon基因、parS基因中的一个或两个基因而得到基因工程菌株;
或者,敲除绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)HT66 CCTCC NO:M2013467rpeA、psrA单突变株或者双突变株基因组的lon基因、parS基因中的一个或两个基因而得到基因工程菌株;其中,所述单突变株为HT66ΔrpeA、HT66ΔpsrA,双突变株为HT66ΔrpeAΔpsrA。
优选地,所述lon基因的碱基序列如SEQ ID NO.1所示;所述parS基因的碱基序列如SEQ ID NO.2所示。
优选地,所述基因工程菌株为HT66Δlon、HT66ΔparS、HT66ΔlonΔparS、HT66ΔlonΔrpeA、HT66ΔparSΔrpeA、HT66ΔlonΔparSΔrpeA、HT66ΔlonΔpsrA、HT66ΔpsrAΔparS、HT66ΔlonΔparSΔpsrA、HT66ΔlonΔparSΔpsrAΔrpeA、HT66ΔlonΔpsrAΔrpeA、HT66ΔparSΔpsrAΔrpeA。其中,所述基因工程菌株HT66Δlon是敲除绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)HT66 CCTCC NO:M 2013467基因组的lon基因而得到基因工程菌株;所述基因工程菌株HT66ΔparS是敲除绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)HT66 CCTCC NO:M 2013467基因组的parS基因而得到基因工程菌株;所述基因工程菌株HT66ΔlonΔparS是敲除绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)HT66 CCTCC NO:M2013467基因组的lon基因、parS基因而得到基因工程菌株。
更优选地,所述基因工程菌株为HT66ΔlonΔparS、HT66ΔlonΔrpeA、HT66ΔparSΔrpeA、HT66ΔlonΔparSΔrpeA、HT66ΔlonΔpsrA、HT66ΔlonΔparSΔpsrA、HT66ΔlonΔparSΔpsrAΔrpeA、HT66ΔlonΔpsrAΔrpeA。
第二方面,本发明还涉及所述高产吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌株的构建方法,具体是:敲除绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)HT66 CCTCC NO:M 2013467基因组的lon基因、parS基因中的一个基因或两个基因,即可;
或者,敲除绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)HT66 CCTCC NO:M2013467 rpeA、psrA单突变株或者双突变株基因组的lon基因、parS基因中的一个或两个基因而得到基因工程菌株;其中,所述单突变株为HT66ΔrpeA、HT66ΔpsrA,双突变株为HT66ΔrpeAΔpsrA。
优选地,所述lon基因的碱基序列如SEQ ID NO.1所示;所述parS基因的碱基序列如SEQ ID NO.2所示。
优选地,所述构建方法中,敲除绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)HT66CCTCC NO:M 2013467基因组的lon基因、parS基因中的一个基因的步骤具体包括:
i、扩增lon基因或parS基因片段的上下游同源臂;
ii、采用融合PCR法连接上下游同源臂并插入pK18mobsacB质粒中得lon基因或parS基因重组质粒;
iii、(a)使lon基因重组质粒上的lon基因上下游同源臂片段与HT66、HT66ΔparS、HT66ΔrpeA、HT66ΔrpeAΔparS、HT66ΔpsrA、HT66ΔpsrAΔparS、HT66ΔrpeAΔpsrA、HT66ΔrpeAΔpsrAΔparS基因组中的lon基因发生同源重组;
或(b)使parS基因重组质粒上的parS基因上下游同源臂片段与HT66、HT66Δlon、HT66ΔrpeA、HT66ΔrpeAΔlon、HT66ΔpsrA、HT66ΔpsrAΔlon、HT66ΔrpeAΔpsrA、HT66ΔrpeAΔpsrAΔlon基因组中的parS基因发生同源重组;
筛选阳性克隆,即得。
上述敲除中,所述pK18mobsacB质粒为假单胞菌和大肠杆菌的穿梭质粒。
第三方面,本发明提供一种基于所述基因工程菌株的吩嗪-1-甲酰胺合成方法,具体包括如下步骤:将所述基因工程菌株的种子发酵液接种于KB发酵培养基中,培养,即可。
优选地,所述种子发酵液的制备具体为:将所述基因工程菌株接种于KB培养基中,置于28℃、180转/分下培养至OD600为0.5~2.0,即得。
