CN102453065B

CN102453065B - 一种去除喷司他丁发酵液中杂质的方法

Info

Publication number: CN102453065B
Application number: CN201010526100.XA
Authority: CN
Inventors: 李继安; 刘文静; 卢亮
Original assignee: Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry
Current assignee: Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry
Priority date: 2010-10-29
Filing date: 2010-10-29
Publication date: 2014-12-17
Anticipated expiration: 2030-10-29
Also published as: CN102453065A

Abstract

本发明公开了一种去除喷司他丁发酵液中杂质的方法包括如下步骤：将经离心的喷司他丁发酵液的上清液，过截流分子量为5000～20000的超滤膜，之后将超滤液过截流分子量为500～2000的纳滤膜，再将纳滤液过截流分子量为100～200的纳滤膜，得滤液即可。该方法操作方便、工艺步骤简单、不要特别加入有机溶剂，分离效果良好，适合工业化生产。

Description

一种去除喷司他丁发酵液中杂质的方法

技术领域

本发明涉及一种去除喷司他丁发酵液中杂质的方法。

背景技术

喷司他丁(Pentostatin)于1974年由Woo等从Streptomyces antiboticus培养液中分离得到，是一种极强的腺苷脱氨酶(ADA)抑制剂。喷司他丁与ADA的亲和力很高，可与ADA紧密结合，抑制ADA的活性，而使细胞脱氧腺苷三磷酸(dATP)水平增高，dATP通过抑制核糖核苷酸还原酶阻断DNA合成。另外，喷司他丁还能抑制RNA合成并增强对DNA的损伤。1998年2月美国FDA正式批准了注射用喷司他丁(商品名Nipent)上市，主要用于干细胞白血病(Hairy cell leukemia，HCL)以及慢性淋巴细胞白血病(Chroniclymphocytic leukemia，CLL)和蕈样霉菌病(Mycosis fungoides)的治疗。

但是，现有技术对于喷司他丁的分离纯化工艺，国内外的研究并不多，USP5463035中报道的喷司他丁的预处理方法是将发酵液高速离心，滤液用氢氧化钠等碱性溶液调pH到8.7，置于＜15℃环境中数小时或数天(视体积大小而定)，过滤，滤液调pH至6.0，再经Dowex-50树脂进一步除杂。此法虽然也能取得一定的效果，但操作步骤繁琐，有机溶媒使用量大，环境污染严重，非常不利于工业化生产。

喷司他丁的发酵液由于杂质较多，滤液混浊，目前现有技术中还没有一种简单、有效的方法能够将发酵液的杂质去除，并将发酵液中喷司他丁的纯度提到较高的水平，该现状亟待解决。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服了现有的预处理喷司他丁发酵液预处理方法存在操作步骤繁琐，有机溶媒使用量大，环境污染严重的缺陷，提供了一种操作方便、工艺步骤简单、不要特别加入有机溶剂，能够有效去除喷司他丁发酵液中杂质的方法。

本发明的去除喷司他丁发酵液中杂质的方法包括如下步骤：将经离心的喷司他丁发酵液的上清液，过截流分子量为5000～20000的超滤膜，之后将超滤液过截流分子量为500～2000的纳滤膜，再将纳滤液过截流分子量为100～200的纳滤膜，得滤液即可。

本发明中，所述的喷司他丁发酵液为本领域常规制备喷司他丁的微生物菌发酵液，一般由Streptomyces antiboticus按本领域常规方法发酵培养获得。所述的Streptomyces antiboticus具体菌种没有特殊限定，常规能够生产喷司他丁的菌种均可使用，如Streptomyces antiboticus NRRL3238等。其中，所述的Streptomyces antiboticus经培养发酵获得含喷司他丁发酵液具体菌种不受限定是鉴于目前产生喷司他丁的菌种均为Streptomyces antiboticusNRRL3238经自然分离或系列诱变产生，不同的具体菌株虽然在喷司他丁产量、杂质的比例上有所不同，但发酵液的主要成分相对固定，故本发明同样适用于其他产生喷司他丁的菌种。

