CN104059950B - 一种化合物的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种制备式（I）化合物的方法，该方法包括在培养基中培养微生物链格孢单孢变种ST‑026‑R CGMCC No.0899，以使所述微生物细胞内和所述培养基中产生和聚集所述式（I）化合物，以及从所述微生物细胞内和培养基中回收并提纯所述式（I）化合物，其中，在所述培养基中，碳源物质与氮源物质的重量比为10‑18:1，
Description
技术领域
本发明涉及一种化合物的制备方法。
背景技术
CN 1880309A公开了一种结构式为(a)的具有抗癌、抗真菌、抗病毒活性的化合物，该化合物是由该专利菌株发酵后经提取纯化而得。该化合物抗癌机理为促进癌细胞凋亡，抗真菌机理为真菌细胞壁β-1,3-葡聚糖合成酶抑制剂。
该专利还公开了化合物(a)的制备方法，由CN 1880309A公开的方法可以实现化合物(a)最高82％的回收率和最高99.5％的纯度，其回收率还有进一步提高的空间。
发明内容
本发明的目的是提供一种与上述化合物(a)结构相近但取代基不同的化合物的制备方法，由该方法制备的目标产物的活性更高，且回收率得到了进一步地提高。
本发明具体提供了一种制备下述式(I)化合物的方法，其包括在培养基中培养微生物链格孢单孢变种(Alternaria alternate var.monosporus)ST-026-R CGMCCNo.0899，以使所述微生物细胞内和所述培养基中产生和聚集所述式(I)化合物，以及从所述微生物细胞内和培养基中回收并提纯所述式(I)化合物，其中，在所述培养基中，碳源物质与氮源物质的重量比为10-18:1
式(I)化合物的物理性质如下：
外观：金黄色晶体；
熔点：213℃；
比旋光度：7.21°；
分子量：350；
分子式：C20H14O6；
UVλmaxnm(ε)：206；
MS图谱：见图3；
IR光谱：见图4；
系列NMR光谱：H－H COSY谱(见图8)、C－H COSY(见图9)；
根据本发明的方法制备的式(I)化合物与专利CN 1880309A公开的化合物(a)的结构相近，不同的是，本发明的式(I)化合物的4位为羰基，而前述化合物(a)的4位为羟基。因以上的化学结构不同，由本发明提供的方法制备的式(I)化合物的生物学活性是已知化合物(a)的数倍，特别是对抗胰腺癌、肝癌、胃癌、前列腺癌、白血病、癌症转移、真菌感染的生物学活性，可开发成新一代的抗癌药物、抗真菌药物，应用前景广阔。
本发明所用的微生物链格孢单孢变种(Alternaria alternate var.monosporus)ST-026-R CGMCC No.0899与专利CN1880309A公开的命名为链格袍单袍变种，学名为Alternaria alernata var.monosporus，代号为ST026-R，菌种保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址:北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所，保藏日期：2003年03月04日，保藏号为:CGMCC No.0899的微生物相同。
本发明通过采用碳源物质与氮源物质的特殊的重量比，例如在所述培养基中碳源物质与氮源物质的重量比为10-18:1来制备与专利CN1880309A中化合物不同的本发明的化合物。
根据本发明，在培养过程中，优选情况下，向所述培养基中加入诱导子物质。所述诱导子物质可以一次加入，也可以分两次加入。优选地，向所述培养基中分两次加入诱导子物质，第一次是在接种时加入，第二次是在菌体生长的对数生长前期加入。通过将所述诱导子物质分两次加入所述培养基中，极大地促进了所述微生物的生长和提高了本发明的式(I)化合物的产率，从而有利于提高式(I)化合物的回收率。
在一个实施方式中，第一次加入的所述诱导子物质占所述培养基的0.001-0.05重量％；第二次加入的所述诱导子物质占所述培养基的0.005-0.1重量％。
根据本发明的一个实施方式，所述诱导子物质包括但不限于柠檬酸铵、硝酸铈铵、高锰酸钾、丙酮酸、对－香豆酸、硫酸钒、马尿酸、α-萘乙酸、6-苄氨基嘌呤、硝酸银、肉桂酸中的一种或多种。
根据本发明，在培养过程中，优选情况下，向所述培养基中加入前体物质。所述前体物质可以一次加入，也可以分两次加入。优选地，向所述培养基中分两次加入前体物质，第一次是在接种时加入，第二次是在所述微生物产生蓝绿色素时加入。通过将所述前体物质分两次加入所述培养基中，极大地促进了所述微生物的生长和提高本发明的式(I)化合物的产率，从而有利于提高式(I)化合物的回收率。
根据本发明的一个实施方式，第一次加入的所述前体物质占所述培养基的0.01-0.05重量％；第二次加入的所述前体物质占所述培养基的0.04-0.15重量％。
根据本发明的一个实施方式，所述前体物质可以为有助于所述微生物生长的常规或已知前体物质中的一种或多种的前体物质。本发明优选所述前体物质为苯甲酰胺、丙酰胺和乙酰胺中的一种或多种。
根据本发明的一个实施方式，第一次加入的所述前体物质与第二次加入的所述前体物质的重量比可以在较宽范围内选择，进一步优选情况下，当第一次加入的所述前体物质与第二次加入的所述前体物质的重量比为1：8-15时，能够更好的实现本发明的目的。
根据本发明的一个实施方式，所述培养基可以是本领域常规或已知的培养基。所述培养基中的所述碳源物质可以选自葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖、甘油、淀粉、乳糖、半乳糖中的一种或多种。所述碳源物质的加入量可以为30-150g/L。
根据本发明的一个实施方式，所述氮源物质可以选自冷榨黄豆饼粉、棉子饼粉、玉米浆、酵母粉、蛋白胨、牛肉浸膏和酵母提取物中的一种或多种。优选情况下，所述氮源物质选自冷榨黄豆饼粉，或者冷榨黄豆饼粉和其他除了冷榨黄豆饼粉外的氮源物质中的一种或多种的组合。当采用冷榨黄豆饼粉作为主要的氮源物质时，能够显著提高式(I)化合物的产率，从而有利于提高式(I)化合物的回收率。更优选情况下，选择冷榨黄豆饼粉作为单一氮源物质，更有利于提高式(I)化合物的产率。