优选地,所述培养的条件具体为:24~30℃、100~300转/分钟、24~72h。
优选地,所述种子发酵液与所述KB发酵培养基的体积比为(1~10):100。
与现有技术相比,本发明的具备如下有益效果:
本发明具体是以绿针假单胞菌HT66为出发菌株,通过基因工程技术从HT66菌株基因组中分别或者同时敲除吩嗪合成过程中的lon、parS负调控基因,构建HT66Δlon、HT66ΔparS、HT66ΔlonΔparS基因工程菌株,使得吩嗪-1-甲酰胺(phenazine-1-carboxamide,CAS号为550-89-0,简称PCN)的产量大幅提高,能够更加有效由于生物防治。其中,基因工程菌株HT66ΔlonΔparS具有最佳效果。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述,本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显:
图1为绿针假单胞菌HT66和lon敲除突变株中分别以内外部引物PCR扩增lon基因及其上下游片段的电泳图;
其中,从左到右依次为marker,HT66Δlon,HT66,空白对照;
图2为HT66Δlon、HT66ΔparS、HT66ΔlonΔparS基因工程菌的生长曲线图;
图3为HT66HT66Δlon、HT66ΔparS、HT66ΔlonΔparS基因工程菌的吩嗪-1-甲酰胺产量图;
图4为HT66ΔlonΔrpeA基因工程菌的生长曲线图;
图5为HT66ΔlonΔrpeA基因工程菌的吩嗪-1-甲酰胺产量图;
图6为HT66ΔparSΔrpeA基因工程菌的生长曲线图;
图7为HT66ΔparSΔrpeA基因工程菌的吩嗪-1-甲酰胺产量图;
图8为HT66ΔlonΔparSΔrpeA基因工程菌的生长曲线图;
图9为HT66ΔlonΔparSΔrpeA基因工程菌的吩嗪-1-甲酰胺产量图;
图10为HT66ΔlonΔpsrA基因工程菌的生长曲线图;
图11为HT66ΔlonΔpsrA基因工程菌的吩嗪-1-甲酰胺产量图;
图12为HT66ΔpsrAΔparS基因工程菌的生长曲线图;
图13为HT66ΔpsrAΔparS基因工程菌的吩嗪-1-甲酰胺产量图;
图14为HT66ΔlonΔparSΔpsrA基因工程菌的生长曲线图;
图15为HT66ΔlonΔparSΔpsrA基因工程菌的吩嗪-1-甲酰胺产量图;
图16为HT66ΔlonΔparSΔpsrAΔrpeA基因工程菌的吩嗪-1-甲酰胺产量图;
图17为HT66ΔlonΔpsrAΔrpeA基因工程菌的吩嗪-1-甲酰胺产量图;
图18为HT66ΔparSΔpsrAΔrpeA基因工程菌的吩嗪-1-甲酰胺产量图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明,但不以任何形式限制本发明。应当指出的是,对本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
本发明的绿针假单胞菌(Pseudomonas choloraphis)HT66,该菌株已在中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)保藏,保藏单位地址为:中国.武汉.武汉大学,邮编为:430072,保藏日期为:2013年10月12日,保藏编号为:CCTCC NO:M 2013467。
实施例1、lon基因体外突变体的构建
根据绿针假单胞菌HT66基因组中lon基因及其上下游序列设计引物(见表1):
表1
以该基因组DNA为模板,扩增基因组中的相应片段。
将上下游PCR产物通过融合PCR连接,并将融合PCR产物与pK18mobsacB载体分别使用EcoRI和XbaI酶切,过柱回收,使用T4连接酶连接,获得体外突变质粒。
用体外突变质粒转化大肠杆菌S17。将携带重组质粒的S17菌株充分活化,接种于含有卡那霉素50mg/L的LB培养基中,37℃,180转/分培养12h。将充分活化的HT66菌株接种于LB培养基中,28℃,180转/分培养12h。5000转/分收集并洗涤两种菌体,LB培养基重悬并以HT66:S17浓度比为3:1的比例混合与EP管中,静置1h;取混合菌液点在LB平板中,28℃培养24h;刮取长出来的混合菌落于LB中重悬,稀释涂布于卡那霉素50mg/L,氨苄霉素100mg/L的LB平板上,28℃培养2~3d后挑取单克隆涂布10%蔗糖平板中,28℃培养1~2d;挑取蔗糖平板上的单克隆,分别点在卡那霉素50mg/L的抗性LB平板及无抗LB平板上,培养12~24h;挑取在卡那霉素50mg/L抗性平板上不生长,但在无抗平板上能够正常生长的单菌落,即为同源重组成功的菌落。PCR验证HT66菌株的lon基因被敲除,并命名为HT66Δlon。
