CN101665448B - 一种利用膜分离技术从发酵液中分离提取冠菌素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用膜分离技术从发酵液中分离提取冠菌素的方法，包括微滤和超滤的步骤：含有冠菌素的发酵液经孔径为0.1-10μm微滤膜过滤除去杂质微粒、菌体，通过孔径为0.001-0.1μm超滤膜过滤去除蛋白质、核酸、胶体颗粒大分子杂质，得到澄清的滤液，再经过常规的树脂交换或柱层析、浓缩、结晶成冠菌素。为了提高分离纯化的效果，还可以在微滤前增加预处理，即将冠菌素发酵液通过孔径为1-10μm的滤膜过滤；在超滤后增加纳滤，即流出液通过截留分子量为400-800的纳滤膜系统过滤。该方法操作简单，收率高，可达90％以上，对冠菌素的结构和活性无影响，而且耗能少、污染小，完全适应工业化生产的要求。
Description
技术领域
本发明属于生物化工领域，具体涉及一种利用膜分离技术从发酵液中分离提取活性成分的方法。
背景技术
冠菌素(I)，也称冠毒素(coronatine，简称COR)是20世纪70年代末发现的微生物产生的生理活性物质，其由两个特殊结构部分组成，即双环羧酸，称为冠面酸(II)(coronafacic acid，简称CFA)，和环丙基氨基酸，称为冠氨酸(III)(coronamicacid，简称CMA)。
冠菌素对植物的生长调节呈现多种功能，如促进块茎的形成与膨大，抑制种子的萌发与根的生长，促进果实脱落等(Weiler，1994；Vignutelli，1998；Koda，1994)。有关冠菌素的应用已申请多项专利。例如：中国发明专利(公开号CN1126441C，专利号98111562.4)公开了冠菌素作为植物生长生理调节剂可望开发成杂交水稻颖花花时调节剂，中国发明专利申请(公开号CN101107901A)公开了冠菌素作为水稻种子萌发抑制剂，美国专利US6,511,939公开了冠菌素作为果实脱落剂，US6,465,221公开了冠菌素作为医疗上的肿瘤抑制剂等。因此，冠菌素作为具有多种生物活性的化合物，在上述领域开发出产品化后极有可能产生良好的社会效益和巨大的经济效益。
冠菌素产业化开发的关键之一是冠菌素的工业化制备。由于冠菌素特殊的分子结构，化学合成比较困难。而冠菌素最早由Ichihara从丁香假单胞菌绛红致病变种(P.syringae pv.atropurpurea)的培养液中分离得到(Ichihara A，Shiraishi K.etal.The structure of coronatine.Journal of the American Chemical Society.1977，99：636-637)。因此，对冠菌素工业化生产而言，从细菌发酵液中分离提纯是一条可行之路。
从目前文献资料显示，从发酵液中分离冠菌素的方法有：①萃取法：此法根据不同pH条件下，冠菌素可溶于有机相或水相的特性，首先调整发酵液pH为碱性，使冠菌素溶于水，用乙酸乙酯分离萃取，保留水相；再调整水相pH为2.0，使冠菌素返溶于有机相中，再次通过乙酸乙酯提取，保留有机相，最后经无水Na2SO4过滤及减压蒸发除去乙酸乙酯，获得冠菌素(Palmer D.A.，Bender C.L.Effects ofEnvironmental and Nutritional Factors on Production of the PolyketidePhytotoxin Coronatine by Pseudomonas syringae pv.Glycinea.Appl EnvironMicrobiol.1993，59(5)：1619-1626.)