根据本发明的一个实施方式，所述氮源物质的加入量可以为2.5-10g/L。
根据本发明的一个实施方式，还可以向培养基中加入无机或有机盐物质以促进微生物的生长和提高本发明的式(I)化合物的产率。优选情况下，所述无机或有机盐物质选自磷酸盐、钙盐、镁盐、铁盐、钠盐中的一种或多种。所述无机或有机盐物质的加入量可以为0.5-5g/L。根据本发明的一个实施方式，还可以向培养基中加入能够促进微生物的生长和提高本发明的式(I)化合物的产率的微量物质。所述微量物质包括但不限于硼酸、碘化钾、二氯化钴、硫酸锌、硫酸锰和维生素中的一种或多种。所述微量物质的加入量可以为1-130mg/L。
本发明中，将所述无机或有机盐物质和所述微量物质加入所述培养基的时间和先后次序没有特别的要求。本领域技术人员可以根据已知的或常规的操作将其加入所述培养基。例如，本领域技术人员可以选择将所述无机或有机盐物质和所述微量物质与所述碳源物质和氮源物质一起混合形成所述培养基。
根据本发明的一个实施方式，所述培养在需氧条件下进行，其中，所述需氧条件可以通过使用摇瓶在本领域常规或已知的转速下进行或者通过搅拌在本领域常规或已知的搅拌速度下进行亦或通过直接通入氧气来实现，优选情况下，通入的氧气与发酵液的体积比为1：1-10；所述培养的温度可以为23-29℃，培养初始pH值(即接种前所述培养基的pH值)可以为5.5-8，优选为6.8-7.2，在培养中后期(即微生物的生长从对数期进入平台后期的时期)调节pH值为6-7.5。培养时间本领域技术人员可以根据培养条件进行选择，例如，培养可以进行6-10天。
根据本发明的一个实施方式，所述培养可以在本领域常规或已知的装置中进行，例如可使用摇瓶，也可以在常规的发酵罐中进行，例如7L、50L发酵罐。
当使用7L、50L发酵罐时，可在培养过程中补充碳源和氮源物质，在培养前期不用调节培养基的pH值，在培养中后期可调节pH值为6-7。可以采用菌丝体进罐的接种方式。在接种后到菌体生长至平台前期可使用较大通气量(例如通入的氧气量和发酵液体积比为1：0.8-1.5)，平台后期通气量可降低(例如通入的氧气量和发酵液体积比为1：0.5-0.8)。
为了从培养基中分离出式(I)化合物，可以使用本领域常规或已知的用于从微生物的培养基中分离代谢物的任何分离方法。例如，可以通过离心或过滤从培养过程所得培养液中分离出菌丝体和滤液，式(I)化合物可以用一种或一种以上不与水相混的第一有机溶剂从滤液中萃取出来。另一方面，分离出的菌丝体中所包含的式(I)化合物可以通过例如用一种或一种以上的第二有机溶剂从菌丝体中提取出来。所得式(I)化合物粗产物可以使用本领域常规或已知的纯化方法纯化，例如色谱法和/或结晶法。其中，第一有机溶剂与第二有机溶剂的选择本领域技术人员可以根据实际情况进行。
根据本发明的一个实施方式，优选情况下，回收并提纯所述式(I)化合物包括以下步骤：(1)将所述培养过程所得培养液的pH值调整为4-8并分离出发酵微生物和发酵上清液；(2)将所述发酵微生物干燥并控制其含水量为25-35重量％，并在-20℃至-70℃放置8-12h；(3)在避光的条件下，用第一有机溶剂提取步骤(2)的所得物；用第二有机溶剂萃取所述发酵上清液，挥干溶剂；(4)将第(3)步所得物依次用正相吸附色谱法和结晶的方法纯化。
本发明中，通过在第(2)步骤控制干燥后的发酵微生物的含水量在25-35重量％范围内，在-20℃至-70℃放置期间，发酵微生物孢内、孢外的水形成冰晶，在加入第一有机溶剂后，发酵冰晶刺破发酵微生物的细胞膜，从而有利于发酵微生物细胞内的式(I)化合物被提取出来。
根据本发明的一个实施方式，所述第一有机溶剂选自乙酸乙酯与丙酮以1:1-2的体积比混合的混合物、乙酸乙酯与三氯甲烷以1:1-2的体积比混合的混合物、pH值为3-5的甲醇和pH值为3-5的乙醇(甲醇或乙醇的pH可以通过酸例如盐酸来调节)中的一种或多种。通过采用所述第一有机溶剂，有利地提高了式(I)化合物的回收率。
根据本发明的一个实施方式，所述第二有机溶剂选自二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯和丙酮中的一种或多种。更优选情况下，所述第二有机溶剂选自三氯甲烷和/或二氯甲烷。
本发明中，所述第一有机溶剂和所述第二有机溶剂的用量可以根据本领域技术人员已知的或常规的用量进行选择。
根据本发明，可以按照本领域常规或已知的方法进行挥干溶剂，例如自然挥发、减压浓缩等。
根据本发明的一个实施方式，所述第(4)步骤中所述正相吸附色谱法包括：使用一个或一个以上的色谱柱，色谱柱填料包括硅胶或氧化铝，流动相包括丙酮和/或二氯甲烷；对第(3)步所得物采用二氯甲烷、丙酮与二氯甲烷以4:96的体积比混合的混合物、丙酮与二氯甲烷以20:80的体积比混合的混合物以及丙酮依次进行梯度洗脱，有利地提高了式(I)化合物的回收率。
根据本发明的一个实施方式，所述第(4)步骤中所述结晶的方法包括：将经过正相吸附色谱法的所得物减压浓缩至饱和，加入等体积的石油醚，静置结晶、过滤、干燥。优选情况下，还可以对石油醚处理过的结晶产物先采用二氯甲烷溶解，待二氯甲烷溶解达饱和，加入等体积的石油醚进行二次结晶。有利于进一步提高产物的回收率。
通过本发明提供的方法，能够有效提高式(I)化合物的回收率，优选情况下，通过对回收并提纯工艺的改进，能够更有效地提高式(I)化合物的纯度和回收率。
附图说明
图1是根据本发明的分离和纯化实施例6所述方法用二氯甲烷提取发酵菌丝体样品的TLC图。
图2是根据本发明的分离和纯化实施例6所述方法用乙酸乙酯提取发酵菌丝体样品的HPLC图谱。
图3是根据本发明的分离和纯化实施例6所述方法制得的式(I)化合物样品的MS图谱。
图4是根据本发明的分离和纯化实施例6所述方法制得的式(I)化合物样品的IR图谱。