图1为绿针假单胞菌HT66和lon敲除突变株中分别以内外部引物PCR扩增lon基因及其上下游片段的电泳图;其中,M,Marker;Δ,lon基因敲除株HT66Δlon;WT,野生株HT66;N,空白对照组。左侧引物为内部引物lon-F/lon-R,右侧引物为外部引物lon-F1/lon-R2。内外部引物扩增结果表明,lon基因已被成功敲除。
实施例2、parS基因体外突变体的构建
根据绿针假单胞菌HT66基因组中parS及上下游序列设计引物(见表2):
表2
以该基因组DNA为模板,扩增基因组中的相应片段。
将上下游PCR产物通过融合PCR连接,并将融合PCR产物与pK18mobsacB载体分别使用BamHI和HindIII酶切,过柱回收,使用T4连接酶连接,获得体外突变质粒。
用所得体外突变质粒转化大肠杆菌S17。将携带重组质粒的S17菌株充分活化,接种于含有卡那霉素50mg/L的LB培养基中,37℃,180转/分培养12h。将充分活化的HT66菌株接种于LB培养基中,28℃,180转/分培养12h。5000转/分收集并洗涤两种菌体,LB培养基重悬并以HT66:S17浓度比为3:1的比例混合与EP管中,静置1h;取混合菌液点在LB平板中,28℃培养24h;刮取长出来的混合菌落于LB中重悬,稀释涂布于卡那霉素50mg/L,氨苄霉素100mg/L的LB平板上,28℃培养2~3d后挑取单克隆涂布10%蔗糖平板中,28℃培养1~2d;挑取蔗糖平板上的单克隆,分别点在卡那霉素50mg/L的抗性LB平板及无抗LB平板上,培养12~24h;挑取在卡那霉素50mg/L抗性平板上不生长,但在无抗平板上能够正常生长的单菌落,即为同源重组成功的菌落。PCR验证HT66菌株的parS基因被敲除,并命名为HT66ΔparS。
实施例3、lon和parS双突变株HT66ΔlonΔparS的构建
将携带parS重组质粒的S17菌株充分活化,接种于含有卡那霉素50mg/L的LB培养基中,37℃,180转/分培养12h。将充分活化的HT66Δlon菌株接种于LB培养基中,28℃,180转/分培养12h。5000转/分收集并洗涤两种菌体,LB培养基重悬并以HT66Δlon:S17浓度比为3:1的比例混合与EP管中,静置1h;取混合菌液点在LB平板中,28℃培养24h;刮取长出来的混合菌落于LB中重悬,稀释涂布于卡那霉素50mg/L,氨苄霉素100mg/L的LB平板上,28℃培养2~3d后挑取单克隆涂布10%蔗糖平板中,28℃培养1~2d;挑取蔗糖平板上的单克隆,分别点在卡那霉素50mg/L的抗性LB平板及无抗LB平板上,培养12~24h;挑取在卡那霉素50mg/L抗性平板上不生长,但在无抗平板上能够正常生长的单菌落,即为同源重组成功的菌落。PCR验证HT66Δlon菌株的parS基因被敲除,并命名为HT66ΔlonΔparS。
实施例4、假单胞菌HT66及基因工程菌株HT66ΔlonΔparS的生长曲线测定
将菌株充分活化并接种于新鲜的KB培养基中,培养过夜后以最初OD600为0.02的浓度接种于发酵培养基,28℃,180转/分培养2~3d,并以一定的时间间隔测定菌液OD600。
图2为绿针假单胞菌HT66及其不同基因工程菌株的生长曲线。由图可知,敲除parS基因对菌株的生长影响不打;敲除lon基因会使菌株稳定期的OD600值略微下降,其中以双敲除株HT66ΔlonΔparS的稳定期OD600值最低,说明两个基因对菌体的生长有着复杂的影响。
实施例5、基因工程菌HT66ΔlonΔparS中PCN的生物合成
将活化后的绿针假单胞菌HT66及其基因工程菌株HT66ΔparS、HT66Δlon、HT66ΔlonΔparS分别接种于KB培养基中,置于28℃恒温摇床(180转/分)培养至OD600为0.5~2.0之间时,将上述菌液以1~10:100的体积比,加入到新鲜的KB发酵培养基中,24~30℃振荡培养,摇床转速100~300转/分钟,培养24~72h后收取菌液。取发酵液0.5mL加入3mL乙酸乙酯充分萃取后,取0.2mL有机相吹干后用乙腈溶解,并通过HPLC检测发酵液中吩嗪-1-甲酰胺产量。
HPLC检测条件:
流动相为乙腈-25mM乙酸铵,色谱柱为WondaSilC18-WRreversephasecolumn(5μm;4.6X250mm,Shimadzu,Japan),检测波长为254nm,检测条件:0~2min,8%乙腈-92%25mM乙酸铵,2-20min,乙腈浓度从8%升至60%,乙酸铵浓度从92%下降至40%,20~21min,8%乙腈-92%25mM乙酸铵。
图3为绿针假单胞菌HT66不同基因工程菌株及野生株中吩嗪-1-甲酰胺的产量变化图。由图可知,敲除parS基因导致了PCN的产量由野生株的425mg/L上升到1102mg/L,敲除lon基因使PCN的产量由野生株的425mg/L上升到2053mg/L;两个基因的双突变株中PCN产量达到2425mg/L,为野生株的5.71倍。
实施例6
