CN114057657A - 一种吩嗪-1-甲酰胺的提纯方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种吩嗪‑1‑甲酰胺(PCN)的提纯方法,涉及微生物源农药杀菌剂的合成与制备技术领域。包括以下步骤:(1)PCN发酵液菌体富集后破碎菌体细胞壁得到菌体破碎液;(2)采用过滤方式截留菌体破碎液中大分子物质,得到胞内溶出液;(3)选择检测器并确定检测波长,将胞内溶出液与离子液体缓冲溶液混合后,以毛细管为分离通道并以高压直流电场为驱动力,分离胞内溶出液,制备得到高纯度的PCN。本发明制备的PCN纯度达97.6~98.9%,该提纯工艺简化了生产流程,避免了有机溶剂的消耗量和残留,降低投资成本和运行成本,提高了产品的收率,解决了PCN由于粘度高而提取较难的技术问题。

Description

一种吩嗪-1-甲酰胺的提纯方法
技术领域
本发明涉及农药技术领域,更具体地,涉及微生物源农药杀菌剂的合成与制备技术领域,为一种吩嗪-1-甲酰胺(PCN)的提纯方法。
背景技术
申嗪霉素是一种新型微生物源农药,具有高效、安全、广谱及环境友好等特点,其主要成分是甜瓜根际促生菌M18产生的次级代谢产物吩嗪-1-羧酸(PCA),申嗪霉素可有效控制多种稻麦果蔬等作物真菌性、细菌性和线虫引起的各种病害,并且同时具有促进植物生长的作用,得到有关省市农业植保部门和全国农技推广服务中心的充分肯定,作为一种高效、安全、广谱及环境友好的新型微生物源农药,在当前“农药使用量零增长行动”以及农业发展对环境要求越来越严格的大趋势大背景下,应用前景非常广阔。
最近的研究发现,另一种吩嗪类抗生素吩嗪-1-甲酰胺(PCN)较吩嗪-1-羧酸(PCA)具有更好的安全性、稳定性以及对植物病原菌的抑菌活性,同时较之PCA,PCN的抗真菌的活性不受使用环境的pH值的影响,在pH中性和碱性环境中,PCN抗真菌的活性是PCA得5~10倍。但由于PCN为胞内产物,而且发酵液中PCN在提取时受粘度影响较难提取,尚未能大规模推广应用。目前发酵液中的PCN主要是通过有机溶剂提纯,造成有机溶剂的消耗量大且残留,不利于工业化生产,鉴于此,找出一种新的PCN发酵液的提纯方法至关重要。
发明内容
针对上述技术中存在的不足之处,本发明提供了一种工艺安全、制备便捷、降低成本的吩嗪-1-甲酰胺(PCN)的提纯方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下:
一种吩嗪-1-甲酰胺的提纯方法,包括以下步骤:
(1)PCN发酵液菌体富集后破碎菌体细胞壁得到菌体破碎液;
(2)采用过滤方式截留菌体破碎液中大分子物质,得到胞内溶出液;
(3)选择检测器并确定检测波长,将胞内溶出液与离子液体缓冲溶液混合后,以毛细管为分离通道并以高压直流电场为驱动力,分离胞内溶出液,制备得到高纯度的PCN。
所述PCN发酵液制备方式为:PCN发酵菌种经活化12~24h后得到PCN种子液,将上述种子液以1%~4%的接种量接种于黄豆粉发酵培养液中进行发酵培养,在25~30℃中发酵培养48~72h即可得到一定发酵效价的PCN发酵液;所述的破碎菌体细胞壁可采用反复冻融法或者酶溶解破碎法实现细胞壁的破碎,使胞内物得以溶出。
优选地,所述步骤(2)中的过滤方式为先用滤布去除菌体破碎液中的滤渣,再将其透过超滤膜使得胞内液富集在超滤截留液中,得到PCN富集的胞内溶出液。
优选地,所述步骤(2)中超滤膜的孔径为50~100nm。
优选地,所述步骤(3)中所用检测器为紫外可见检测器,其检测波长为248nm。
优选地,所述步骤(3)中所用缓冲溶液为1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐(1B-3MI-TFB)离子液体,其浓度为8~11mmol/L。
优选地,所述步骤(3)中胞内溶出液分离温度为27~32℃,分离电压为18~23KV,进样压力为0.5~1psi,进样时间为5~10s。
优选地,所述步骤(3)中分离时间为6~10min,PCN收率达82.3%~88.7%,PCN纯度达97.6%~98.9%。
如无特殊说明,本发明中使用的原料均可通过市售购买获得或通过本领域常规通用的方法获得。
本发明的有益效果如下:
(1)本发明将毛细管电泳法应用到PCN的分离提纯,使抗生素依据自身所带电荷及大小等原因在缓冲溶液中以不同的迁移速率移动,在不同的时间到达检测窗口而实现分离。该方法避免了有机溶剂的残留;
(2)本发明所用的缓冲液为离子液体,该液体可良好的参与PCN的分离过程,同时不与胞内溶出液发生任何的反应,且能通过离子相互作用来掩盖毛细管内壁,同时还有烷基链的疏水作用力,其热稳定性好,能减少毛细管内壁吸附,得到稳定的电渗流和非常好的迁移时间重现性,改善抗生素分离度;
(3)本发明得到的PCN的收率达82.3%~88.7%,PCN纯度达97.6%~98.9%,市场应用性前景好;
(4)提纯工艺简化了生产流程,避免了有机溶剂的消耗量和残留,降低投资成本和运行成本,提高了产品的收率和纯度,解决了PCN由于粘度高而提取较难的技术问题。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明,下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解,下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的,不应以此限制本发明的保护范围。
实施例1
一种吩嗪-1-甲酰胺(PCN)的提纯方法,具体步骤如下:
(1)胞内溶出液的制备:先用滤布去除经细胞破碎后得到的菌体破碎液中的滤渣,再将其透过50nm孔径的超滤膜,得到PCN富集的胞内溶出液。
(2)毛细管电泳参数条件的构建:紫外可见检测器的检测波长为248nm,样品分离温度为28℃,缓冲液为8mmol/L的1B-3MI-TFB。
(3)PCN的分离提纯:将PCN富集的胞内溶出液在1psi的压力下注入毛细管,进样时间为5s,在18KV的电压下电泳分离,分离时间为6min,制备得到的PCN收率达88.7%,纯度达98.9%。
实施例2
一种吩嗪-1-甲酰胺(PCN)的提纯方法,具体步骤如下:
(1)胞内溶出液的制备:先用滤布去除经细胞破碎后得到的菌体破碎液中的滤渣,再将其透过75nm孔径的超滤膜,得到PCN富集的胞内溶出液。
(2)毛细管电泳参数条件的构建:紫外可见检测器的检测波长为248nm,样品分离温度为30℃,缓冲液为10mmol/L的1B-3MI-TFB。
(3)PCN的分离提纯:将PCN富集的胞内溶出液在0.8psi的压力下注入毛细管,进样时间为8s,在18KV的电压下电泳分离,分离时间为8min,制备得到的PCN收率达85.8%,纯度达98.1%。
实施例3
一种吩嗪-1-甲酰胺(PCN)的提纯方法,具体步骤如下:
(1)胞内溶出液的制备:先用滤布去除经细胞破碎后得到的菌体破碎液中的滤渣,再将其透过100nm孔径的超滤膜,得到PCN富集的胞内溶出液。
(2)毛细管电泳参数条件的构建:紫外可见检测器的检测波长为248nm,样品分离温度为28℃,缓冲液为11mmol/L的1B-3MI-TFB。
(3)PCN的分离提纯:将PCN富集的胞内溶出液在0.5psi的压力下注入毛细管,进样时间为10s,在18KV的电压下电泳分离,分离时间为10min,制备得到的PCN收率达82.3%,纯度达97.6%。
应说明的是,以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制,尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明,本领域的普通技术人员应当理解的是,对本发明的技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的精神和范围,其均应涵盖在本发明的权利要求范围之内。

Claims (7)

1.一种吩嗪-1-甲酰胺(PCN)的提纯方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)PCN发酵液菌体富集后破碎菌体细胞壁得到菌体破碎液;
(2)采用过滤方式截留菌体破碎液中大分子物质,得到胞内溶出液;
(3)选择检测器并确定检测波长,将胞内溶出液与离子液体缓冲溶液混合后,以毛细管为分离通道并以高压直流电场为驱动力,分离胞内溶出液,制备得到高纯度的PCN。
2.根据权利要求1所述的一种吩嗪-1-甲酰胺(PCN)的提纯方法,其特征在于,所述步骤(2)中的过滤方式为先用滤布去除菌体破碎液中的滤渣,再将其透过超滤膜使得胞内液富集在超滤截留液中,得到PCN富集的胞内溶出液。
3.根据权利要求2所述的一种吩嗪-1-甲酰胺(PCN)的提纯方法,其特征在于,所述步骤(2)中超滤膜的孔径为50~100nm。
4.根据权利要求1所述的一种吩嗪-1-甲酰胺(PCN)的提纯方法,其特征在于,所述步骤(3)中所用检测器为紫外可见检测器,其检测波长为248nm。
5.根据权利要求1所述的一种吩嗪-1-甲酰胺(PCN)的提纯方法,其特征在于,所述步骤(3)中所用缓冲溶液为1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐(1B-3MI-TFB)离子液体,其浓度为8~11mmol/L。
6.根据权利要求1所述的一种吩嗪-1-甲酰胺(PCN)的提纯方法,其特征在于,所述步骤(3)中胞内溶出液分离温度为27~31℃,分离电压为18~23KV,进样压力为0.5~1psi,进样时间为5~10s。
7.根据权利要求1所述的一种吩嗪-1-甲酰胺(PCN)的提纯方法,其特征在于,所述步骤(3)中分离时间为6~10min,PCN收率达82.3%~88.7%,PCN纯度达97.6~98.9%。
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