图5是根据本发明的分离和纯化实施例6所述方法制得的式(I)化合物样品的H谱。
图6是根据本发明的分离和纯化实施例6所述方法制得的式(I)化合物样品的C谱。
图7是根据本发明的分离和纯化实施例6所述方法制得的式(I)化合物样品的DEPT谱。
图8是根据本发明的分离和纯化实施例6所述方法制得的式(I)化合物样品的H－HCOSY谱。
图9是根据本发明的分离和纯化实施例6所述方法制得的式(I)化合物样品C－HCOSY谱；
具体实施方式
下面将通过实施例对本发明作进一步的描述，这些描述并不是对本发明内容作进一步的限定。本领域的技术人员应理解，对本发明技术特征所作的等同替换，或相应的改进，仍属于本发明的保护范围之内。
以下实施例中所用原料均来自商购。
化合物的元素分析通过Elementar Vario EL元素分析仪进行；
质谱通过英国VG公司ZAB-HS双聚焦磁质谱仪获得；
红外光谱通过Bruker公司EQUINOX55傅里叶变换红外光谱仪获得；
核磁共振谱通过美国Varian公司unitiINOVA500超导核磁共振谱仪获得；
化合物的纯度通过美国waters公司高效液相色谱仪进行；
发酵菌体和发酵清液中化学式I的化合物的含量通过美国waters公司高效液相色谱仪进行；
回收率的计算公式：
回收率＝(二次重结晶后化学式I的化合物的重量/发酵菌体和发酵清液中化学式I的化合物的总重量)×100％。
准备实施例(种子培养)
接种微生物链格孢单孢变种(Alternaria alternate var.monosporus)ST-026-RCGMCC No.0899(CN1880309A中公开)菌株，采用孢子直接接种的方法，将种龄7天的菌种按接种量2×106个孢子接种至装有100mL种子培养基(见表1)的250mL三角瓶中，于25℃，200rpm摇床培养24小时，即得待接种的菌种。
表1：种子培养基
| 成分与pH值 | 质量/g |
| 葡萄糖 | 2％ |
| 冷榨黄豆饼粉 | 0.5％ |
| 棉子饼粉 | 0.2％ |
| MgSO4 | 0.01％ |
| NaH2PO4 | 0.05％ |
| 碳酸钙 | 0.1％ |
| 无菌水 | 100mL |
| 调节pH值 | 7.0-7.2 |
制备实施例1-6用于说明摇瓶发酵。
制备实施例1
将准备实施例培养的菌种接种到培养基(含：蔗糖50g/L，冷榨黄豆饼粉3.0g/L，硫酸镁0.1g/L，碳酸钙1g/L，三氯化铁2mg/L，VB1(即维生素B1)110mg/L，硫酸锰5mg/L，硫酸锌2.5mg/L，碘化钾0.7mg/L，硼酸1.4mg/L，pH6.8，其中，碳源物质与氮源物质的重量比为16.7:1中。接种时加入诱导子物质：占培养基0.005重量％的硝酸铈铵和占培养基0.005重量％的高锰酸钾。
装量为100mL的250mL三角瓶、培养温度为25℃、转速175rpm。在菌体生长的对数生长前期加入占培养基0.01重量％的硝酸铈铵和占培养基0.01重量％的高锰酸钾。在接种后第78小时，可见产蓝绿色素时加入占培养基0.04重量％的乙酰胺。发酵9天。
制备实施例2
采用制备实施例1的方法进行摇瓶发酵，不同的是：
采用的培养基为：蔗糖50g/L、棉子饼粉4.5g/L、酵母提取物0.5g/L、硫酸镁0.06g/L、碳酸钙1.2g/L、三氯化铁2mg/L、维生素B110mg/L、硫酸锰5mg/L、硫酸锌2.5mg/L、碘化钾0.7mg/L、硼酸1.4mg/L，pH6.8；其中，碳源物质与氮源物质的重量比为10:1。
接种时加入诱导子物质占培养基的重量为：
硝酸铈铵0.006％、高锰酸钾0.001％；
在菌体生长的对数生长前期加入的诱导子物质占培养基的重量为：
硝酸铈铵0.1％、高锰酸钾0.1％；
微生物开始产生蓝绿色素时加入的前体物质占培养基的重量为：
乙酰胺0.04％。
制备实施例3
采用制备实施例1的方法进行摇瓶发酵，不同的是：
采用的培养基为：葡萄糖10g/L、蔗糖30g/L、棉子饼粉2g/L、冷榨黄豆饼粉2g/L、酵母提取物0.5g/L、硫酸镁0.1g/L、维生素B110mg/L、磷酸氢二钾1g/L、磷酸二氢钾1g/L，pH6.8；其中，碳源物质与氮源物质的重量比为10：1。
接种时加入诱导子物质占培养基的重量为：
高锰酸钾0.001％；
在菌体生长的对数生长前期加入的诱导子物质占培养基的重量为：
高锰酸钾0.08％；
微生物开始产生蓝绿色素时加入的前体物质占培养基的重量为：
乙酸铵0.04％。
制备实施例4
采用制备实施例1的方法进行摇瓶发酵，不同的是：
采用的培养基为：蔗糖40g/L、棉子饼粉1.5g/L、冷榨黄豆饼粉1.5g/L、酵母提取物0.5g/L、硫酸镁1g/L、磷酸氢二钾0.6g/L、酒石酸钾钠5g/L、三氯化铁2mg/L、维生素B110mg/L、硫酸锰5mg/L、硫酸锌2.5mg/L、碘化钾0.7mg/L、硼酸1.4mg/L，pH6.8；其中，碳源物质与氮源物质的重量比为13.3：1。
接种时加入诱导子物质占培养基的重量为：
柠檬酸铵0.005％、高锰酸钾0.008％；
在菌体生长的对数生长前期加入的诱导子物质占培养基的重量为：
柠檬酸铵0.1％、高锰酸钾0.1％；
接种时加入前体物质占培养基的重量为：
苯甲酰胺0.015％；
微生物开始产生蓝绿色素时加入的前体物质占培养基的重量为：
苯甲酰胺0.1％。
制备实施例5
采用制备实施例1的方法进行摇瓶发酵，不同的是：
采用的培养基为：葡萄糖8g/L、蔗糖28g/L、可溶性淀粉10g/L、棉子饼粉1g/L、冷榨黄豆饼粉3g/L、酵母提取物0.5g/L、硫酸镁0.1g/L、维生素B110mg/L、磷酸氢二钾0.56g/L、磷酸二氢钾0.35g/L，pH6.8；其中，碳源物质与氮源物质的重量比为10.2：1。
接种时加入诱导子物质占培养基的重量为：
硝酸铈铵0.01％；
在菌体生长的对数生长前期加入的诱导子物质占培养基的重量为：
硝酸铈铵0.1％；
接种时加入前体物质占培养基的重量为：
丙酰胺0.04％；微生物开始产生蓝绿色素时加入的前体物质占培养基的重量为：
丙酰胺0.1％。
制备实施例6
采用制备实施例1的方法进行摇瓶发酵，不同的是：
采用的培养基为：葡萄糖5g/L、蔗糖20g/L、可溶性淀粉10g/L、冷榨黄豆饼粉2.5g/L、硫酸镁0.1g/L、维生素B110mg/L、磷酸氢二钾0.56g/L、磷酸二氢钾0.35g/L，pH6.8；其中，碳源物质与氮源物质的重量比为14：1。
接种时加入诱导子物质占培养基的重量为：
硝酸铈铵0.04％、高锰酸钾0.04％；
在菌体生长的对数生长前期加入的诱导子物质占培养基的重量为：
硝酸铈铵0.1％、高锰酸钾0.1％；
接种时加入前体物质占培养基的重量为：
乙酰胺0.01％；微生物开始产生蓝绿色素时加入的前体物质占培养基的重量为：
乙酰胺0.15％。
制备实施例7 7L罐发酵
按照准备实施例的方法进行种子培养，不同的是温度为25℃，175rpm摇床培养24小时，得到一级种子的菌丝体，采用菌丝体进罐方法，接种量5％，接种到7L发酵罐中的培养基(葡萄糖10g/L，蔗糖20g/L，棉子饼粉1.5g/L，酵母提取物0.5g/L，硫酸镁0.1g/L，碳酸钙1g/L，三氯化铁2mg/L，维生素B1110mg/L，硫酸锰5mg/L，硫酸锌2.5mg/L，碘化钾0.7mg/L，硼酸1.4mg/L，pH6.8；其中，碳源物质与氮源物质的重量比为15：1。)中。在接种时加入诱导子物质：占培养基0.002重量％的硝酸铈铵和占培养基0.002重量％的高锰酸钾。
发酵过程中菌体生长期用0.5mol/L氢氧化钠控制pH值不低于6.5，菌体生长达平台期后期(接种后78小时)用0.5mol/L的盐酸溶液控制pH值在6.8。在培养过程中通过控制通入的氧气与发酵液的体积比为1：1.2、最大转速500rpm来控制溶解氧不低于20体积％。于接种后16小时用流加方法加入1％的蔗糖、0.2％的棉子饼粉，持续44小时。在菌体生长的对数生长前期加入诱导子物质：占培养基0.06重量％的硝酸铈铵、0.06重量％的高锰酸钾。在发酵到产生蓝绿色素时，加入占培养基0.04重量％的前体物质乙酰胺。发酵9天。
制备实施例8 7L罐发酵
将微生物链格孢单孢变种(Alternaria alternate var.monosporus)ST-026-RCGMCC No.0899在常规孢子培养基(大米、葡萄糖、琼脂)于25℃培养7天的菌种斜面，接种量为3.4×106个孢子/1L培养基。采用孢子直接进罐的方法，将所得孢子接种到7L发酵罐的培养基(葡萄糖10g/L，蔗糖20g/L，冷榨黄豆饼粉1.5g/L，酵母提取物0.5g/L，硫酸镁0.1g/L，碳酸钙1g/L，三氯化铁2mg/L，维生素B1110mg/L，硫酸锰5mg/L，硫酸锌2.5mg/L，碘化钾0.7mg/L，硼酸1.4mg/L，pH6.8；其中，碳源物质与氮源物质的重量比为15：1。)中。在接种时加入诱导子物质：占培养基0.001重量％的硝酸铈铵和占培养基0.001重量％的高锰酸钾。
发酵过程中菌体生长期用0.5mol/L氢氧化钠控制pH值不低于6.5，菌体生长达平台期后期(接种后78小时)用0.5mol/L的盐酸溶液控制pH值在7.0。在培养过程中通过控制通入的氧气与发酵液的体积比为1：1.2、最大转速500rpm来控制溶解氧不低于20体积％。于接种后24小时用流加方法加入0.8％的蔗糖、0.2％的棉子饼粉，持续36小时。在菌体生长的对数生长前期加入诱导子物质：占培养基0.06重量％的硝酸铈铵、0.06重量％的高锰酸钾。在发酵到产蓝绿色素时，加入占培养基0.04重量％的前体物质乙酰胺。发酵10天。
制备实施例9 7L罐发酵
按照制备实施例7的方法发酵，不同的是：
发酵培养基为：蔗糖50g/L、冷榨黄豆饼粉3.0g/L、酵母提取物0.5g/L、硫酸镁0.1g/L、磷酸氢二钾1.0g/L、磷酸二氢钾1.0g/L、三氯化铁2mg/L、维生素B110mg/L、硫酸锰5mg/L、硫酸锌2.5mg/L、碘化钾0.7mg/L、硼酸1.4mg/L，pH6.8；其中，碳源物质与氮源物质的重量比为12.5：1。
接种时加入占培养基0.05重量％的前体物质乙酰胺以及占培养基0.002重量％的高锰酸钾的诱导子物质。发酵过程中用15体积％氨水和0.5mol/L盐酸控制pH6.7。发酵过程中通过控制最大转速500rpm、通入的氧气与发酵液的体积比为1：1.2来控制溶解氧不低于20体积％。并于在菌体生长的对数生长前期加入占培养基0.01重量％的高锰酸钾诱导子物质。在发酵到产蓝绿色素时，加入占培养基0.1重量％的乙酰胺，发酵10天。
制备实施例10 7L罐发酵
按照准备实施例的方法培养种子，不同的是种子培养基为：葡萄糖20g/L、蔗糖20g/L、棉子饼粉5g/L、冷榨黄豆饼粉2g/L、硫酸镁0.1g/L、磷酸二氢钾1g/L、磷酸氢二钾1g/L，pH6.8。种子于25℃，200rpm培养16小时。
采用常规的菌丝体进罐方法，将所得种子接种于7L发酵罐中，接种量为5％，发酵培养基为(蔗糖20g/L、麦芽糖20g/L、冷榨黄豆饼粉3.5g/L、酵母提取物0.5g/L、硫酸镁0.06g/L、碳酸钙1.0g/L、三氯化铁2mg/L、维生素B110mg/L、硫酸锰5mg/L、硫酸锌2.5mg/L、碘化钾0.7mg/L、硼酸1.4mg/L，pH6.8；其中，碳源物质与氮源物质的重量比为10：1)。
接种时加入诱导子物质：占培养基0.002重量％的高锰酸钾和占培养基0.005重量％的硝酸铈铵。发酵过程中用15体积％氨水和2mol/L盐酸控制pH7.5。发酵过程中控制通入的氧气与发酵液的体积比为1：1.2，最高转速500rpm，控制溶解氧不得低于20体积％。在菌体生长的对数生长前期加入诱导子物质：占培养基0.02重量％的高锰酸钾和0.05重量％的硝酸铈铵。在发酵到产蓝绿色素时加入0.1重量％的前体物质乙酰胺，发酵8天。
制备实施例11 7L罐发酵
按照制备实施例10的方法进行7L罐发酵，不同的是接种时加入诱导子物质：占培养基0.02重量％的高锰酸钾和占培养基0.05重量％的硝酸铈铵。在发酵到产蓝绿色素时加入0.04重量％的乙酰胺前体物质。