本实施例提供了一株高产吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌株,具体是通过敲除绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)HT66 CCTCC NO:M 2013467rpeA、psrA单突变株或者双突变株基因组的lon基因、parS基因中的一个或两个基因而得到基因工程菌株;
其中,绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)HT66 CCTCC NO:M 2013467rpeA、psrA单突变株分为HT66ΔrpeA、HT66ΔpsrA,双突变株为HT66ΔrpeAΔpsrA;上述单突变株及双突变株相关信息公开于在先申请CN 103642714 A中。
参照实施例1至3提供的方法,将基因工程菌株HT66ΔrpeA、HT66ΔpsrA、HT66ΔrpeAΔpsrA的lon基因、parS基因中的一个进行敲除或者两个同时敲除,即得;包括基因工程菌株HT66ΔlonΔrpeA、HT66ΔparSΔrpeA、HT66ΔlonΔparSΔrpeA、HT66ΔlonΔpsrA、HT66ΔpsrAΔparS、HT66ΔlonΔparSΔpsrA、HT66ΔlonΔparSΔpsrAΔrpeA、HT66ΔlonΔpsrAΔrpeA、HT66ΔparSΔpsrAΔrpeA。上述基因工程菌株生长情况及PCN产量情况如图4至图18所示。其中:
图4为HT66ΔlonΔrpeA基因工程菌的生长曲线图;
图5为HT66ΔlonΔrpeA基因工程菌的吩嗪-1-甲酰胺产量图;
图6为HT66ΔparSΔrpeA基因工程菌的生长曲线图;
图7为HT66ΔparSΔrpeA基因工程菌的吩嗪-1-甲酰胺产量图;
图8为HT66ΔlonΔparSΔrpeA基因工程菌的生长曲线图;
图9为HT66ΔlonΔparSΔrpeA基因工程菌的吩嗪-1-甲酰胺产量图;
图10为HT66ΔlonΔpsrA基因工程菌的生长曲线图;
图11为HT66ΔlonΔpsrA基因工程菌的吩嗪-1-甲酰胺产量图;
图12为HT66ΔpsrAΔparS基因工程菌的生长曲线图;
图13为HT66ΔpsrAΔparS基因工程菌的吩嗪-1-甲酰胺产量图;
图14为HT66ΔlonΔparSΔpsrA基因工程菌的生长曲线图;
图15为HT66ΔlonΔparSΔpsrA基因工程菌的吩嗪-1-甲酰胺产量图;
图16为HT66ΔlonΔparSΔpsrAΔrpeA基因工程菌的吩嗪-1-甲酰胺产量图;
图17为HT66ΔlonΔpsrAΔrpeA基因工程菌的吩嗪-1-甲酰胺产量图;
图18为HT66ΔparSΔpsrAΔrpeA基因工程菌的吩嗪-1-甲酰胺产量图。
本发明具体是以绿针假单胞菌HT66为出发菌株,通过基因工程技术从HT66菌株及其已知突变株基因组中分别或者同时敲除吩嗪合成过程中的lon、parS负调控基因,构建lon、parS基因单基因突变株或双基因工程菌株,使得吩嗪-1-甲酰胺(phenazine-1-carboxamide,CAS号为550-89-0,简称PCN)的产量大幅提高,能够更加有效由于生物防治。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是,本发明并不局限于上述特定实施方式,本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改,这并不影响本发明的实质内容。
Claims (10)
1.一株高产吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌株,其特征在于,具体是敲除绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)HT66CCTCC NO:M 2013467基因组的lon基因、parS基因中的一个或两个基因而得到基因工程菌株;
或者,敲除绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)HT66CCTCC NO:M2013467rpeA、psrA单突变株或者双突变株基因组的lon基因、parS基因中的一个或两个基因而得到基因工程菌株;其中,所述单突变株为HT66ΔrpeA、HT66ΔpsrA,双突变株为HT66ΔrpeAΔpsrA。
2.根据权利要求1所述的高产吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌株,其特征在于,所述lon基因的碱基序列如SEQ ID NO.1所示;所述parS基因的碱基序列如SEQ ID NO.2所示。