。此方法仅为实验室分析测定用。收率低，分离冠菌素纯度偏低，不适宜工业化生产用。②树脂法：根据冠菌素与吸附剂极性的相似性和溶剂的极性，将被冠菌素吸附于大孔吸附树脂，再在适宜的温度、pH值和盐浓度等物理条件下洗脱，获得初步纯化的冠菌素。此法设备简单，操作条件温和，但回收率偏低，约为48-86％，分离纯度不高，约为53％，且洗脱与树脂预处理等使用的有机溶剂、盐类等对环境有一定的污染。适用于冠菌素发酵液的初步分离纯化。(吴晓玉，丰娟，周静，储炬.树脂法提取冠毒素的研究.江西农业大学学报.2007，29：660-664.；周静，李仕祥，郭成志，吴晓玉.大孔吸附树脂对冠毒素的吸附工艺研究.西北农业学报.2008，17：132-138.)。
膜分离作为一门新型的分离、浓缩、提纯及净化技术，在近30年来发展迅速，已成为解决当代能源、资源和环境污染问题的重要高新技术及可持续发展技术的基础，它具有节能、不破坏产品结构、少污染和操作简单等特点。而利用膜分离技术从发酵液中分离提取冠菌素还未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用膜分离技术从发酵液中分离提取冠菌素的方法。该方法操作简单，收率高，可达90％以上，对冠菌素的结构和活性无影响，而且耗能少、污染小，完全适应工业化生产的要求。
本发明提供一种利用膜分离技术从发酵液中分离提取冠菌素的方法，包括微滤和超滤的步骤：含有冠菌素的发酵液经微滤膜过滤除去杂质微粒、菌体，通过超滤膜过滤去除蛋白质、核酸、胶体颗粒大分子杂质，得到澄清的滤液，再经过常规的树脂交换、真空浓缩、结晶成冠菌素。
作为本发明的一种优选方式，所述利用膜分离技术从发酵液中分离提取冠菌素的方法的具体步骤为：
(1)发酵液的粗提取：将含有冠菌素的发酵液通过孔径为0.1-10μm的微滤膜过滤，去除杂质微粒和菌体，得到冠菌素粗提液；微滤操作压力为0.1-1.0MPa，操作温度为10-50℃，浓缩倍数10-40倍，透析水量以体积百分比计占进料液体积的10-80％；
(2)发酵液大分子杂质的去除：将所述步骤1得到的粗提液通过孔径为0.001-0.1μm超滤膜过滤，去除发酵液中残存的蛋白质、核酸、胶体颗粒大分子杂质；超滤操作压力0.15-2.5MPa，温度10-50℃，浓缩倍数10-40倍，透析水量以体积百分比计占进料量的10-50％；
(3)浓缩、结晶：将所述步骤2得到的澄清无色的冠菌素发酵液以常规方法进行树脂吸附交换或柱层析、真空浓缩、结晶，得到纯度大于95％的冠菌素。
所述微滤膜的材料优选无机类、纤维素类、聚氯乙烯、聚酰胺、聚丙烯、聚四氟乙烯、聚碳酸酯材料中的一种或几种；微滤膜的孔径优选0.5-5μm。
所述超滤膜的材料优选无机类、含氟高分子材料类、聚烯烃类、聚酰胺类、聚砜类、甲壳素类或纤维素类膜材料中的一种或几种；超滤膜的孔径优选0.005-0.05μm。
为了提高分离效率，达到更好的分离效果，本发明优选将经过微滤和超滤得到的滤液再经过纳滤，去除色素、低聚糖、核苷酸、多肽、脂肪酸小分子杂质，而后经过常规的树脂交换或柱层析，最后浓缩、结晶，或者直接喷雾干燥得到冠菌素。
所述纳滤步骤的优选工艺条件是：纳滤膜的截留分子量为400-800，操作压力0.15-3MPa，温度10-50℃，浓缩倍数10-40倍，透析水量以体积百分比计占进料量的10-50％。
所述纳滤膜的材料优选无机类、芳香聚酰胺类、聚砜类、聚哌嗪酰胺类、聚偏氟乙烯类、聚丙烯腈类、壳聚糖类或纤维素类膜材料中的一种或几种。
本发明还优选在所述利用膜分离技术从发酵液中分离提取冠菌素的方法中增加发酵液的预处理：即冠菌素发酵液首先通过孔径为1-10μm的滤膜过滤，除去发酵液中较大的杂质微粒和部分菌体，预处理后的冠菌素发酵液再经过所述微滤和超滤，或者经过所述微滤、超滤和纳滤，最后经过常规的树脂交换或柱层析、真空浓缩、结晶成冠菌素。
所述发酵液预处理步骤的优选工艺条件是操作压力为0.1-0.5MPa，操作温度为10-50℃，浓缩倍数10-40倍，透析水量以体积百分比计占进料体积的10-60％。
所述预处理的滤膜的材料优选纤维素类、聚氯乙烯、聚酰胺、聚丙烯、聚四氟乙烯、聚碳酸酯材料中的一种或几种。
冠菌素发酵液在膜分离之前还可以先离心，得到的上清液再通过分级膜过滤，同样可以提高膜分离效率。
经过多级膜分离后得到的富集冠菌素的滤液还需要经过树脂交换或柱层析。本发明所述树脂交换及柱层析均采用本领域常规的条件。树脂交换采用大孔吸附树脂或离子交换树脂，大孔树脂洗脱剂采用1％氨水-60％乙醇的混合洗脱剂，离子交换树脂采用2mol/L NaOH洗脱剂。柱层析通常采用硅胶为吸附剂以三氯甲烷-乙酸乙酯-丙酮为洗脱剂，收集冠菌素集中的流份。
本发明所述的冠菌素发酵液以本领域通用的技术手段经过发酵得到：将产冠菌素菌株经斜面培养，然后接入种子培养基培养，再转入发酵培养基，最后放罐，获得含冠菌素发酵液。所述产冠菌素菌株可以是保藏的，例如CN1900269A公开的基因工程菌——丁香假单孢大豆致病变种(Pseudomonas syringae pv.glycinae)，保藏号CGMCC1412；或者市场上购买的，例如CN101033457A提及的洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)。
膜在使用过程中，尽管操作条件保持不变，但膜通量——在一定压力下，单位时间内通过单位面积滤膜的透过液量——仍会逐渐降低。这是由于膜污染的原因。因此必须采取一定的清洗方法除去膜面或膜孔内的污染物，达到膜通量恢复的目的。采用0.1～0.2％的NaOH溶液作为清洗液，使用低压高流速法(清洗条件：进口压力0.2MPa；出口压力0.10MPa，清洗时间30min)或反压法清洗(清洗条件：反向压力0.1MPa，清洗时间5min)，都可以达到满意的效果。或者两者结合起来，清洗的效果会更好。
本发明相对于现有的冠菌素的分离提纯方法的优点是：工艺简单，分离步骤少，生产能耗少，条件温和，不破坏产品结构。克服了现有技术存在的收率不高，污水排放量大的缺陷。
附图说明
图1是冠菌素(I)、冠面酸(II)和冠氨酸(III)的结构式。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明，但这些实施例不能用于限制本发明。
实施例1 冠菌素含量测定
采用高效液相色谱检测，色谱工作条件为：色谱柱Symmet ry C18柱(Waters，4.6×150mm，5μm)；流动相为含0.05％磷酸的60％甲醇溶液；检测波长230nm；流速1.0mL/min；柱温35℃。标准品由日本北海道大学有机分析化学实验室提供。
实施例2 冠菌素发酵液的制备
1.菌株
冠菌素产生菌洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)。
2.培养基
斜面培养基(g/L)：葡萄糖10、牛肉膏3、蛋白胨5、酵母浸膏1、琼脂15、pH6.8-7.0。
种子培养基(g/L)：葡萄糖20、牛肉膏20、KH2PO4 4.1、K2HPO4 1.8、MgSO4·7H2O0.2、FeCl3(1.5μmol/L)、pH6.8-7.0。
基础发酵培养基(g/L)：葡萄糖10、黄豆饼粉20、尿素10、糖蜜10、KH2PO4 4.1、K2HPO4 3.6、MgSO4·7H2O 0.2、FeCl3(1.5μmol/L)、pH6.8-7.0。
3.冠菌素发酵液的制备
菌株经斜面培养1天，接入种子培养基培养16小时，再转入发酵培养基，发酵3天后放罐，获得含冠菌素发酵液。
实施例3
冠菌素发酵液10L通过孔径为1μm聚氯乙烯微滤膜去除杂质微粒和部分菌体，操作压力0.2MPa，温度30℃，浓缩倍数20倍，透析水量2L；过滤后的粗提液流经孔径为0.05μm聚烯烃类超滤膜，去除发酵液中残存的蛋白质、核酸、胶体颗粒大分子杂质，操作压力0.15MPa，温度30℃，浓缩倍数15倍，透析水量4L；采用实施例1相同的方法测定，冠菌素总收率为90％。该透过液用柱层析进行进一步的处理，浓缩结晶后，得到纯度为97％的冠菌素成品。
实施例4
冠菌素发酵液15L通过孔径为5μm纤维素类微滤膜去除杂质微粒和部分菌体，操作压力0.2MPa，温度30℃，浓缩倍数20倍，透析水量3L；过滤后的粗提液流经孔径为0.01μm含氟高分子材料类超滤膜，去除发酵液中残存的蛋白质、核酸、胶体颗粒大分子杂质，操作压力0.15MPa，温度30℃，浓缩倍数15倍，透析水量6L；流出液经截留分子量为500的聚哌嗪酰胺类纳滤膜过滤，脱除色素、低聚糖、核苷酸、多肽、脂肪酸小分子杂质，操作压力0.5MPa，温度40℃，浓缩倍数25倍，透析水量7L；冠菌素总收率为91％。该透过液可用柱层析进行进一步的处理，喷雾干燥后，得到纯度为97％的冠菌素成品。
实施例5
冠菌素发酵液50L通过孔径为10μm纤维素类滤膜去除杂质颗粒和部分菌体，操作压力0.25MPa，温度25℃，浓缩倍数15倍，透析水量6L；滤液经2μm聚氯乙烯微滤膜去除杂质微粒和菌体，操作压力0.2MPa，温度30℃，浓缩倍数20倍，透析水量8L；过滤后的粗提液流经孔径为0.03μm聚酰胺类超滤膜，去除发酵液中残存的蛋白质、核酸、胶体颗粒大分子杂质，操作压力0.15MPa，温度30℃，浓缩倍数15倍，透析水量10L；冠菌素总收率为92％。该透过液可用树脂交换或柱层析进行进一步的处理，浓缩结晶后，得到纯度为95％的冠菌素成品。
实施例6
冠菌素发酵液100L通过孔径为10μm陶瓷(无机类)滤膜去除杂质颗粒和部分菌体，操作压力0.35MPa，温度30℃，浓缩倍数15倍，透析水量30L；滤液通过孔径为1μm聚酰胺类微滤膜去除杂质微粒和菌体，操作压力0.25MPa，温度30℃，浓缩倍数20倍，透析水量35L；过滤后的粗提液流经孔径为0.02μm陶瓷(无机类)超滤膜，去除发酵液中残存的蛋白质、核酸、胶体颗粒大分子杂质，操作压力0.15MPa，温度30℃，浓缩倍数15倍，透析水量40L；流出液经截留分子量为500的聚偏氟乙烯类纳滤膜过滤，脱除色素、低聚糖、核苷酸、多肽、脂肪酸小分子杂质，操作压力0.45MPa，温度35℃，浓缩倍数25倍，透析水量30L；冠菌素总收率为95％。该透过液可用柱层析进行进一步的处理，喷雾干燥后，得到纯度为97％的冠菌素成品。
实施例7
冠菌素发酵液100L通过孔径为8μm聚酰胺类滤膜去除杂质颗粒和部分菌体，操作压力0.45MPa，温度30℃，浓缩倍数20倍，透析水量35L；滤液通过孔径为2μm聚丙烯微滤膜去除杂质微粒和菌体，操作压力0.25MPa，温度30℃，浓缩倍数20倍，透析水量35L；过滤后的粗提液流经孔径为0.01μm甲壳素类超滤膜，去除发酵液中残存的蛋白质、核酸、胶体颗粒大分子杂质，操作压力0.15MPa，温度30℃，浓缩倍数15倍，透析水量45L；冠菌素总收率为95％。该透过液用树脂交换和柱层析进行进一步的处理，喷雾干燥后，得到纯度为95％的冠菌素成品。