制备实施例12 50L罐发酵
按照准备实施例的方法培养种子，将所得一级种子接种到培养基(葡萄糖10g/L，蔗糖40g/L，冷榨黄豆饼粉2.5％、酵母提取物0.5g/L，硫酸镁0.3g/L，碳酸钙1g/L，VB110mg/L，三氯化铁2mg/L，硫酸锰5mg/L，硫酸锌2.5mg/L，碘化钾0.7mg/L，硼酸1.4mg/L，pH6.8；其中，碳源物质与氮源物质的重量比为16.7：1)中。
在接种同时加入诱导子物质：占培养基0.005重量％的硝酸铈铵和占培养基0.002重量％的高锰酸钾。发酵过程中用0.5mol/L氢氧化钠、0.5mol/L盐酸控制pH7.2。发酵过程中控制通入的氧气与发酵液的体积比为1：1，最高转速450rpm，控制溶解氧不得低于30体积％。在菌体生长的对数生长前期加入诱导子物质：占培养基0.02重量％的高锰酸钾和0.05重量％的硝酸铈铵。在发酵到产蓝绿色素时加入0.04重量％的前体物质乙酰胺，发酵8天。
制备实施例13 50L罐发酵
种子培养基为：葡萄糖20g/L、蔗糖20g/L、棉子饼粉2.5g/L、冷榨黄豆饼粉2.5g/L、硫酸镁0.1g/L、磷酸二氢钠0.5g/L，VB1 10mg/L，三氯化铁2mg/L，硫酸锰5mg/L，硫酸锌2.5mg/L，碘化钾0.7mg/L，硼酸1.4mg/L，pH6.8。种子于25℃，200rpm培养16小时。
采用常规的菌丝体进罐方法，将所得菌丝体接种到50L发酵罐中，接种量为5％，发酵培养基为(葡萄糖10g/L、麦芽糖30g/L、可溶性淀粉10g/L、棉子饼粉0.5g/L、冷榨黄豆饼粉2.2g/L、硫酸镁0.06g/L、碳酸钙1.0g/L、三氯化铁2mg/L、维生素B110mg/L、硫酸锰5mg/L、硫酸锌2.5mg/L、碘化钾0.7mg/L、硼酸1.4mg/L，pH6.8；其中，碳源物质与氮源物质的重量比为18：1)。
接种时加入占培养基0.01重量％的前体物质乙酰胺以及占培养基0.02重量％的高锰酸钾和占培养基0.05重量％的硝酸铈铵的诱导子物质。发酵过程中用0.5mol/L氢氧化钠和0.5mol/L盐酸控制pH6.8。发酵过程中通过控制通入的氧气与发酵液的体积比为为1：1.0，转速450rpm，控制溶氧值不得低于30体积％。接种后36小时开始流加2％蔗糖+0.1％酵母提取物，持续24小时。在发酵到产蓝绿色素时加入0.1重量％前体物质乙酰胺，同时流加1％培养基，持续12小时。发酵8天。
制备实施例14 50L罐发酵
种子培养基为：葡萄糖10g/L、蔗糖30g/L、冷榨黄豆饼粉5g/L、棉子饼粉2g/L、硫酸镁0.1g/L、磷酸二氢钠0.5g/L，pH6.8。种子于25℃，200rpm培养16小时。
采用常规的菌丝体进罐方法，将所得菌丝体接种到50L发酵罐中，接种量为5％，发酵培养基为(葡萄糖10g/L、蔗糖40g/L、冷榨黄豆饼粉5.0g/L、硫酸镁0.06g/L、碳酸钙1.0g/L、维生素B110mg/L、三氯化铁2mg/L、硫酸锰5mg/L、硫酸锌2.5mg/L、碘化钾0.7mg/L、硼酸1.4mg/L，pH6.8；其中，碳源物质与氮源物质的重量比为10：1)。
接种时加入占培养基0.01重量％的前体物质乙酰胺以及占培养基0.02重量％的高锰酸钾和占培养基0.05重量％的硝酸铈铵的诱导子物质。发酵过程中用0.5mol/L氢氧化钠和0.5mol/L盐酸控制pH7。整个发酵过程，溶氧值控制在30体积％以上。在发酵到产蓝绿色素时加入0.1重量％前体物质乙酰胺，同时流加1％培养基，持续12小时。发酵8天。
制备实施例15 50L罐发酵
种子培养基为：葡萄糖10g/L、蔗糖30g/L、棉子饼粉5g/L、硫酸镁0.1g/L、碳酸钙1.0g/L，pH6.8，也可为常规种子培养基。种子于25℃，200rpm培养16小时。
采用常规的菌丝体进罐方法，将所得菌丝体接种到50L发酵罐中，接种量为5％，发酵培养基为(蔗糖50g/L、棉子饼粉1.0g/L、冷榨黄豆饼粉1.0g/L、酵母提取物0.8g/L、硫酸镁0.06g/L、碳酸钙1.0g/L、维生素B110mg/L、三氯化铁2mg/L、硫酸锰5mg/L、硫酸锌2.5mg/L、碘化钾0.7mg/L、硼酸1.4mg/L，pH6.8；其中，碳源物质与氮源物质的重量比为17.8：1)。
接种时加入诱导子物质：占培养基0.002重量％的高锰酸钾和占培养基0.005重量％的硝酸铈铵。发酵过程中用15体积％氨水和0.5mol/L盐酸控制pH7.2。发酵过程中通过控制通入的氧气与发酵液的体积比为1：1.0，最高转速450rpm，控制溶氧值在30体积％以上。在菌体生长的对数生长前期加入占培养基0.02重量％的高锰酸钾和0.05重量％的硝酸铈铵的诱导子物质。在发酵到产蓝绿色素时加入0.04重量％前体物质乙酰胺，发酵8天。
制备实施例16 50L罐发酵
种子培养基为：葡萄糖20g/L、棉子饼粉2.5g/L、冷榨黄豆饼粉2.5g/L、硫酸镁0.1g/L、磷酸二氢钠0.5g/L，pH6.8。种子于25℃，250rpm培养16小时。
采用常规的菌丝体进罐方法，将所得菌丝体接种到50L发酵罐中，接种量为15％，发酵培养基为(葡萄糖10g/L、蔗糖40g/L、棉子饼粉2.0g/L、冷榨黄豆饼粉2.5g/L、酵母提取物0.5g/L、硫酸镁0.06g/L、碳酸钙1.0g/L、三氯化铁2mg/L、维生素B1 10mg/L、硫酸锰5mg/L、硫酸锌2.5mg/L、碘化钾0.7mg/L、硼酸1.4mg/L，pH6.8；其中，碳源物质与氮源物质的重量比为10：1)。
接种时加入占培养基0.01重量％的前体物质乙酰胺以及占培养基0.002重量％的高锰酸钾和占培养基0.005重量％的硝酸铈铵的诱导子物质。发酵过程中用15体积％氨水和0.5mol/L盐酸控制pH7.1。发酵过程通过控制通入的氧气与发酵液的体积比为1：1.0，最大转速在450rpm，来控制溶氧值在30体积％以上。接种后36小时开始流加1％蔗糖+0.5％棉子饼粉+0.05％酵母提取物，持续24小时。在菌体生长的对数生长前期加入占培养基0.02重量％的高锰酸钾和0.05重量％的硝酸铈铵的诱导子物质。在发酵到产蓝绿色素时加入0.1重量％前体物质乙酰胺。发酵8天。
制备实施例17
种子培养基为：葡萄糖20g/L、棉子饼粉2.5g/L、冷榨黄豆饼粉2.5g/L、硫酸镁0.1g/L、磷酸二氢钠0.5g/L，pH6.8。种子于25℃，250rpm培养16小时。
采用常规的菌丝体进罐方法，将所得菌丝体接种到50L发酵罐中，接种量为15％，发酵培养基为(葡萄糖10g/L、蔗糖20g/L、可溶性淀粉20g/L、冷榨黄豆饼粉5g/L、硫酸镁0.06g/L、碳酸钙1.0g/L、三氯化铁2mg/L、维生素B110mg/L、硫酸锰5mg/L、硫酸锌2.5mg/L、碘化钾0.7mg/L、硼酸1.4mg/L，pH6.8；其中，碳源物质与氮源物质的重量比为10:1)。
接种时加入占培养基0.01重量％的前体物质乙酰胺以及占培养基0.002重量％的高锰酸钾和占培养基0.005重量％的硝酸铈铵的诱导子物质。发酵过程中用15体积％氨水和0.5mol/L盐酸控制pH7.2。发酵过程通过控制通入的氧气与发酵液的体积比为1：1.0，最大转速在450rpm，来控制溶氧值在30体积％以上。接种后36小时开始流加1％蔗糖+0.5％棉子饼粉+0.05％酵母提取物，持续24小时。在菌体生长的对数生长前期加入占培养基0.02重量％的高锰酸钾和0.05重量％的硝酸铈铵的诱导子物质。在发酵到产蓝绿色素时加入0.1重量％前体物质乙酰胺。发酵8天。
分离和纯化实施例1-6
分别将制备实施例1-6所得发酵液的pH调整到4.0，离心分离，收集过滤出的发酵菌体和发酵上清液。将所得发酵菌体55℃干燥，控制菌体含水量30％，置于-70℃冰箱冷冻8小时，将冷冻后的菌粉在避光的条件下加入乙酸乙酯与丙酮以1：1的体积比混合的混合物中,其中，菌粉与混合物的质量比为1：5，室温下浸泡振摇12小时，过滤得提取液，真空旋转蒸发得浸膏。
将所得发酵上清液在避光的条件下加入相同体积的三氯甲烷，室温下振摇萃取2小时，高速离心后分离出有机溶剂层，减压旋转蒸发得浸膏。
将前面所得物用流动相溶解后，溶液分别装入色谱柱，常压下进行纯化：硅胶(200目，柱径高(CM)5×40，硅胶预先用120℃干燥处理5小时)中，流动相分别为：二氯甲烷、丙酮与二氯甲烷以4:96的体积比混合的混合物、丙酮与二氯甲烷以20:80的体积比混合的混合物、在常压下梯度洗脱，流速5mL/min，收集纯化产物，减压浓缩至饱和，得纯度约95％的式(I)化合物。
将所得纯度约95％的式(I)化合物加入等体积的石油醚，静置结晶、过滤、干燥，即得纯度为98％的式(I)化合物。重复前述重结晶过程2次，过滤，减压干燥，即得纯度为99.5％的式(I)化合物。
选择分离和纯化实施例6所得最终产物进行鉴定，其TLC图见图1，HPLC图谱见图2。由图1和2可见样品中含有相当大含量的式(I)化合物。
通过对分离和纯化实施例6所得最终产物进行元素分析，测定该样品中C、H元素的含量分别为C64.48％、H4.16％，样品中不含氮，与根据C20H14O6计算的理论值(C68.57％、H4％)基本一致。另外，分离和纯化实施例6所得最终产物的MS图谱如图3所示，有机质谱测得该样品的准分子离子峰[M+H]+为351，表明其相对分子质量为350。
分离和纯化实施例6所得最终产物的红外光谱如图4所示，其中，3072、3036cm-1处出现中等强度的吸收峰，是由O-H伸缩振动引起。1623、l651、1686cm-1处有C＝O吸收峰。
分离和纯化实施例6所得最终产物的1H-NMR谱如图5所示：共有13组峰共14个质子。综合一维、二维谱信息，归属δ2.20(l H,m)、2.53(lH,m)为12位亚甲基同碳质子；δ2.79(2H,m)为13位亚甲基质子；δ4.06(1H,d,4.5)、4.10(1H,d,4.5)、4.93(1H,dd,9,5)分别为2位、3位和11位次甲基质子；δ7.27(1H,d,9)、7.16(1H,d,9)、6.83(1H,dt,8,1)、7.30(1H,t,8)、6.23(lH,dt,8,1)分别为6位、7位、16位、l7位和18位质子。δ11.39(1H,s)、12.59(lH,s)分别为8位和15位羟基质子峰，该峰于重水交换谱中明显减弱。
分离和纯化实施例6所得最终产物的13C-NMR谱如图6所示：共有20个有效峰，结合DEPT谱氢谱和二维谱，可归属δ30.82、37.13分别为12位、l3位亚甲基碳，δ40.07、55.36、55.65分别为1l位、3位和2位次甲基碳；δ116.24、119.82、123.95、136.49、139.44分别l6位、18位、7位、17位和6位芳香叔碳峰。δ114.17、117.54、130.52、137.85、146.95、160.82、163.01分别为9位、20位、l0位、5位、19位、8位和15位季碳峰。δ193.12、196.29、204.60分别为4位、1位和14位羰基碳。
分离和纯化实施例6所得最终产物的DEPT谱如图7所示。
分离和纯化实施例6所得最终产物的H－H COSY谱如图8所示。
分离和纯化实施例6所得最终产物的C－H COSY谱如图9所示。
综上所述，分离和纯化实施例6所得最终产物确定为式(I)化合物。
分离和纯化实施例1-5与分离和纯化实施例6所得提取浸膏的TLC图、HPLC图、红外谱图、质谱图以及核磁谱图相近。
分离和纯化实施例1-6所得产物式(I)化合物的回收率和纯度如表2所示。
分离和纯化实施例7-11
分别将制备实施例7-11所得培养液(发酵液)调节pH到4.0，用板框压滤机过滤，收集过滤出的发酵微生物(菌体)和发酵上清液。将所得菌体分别通过自然吹干，控制含水量在30％，分别得干燥菌体185、182、185、198、201g/7L，在-70℃放置12h，在避光的条件下分别加入(菌丝体与溶剂重量比为1:10)乙酸乙酯与丙酮以1:1的体积比混合的混合物、乙酸乙酯与丙酮以1:2的体积比混合的混合物、乙酸乙酯与三氯甲烷以1:1的体积比混合的混合物、pH4.0的甲醇、pH4.0的乙醇，分别提取24小时，减压旋转蒸发溶剂得浸膏。