3.根据权利要求1所述的高产吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌株,其特征在于,所述基因工程菌株包括HT66Δlon、HT66ΔparS、HT66ΔlonΔparS、HT66ΔlonΔrpeA、HT66ΔparSΔrpeA、HT66ΔlonΔpsrA、HT66ΔpsrAΔparS、HT66ΔlonΔparSΔrpeA、HT66ΔlonΔparSΔpsrA、HT66ΔlonΔpsrAΔrpeA、HT66ΔparSΔpsrAΔrpeA、HT66ΔlonΔparSΔpsrAΔrpeA。
4.根据权利要求3所述的高产吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌株,其特征在于,所述基因工程菌株为HT66ΔlonΔparS、HT66ΔlonΔrpeA、HT66ΔparSΔrpeA、HT66ΔlonΔparSΔrpeA、HT66ΔlonΔpsrA、HT66ΔlonΔparSΔpsrA、HT66ΔlonΔparSΔpsrAΔrpeA、HT66ΔlonΔpsrAΔrpeA。
5.一种根据权利要求1所述高产吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌株的构建方法,其特征在于,具体是:敲除绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)HT66CCTCC NO:M2013467基因组的lon基因、parS基因中的一个基因或两个基因,即可;
或者,敲除绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)HT66CCTCC NO:M2013467rpeA、psrA单突变株或者双突变株基因组的lon基因、parS基因中的一个或两个基因而得到基因工程菌株;其中,所述单突变株为HT66ΔrpeA、HT66ΔpsrA,双突变株为HT66ΔrpeAΔpsrA。
6.根据权利要求5所述高产吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌株的构建方法,其特征在于,所述构建方法包括:
i、扩增lon基因或parS基因片段的上下游同源臂;
ii、采用融合PCR法连接上下游同源臂并插入pK18mobsacB质粒中得lon基因或parS基因重组质粒;
iii、(a)使lon基因重组质粒上的lon基因上下游同源臂片段与HT66、HT66ΔparS、HT66ΔrpeA、HT66ΔrpeAΔparS、HT66ΔpsrA、HT66ΔpsrAΔparS、HT66ΔrpeAΔpsrA、HT66ΔrpeAΔpsrAΔparS基因组中的lon基因发生同源重组;
或(b)使parS基因重组质粒上的parS基因上下游同源臂片段与HT66、HT66Δlon、HT66ΔrpeA、HT66ΔrpeAΔlon、HT66ΔpsrA、HT66ΔpsrAΔlon、HT66ΔrpeAΔpsrA、HT66ΔrpeAΔpsrAΔlon基因组中的parS基因发生同源重组;
筛选阳性克隆,即得。
7.一种基于权利要求1至4任一项所述基因工程菌株的吩嗪-1-甲酰胺合成方法,其特征在于,具体包括如下步骤:将所述基因工程菌株的种子发酵液接种于KB发酵培养基中培养,即可。
8.根据权利要求7所述的基因工程菌株的吩嗪-1-甲酰胺合成方法,其特征在于,所述种子发酵液的制备具体为:将所述基因工程菌株接种于KB培养基中,置于28℃、180转/分下培养至OD600为0.5~2.0,即得。
9.根据权利要求7所述的基因工程菌株的吩嗪-1-甲酰胺合成方法,其特征在于,所述培养的条件具体为:24~30℃、100~300转/分钟、24~72h。
10.根据权利要求7所述的基因工程菌株的吩嗪-1-甲酰胺合成方法,其特征在于,所述种子发酵液与所述KB发酵培养基的体积比为(1~10):100。
Priority Applications (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201610704406.7A CN106635937B (zh) | 2016-08-22 | 2016-08-22 | 高产吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌株及其构建方法 |
PCT/CN2017/098480 WO2018036479A1 (zh) | 2016-08-22 | 2017-08-22 | 高产吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌株及其构建方法和用途 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201610704406.7A CN106635937B (zh) | 2016-08-22 | 2016-08-22 | 高产吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌株及其构建方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN106635937A true CN106635937A (zh) | 2017-05-10 |