实施例8
冠菌素发酵液20L通过孔径为1μm聚四氟乙烯滤膜去除杂质颗粒和部分菌体，操作压力0.5MPa，温度40℃，浓缩倍数30倍，透析水量10L；滤液通过孔径为0.1μm纤维素类微滤膜去除杂质微粒和菌体，操作压力1.0MPa，温度40℃，浓缩倍数40倍，透析水量5L；过滤后的粗提液流经孔径为0.005μm含氟高分子材料类超滤膜，去除发酵液中残存的蛋白质、核酸、胶体颗粒大分子杂质，操作压力2.0MPa，温度30℃，浓缩倍数15倍，透析水量4L；冠菌素总收率为91％。该透过液用离子交换树脂进行进一步的处理，喷雾干燥后，得到纯度为98％的冠菌素成品。
实施例9
冠菌素发酵液10L通过孔径为10μm聚酰胺类微滤膜去除杂质微粒和菌体，操作压力0.5MPa，温度30℃，浓缩倍数20倍，透析水量4L；过滤后的粗提液流经孔径为0.05μm无机类(陶瓷)超滤膜，去除发酵液中残存的蛋白质、核酸、胶体颗粒大分子杂质，操作压力1.0MPa，温度30℃，浓缩倍数15倍，透析水量5L；流出液经截留分子量为800的聚砜类纳滤膜过滤，脱除色素、低聚糖、核苷酸、多肽、脂肪酸小分子杂质，操作压力2.0MPa，温度30℃，浓缩倍数25倍，透析水量3L；冠菌素总收率为95％。该透过液用树脂交换和柱层析进行进一步的处理，喷雾干燥后，得到纯度为95％的冠菌素成品。
实施例10
冠菌素发酵液100L通过孔径为10μm聚丙烯滤膜去除杂质颗粒和部分菌体，操作压力0.15MPa，温度25℃，浓缩倍数20倍，透析水量20L；滤液通过孔径为0.1μm纤维素类微滤膜去除杂质微粒和菌体，操作压力1.0MPa，温度30℃，浓缩倍数20倍，透析水量35L；过滤后的粗提液流经孔径为0.005μm聚砜类超滤膜，去除发酵液中残存的蛋白质、核酸、胶体颗粒大分子杂质，操作压力2.5MPa，温度30℃，浓缩倍数15倍，透析水量45L；冠菌素总收率为89％。该透过液用柱层析进行进一步的处理，喷雾干燥后，得到纯度为97％的冠菌素成品。
Claims (10)
1.一种利用膜分离技术从发酵液中分离提取冠菌素的方法，包括微滤和超滤的步骤：含有冠菌素的发酵液经微滤膜过滤除去杂质微粒、菌体，通过超滤膜过滤去除蛋白质、核酸、胶体颗粒大分子杂质，得到澄清的滤液，再经过常规的树脂吸附交换或柱层析、浓缩、结晶成冠菌素；其特征在于所述方法的步骤为：
(1)发酵液的粗提取：将含有冠菌素的发酵液通过孔径为0.1-10μm的微滤膜过滤，去除杂质微粒和菌体，得到冠菌素粗提液；微滤操作压力为0.1-1.0MPa，操作温度为10-50℃，浓缩倍数10-40倍，透析水量以体积百分比计占进料液体积的10-80％；
(2)发酵液大分子杂质的去除：将所述步骤(1)得到的粗提液通过孔径为0.001-0.1μm超滤膜过滤，去除发酵液中残存的蛋白质、核酸、胶体颗粒大分子杂质；超滤操作压力0.15-2.5MPa，温度10-50℃，浓缩倍数10-40倍，透析水量以体积百分比计占进料量的10-50％；
(3)制得成品：将所述步骤(2)得到的澄清无色的冠菌素发酵液以常规方法进行树脂吸附交换或柱层析、浓缩、结晶，得到纯度大于95％的冠菌素。
2.一种利用膜分离技术从发酵液中分离提取冠菌素的方法，包括微滤、超滤和纳滤的步骤：含有冠菌素的发酵液经微滤膜过滤除去杂质微粒、菌体，通过超滤膜过滤去除蛋白质、核酸、胶体颗粒大分子杂质，得到澄清的滤液，再经纳滤膜过滤去除色素、低聚糖、核苷酸、多肽、脂肪酸小分子杂质，而后经过常规的树脂吸附交换或柱层析，最后浓缩、结晶，或者直接喷雾干燥得到冠菌素；其特征在于所述方法的步骤为：
(1)发酵液的粗提取：将含有冠菌素的发酵液通过孔径为0.1-10μm的微滤膜过滤，去除杂质微粒和菌体，得到冠菌素粗提液；微滤操作压力为0.1-1.0MPa，操作温度为10-50℃，浓缩倍数10-40倍，透析水量以体积百分比计占进料液体积的10-80％；
(2)发酵液大分子杂质的去除：将所述步骤(1)得到的粗提液通过孔径为0.001-0.1μm的超滤膜过滤，去除发酵液中残存的蛋白质、核酸、胶体颗粒大分子杂质；超滤操作压力0.15-2.5MPa，温度10-50℃，浓缩倍数10-40倍，透析水量以体积百分比计占进料量的10-50％；
(3)发酵液小分子杂质的去除：将所述步骤(2)得到的流出液通过截留分子量为400-800的纳滤膜系统过滤，脱除色素、低聚糖、核苷酸、多肽、脂肪酸小分子杂质，得到澄清无色的冠菌素溶液；纳滤操作压力0.15-3MPa，温度10-50℃，浓缩倍数10-40倍，透析水量以体积百分比计占进料量的10-50％；
(4)制得成品：将所述步骤(3)得到的澄清无色的冠菌素发酵液以常规方法进行树脂吸附交换或柱层析，然后浓缩、结晶，或者直接喷雾干燥得到纯度大于95％的冠菌素成品。
3.根据权利要求1或2所述的利用膜分离技术从发酵液中分离提取冠菌素的方法，其特征在于所述微滤膜的材料是无机类、纤维素类、聚氯乙烯、聚酰胺、聚丙烯、聚四氟乙烯、聚碳酸酯材料中的一种或几种。
4.根据权利要求1或2所述的利用膜分离技术从发酵液中分离提取冠菌素的方法，其特征在于所述微滤膜的孔径为0.5-5μm。
5.根据权利要求1或2所述的利用膜分离技术从发酵液中分离提取冠菌素的方法，其特征在于所述超滤膜的材料是无机类、含氟高分子材料类、聚烯烃类、聚酰胺类、聚砜类、甲壳素类或纤维素类膜材料中的一种或几种。
6.根据权利要求1或2所述的利用膜分离技术从发酵液中分离提取冠菌素的方法，其特征在于所述超滤膜的孔径为0.005-0.05μm。
7.根据权利要求1所述的利用膜分离技术从发酵液中分离提取冠菌素的方法，其特征在于所述方法还包括发酵液的预处理，将冠菌素发酵液通过孔径为1-10μm的滤膜过滤，除去发酵液中较大的杂质微粒和部分菌体，预处理后的冠菌素发酵液再经过微滤和超滤，最后经过常规的树脂吸附交换、真空浓缩、结晶成冠菌素。
8.根据权利要求2所述的利用膜分离技术从发酵液中分离提取冠菌素的方法，其特征在于所述方法还包括发酵液的预处理，将冠菌素发酵液通过孔径为1-10μm的滤膜过滤，除去发酵液中较大的杂质微粒和部分菌体，预处理后的冠菌素发酵液经过微滤、超滤和纳滤，最后经过常规的树脂吸附交换、真空浓缩、结晶成冠菌素。
9.根据权利要求7或8所述的利用膜分离技术从发酵液中分离提取冠菌素的方法，其特征在于所述发酵液的预处理步骤的工艺条件是：操作压力为0.1-0.5MPa，操作温度为10-50℃，浓缩倍数10-40倍，透析水量以体积百分比计占进料体积的10-60％。
10.根据权利要求7或8所述的利用膜分离技术从发酵液中分离提取冠菌素的方法，其特征在于：所述预处理的滤膜的材料是纤维素类、聚氯乙烯、聚酰胺、聚丙烯、聚四氟乙烯、聚碳酸酯材料中的一种或几种。
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