将前面过滤所得的发酵上清液在25℃下加入相同体积的三氯甲烷、振摇萃取2小时，高速离心(8000rpm，10min)，静置10分钟，分离出有机溶剂层，减压浓缩得浸膏。
将前面所得物用流动相溶解后，溶液分别装入色谱柱，常压下进行纯化：硅胶(200目，柱径高(CM)5×40，硅胶预先用120℃干燥处理5小时)中，流动相分别为二氯甲烷、丙酮与二氯甲烷以4:96的体积比混合的混合物、丙酮与二氯甲烷以20:80的体积比混合的混合物以及丙酮，在常压下梯度洗脱，流速4mL/min，收集纯化产物，减压浓缩，得纯度约95％的式(I)化合物。
将所得纯度约95％的式(I)化合物加入等体积的石油醚，静置结晶、过滤、干燥，即得纯度为98％的式(I)化合物。重复前述重结晶过程2次，过滤，减压干燥，即得纯度为99.5％的式(I)化合物。
分离和纯化实施例7-11与分离和纯化实施例6所得提取最终产物的TLC图、HPLC图、红外谱图、质谱图以及核磁谱图相近。
分离和纯化实施例7-11所得产物式(I)化合物的回收率和纯度如表2所示。
分离和纯化实施例12-16
分别将制备实施例12-16所得培养液(发酵液)调节pH到4.0，用板框压滤机过滤，收集过滤出的发酵微生物(菌体)和发酵上清液。将所得菌体分别通过自然吹干、真空冷冻干燥、50℃烘干、80℃烘干、100℃烘干，控制含水量在30％，分别得干燥菌体1280、1274、1295、1425、1417g/50L，在-70℃放置12h，在避光的条件下分别加入(菌丝体与溶剂重量比为1:10)乙酸乙酯与丙酮以1:1的体积比混合的混合物中，分别提取24小时，减压旋转蒸发溶剂得浸膏。
将前面过滤所得的发酵上清液在25℃下加入相同体积的三氯甲烷、振摇萃取2小时，高速离心(8000rpm，10min)，静置10分钟，分离出有机溶剂层，减压浓缩得浸膏。
将前面所得物用流动相溶解后，溶液分别装入色谱柱，常压下进行纯化：硅胶(200目，柱径高(CM)5×40，硅胶预先用120℃干燥处理5小时)中，流动相分别为二氯甲烷、丙酮与二氯甲烷以4:96的体积比混合的混合物、丙酮与二氯甲烷以20:80的体积比混合的混合物以及丙酮，在常压下梯度洗脱，流速4mL/min，收集纯化产物，减压浓缩，得纯度约95.5％的式(I)化合物。
将所得纯度约95.5％的式(I)化合物加入等体积的石油醚，静置结晶、过滤、干燥，即得纯度为98％的式(I)化合物。重复前述重结晶过程2次，过滤，减压干燥，即得纯度为99.5％的式(I)化合物。
分离和纯化实施例12-16与分离和纯化实施例6所得提取浸膏的TLC图、HPLC图、红外谱图、质谱图以及核磁谱图相近。
分离和纯化实施例12-16所得产物式(I)化合物的回收率和纯度如表2所示。
分离和纯化实施例17-24
分别采用分离和纯化实施例7-14的分离和纯化方法，依次对制备实施例8-15所得培养液进行分离和纯化，不同的是：用1mol/L的HCl或1mol/L的NaOH溶液慢慢滴入发酵液中，不断搅拌，调其pH分别为6.8、6.5(操作时避光进行)、5.5、4.0(操作时避光进行)、3.0、7.5(操作时避光进行)、8.0、6.0(操作时避光进行)。得式(I)化合物纯品。
分离和纯化实施例17-24与分离和纯化实施例6所得提取浸膏的TLC图、HPLC图、红外谱图、质谱图以及核磁谱图相近。
分离和纯化实施例17-24所得产物式(I)化合物的回收率和纯度如表2所示。
表2 式(I)化合物的回收率和纯度
| 实施例编号 | 产物重量/mg | 回收率％ | 纯度％ |
| 分离和纯化实施例1 | 450 | 79 | 99.5 |
| 分离和纯化实施例2 | 463 | 77 | 99.5 |
| 分离和纯化实施例3 | 454 | 77 | 99.5 |
| 分离和纯化实施例4 | 480 | 79 | 99.5 |
| 分离和纯化实施例5 | 447 | 75 | 99.5 |
| 分离和纯化实施例6 | 495 | 79 | 99.5 |
| 分离和纯化实施例7 | 525 | 80 | 99.5 |
| 分离和纯化实施例8 | 510 | 79 | 99.5 |
| 分离和纯化实施例9 | 550 | 78 | 99.5 |
| 分离和纯化实施例10 | 513 | 78 | 99.5 |
| 分离和纯化实施例11 | 525 | 78 | 99.5 |
| 分离和纯化实施例12 | 582 | 77 | 99.5 |
| 分离和纯化实施例13 | 570 | 80 | 99.5 |
| 分离和纯化实施例14 | 604 | 81 | 99.5 |
| 分离和纯化实施例15 | 546 | 70 | 99.5 |
| 分离和纯化实施例16 | 567 | 65 | 99.5 |
| 分离和纯化实施例17 | 545 | 65 | 99.8 |
| 分离和纯化实施例18 | 545 | 65 | 99.8 |
| 分离和纯化实施例19 | 545 | 70 | 99.8 |
| 分离和纯化实施例20 | 545 | 82 | 99.8 |
| 分离和纯化实施例21 | 545 | 50 | 99.8 |
| 分离和纯化实施例22 | 545 | 65 | 99.8 |
| 分离和纯化实施例23 | 545 | 50 | 99.8 |
| 分离和纯化实施例24 | 545 | 69 | 99.8 |
从表2可以看出，通过本发明提供的制备式(I)化合物的方法，在获得式(I)化合物较高纯度的同时也能够获得较高的回收率。
测试实施例
本测试例采用MTT测试方法对任选的实施例14制备的式(I)化合物的生物活性进行测试。
L1210(小鼠淋巴白血病细胞，来源中国科学院上海药物研究所)培养基为：2％小牛血清RPMI－1640(来自上海赛悦生物技术有限公司)
MGC-803(人胃癌细胞，来源中国科学院上海药物研究所)培养基为：2％小牛血清RPMI－1640(来自上海赛悦生物技术有限公司)。
取10μL 8mM实施例14制备的式(I)化合物和化合物(a)(即CN1880309A实施例4式a化合物)，按照如下浓度梯度(50、25、12.5、6.25、3.12μM)稀释10X药品，并加入每孔10uL药品到细胞培养板内，再加入无血清培养基(终浓度为：5、2.5、1.25μM，625、312nM)，其中DMSO终浓度为10％。
加药后将细胞放入培养箱，培养72小时后，每孔加入10μL的5mg/mL的MTT(Sigma,M5655)溶液，然后将96孔板放入37℃5％CO2培养箱培养24小时。
再在2000rpm，5min的条件下离心平板，移除上清后，每孔加入150μL DMSO，并在摇床中震荡平板至所有结晶紫溶解(约10-20分钟)。最后使用318MC型酶标仪测定546nm光吸收，根据下式计算杀伤率：
杀伤率＝(对照细胞存活OD值-给药细胞存活OD值)/对照细胞存活OD值。
式a化合物和实施例14制备的式(I)化合物对L1210和MGC-803的杀伤率结果如表3所示。
表3
从表3可以看出，本发明的方法提供的式(I)化合物与式a化合物相比，对L1210和MGC-803细胞的杀伤率较高，尤其在低浓度时效果极其明显。由此可见，本发明的化合物对L1210和MGC-803细胞显示出较高的生物活性。
综上所述，以上仅为本申请的较佳实施例而已，并非用于限定本申请的保护范围，因此，凡在本申请的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
Claims (12)
1.一种制备式(I)化合物的方法，该方法包括在培养基中培养微生物链格孢单孢变种(Alternaria alternate var.monosporus)ST-026-R CGMCC No.0899，以使所述微生物细胞内和所述培养基中产生和聚集所述式(I)化合物，以及从所述微生物细胞内和培养基中回收并提纯所述式(I)化合物，其特征在于，在所述培养基中，碳源物质与氮源物质的重量比为10-18:1，所述氮源物质选自冷榨黄豆饼粉，或者冷榨黄豆饼粉和棉子饼粉、玉米浆、酵母粉、蛋白胨、牛肉浸膏和酵母提取物中的一种或多种的组合，
2.根据权利要求1所述的方法，其中，在培养过程中，向所述培养基中两次加入诱导子物质，第一次是在接种时加入，第二次是在菌体生长的对数生长前期加入，其中，第一次加入的所述诱导子物质占所述培养基的0.001-0.07重量％；第二次加入的所述诱导子物质占所述培养基的0.005-0.5重量％。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述诱导子物质选自柠檬酸铵、硝酸铈铵、高锰酸钾、丙酮酸、对－香豆酸、硫酸钒、马尿酸、α-萘乙酸、6-苄氨基嘌呤、硝酸银和肉桂酸中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，在培养过程中，向所述培养基中两次加入前体物质，第一次是在接种时加入，第二次是在所述微生物产生蓝绿色素时加入；其中，第一次加入的所述前体物质占所述培养基的0.01-0.05重量％；第二次加入的所述前体物质占所述培养基的0.04-0.15重量％。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，第一次加入的所述前体物质与第二次加入的所述前体物质的重量比为1：8-15。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其中，所述前体物质选自苯甲酰胺、丙酰胺和乙酰胺中的一种或多种。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述培养基中的所述碳源物质选自葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖、甘油、淀粉、乳糖和半乳糖中的一种或多种。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述培养基还含有磷酸盐、钙盐、镁盐、铁盐和钠盐中的一种或多种无机或有机盐物质；和/或硼酸、碘化钾、二氯化钴、硫酸锌、硫酸锰和维生素中的一种或多种微量物质。
9.根据权利要求1所述的方法，其中，所述培养在需氧条件下进行，温度为23-29℃，培养初始pH值为5.5-8，在培养中后期调节pH值为6-7.5。
10.根据权利要求1所述的方法，其中，回收并提纯所述式(I)化合物包括以下步骤：
(1)将所述培养过程所得培养液的pH值调整为4-8并分离出发酵微生物和发酵上清液；
(2)将所述发酵微生物干燥并控制其含水量为25-35重量％，并在-20℃至-70℃放置8-12h；
(3)在避光的条件下，用第一有机溶剂提取步骤(2)的所得物；用第二有机溶剂萃取所述发酵上清液，挥干溶剂；
(4)将第(3)步所得物依次用正相吸附色谱法和结晶的方法纯化；所述第一有机溶剂选自乙酸乙酯与丙酮以1:1-2的体积比混合的混合物、乙酸乙酯与三氯甲烷以1:1-2的体积比混合的混合物、pH值为3-5的甲醇和pH值为3-5的乙醇中的一种或多种；所述第二有机溶剂选自三氯甲烷和/或二氯甲烷。
11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述第(4)步骤中所述正相吸附色谱法包括：使用一个或一个以上的色谱柱，色谱柱填料包括硅胶或氧化铝，流动相包括丙酮和/或二氯甲烷；对第(3)步所得物采用二氯甲烷、丙酮与二氯甲烷以4:96的体积比混合的混合物、丙酮与二氯甲烷以20:80的体积比混合的混合物以及丙酮依次进行梯度洗脱。
12.根据权利要求10所述的方法，其中，所述第(4)步骤中所述结晶的方法包括：将经过正相吸附色谱法的所得物减压浓缩至饱和，加入等体积的石油醚，静置结晶、过滤、干燥。
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