CN106635937B CN106635937B (zh) | 2024-01-30 |
Family
ID=58851871
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201610704406.7A Active CN106635937B (zh) | 2016-08-22 | 2016-08-22 | 高产吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌株及其构建方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN106635937B (zh) |
Cited By (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2018036479A1 (zh) * | 2016-08-22 | 2018-03-01 | 上海交通大学 | 高产吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌株及其构建方法和用途 |
CN108795834A (zh) * | 2018-06-01 | 2018-11-13 | 西北大学 | 一种减毒的铜绿假单胞菌基因工程菌及其构建方法和应用 |
CN112094796A (zh) * | 2020-09-25 | 2020-12-18 | 齐鲁工业大学 | 一种用于生产2-羟基-吩嗪的工程菌株及应用 |
CN112111441A (zh) * | 2020-09-25 | 2020-12-22 | 齐鲁工业大学 | 一株高产吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌株及其构建方法和应用 |
CN112111440A (zh) * | 2020-09-25 | 2020-12-22 | 齐鲁工业大学 | 用于生产吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌及其制备方法和用途 |
CN112126611A (zh) * | 2020-09-25 | 2020-12-25 | 齐鲁工业大学 | 一株高产吩嗪-1-羧酸的基因工程菌株及其构建方法和应用 |
CN114057657A (zh) * | 2021-12-14 | 2022-02-18 | 上海农乐生物制品股份有限公司 | 一种吩嗪-1-甲酰胺的提纯方法 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103642714A (zh) * | 2013-11-13 | 2014-03-19 | 上海交通大学 | 用于生产吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌株及其用途 |
CN104017744A (zh) * | 2013-11-07 | 2014-09-03 | 上海交通大学 | 抗病促生的绿针假单胞菌剂的制备方法与用途 |
-
2016
- 2016-08-22 CN CN201610704406.7A patent/CN106635937B/zh active Active
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104017744A (zh) * | 2013-11-07 | 2014-09-03 | 上海交通大学 | 抗病促生的绿针假单胞菌剂的制备方法与用途 |
CN103642714A (zh) * | 2013-11-13 | 2014-03-19 | 上海交通大学 | 用于生产吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌株及其用途 |
Non-Patent Citations (8)
Cited By (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2018036479A1 (zh) * | 2016-08-22 | 2018-03-01 | 上海交通大学 | 高产吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌株及其构建方法和用途 |
CN108795834A (zh) * | 2018-06-01 | 2018-11-13 | 西北大学 | 一种减毒的铜绿假单胞菌基因工程菌及其构建方法和应用 |
CN112094796A (zh) * | 2020-09-25 | 2020-12-18 | 齐鲁工业大学 | 一种用于生产2-羟基-吩嗪的工程菌株及应用 |