本发明中，所述的截流分子量为5000～20000的超滤膜较佳的为截流分子量为8000的超滤膜。

本发明中，所述的过截流分子量为5000～20000的超滤膜的条件为本领域常规条件，为获得更好的效果，进一步地优选下述条件：pH值较佳的为3～6；和/或温度较佳的为30℃～40℃；和/或操作压力较佳的为0.1Mpa～0.3Mpa。

本发明中，所述的超滤膜较佳的为中空纤维膜。

本发明中，所述的截流分子量为500～2000的纳滤膜较佳的为截流分子量为500～1000的纳滤膜，更佳的为截流分子量为500的纳滤膜。

本发明中，所述的过截流分子量为500～2000的纳滤膜的条件为本领域常规条件，为获得更好的效果，进一步地优选下述条件：pH值较佳的为3～6；和/或温度较佳的为40℃～60℃；和/或操作压力较佳的为0.2Mpa～0.4Mpa。

本发明中，所述的截流分子量为100～200的纳滤膜较佳的为截流分子量为150～200的纳滤膜，更佳的为截流分子量为150的纳滤膜。

本发明中，所述的过截流分子量为100～200的纳滤膜的条件为本领域常规条件，为获得更好的效果，进一步地优选下述条件：pH值较佳的为8～9；和/或温度较佳的为40℃～60℃；和/或操作压力较佳的为0.2Mpa～0.4Mpa。

本发明中，所述的纳滤膜较佳的为醋酸纤维素膜。

本发明中，所述的pH值的调节剂为本领域常规所用pH调节剂，当调节pH为酸性时，pH调节剂较佳的为盐酸；当调节pH为碱性时，pH调节剂较佳的为氢氧化钠。所述的pH值的调节剂的使用浓度较佳的为1mol/L。

本发明所用试剂和原料除特殊说明外均市售可得。

在符合本领域常识的基础上，本发明中上述的各技术特征优选条件可以任意组合得到较佳实例。

本发明的积极进步效果在于：本发明的去除喷司他丁发酵液中杂质的方法操作方便、工艺步骤简单、不要特别加入有机溶剂，分离效果良好、处理得到的喷司他丁预处理液中的喷司他丁HPLC纯度可达50％以上，适合工业化生产。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。

下述实施例中，检测喷司他丁的高效液相色谱(HPLC)检测条件为：色谱柱为Agilent C18(5μm，250×4.6mm)，流动相为甲醇∶乙腈∶乙酸铵水溶液(10mmol/L)体积比为2.5∶2.5∶95，柱温40℃，流速为1mL/min，检测波长280nm，进样量为10μL。

下述实施例中，各滤膜的来源为：上海亚东核级树脂有限公司，超滤膜为中空纤维膜，纳滤膜为醋酸纤维素膜。

制备实施例

制备喷司他丁发酵液，使用的菌种为Streptomyces antiboticus NRRL3238(来源美国农业研究菌种保藏中心)。

具体发酵培养条件为：

1、斜面培养：28℃培养10天

培养基(g/L)：葡萄糖10、酵母膏20、琼脂25、自来水，消毒前pH7.2；

2、种子培养：28℃，2天，摇床转速：250rpm

培养基(g/L)：葡萄20、豆粕粉20、氯化钠5、碳酸钙2.5、自来水，消毒前pH 7.5；

3、发酵培养：121℃灭菌20min，接种量10％，摇瓶装量100mL/750mL，置于30℃恒温室中旋转式摇床250rpm摇瓶发酵5天后，得到喷司他丁发酵液；

培养基(g/L)：葡萄糖50、豆粕粉20、氯化钠5、碳酸钙2.5、自来水，消毒前pH 7.2。

实施例1

将喷司他丁发酵液高速离心后取上清液，1mol/L盐酸调pH至3.0，采用截流分子量为20000的中空纤维超滤膜在30℃、0.3Mpa时过滤上清液，平均膜通量为49.5L/h，超滤膜的收率为98.3％，浓缩倍数约为1.5倍，去除了上清液中可溶性蛋白，高聚物，培养基，菌丝体等杂质，滤出液澄清度较好；

再用纳滤膜进一步提纯超滤液，先将滤过液用lmol/L氢氧化钠调pH至5.0，再用截流分子量为500的纳滤膜在40℃、0.3Mpa时过滤，平均膜通量为30.7L/h，浓缩倍数约为2倍，收集滤出液，收率约为82.1％，并且除去了部分多糖，多肽、色素等杂质；

将滤过液用1mol/L氢氧化钠调pH至8.0，再用截流分子量为150的纳滤膜在40℃、0.2Mpa时过滤，平均膜通量为19.5L/h，浓缩倍数约为3倍，收率约为89.3％，除去了溶液中小分子盐类，色素等极性杂质，得到澄清的喷司他丁纳滤液，HPLC检测其纯度为50.4％。

实施例2

将喷司他丁发酵液高速离心后取上清液，先用1mol/L盐酸调pH至4.0再用截流分子量为5000的中空纤维超滤膜在35℃、0.2Mpa时过滤上清液，平均膜通量为45.8L/h，超滤膜的收率为94.8％，浓缩倍数约为1.5倍，去除了上清液中可溶性蛋白，高聚物，培养基，菌丝体等杂质，滤出液澄清度较好；

再用纳滤膜进一步提纯超滤液，先将滤过液用1mol/L氢氧化钠调pH至6.0，再用截流分子量为500的纳滤膜在45℃、0.25Mpa时过滤，平均膜通量为30.5L/h，浓缩倍数约为2倍，收集滤出液，收率约为82.8％，并且除去了部分多糖，多肽、色素等杂质；

将滤过液用1mol/L氢氧化钠调pH至8.0，再用截流分子量为150的纳滤膜在55℃、0.4Mpa时过滤，平均膜通量为17.9L/h，浓缩倍数约为3倍，收率约为91.5％，除去了溶液中小分子盐类，色素等极性杂质，得到澄清的喷司他丁纳滤液，HPLC检测其纯度为51.7％。

实施例3

将喷司他丁发酵液高速离心后取上清液，先用1mol/L盐酸调pH至5.0，再用截流分子量为8000的中空纤维超滤膜在30℃、0.3Mpa时过滤上清液，平均膜通量为47.6L/h，超滤膜的收率为96.4％，浓缩倍数约为1.5倍，去除了上清液中可溶性蛋白，高聚物，培养基，菌丝体等杂质，滤出液澄清度较好；

再用纳滤膜进一步提纯超滤液，先将滤过液用1mol/L氢氧化钠调pH至4.5，再用截流分子量为500的纳滤膜在60℃、0.35Mpa时过滤，平均膜通量为26.4L/h，浓缩倍数约为2倍，收集滤出液，收率约为79.5％，并且除去了部分多糖，多肽、色素等杂质；

将滤过液用1mol/L氢氧化钠调pH至8.0，再用截流分子量为150的纳滤膜在45℃、0.3Mpa时过滤，平均膜通量为19.1L/h，浓缩倍数约为3倍，收率约为88.1％，除去了溶液中小分子盐类，色素等极性杂质，得到澄清的喷司他丁纳滤液，HPLC检测其纯度为52.1％。

实施例4

将喷司他丁发酵液高速离心后取上清液，先用1mol/L盐酸调pH至6.0，再用截流分子量为8000的中空纤维超滤膜在40℃、0.15Mpa时过滤上清液，平均膜通量为46.2L/h，超滤膜的收率为95.3％，浓缩倍数约为1.5倍，去除了上清液中可溶性蛋白，高聚物，培养基，菌丝体等杂质，滤出液澄清度较好；

再用纳滤膜进一步提纯超滤液，先将滤过液用1mol/L盐酸调pH至3.0，再用截流分子量为1000的纳滤膜在40℃、0.2Mpa时过滤，平均膜通量为27.9L/h，浓缩倍数约为2倍，收集滤出液，收率约为81.4％，并且除去了部分多糖，多肽、色素等杂质；

将滤过液用1mol/L氢氧化钠调pH至8.5，再用截流分子量为150的纳滤膜在60℃、0.4Mpa时过滤，平均膜通量为18.4L/h，浓缩倍数约为3倍，收率约为90.7％，除去了溶液中小分子盐类，色素等极性杂质，得到澄清的喷司他丁纳滤液，HPLC检测其纯度为54.3％。

实施例5

将喷司他丁发酵液高速离心后取上清液，先用1mol/L盐酸调pH至4.5，再用截流分子量为8000的中空纤维超滤膜在35℃、0.1Mpa时过滤上清液，平均膜通量为49.3L/h，超滤膜的收率为97.7％，浓缩倍数约为1.5倍，去除了上清液中可溶性蛋白，高聚物，培养基，菌丝体等杂质，滤出液澄清度较好；

再用纳滤膜进一步提纯超滤液，先将滤过液用1mol/L氢氧化钠调pH至3.5，再用截流分子量为800的纳滤膜在50℃、0.4Mpa时过滤，平均膜通量为27.1L/h，浓缩倍数约为2倍，收集滤出液，收率约为80.5％，并且除去了部分多糖，多肽、色素等杂质；

将滤过液用1mol/L氢氧化钠调pH至8.5，再用截流分子量为150的纳滤膜在50℃、0.4Mpa时过滤，平均膜通量为17.8L/h，浓缩倍数约为3倍，收率约为91.2％，除去了溶液中小分子盐类，色素等极性杂质，得到澄清的喷司他丁纳滤液，HPLC检测其纯度为54.2％。

实施例6

将喷司他丁发酵液高速离心后取上清液，先用1mol/L盐酸调pH至5.5，再用截流分子量为5000的中空纤维超滤膜在30℃、0.25Mpa时过滤上清液，平均膜通量为46.1L/h，超滤膜的收率为95.4％，浓缩倍数约为1.5倍，去除了上清液中可溶性蛋白，高聚物，培养基，菌丝体等杂质，滤出液澄清度较好；

再用纳滤膜进一步提纯超滤液，先将滤过液用1mol/L氢氧化钠调pH至4.0，再用截流分子量为500的纳滤膜在55℃、0.2Mpa时过滤，平均膜通量为26.7L/h，浓缩倍数约为2倍，收集滤出液，收率约为79.6％，并且除去了部分多糖，多肽、色素等杂质；

将滤过液用1mol/L氢氧化钠调pH至8.5，再用截流分子量为200的纳滤膜在40℃、0.4Mpa时过滤，平均膜通量为19.8L/h，浓缩倍数约为3倍，收率约为88.7％，除去了溶液中小分子盐类，色素等极性杂质，得到澄清的喷司他丁纳滤液，HPLC检测其纯度为55.3％。

实施例7

将喷司他丁发酵液高速离心后取上清液，先用1mol/L盐酸调pH至6.0，再用截流分子量为8000的中空纤维超滤膜在30℃、0.2Mpa时过滤上清液，平均膜通量为46.1L/h，超滤膜的收率为95.4％，浓缩倍数约为1.5倍，去除了上清液中可溶性蛋白，高聚物，培养基，菌丝体等杂质，滤出液澄清度较好；

再用纳滤膜进一步提纯超滤液，先将滤过液用1mol/L氢氧化钠调pH至4.0，再用截流分子量为500的纳滤膜在45℃、0.35Mpa时过滤，平均膜通量为26.7L/h，浓缩倍数约为2倍，收集滤出液，收率约为79.6％，并且除去了部分多糖，多肽、色素等杂质；

将滤过液用1mol/L氢氧化钠调pH至9.0，再用截流分子量为150的纳滤膜在50℃、0.4Mpa时过滤，平均膜通量为19.8L/h，浓缩倍数约为3倍，收率约为88.7％，除去了溶液中小分子盐类，色素等极性杂质，得到澄清的喷司他丁纳滤液，HPLC检测其纯度为55.3％。

对比例1

将喷司他丁发酵液高速离心后取上清液，先用1mol/L盐酸调pH至4.0，再用截流分子量为50000的中空纤维超滤膜在30℃、0.15Mpa时过滤上清液，平均膜通量为54.1L/h，超滤膜的收率为96.4％，浓缩倍数约为1.5倍；然后依次用截流分子量为500的纳滤膜在40℃、0.3Mpa和截流分子量为150的纳滤膜在50℃、0.3Mpa除杂，得到较澄清的喷司他丁纳滤液，HPLC检测其纯度为43.2％。

对比例2

将喷司他丁发酵液高速离心后取上清液，先用1mol/L盐酸调pH至5.0，再用截流分子量为100000的中空纤维超滤膜在30℃、0.15Mpa时过滤上清液，平均膜通量为59.4L/h，超滤膜的收率为99.2％，浓缩倍数约为1.5倍；然后依次用截流分子量为500的纳滤膜在45℃、0.2Mpa和截流分子量为150的纳滤膜在60℃、0.4Mpa除杂，得到较澄清的喷司他丁纳滤液，HPLC检测其纯度为38.2％。

结论：由对比例1、2可以看出，超滤膜截流分子量太大会显著影响喷司他丁滤液的纯度，增加了后期分离纯化的难度。

对比例3

将喷司他丁发酵液高速离心后取上清液，先用1mol/L盐酸调pH至6.0，再用截流分子量为5000的中空纤维超滤膜在30℃、0.15Mpa时过滤上清液，再用截流分子量为300的纳滤膜在40℃、0.2Mpa进一步提纯，得到较澄清的喷司他丁纳滤液，HPLC检测其纯度为41.2％。

结论：可见，不在本发明纳滤膜截流分子量范围内，纳滤液中喷司他丁的纯度增加了后期分离纯化的难度。

实施例8

将喷司他丁发酵液高速离心后取上清液，先用1mol/L盐酸调pH至9，再用截流分子量为8000的中空纤维超滤膜在35℃、0.1Mpa时过滤上清液，平均膜通量为41.3L/h，超滤膜的收率为85.7％；

再用纳滤膜进一步提纯超滤液，先将滤过液用1mol/L氢氧化钠调pH至10，再用截流分子量为800的纳滤膜在50℃、0.4Mpa时过滤，平均膜通量为23.1L/h，收率约为70.5％；

将滤过液用1mol/L氢氧化钠调pH至10，再用截流分子量为150的纳滤膜在50℃、0.4Mpa时过滤，平均膜通量为16.7L/h，收率约为81.1％，HPLC检测其纯度为51.2％。

实施例9

将喷司他丁发酵液高速离心后取上清液，先用1mol/L盐酸调pH至1.0，再用截流分子量为8000的中空纤维超滤膜在35℃、0.1Mpa时过滤上清液，平均膜通量为48.5L/h，超滤膜的收率为84.1％；

再用纳滤膜进一步提纯超滤液，先将滤过液用1mol/L氢氧化钠调pH至2.5，再用截流分子量为800的纳滤膜在50℃、0.4Mpa时过滤，平均膜通量为26.1L/h，收率约为72.1％；

将滤过液用1mol/L氢氧化钠调pH至8，再用截流分子量为150的纳滤膜在50℃、0.4Mpa时过滤，平均膜通量为16.3L/h，收率约为81.1％。

实施例10

将喷司他丁发酵液高速离心后取上清液，先用1mol/L盐酸调pH至10，再用截流分子量为8000的中空纤维超滤膜在35℃、0.1Mpa时过滤上清液，平均膜通量为37.3L/h，超滤膜的收率为67.8％；

再用纳滤膜进一步提纯超滤液，先将滤过液用1mol/L氢氧化钠调pH至13，再用截流分子量为800的纳滤膜在50℃、0.4Mpa时过滤，平均膜通量为20.1L/h，收率约为63.5％；

将滤过液用1mol/L氢氧化钠调pH至9，再用截流分子量为150的纳滤膜在50℃、0.4Mpa时过滤，平均膜通量为15.7L/h，收率约为77.4％，HPLC检测其纯度为42.2％。

实施例11

将喷司他丁发酵液高速离心后取上清液，先用1mol/L盐酸调pH至4.0，再用截流分子量为8000的中空纤维超滤膜在45℃、0.1Mpa时过滤上清液，平均膜通量为43.1L/h，超滤膜的收率为88.7％；

再用纳滤膜进一步提纯超滤液，先将滤过液用1mol/L氢氧化钠调pH至3.0，再用截流分子量为800的纳滤膜在70℃、0.4Mpa时过滤，平均膜通量为26.4L/h，收率约为72.5％；

将滤过液用1mol/L氢氧化钠调pH至8.5，再用截流分子量为150的纳滤膜在75℃、0.4Mpa时过滤，平均膜通量为16.7L/h，收率约为79.2％，HPLC检测其纯度为52.2％。

实施例12

将喷司他丁发酵液高速离心后取上清液，先用1mol/L盐酸调pH至4.0，再用截流分子量为8000的中空纤维超滤膜在15℃、0.1Mpa时过滤上清液，平均膜通量为33.1L/h，超滤膜的收率为87.1％；

再用纳滤膜进一步提纯超滤液，先将滤过液用1mol/L氢氧化钠调pH至3.0，再用截流分子量为800的纳滤膜在20℃、0.4Mpa时过滤，平均膜通量为21.4L/h，收率约为77.5％；

将滤过液用1mol/L氢氧化钠调pH至8.5，再用截流分子量为150的纳滤膜在25℃、0.4Mpa时过滤，平均膜通量为13.7L/h，收率约为71.2％，HPLC检测其纯度为53.4％。

Claims

1.一种去除喷司他丁发酵液中杂质的方法，其包括如下步骤：将经离心的喷司他丁发酵液的上清液，过截流分子量为5000～20000的超滤膜，之后将超滤液过截流分子量为500～2000的纳滤膜，再将纳滤液过截流分子量为100～200的纳滤膜，得滤液即可。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的喷司他丁发酵液由Streptomyces antiboticus按本领域常规方法发酵培养获得。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述的Streptomycesantiboticus为Streptomyces antiboticus NRRL3238。

4.如权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于：所述的截流分子量为5000～20000的超滤膜为截流分子量为8000的超滤膜。

5.如权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于：所述的过截流分子量为5000～20000的超滤膜的条件为：pH值为3～6；和/或温度为30℃～40℃；和/或操作压力为0.1Mpa～0.3Mpa。

6.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述的过截流分子量为5000～20000的超滤膜的条件为：pH值为3～6；和/或温度为30℃～40℃；和/或操作压力为0.1Mpa～0.3Mpa。

7.如权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于：所述的截流分子量为500～2000的纳滤膜为截流分子量为500～1000的纳滤膜；和/或所述的截流分子量为100～200的纳滤膜为截流分子量为150～200的纳滤膜。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于：所述的截流分子量为500～2000的纳滤膜为截流分子量为500的纳滤膜；和/或所述的截流分子量为100～200的纳滤膜为截流分子量为150的纳滤膜。

9.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述的截流分子量为500～2000的纳滤膜为截流分子量为500～1000的纳滤膜；和/或所述的截流分子量为100～200的纳滤膜为截流分子量为150～200的纳滤膜。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于：所述的截流分子量为500～2000的纳滤膜为截流分子量为500的纳滤膜；和/或所述的截流分子量为100～200的纳滤膜为截流分子量为150的纳滤膜。

11.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述的截流分子量为500～2000的纳滤膜为截流分子量为500～1000的纳滤膜；和/或所述的截流分子量为100～200的纳滤膜为截流分子量为150～200的纳滤膜。

12.如权利要求11所述的方法，其特征在于：所述的截流分子量为500～2000的纳滤膜为截流分子量为500的纳滤膜；和/或所述的截流分子量为100～200的纳滤膜为截流分子量为150的纳滤膜。

13.如权利要求6所述的方法，其特征在于：所述的截流分子量为500～2000的纳滤膜为截流分子量为500～1000的纳滤膜；和/或所述的截流分子量为100～200的纳滤膜为截流分子量为150～200的纳滤膜。

14.如权利要求13所述的方法，其特征在于：所述的截流分子量为500～2000的纳滤膜为截流分子量为500的纳滤膜；和/或所述的截流分子量为100～200的纳滤膜为截流分子量为150的纳滤膜。

15.如权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于：所述的过截流分子量为500～2000的纳滤膜的条件为：pH值为3～6；和/或温度为40℃～60℃；和/或操作压力为0.2Mpa～0.4Mpa。

16.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述的过截流分子量为500～2000的纳滤膜的条件为：pH值为3～6；和/或温度为40℃～60℃；和/或操作压力为0.2Mpa～0.4Mpa。

17.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述的过截流分子量为500～2000的纳滤膜的条件为：pH值为3～6；和/或温度为40℃～60℃；和/或操作压力为0.2Mpa～0.4Mpa。

18.如权利要求6、8-14任一项所述的方法，其特征在于：所述的过截流分子量为500～2000的纳滤膜的条件为：pH值为3～6；和/或温度为40℃～60℃；和/或操作压力为0.2Mpa～0.4Mpa。

19.如权利要求7所述的方法，其特征在于：所述的过截流分子量为500～2000的纳滤膜的条件为：pH值为3～6；和/或温度为40℃～60℃；和/或操作压力为0.2Mpa～0.4Mpa。

20.如权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于：所述的过截流分子量为100～200的纳滤膜的条件为：pH值为8～9；和/或温度为40℃～60℃；和/或操作压力为0.2Mpa～0.4Mpa。

21.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述的过截流分子量为100～200的纳滤膜的条件为：pH值为8～9；和/或温度为40℃～60℃；和/或操作压力为0.2Mpa～0.4Mpa。

22.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述的过截流分子量为100～200的纳滤膜的条件为：pH值为8～9；和/或温度为40℃～60℃；和/或操作压力为0.2Mpa～0.4Mpa。

23.如权利要求6、8-14、16-17、19任一项所述的方法，其特征在于：所述的过截流分子量为100～200的纳滤膜的条件为：pH值为8～9；和/或温度为40℃～60℃；和/或操作压力为0.2Mpa～0.4Mpa。

24.如权利要求7所述的方法，其特征在于：所述的过截流分子量为100～200的纳滤膜的条件为：pH值为8～9；和/或温度为40℃～60℃；和/或操作压力为0.2Mpa～0.4Mpa。

25.如权利要求15所述的方法，其特征在于：所述的过截流分子量为100～200的纳滤膜的条件为：pH值为8～9；和/或温度为40℃～60℃；和/或操作压力为0.2Mpa～0.4Mpa。

26.如权利要求18所述的方法，其特征在于：所述的过截流分子量为100～200的纳滤膜的条件为：pH值为8～9；和/或温度为40℃～60℃；和/或操作压力为0.2Mpa～0.4Mpa。

27.如权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于：所述的超滤膜为中空纤维膜；所述的纳滤膜为醋酸纤维素膜。

28.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述的超滤膜为中空纤维膜；所述的纳滤膜为醋酸纤维素膜。

29.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述的超滤膜为中空纤维膜；所述的纳滤膜为醋酸纤维素膜。

30.如权利要求6、8-14、16-17、19、21-22、24-26任一项所述的方法，其特征在于：所述的超滤膜为中空纤维膜；所述的纳滤膜为醋酸纤维素膜。

31.如权利要求7所述的方法，其特征在于：所述的超滤膜为中空纤维膜；所述的纳滤膜为醋酸纤维素膜。

32.如权利要求15所述的方法，其特征在于：所述的超滤膜为中空纤维膜；所述的纳滤膜为醋酸纤维素膜。

33.如权利要求18所述的方法，其特征在于：所述的超滤膜为中空纤维膜；所述的纳滤膜为醋酸纤维素膜。

34.如权利要求20所述的方法，其特征在于：所述的超滤膜为中空纤维膜；所述的纳滤膜为醋酸纤维素膜。

35.如权利要求23所述的方法，其特征在于：所述的超滤膜为中空纤维膜；所述的纳滤膜为醋酸纤维素膜。

36.如权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于：所述的pH值的调节剂：当调节pH为酸性时，pH调节剂为盐酸；当调节pH为碱性时，pH调节剂为氢氧化钠；所述的pH值的调节剂的使用浓度为1mol/L。

37.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述的pH值的调节剂：当调节pH为酸性时，pH调节剂为盐酸；当调节pH为碱性时，pH调节剂为氢氧化钠；所述的pH值的调节剂的使用浓度为1mol/L。

38.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述的pH值的调节剂：当调节pH为酸性时，pH调节剂为盐酸；当调节pH为碱性时，pH调节剂为氢氧化钠；所述的pH值的调节剂的使用浓度为1mol/L。

39.如权利要求6、8-14、16-17、19、21-22、24-26、28-29、31-35任一项所述的方法，其特征在于：所述的pH值的调节剂：当调节pH为酸性时，pH调节剂为盐酸；当调节pH为碱性时，pH调节剂为氢氧化钠；所述的pH值的调节剂的使用浓度为1mol/L。

40.如权利要求7所述的方法，其特征在于：所述的pH值的调节剂：当调节pH为酸性时，pH调节剂为盐酸；当调节pH为碱性时，pH调节剂为氢氧化钠；所述的pH值的调节剂的使用浓度为1mol/L。

41.如权利要求15所述的方法，其特征在于：所述的pH值的调节剂：当调节pH为酸性时，pH调节剂为盐酸；当调节pH为碱性时，pH调节剂为氢氧化钠；所述的pH值的调节剂的使用浓度为1mol/L。

42.如权利要求18所述的方法，其特征在于：所述的pH值的调节剂：当调节pH为酸性时，pH调节剂为盐酸；当调节pH为碱性时，pH调节剂为氢氧化钠；所述的pH值的调节剂的使用浓度为1mol/L。

43.如权利要求20所述的方法，其特征在于：所述的pH值的调节剂：当调节pH为酸性时，pH调节剂为盐酸；当调节pH为碱性时，pH调节剂为氢氧化钠；所述的pH值的调节剂的使用浓度为1mol/L。

44.如权利要求23所述的方法，其特征在于：所述的pH值的调节剂：当调节pH为酸性时，pH调节剂为盐酸；当调节pH为碱性时，pH调节剂为氢氧化钠；所述的pH值的调节剂的使用浓度为1mol/L。

45.如权利要求27所述的方法，其特征在于：所述的pH值的调节剂：当调节pH为酸性时，pH调节剂为盐酸；当调节pH为碱性时，pH调节剂为氢氧化钠；所述的pH值的调节剂的使用浓度为1mol/L。

46.如权利要求30所述的方法，其特征在于：所述的pH值的调节剂：当调节pH为酸性时，pH调节剂为盐酸；当调节pH为碱性时，pH调节剂为氢氧化钠；所述的pH值的调节剂的使用浓度为1mol/L。