CN105802872A - 一种荧光假单孢菌和生产吩嗪酰胺的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种荧光假单孢菌(Pseudomonas)sp.ST16，保藏编号为CGMCC No.2397，以及一种生产吩嗪酰胺的方法，该方法包括在培养基中培养荧光假单孢菌CGMCC No.2397以使在所述菌株细胞内和所述培养基中产生和聚集吩嗪类化合物，以及从所述菌株细胞内和所述培养基中回收并提纯吩嗪酰胺。本发明提供的吩嗪酰胺可作为生物农药用于农业生产，效果优于吩嗪羧酸。
Description
技术领域
本发明涉及一种荧光假单孢菌CGMCCNo.2397，以及一种生产吩嗪酰胺的方法和由该方法制备的吩嗪酰胺在生物农药中的应用。
背景技术
吩嗪类化合物的生产方法主要有化学合成法和生物发酵法。化学合成法最早在1930年就有文献报道，主要有邻氨基苯甲酸/硝基苯法、1-甲基吩嗪氧化法、1-氰基吩嗪水解法及2-(苯胺基)异二苯甲酸法等。化学法收率低、成本高、环境污染大，难以工业化。
生物发酵又分为传统方法和改进方法。传统发酵法的提取工艺繁琐、能耗高、收率低。改进的发酵法采用膜集成工艺，用微滤、超滤和纳滤技术除去了大量的杂质，产品的收率达90％，提高了产品纯度、降低成本且安全、无污染。但是膜集成工艺中膜容易污堵，影响工艺的正常生产。
CN1340609A公开了一种生物农药促生拮抗菌M18及其制备方法，由该方法能够制得吩嗪羧酸。然而，吩嗪羧酸作为生物农药存在产量低、用药剂量大的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种荧光假单孢菌CGMCCNo.2397。
本发明的另一个目的是提供一种生产吩嗪酰胺的方法。
本发明的另一个目的是提供由上述方法制备的吩嗪酰胺在生物农药中的应用。
首先，本发明的发明人从红豆杉树皮上分离得到一种能生产吩嗪酰胺的荧光假单孢菌。经过多次、多种方法诱变得到一株高产吩嗪酰胺的菌株，吩嗪酰胺产量可达2g/L。本发明的发明人经过大量的试验研究出吩嗪酰胺可作为生物农药用于农业生产，效果优于吩嗪羧酸。达到同样的作用效果，吩嗪酰胺的剂量可以仅是吩嗪羧酸的百分之一。
本发明的发明人经过多年大量深入细致地研究，发现、培养、诱变出一种新的菌种荧光假单孢菌(Pseudomonas)sp.ST16，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，保藏日期为2008年3月10日，保藏编号为CGMCCNo.2397。
本发明的发明人从云南省丽江地区的老君山海拔2500-3000米的针阔混交林中的7株300年以上的云南红豆杉(Taxusyunnanensis)树的树枝、树皮、叶和根皮采集样品310个，各剪成1cm×1cm大小的小块，经50-90重量％酒精消毒3分钟后，用匀浆器匀浆，之后，涂布PDA培养基上，25℃培养4天后，长出有荧光的细菌菌落，转移到金氏B培养基(King’smediumB)斜面上，在28℃条件下培养24小时，其形状如下：表面薄膜状有光泽，浅黄绿色，在紫外光照射下，有较强荧光。荧光色素为水溶性，扩散到整个斜面中有较强的刺鼻臭味，金氏平板培养共培养48小时，菌落大小约1-2mm，圆形，有光泽，微隆起，中央有一小凹陷，边缘微锯齿状，不透明，无粘性。经硝酸银鞭毛染色，荧光假单孢菌，菌体为直杆状，一根极生鞭毛，大小0.8-1.0μm×1.8-2.6μm。细胞革兰氏染色为阴性。
本发明提供的荧光假单孢菌CGMCCNo.2397能大量生产吩嗪酰胺。
本发明还提供了一种生产吩嗪酰胺的方法，该方法包括在培养基中培养上述荧光假单孢菌CGMCCNo.2397以使在所述菌株细胞内和所述培养基中产生和聚集吩嗪类化合物，以及从所述菌株细胞内和所述培养基中回收并提纯吩嗪酰胺。
所述培养基可以是本领域常规或已知的培养基。优选地，所述培养基可以含有碳源物质和氮源物质。
根据本发明的一个实施方式，所述碳源物质可以选自葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖和甘油中的一种或多种。优选情况下，所述碳源物质选自甘油。本发明的发明人经过大量的实验研究发现，只要所述培养基中含有甘油，即可有利于促进荧光假单孢菌的生长。所述培养基中所述碳源物质的加入量可以由本领域技术人员根据需要确定。优选情况下，所述培养基中所述碳源物质的加入量为5-80g/L。
根据本发明的一个实施方式，所述氮源物质可以选自玉米浆、酵母粉、蛋白胨、牛肉浸膏、酵母提取物、硝酸铵、氯化铵和硫酸铵中的一种或多种。优选情况下，所述氮源选自蛋白胨。进一步优选情况下，所述氮源选自蛋白胨F403(例如，蛋白胨F403可以为购自上海市水产研究所的市售商品)。本发明的发明人经过大量的实验研究发现，只要所述培养基中含有蛋白胨，特别是蛋白胨F403，即可有利于促进荧光假单孢菌生产更多的吩嗪酰胺。所述培养基中所述氮源物质的加入量可以由本领域技术人员根据需要确定，优选情况下，所述培养基中所述氮源物质的加入量为5-120g/L。
根据本发明的一个实施方式，所述培养基中所述碳源物质与所述氮源物质的加入量的重量比为1：1-10时，更有利于提高本发明的吩嗪酰胺的产率。
根据本发明的一个实施方式，还可以向所述培养基中加入其它有机或无机物质以促进微生物的生长和提高本发明的吩嗪酰胺的产率。优选情况下，所述培养基还可以含有磷酸盐和/或镁盐。优选地，所述磷酸盐选自磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠和磷酸氢二钠中的一种或多种，所述培养基中所述磷酸盐的加入量为1-5g/L。优选地，所述镁盐选自硫酸镁，所述培养基中所述镁盐的加入量为0.1-1.5g/L。
根据本发明的一个实施方式，所述培养基还可以含有占培养基0.28-18.3g/L的前体物质，优选地，所述前体物质选自莽草酸、酪氨酸、苯胺、1,2-苯二胺、临苯二酚、邻氨基苯甲酸、水杨酸和2-氨基酚中的一种或多种。进一步优选地，所述前体物质为莽草酸。所述前体物质可以分一次或多次加入所述培养基中。
根据本发明的一个实施方式，所述前体物质分两次加入所述培养基中，第一次在接种时加入占培养基0.01-0.3g/L的所述前体物质，第二次在菌体生长至pH值出现回升时立即加入占培养基0.27-18g/L的所述前体物质。
此外，在本发明的其他实施方式中，本发明的培养基还可以含有铁盐、锰盐、锌盐、钾盐、钠盐、硼酸、维生素B1中的一种或多种。本领域技术人员可以根据实际需要选择上述各个组分并确定其添加量。
如上所述各组分的加入量均指各组分占所述培养基的加入量。
根据本发明的一个实施方式，所述培养基含有：
选自葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖和甘油中的一种或多种的碳源物质；
选自玉米浆、酵母粉、蛋白胨、牛肉浸膏、酵母提取物、硝酸铵、氯化铵和硫酸铵中的一种或多种的氮源物质；
磷酸盐和/或镁盐；以及
选自莽草酸、酪氨酸、苯胺、1，2-苯二胺、临苯二酚、邻氨基苯甲酸、水杨酸和2-氨基酚中的一种或多种的前体物质。
上述各种组分的加入量如前所述，本发明在此不再赘述。
根据本发明的一个实施方式，所述培养可以在需氧条件下进行，例如，通入的氧气与培养液的体积比可以为1：0.8；温度可以为23-38℃，优选为28℃；培养初始pH值可以为5.5-11，优选6.5-7.5；在培养中后期可调节pH值为4-9.5，优选7.5-8.5；培养时间依培养条件而定，例如，培养可进行24-68小时。在培养过程中可用碱性或酸性溶液调节pH值。
根据本发明的一个实施方式，所述培养过程可以在本领域常规或已知的装置和条件下进行，例如可使用摇瓶在本领域常规或已知的转速下进行；也可以在常规的发酵罐中进行，例如可以在7L、50L发酵罐中进行。
在所述培养过程中需要使用7L、50L发酵罐时，可在发酵过程中流加补充碳源物质、氮源物质，在发酵前期不用调节pH值，在发酵中后期可调节pH值为7-9.5。可以采用菌体进罐的接种方式。在接种后到菌体生长至pH值开始回升前使用较大通气量(例如控制溶氧值达40％以上)，pH回升后通气量可降低(例如控制溶氧值达10-40％)。
为了从培养基中分离出吩嗪酰胺，可以使用本领域常规或已知的用于从微生物的培养基中分离代谢物的任何分离方法。例如，可以采用一种或多种与水不相混的有机溶剂(例如卤化烃，如二氯甲烷、三氯甲烷，等)将吩嗪酰胺从培养液的滤液中萃取出来。所得吩嗪酰胺粗产物可以使用本领域常规或已知的方法例如色谱法、结晶法纯化精制。
根据本发明的一个实施方式，回收并提纯吩嗪酰胺可以包括以下步骤：
(1)将所述培养过程所得培养液的pH值调整为8-10并将所得培养液分离出发酵菌体和发酵上清液；
(2)用有机溶剂提取所得的发酵上清液，挥干溶剂；
(3)将第(2)步所得物用色谱纯化的方法和结晶纯化的方法纯化。
根据本发明的一个实施方式，所述第(1)步骤中可以采用常规的碱性溶液，例如氨水和/或氢氧化钠调节所得培养液的pH值为8-10。
根据本发明的一个实施方式，所述第(2)步骤中使用的有机溶剂可以为本领域技术人员常用的有机溶剂，优选所述有机溶剂为二氯甲烷和/或三氯甲烷。另外，优选在避光条件下用有机溶剂进行萃取，以防止吩嗪酰胺见光分解。
根据本发明的一个实施方式，所述第(3)步骤中所述色谱纯化方法可以包括使用一个或多个色谱柱，色谱柱填料包括硅胶或氧化铝，流动相包括三氯甲烷，或甲醇/三氯甲烷。
根据本发明的一个实施方式，所述的第(3)步骤中所述结晶纯化的方法包括将待纯化物溶解于甲醇溶剂中，用40-60℃的甲醇溶解，慢慢冷却，即可析出吩嗪酰胺针状晶体。
本发明还提供了由上述方法制备的吩嗪酰胺在生物农药中的应用。
本发明提供的荧光假单孢菌CGMCCNo.2397，能够高产吩嗪酰胺。通过本发明提供的方法，能够获得较高产率的吩嗪酰胺。优选情况下，当所述培养基中含有甘油和蛋白胨时，能够获得产率更高的吩嗪酰胺。更优选情况下，在所述培养基中含有甘油和蛋白胨的同时，采用草莽酸作为前体物质，并分两次加入培养基进行培养时，能够进一步提高吩嗪酰胺的产率。本发明提供的方法，不仅简单易操作，而且能够明显提高吩嗪酰胺的产率。并且，本申请所制得的吩嗪酰胺用于生物农药的效果明显优于现有技术中的吩嗪羧酸。
附图说明
附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1是从制备实施例6所得浸膏的TLC图。
图2是从制备实施例6所得浸膏的HPLC图谱。
图3是分离和纯化实施例1所得产品的1H谱。
图4-5是分离和纯化实施例1所得产品的13C谱。
图6是分离和纯化实施例1所得产品的DEPT135谱。
图7是分离和纯化实施例1所得产品的COSY谱。
图8是分离和纯化实施例1所得产品的HSQC谱。
图9-10是分离和纯化实施例1所得产品的HMBC谱。
具体实施方式
下面将通过实施例对本发明作进一步的描述，这些描述并不是对本发明内容作进一步的限定。本领域的技术人员应理解，对本发明技术特征所作的等同替换，或相应的改进，仍属于本发明的保护范围之内。
以下实施例中所用试剂均来自商购。并且相同的试剂来源相同。
TLC图通过上海楚定分析仪器有限公司的玻璃层析缸获得；
HPLC图谱通过美国waters公司高效液相色谱仪获得；
核磁全套谱(1H、13C、DEPT135、COSY、HSQC和HMBC)通过BrukerAvanceIII-600MHz核磁共振波谱仪(参考依据：JY/T007-1996超导脉冲傅里叶变换核磁共振波谱方法通则)获得。
吩嗪酰胺的纯度通过美国waters公司高效液相色谱仪测量。
吩嗪酰胺的收率通过下式计算：
吩嗪酰胺的收率＝吩嗪酰胺纯品纯度×吩嗪酰胺纯品重量×100％/发酵液体积。
荧光假单孢菌的分离、纯化鉴定实施例
将从云南省丽江地区的老君山海拔2500-3000米的针阔混交林中的7株300年以上的云南红豆杉(Taxusyunnanensis)树的树枝、树皮、叶和根皮采集的310个样品各剪成1cm×1cm大小的小块，经75重量％酒精消毒3分钟后，用匀浆器匀浆，之后，涂布PDA培养基上，25℃培养4天后，长出有荧光的细菌菌落，转移到金氏B培养基斜面上，28℃培养24小时，取108个细菌接种于发酵培养基中(100ml三角瓶装量30ml，培养基配方：甘油10g/L、蛋白胨20g/L、MgSO40.15g/L、K2HPO41.5g/L，pH7.2)，28℃,220rpm于摇床培养56小时，用2.0mol/L氢氧化钠调节pH为9，再用三氯甲烷萃取1h，真空浓缩至干得浸膏样品，加入1mL甲醇溶液，取5μL点样于硅胶平板上，在层析系统中展开(乙酸：乙醇：三氯甲烷体积比＝5：5：90)之后60℃、5分钟烘干，在紫外灯下观察荧光情况，挑选与吩嗪酰胺相同迁移率的斑点所对应的菌体，进行进一步的鉴定，得到红豆杉树皮内分离出的菌株。
将上述所得的菌株在金氏B培养基平板上分离纯化三代(28℃，48小时)之后，得到ST-11菌株。ST-11菌株在金氏B培养基上生长迅速，直径为2-6mm，在培养基中产生可扩散的青或褐色的色素，在紫外光照射时显青到蓝色，经金氏B培养基在28℃条件下培养，其形状如下：金氏B培养基斜面上培养24小时，表面薄膜状有光泽，浅黄绿色，在紫外光照射下，有较强荧光。荧光色素为水溶性，扩散到整个斜面中有较强的刺鼻臭味，金氏平板培养共培养48小时，菌落大小约1-2mm、圆形、有光泽、微隆起、中央有一小凹陷、边缘微锯齿状、不透明、无粘性。经硝酸银鞭毛染色，荧光假单孢菌，菌体为直杆状，一根极生鞭毛，大小0.8-1.0μm×1.8-2.6μm。细胞革兰氏染色为阴性。
以该菌株为出发菌株进行紫外诱变，经16代诱变得一高产变异菌株，代号为ST16。以上高产变异株经5代传代培养较稳定。根据植物命名法规命名为荧光假单孢菌，学名为Pseudomonas，代号为sp.ST16，菌种保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，保藏日期为2008年3月10日，保藏号为：CGMCCNo.2397。
准备实施例
接种“荧光假单孢菌的分离、纯化鉴定实施例”所得荧光假单孢菌CGMCCNo.2397冻干菌至装有30ml种子培养基(见表1)的100ml三角瓶中，于28℃，260rpm摇床培养16小时，即得待接种的菌种。
表1：种子培养基
制备实施例1摇瓶发酵
将准备实施例所得菌种在斜面种子金氏B培养基上培养。采用孢子直接接种的方法，将种龄16h的菌种按接种量108个孢子/30ml培养基，接种到发酵培养基(含：甘油10g/L、蛋白胨F40310g/L(上海市水产研究所)、蛋白胨(安琪酵母股份有限公司)10g/L、酵母粉5g/L、硝酸铵5g/L、硫酸镁1.5g/L、磷酸氢二钾1.5g/L、三氯化铁2mg/L、硫酸锰5mg/L、硫酸锌2.5mg/L、硼酸1.4mg/L，pH7.2)中。接种时加入前体物质莽草酸0.01g/L、苯胺0.01g/L、邻苯二酚0.01g/L。
装量为30ml/250ml三角瓶、培养温度为28℃、转速220rpm。接种后pH开始回升时加入莽草酸2g/L、苯胺1g/L、邻苯二酚1g/L。发酵周期为48小时。
制备实施例2至5摇瓶发酵
按照制备实施例1的方法进行摇瓶发酵，不同的是，发酵培养基分别为：
制备实施例2：甘油10g/L、蔗糖10g/L、蛋白胨F40320g/L、硝酸铵0.5g/L、硫酸镁1g/L、磷酸氢二钾1g/L、维生素B110mg/L、三氯化铁2mg/L、硫酸锰5mg/L、硫酸锌2.5mg/L、碘化钾0.7mg/L、硼酸1.4mg/L，pH7.2。
制备实施例3：葡萄糖10g/L、蔗糖10g/L、蛋白胨20g/L、硝酸铵0.5g/L、硫酸镁1g/L、磷酸氢二钾1g/L、维生素B110mg/L，pH7.2。
制备实施例4：葡萄糖5g/L、甘油5g/L、蔗糖10g/L、蛋白胨F40310g/L、蛋白胨10g/L、硫酸镁1.5g/L、磷酸氢二钾1.5g/L、维生素B110mg/L、三氯化铁2mg/L、硫酸锰5mg/L、硫酸锌2.5mg/L、碘化钾0.7mg/L、硼酸1.4mg/L，pH7.2。
制备实施例5：甘油10g/L、蛋白胨F40320g/L、硫酸镁1.5g/L、磷酸氢二钾1.5g/L、维生素B110mg/L、三氯化铁2mg/L、硫酸锰5mg/L、硫酸锌2.5mg/L、碘化钾0.7mg/L、硼酸1.4mg/L，pH7.2。
接种时加入前体物质的量分别为：
制备实施例2：莽草酸0.05g/L、苯胺0.05g/L、邻苯二酚0.05g/L；
制备实施例3：莽草酸0.1g/L、水杨酸0.1g/L、二氨基酚0.1g/L；
制备实施例4：水杨酸0.01g/L、1,2-苯二胺0.01g/L；
制备实施例5：水杨酸0.01g/L、莽草酸0.05g/L。
接种后pH出现回升时加入的前体物质的量分别为：
制备实施例2：莽草酸0.5g/L、苯胺0.5g/L、邻苯二酚0.5g/L；
制备实施例3：莽草酸6g/L、水杨酸6g/L、二氨基酚6g/L；
制备实施例4：水杨酸3g/L、1,2-苯二胺3g/L；
制备实施例5：水杨酸5g/L、莽草酸5g/L。
制备实施例67L罐发酵
按照准备实施例的方法，不同的是温度为28℃，220rpm、培养16小时，得到一级种子的菌体，采用菌体进罐方法，OD600为1的菌悬液与发酵液以10％的体积比接种，接种到7L发酵罐中的发酵培养基(葡萄糖10g/L、蔗糖10g/L、蛋白胨F40310g/L、蛋白胨10g/L、硝酸铵0.5g/L、硫酸镁1g/L、磷酸氢二钾1g/L、VB110mg/L、三氯化铁2mg/L、硫酸锰5mg/L、硫酸锌2.5mg/L、碘化钾0.7mg/L、硼酸1.4mg/L，pH7.2)中。
在接种同时加入前体物质：莽草酸0.05g/L、苯胺0.05g/L、邻苯二酚0.05g/L。发酵过程中前期pH值自然(不用控制)，菌体生长达pH开始回升时，用20重量％的氨水控制pH值在7.5～8.5之间。在接种后到菌体生长至pH开始回升前通气量较大，控制溶氧值达40％以上，pH值回升后通气量降低，控制溶氧值达10-40％，有利于吩嗪酰胺的合成。于接种后12小时用流加方法加入10g/L的甘油，持续24小时。于pH出现回升时立即一次性加入前体物质：莽草酸2g/L、苯胺2g/L、邻苯二酚2g/L。发酵周期为56小时。
制备实施例77L罐发酵
菌种为荧光假单孢菌的分离、纯化鉴定实施例所得菌种，用细菌培养基(甘油、蛋白胨、琼脂)于28℃培养16小时的菌种斜面，接种量为109个孢子/1L培养基。采用斜面菌种直接进罐的方法，将所得斜面菌种接种到7L发酵罐的发酵培养基(甘油10g/L、蛋白胨10g/L、蛋白胨F40310g/L、硫酸镁0.1g/L、磷酸氢二钾1g/L、维生素B110mg/L、三氯化铁2mg/L、硫酸锰5mg/L、硫酸锌2.5mg/L、碘化钾0.7mg/L、硼酸1.4mg/L，pH7.2)中，接种时加入0.01％的莽草酸、0.01％苯胺、0.01％邻苯二酚。
整个发酵过程用20重量％的氨水和2mol/L的盐酸控制pH7.5～8.5，在接种后期通过调整通气量控制溶氧值在40％以上，在生长平台后期以后控制溶氧值在10-40％。并于接种后18小时，用流加的方法加入甘油10g/L、蛋白胨F40310g/L，持续24小时；在发酵到生长平台后期加前体物质：莽草酸2g/L、苯胺1g/L、邻苯二酚1g/L。发酵周期为56小时。
制备实施例87L罐发酵
按照制备实施例7的方法发酵培养，只是发酵培养基为：甘油10g/L、蛋白胨F40320g/L、硫酸镁0.5g/L、磷酸氢二钾1.5g/L、维生素B110mg/L、三氯化铁2mg/L、硫酸锰5mg/L、硫酸锌2.5mg/L、碘化钾0.7mg/L、硼酸1.4mg/L，pH7.2。
接种时加入前体物质为：水杨酸0.1g/L、1,2苯二胺0.1g/L。发酵过程中用20重量％氨水和2mol/L盐酸控制pH7.5～8.5之间。在接种后至生长平台后期，溶氧值控制在40％以上，平台后期以后控制溶氧值在10-40％，并于12小时后一次性加前体物质：水杨酸4g/L、1,2苯二胺4g/L。发酵周期为56小时。
制备实施例97L罐发酵
按照准备实施例的方法培养种子，种子培养基为：葡萄糖10g/L、甘油10g/L、蛋白胨20g/L、氯化钠5g/L、硫酸镁0.1g/L、磷酸二氢钠5g/L，pH7.2。种子于28℃，220rpm培养16小时。
采用常规的菌体进罐方法，将所得种子接种于7L发酵罐中，OD600为1的菌悬液与发酵液以15％的体积比接种，发酵培养基为(葡萄糖10g/L、甘油10g/L、蛋白胨F40320g/L、硝酸铵0.5g/L、硫酸镁0.5g/L、磷酸氢二钾1.5g/L、维生素B110mg/L、三氯化铁2mg/L、硫酸锰5mg/L、硫酸锌2.5mg/L、碘化钾0.7mg/L、硼酸1.4mg/L，pH7.2)。
接种时加入前体物质：莽草酸0.05g/L。发酵过程中用20重量％氨水和2mol/L盐酸控制pH7.5～8.5之间。在接种后至pH值回升时，溶氧值控制在40％以上，pH值回升后控制溶氧值在40％以下。接种后12小时开始流加甘油20g/L，持续24小时，于pH开始回升时一次性加入前体物质：6g/L莽草酸。发酵周期为56小时。
制备实施例107L罐发酵
按照制备实施例9的方法进行7L罐发酵，不同的是接种时加入前体物质：水杨酸0.1g/L、莽草酸0.1g/L；接种后12小时开始流加20g/L蔗糖，持续24小时，于接种后12小时一次性加入前体物质：6.5g/L水杨酸、6.5g/L莽草酸，发酵周期为56小时。
制备实施例1150L罐发酵
按照准备实施例的方法培养种子，将所得一级种子以OD600为1的菌悬液与发酵液以10％的体积比接种到培养基(葡萄糖10g/L、甘油10g/L、蛋白胨10g/L、蛋白胨F40310g/L、硝酸铵0.5g/L、硫酸镁0.2g/L、磷酸氢二钾1.5g/L、VB110mg/L，pH7.2)中。
在接种同时加入前体物质：莽草酸0.1g/L、水杨酸0.1g/L、1,2苯二胺0.1g/L。发酵过程中不调节pH值，使pH值自然变化。于接种后12小时用流加方法加入甘油10g/L和蛋白胨10g/L，持续24小时。在发酵到pH值开始回升时，一次性加入前体物质莽草酸2g/L、水杨酸2g/L、苯二胺2g/L。加完前体后，用20重量％氨水控制pH值在8.0～8.5之间。发酵周期为56小时。在接种后到菌体生长至平台前期通气量较大，控制溶氧值达40％以上,平台期后通气量降低，控制溶氧值达10-40％，发酵周期56小时。
制备实施例1250L罐发酵
按照准备实施例的方法培养种子，不同的是，种子培养基为：甘油15g/L、蛋白胨F40325g/L、硫酸镁0.5g/L、磷酸氢二钾5g/L，pH7.2。种子于28℃，220rpm培养12小时。
采用常规的菌体进罐方法，将所得菌体接种到50L发酵罐中，OD600为1的菌悬液与发酵液以15％的体积比接种，发酵培养基为(甘油10g/L、蛋白胨F40320g/L、硝酸铵0.5g/L、硫酸镁0.5g/L、磷酸氢二钾5g/L、维生素B110mg/L，pH7.2)。
接种时加入前体物质：莽草酸0.1g/L；发酵过程中用20重量％氨水和2mol/L盐酸控制pH7.5～8.5之间。在接种后至pH开始回升时，溶氧值控制在40％以上，pH开始回升后控制溶氧值在10-40％。接种后12小时开始流加甘油20g/L和酵母提取物10g/L，持续24小时，于pH值开始回升时一次性加入前体物质：莽草酸6.5g/L。发酵周期为56小时。
制备实施例1350L罐发酵
按照准备实施例的方法培养种子，不同的是，种子培养基为：葡萄糖10g/L、甘油10g/L、蛋白胨10g/L、蛋白胨F40310g/L、硫酸镁0.5g/L、磷酸氢二钾5g/L、氯化钠5g/L，pH7.2。种子于28℃，220rpm培养12小时。
采用常规的菌体进罐方法，将所得菌体接种到50L发酵罐中，OD600为1的菌悬液与发酵液以15％的体积比接种，发酵培养基为(葡萄糖5g/L、甘油10g/L、蔗糖10g/L、蛋白胨10g/L、蛋白胨F40310g/L、氯化铵0.5g/L、硫酸镁0.5g/L、磷酸氢二钾5g/L，pH7.2)。
接种时加入前体物质：水杨酸0.05g/L、莽草酸0.02g/L；发酵过程中用20重量％氨水和2mol/L盐酸控制pH7.5～8.5之间。在接种后至pH值回升时，溶氧值控制在40％以上，pH回升后溶氧值在10-40％。于pH开始回升时一次性加入前体物质：水杨酸5g/L、莽草酸2g/L，于12小时后流加10g/L发酵培养基，持续24小时。发酵周期为56小时。
制备实施例1450L罐发酵
按照准备实施例的方法培养种子，不同的是，种子培养基为：甘油10g/L、蛋白胨20g/L、硝酸铵0.5g/L、硫酸镁0.5g/L、磷酸氢二钾1.5g/L、氯化钠5g/L，pH7.2。种子于28℃，220rpm培养12小时。
采用常规的菌体进罐方法，将所得菌体接种到50L发酵罐中，OD600为1的菌悬液与发酵液以15％的体积比接种，发酵培养基为(甘油15g/L、蛋白胨20g/L、硝酸铵0.5g/L、硫酸镁0.5g/L、磷酸氢二钾1.5g/L、维生素B110mg/L、三氯化铁2mg/L、硫酸锰5mg/L、硫酸锌2.5mg/L、碘化钾0.7mg/L、硼酸1.4mg/L，pH7.2)。
接种时加入前体物质：水杨酸0.05g/L、苯胺0.05g/L、邻苯二酚0.05g/L；发酵过程中用20重量％氨水和2mol/L盐酸控制pH7.5～8.5之间。在接种后至pH开始回升时，溶氧值控制在40％以上，pH值回升后控制溶氧值在10-40％。于pH开始回升时一次性加入前体物质：水杨酸1g/L、苯胺1g/L、邻苯二酚1g/L，同时流加10g/L发酵培养基，持续12小时。发酵周期为56小时。
制备实施例1550L罐发酵
按照准备实施例的方法培养种子，不同的是，种子培养基为：葡萄糖10g/L、甘油10g/L、蛋白胨F40310g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠5g/L、硫酸镁0.5g/L、磷酸氢二钾1g/L，pH7.2。种子于28℃，220rpm培养12小时。
采用常规的菌体进罐方法，将所得菌体接种到50L发酵罐中，OD600为1的菌悬液与发酵液以15％的体积比接种，发酵培养基为(甘油10g/L、蛋白胨F40320g/L、硝酸铵0.5g/L、酵母提取物0.5g/L、硫酸镁0.5g/L、磷酸氢二钾5g/L、维生素B110mg/L、三氯化铁2mg/L、硫酸锰5mg/L、硫酸锌2.5mg/L、碘化钾0.7mg/L、硼酸1.4mg/L，pH7.2)。
发酵过程中用20重量％氨水和2mol/L盐酸控制pH7.5～8.5之间。在接种后至pH开始回升时，溶氧值控制在40％以上，pH回升后控制溶氧值在10-40％。接种后12小时开始流加20g/L蔗糖和10g/L酵母提取物，持续24小时，于pH值开始回升时一次性加入前体物质：6.5g/L莽草酸。发酵周期为56小时。
制备实施例16摇瓶发酵
采用制备实施例2的方法进行摇瓶发酵，不同的是：
接种时加入前体物质的量为：莽草酸0.15g/L；
接种后pH开始回升时加入的前体物质的量为：莽草酸1.5g/L。
制备实施例17摇瓶发酵
采用制备实施例2的方法进行摇瓶发酵，不同的是：
发酵培养基为甘油20g/L、蛋白胨F40320.5g/L、硫酸镁1g/L、磷酸氢二钾1g/L、维生素B110mg/L、三氯化铁2mg/L、硫酸锰5mg/L、硫酸锌2.5mg/L、碘化钾0.7mg/L、硼酸1.4mg/L，pH7.2。
分离和纯化实施例1至5
将制备实施例6至10所得发酵液依次用10mol/L氢氧化钠调节pH9，并将所得发酵液分离出发酵菌体和发酵上清液，在所得发酵上清液中加入十分之一体积的三氯甲烷萃取、分液，取水相再次用三氯甲烷萃取、分液，把两次萃取所得有机相合并，减压浓缩得浸膏。依次得浸膏8、9、8.5、8.6、9.2g/5L。
从制备实施例6所得浸膏的TLC图见图1，HPLC图谱见图2。由图可见样品中含有相当大含量的吩嗪酰胺。图1、2中箭头表示出的斑点或峰是吩嗪酰胺的斑点或峰。从制备实施例7-10所得浸膏的TLC图和HPLC图谱与图1和图2类同。
将前面所得物用流动相溶解后，溶液分别装入色谱柱：硅胶(200目，柱径高(cm)5×40)中，流动相分别为：1％乙醇/99％CH2Cl2、在1.6-10MPa压力下梯度洗脱，流速10mL/min，收集纯化产物，减压浓缩，得纯度约95％的吩嗪酰胺。
将所得纯度约95％的吩嗪酰胺溶于50℃甲醇中，慢慢冷却，析出吩嗪酰胺针状晶体，过滤，减压干燥，即得纯度为98％的吩嗪酰胺。重复前述重结晶过程2至3次，过滤，减压干燥，即得纯度为99.5％的吩嗪酰胺。
分离和纯化实施例1所得最终产物的1H谱如图3所示。
分离和纯化实施例1所得最终产物的13C谱如图4-5所示。
分离和纯化实施例1所得最终产物的DEPT135谱如图6所示。
分离和纯化实施例1所得最终产物的COSY谱如图7所示。
分离和纯化实施例1所得最终产物的HSQC谱如图8所示。
分离和纯化实施例1所得最终产物的HMBC谱如图9-10所示。
经过对1H谱、13C谱、DEPT135谱、COSY谱、HSQC谱以及HMBC谱的解析，可认定分离和纯化实施例1所得最终产物的核磁共振氢谱、碳谱及化学位移相关谱与吩嗪酰胺的结构式相符，具体结构式和谱峰归属如下所示：
通过上述表征可以确定，分离和纯化实施例1所得最终产物为吩嗪酰胺。
分离和纯化实施例2-5所得最终产物与分离和纯化实施例1所得最终产物的1H谱、13C谱、DEPT135谱、COSY谱、HSQC谱以及HMBC谱相近。
分离和纯化实施例1-5所得吩嗪酰胺的产率和纯度如表2所示。
分离和纯化实施例6-7
将制备实施例11-12所得发酵液的pH值调整为9并将所得发酵液分离出发酵菌体和发酵上清液，在所得发酵上清液中加入三分之一体积的三氯甲烷，振摇2小时，分液得有机相，真空旋转蒸发得浸膏。制备实施例11-12所得浸膏的TLC图和HPLC图谱与图1和图2类同。
将前面由发酵液所得物浸膏用流动相溶解后，溶液分别装入色谱柱：硅胶(300目，柱径高(cm)5×40)中，流动相分别为：5％甲醇/95％CHCl3，在中压下梯度洗脱，流速30mL/min，收集纯化产物，减压干燥，得纯度约94％的吩嗪酰胺。
将所得纯度约94％的吩嗪酰胺溶于热甲醇60℃中，缓慢降温，吩嗪酰胺针状晶体析出，过滤，重复前述重结晶过程2～4次，过滤，减压干燥，即得纯度为99.5％的吩嗪酰胺。
分离和纯化实施例6-7所得最终产物与分离和纯化实施例1所得最终产物的1H谱、13C谱、DEPT135谱、COSY谱、HSQC谱以及HMBC谱相近。
分离和纯化实施例6-7所得吩嗪酰胺的产率和纯度如表2所示。
分离和纯化实施例8-15
按照分离和纯化实施例6的方法，对制备实施例1至5及13至15所得物进行分离纯化，得纯度为99.5％的吩嗪酰胺。
分离和纯化实施例8-15所得最终产物与分离和纯化实施例1所得最终产物的1H谱、13C谱、DEPT135谱、COSY谱、HSQC谱以及HMBC谱相近。
分离和纯化实施例8-15所得吩嗪酰胺的产率和纯度如表2所示。
分离和纯化实施例16-18
按照分离和纯化实施例1的方法，对制备实施例7至9所得物进行分离纯化，不同的是在制备实施例7至9所得发酵液，用2mol/L氢氧化钠溶液慢慢的加入发酵液，不断搅拌，调节pH依次为7.8、8.0、8.2。得终产物吩嗪酰胺。
分离和纯化实施例16-18所得最终产物与分离和纯化实施例1所得最终产物的1H谱、13C谱、DEPT135谱、COSY谱、HSQC谱以及HMBC谱相近。
分离和纯化实施例16-18所得吩嗪酰胺的产率和纯度如表2所示。
分离和纯化实施例19-20
按照分离和纯化实施例1的方法，对制备实施例16-17所得物进行分离纯化。
分离和纯化实施例19-20所得最终产物与分离和纯化实施例1所得最终产物的1H谱、13C谱、DEPT135谱、COSY谱、HSQC谱以及HMBC谱相近。
分离和纯化实施例19-20所得吩嗪酰胺的产率和纯度如表2所示。
表2
| 实施例编号 | 所得吩嗪酰胺g/L | 所得吩嗪酰胺纯度％ |
| 分离和纯化实施例1 | 1.8 | 99.5 |
| 分离和纯化实施例2 | 1.9 | 99.5 |
| 分离和纯化实施例3 | 2.1 | 99.5 |
| 分离和纯化实施例4 | 1.95 | 99.5 |
| 分离和纯化实施例5 | 1.83 | 99.5 |
| 分离和纯化实施例6 | 2.2 | 99.5 |
| 分离和纯化实施例7 | 2.78 | 99.5 |
| 分离和纯化实施例8 | 2 | 99.5 |
| 分离和纯化实施例9 | 2.2 | 99.5 |
| 分离和纯化实施例10 | 1.97 | 99.5 |
| 分离和纯化实施例11 | 1.6 | 99.5 |
| 分离和纯化实施例12 | 1.8 | 99.5 |
| 分离和纯化实施例13 | 1.85 | 99.5 |
| 分离和纯化实施例14 | 1.98 | 99.5 |
| 分离和纯化实施例15 | 2.2 | 99.5 |
| 分离和纯化实施例16 | 2.1 | 99.5 |
| 分离和纯化实施例17 | 2.0 | 99.5 |
| 分离和纯化实施例18 | 1.95 | 99.5 |
| 分离和纯化实施例19 | 3.01 | 99.5 |
| 分离和纯化实施例20 | 2.92 | 99.5 |
从表2可以看出，通过本发明提供的制备吩嗪酰胺的方法，能够获得较高的产率。
测试实施例
将水稻白叶枯病菌接种于NA液体培养基中，震荡培养24小时后(265rpm，28℃)，调整浓度为10×105CFU/mL的菌悬液，取1mL菌液接种于100mL已经熔化(42℃恒温)的NA琼脂培养基中，迅速混匀后分别倒入培养皿中，平板凝固干燥后，用打孔器打直径为2mm的孔，用移液器分别吸取1重量％的吩嗪酰胺、1重量％的吩嗪羧酸(购自Sigma-Aldrich)加入孔内。于28℃恒温培养箱中培养24h。测定抑菌圈直径如表3所示。
表3
从表3可以看出，本发明的方法提供的吩嗪酰胺与吩嗪羧酸相比，对水稻白叶枯病菌的抑制效果显著较好，尤其在低浓度时效果极其明显。由此可见，本发明的方法提供的吩嗪酰胺对水稻白叶枯病菌显示出较高的生物活性。
以上仅为本申请的较佳实施例而已，并非用于限定本申请的保护范围，因此，凡在本申请的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种荧光假单孢菌(Pseudomonas)sp.ST16，保藏编号为CGMCCNo.2397。
2.一种生产吩嗪酰胺的方法，该方法包括在培养基中培养权利要求1所述的荧光假单孢菌CGMCCNo.2397以使在所述菌株细胞内和所述培养基中产生和聚集吩嗪类化合物，以及从所述菌株细胞内和所述培养基中回收并提纯吩嗪酰胺。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述培养基含有碳源物质和氮源物质，其中所述碳源物质选自葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖和甘油中的一种或多种，所述碳源物质优选选自甘油，所述培养基中所述碳源物质的加入量为5-80g/L；所述氮源物质选自玉米浆、酵母粉、蛋白胨、牛肉浸膏、酵母提取物、硝酸铵、氯化铵和硫酸铵中的一种或多种，所述氮源物质优选选自蛋白胨，进一步优选选自蛋白胨F403，所述培养基中所述氮源物质的加入量为5-120g/L。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述培养基中所述碳源物质与所述氮源物质的加入量重量比为1:1-10。
5.根据权利要求2或3所述的方法，其中，所述培养基还含有磷酸盐和/或镁盐；所述磷酸盐选自磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠和磷酸氢二钠中的一种或多种，所述培养基中所述磷酸盐的加入量为1-5g/L；所述镁盐选自硫酸镁，所述培养基中所述镁盐的加入量为0.1-1.5g/L。
6.根据权利要求2或3所述的方法，其中，所述培养基还含有占培养基0.28-18.3g/L的前体物质，所述前体物质选自莽草酸、酪氨酸、苯胺、1,2-苯二胺、临苯二酚、邻氨基苯甲酸、水杨酸和2-氨基酚中的一种或多种，所述前体物质优选为莽草酸。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述前体物质分两次加入所述培养基中，第一次在接种时加入占培养基0.01-0.3g/L的所述前体物质，第二次在菌体生长至pH值出现回升时立即加入占培养基0.27-18g/L的所述前体物质。
8.根据权利要求2-4中任一项所述的方法，其中，所述培养在需氧条件下进行，培养温度为23-38℃，初始pH值为5.5-11，在培养中后期调节pH值为4-9.5，培养时间为24-68h。
9.根据权利要求2-4中任一项所述的方法，其中，回收并提纯吩嗪酰胺包括以下步骤：
(1)将所述培养过程所得培养液的pH值调整为8-10并将所得培养液分离出发酵菌体和发酵上清液；
(2)用有机溶剂提取所得的发酵上清液，挥干溶剂；
(3)将第(2)步所得物用色谱纯化的方法和结晶纯化的方法纯化。
10.权利要求2-9中任一项所述的方法制备的吩嗪酰胺在生物农药中的应用。
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