CN112111441A (zh) * | 2020-09-25 | 2020-12-22 | 齐鲁工业大学 | 一株高产吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌株及其构建方法和应用 |
CN112111440A (zh) * | 2020-09-25 | 2020-12-22 | 齐鲁工业大学 | 用于生产吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌及其制备方法和用途 |
CN112126611A (zh) * | 2020-09-25 | 2020-12-25 | 齐鲁工业大学 | 一株高产吩嗪-1-羧酸的基因工程菌株及其构建方法和应用 |
CN112111440B (zh) * | 2020-09-25 | 2022-03-04 | 齐鲁工业大学 | 用于生产吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌及其制备方法和用途 |
CN114057657A (zh) * | 2021-12-14 | 2022-02-18 | 上海农乐生物制品股份有限公司 | 一种吩嗪-1-甲酰胺的提纯方法 |
CN114057657B (zh) * | 2021-12-14 | 2024-03-22 | 无锡秋可生物科技有限公司 | 一种吩嗪-1-甲酰胺的提纯方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN106635937B (zh) | 2024-01-30 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN106635937A (zh) | 高产吩嗪‑1‑甲酰胺的基因工程菌株及其构建方法 | |
CN103642714B (zh) | 用于生产吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌株及其用途 | |
CN110157623B (zh) | 一种镰刀菌菌株及其发酵生产d-泛解酸内酯水解酶的方法 | |
CN106635938A (zh) | 用于生产2‑羟基吩嗪的基因工程菌株及其制备方法和用途 | |
CN110257420A (zh) | 基于CasRx的植物基因沉默载体及其构建方法和应用 | |
CN105420154A (zh) | 双基因敲除重组红球菌、构建方法及其应用 | |
CN105368866A (zh) | 改良ATMT在构建深绿木霉T23△Crel中的应用 | |
CN108359631B (zh) | 一种木霉厚垣孢子的生产方法 | |
CN113403299A (zh) | 一种选育高产抗菌脂肽的枯草芽孢杆菌的方法 | |
CN103952429B (zh) | 一种基因工程恶臭假单胞菌及其构建方法与应用 | |
CN104946552B (zh) | 安全高效生产申嗪霉素的基因工程菌株及其应用 | |
CN105886422A (zh) | 枯草芽孢杆菌by7及其降解残饵和氨氮的应用 | |
CN103525748A (zh) | 哈茨木霉厚垣孢子的生产方法 | |
CN103834681B (zh) | 一种农杆菌介导遗传转化稻曲菌的方法 | |
WO2018036479A1 (zh) | 高产吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌株及其构建方法和用途 | |
CN106282222B (zh) | 一种农杆菌介导的寡雄腐霉遗传转化方法 | |
CN104152483A (zh) | argJ基因在发酵生产L-瓜氨酸中的应用 | |
CN106520572A (zh) | 一种香椿内生真菌56‑50及其次级代谢产物、制备方法和应用 | |
CN105349441A (zh) | 高产孢子的木霉菌T23-Ovel1菌株及其构建方法 | |
CN105524849B (zh) | 一株不依赖于甲硫氨酸的头孢菌素高产基因工程菌株的构建及其应用 | |
CN104862237B (zh) | 一株含有人工锌指转录因子的里氏木霉重组菌株及其应用 | |
CN104894115B (zh) | 一种具有高效同源重组能力的土曲霉及其构建方法与应用 | |
CN105062906B (zh) | 一种优化有机磷水解酶酵母工程菌及其酶的生产方法 | |
CN106010999A (zh) | 基因工程菌株、培养方法及该基因工程菌株的用途 | |
CN114480436A (zh) | 一种提高罗伯茨绿僵菌杀虫毒力的方法和菌株及应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |