CN105400842A

CN105400842A - 一种提高内生真菌发酵产物中紫杉醇产量的方法

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Publication number: CN105400842A
Application number: CN201511027713.8A
Authority: CN
Inventors: 程俊文; 贺亮; 魏海龙; 胡传久; 方茹; 李海波
Original assignee: Zhejiang Academy of Forestry
Current assignee: Zhejiang Academy of Forestry
Priority date: 2015-12-31
Filing date: 2015-12-31
Publication date: 2016-03-16
Anticipated expiration: 2035-12-31
Also published as: CN105400842B

Abstract

本发明公开了一种提高内生真菌发酵产物中紫杉醇产量的方法，包括：将产紫杉醇内生真菌种子液接入含有曼地亚红豆杉和蜘蛛香的内生真菌固态发酵培养基中培养，然后置于交变磁场环境中再培养，得内生真菌固态发酵产物；再将产紫杉醇内生真菌种子液接入含有内生真菌固态发酵产物的液体发酵培养基中培养，得到内生真菌发酵终产物。该方法原料来源天然，对环境无污染，周期短，产率高，适于工业化生产，与普通内生真菌发酵产物相比，本发明方法内生真菌发酵产物中紫杉醇的产量明显提高。

Description

一种提高内生真菌发酵产物中紫杉醇产量的方法

技术领域

本发明涉及生物发酵领域，具体涉及一种提高内生真菌发酵产物中紫杉醇产量的方法。

背景技术

紫杉醇(Paclitaxel，商品名Taxol)是一种二萜类衍生物,是具有独特抗癌机制的天然产物，分子式为C₄₇H₅₁NO₁₄，最初从红豆杉植物中分离得到。经临床验证，具有良好的抗肿瘤作用，特别是对癌症发病率较高的卵巢癌、子宫癌和乳腺癌等有特效。紫杉醇是近年来国际市场上最热门的抗癌药物之一。随着地球人口癌发率的增长，对紫杉醇的需求量明显增大。目前临床和科研所需的紫杉醇主要是从红豆杉中直接提取。由于紫杉醇在植物体中含量极低，生产1kg紫杉醇需要2500棵左右成年红豆杉树木的原料，也因此造成了对红豆杉的大量砍伐，致使其天然资源趋于枯竭，造成了生物多样性和生态环境的极大破坏。

能合成紫杉醇的红豆杉内生真菌的发现，是紫杉醇资源研究的重要进展。自从Stierle等证明短叶红豆杉的内生真菌可以产生抗癌药物紫杉醇，对植物内生真菌的研究更加引人注目。我国学者也发现了多种产紫杉醇的内生真菌。

植物内生菌是一种分布广、种类多、生物学功能多样的微生物资源库。在与宿主植物长期共进化过程中，内生菌可产生一系列具有抗肿瘤、抗病毒、免疫抑制等作用的生物活性。由于内生真菌生长迅速，易于进行大规模培养，培养所需的原料可以是来源广泛、价格低廉的农林副产物，因而利用内生真菌生物制备紫杉醇，被认为是破解紫杉醇来源的最有效的解决方法。利用内生真菌生物制备紫杉醇如：中国专利ZL200810152499.2公开了一种利用双液相发酵提高真菌产紫杉醇的方法，其包括在培养基中培养产紫杉醇真菌拟盘多毛孢(Pestalotiopsismicrospora)NK17，当菌体生长达到平台期，加入有机溶剂继续培养，以使在所述菌株细胞内和所述培养基中更多地产生和聚集紫杉醇，以及从所述细胞内和培养基中回收并提纯紫杉醇。该方法紫杉醇产率可达551.72μg/L。如能开发新的提高紫杉醇产量的内生真菌发酵方法，将有望为紫杉醇的制备提供新的途径。

发明内容

本发明提供了一种提高内生真菌发酵产物中紫杉醇产量的方法，该方法周期短、产率高，适于工业化生产。

本发明发现，通过本发明特定的内生真菌发酵及特定的工艺，同时在培养基中添加具有协同增产效果的曼地亚红豆杉和蜘蛛香，能够有效地将其营养成分和有效成分进行生物降解和转化，使各原料资源得到充分的利用，有助于提高最终产品中紫杉醇的含量。

本发明采用的技术方案是：

一种提高内生真菌发酵产物中紫杉醇产量的方法，包括步骤：

(1)取活化后的产紫杉醇内生真菌菌种接种到液体MRS培养基中培养4h-6h，离心收集第一菌体；将第一菌体悬浮在含胆盐的液体MRS培养基中于20℃-30℃孵育3h-40h，离心收集第二菌体；将第二菌体经PBS缓冲液清洗干净后重新悬浮于液体MRS培养基中，震荡摇匀，在20℃-30℃培养2天-10天，得到产紫杉醇内生真菌种子液；

(2)将步骤(1)的产紫杉醇内生真菌种子液接入内生真菌固态发酵培养基中，在16℃-30℃培养3天-30天，然后置于交变磁场环境中再培养5天-20天，培养产物经真空冷冻干燥、粉碎后得内生真菌固态发酵产物；所述内生真菌固态发酵培养基中含有曼地亚红豆杉和蜘蛛香；

(3)将步骤(1)的产紫杉醇内生真菌种子液接入液体发酵培养基中，调pH值为3-7，在15℃-25℃培养5天-25天，离心，得到内生真菌发酵终产物；所述液体发酵培养基中含有内生真菌固态发酵产物。

本发明进行固态发酵时，直接采用经含胆盐的液体MRS培养基孵育处理的产紫杉醇内生真菌种子液，同时在培养基中添加具有协同增产效果的蜘蛛香，能够有效地将红豆杉中的营养成分和有效成分进行生物降解和转化，有助于提高最终产品中紫杉醇的含量。步骤(3)中，再次采用经含胆盐的液体MRS培养基孵育处理的产紫杉醇内生真菌种子液对含有内生真菌固态发酵产物的液体发酵培养基进行深层次发酵，使原料资源得到充分的利用，进一步提高了最终产品中紫杉醇的含量。

为了达到更好的效果，优选：

步骤(1)中，所述含胆盐的液体MRS培养基中胆盐的质量百分含量为0.1％-0.5％。

所述第一菌体与用于悬浮第一菌体的含胆盐的液体MRS培养基的体积比为1:1-3，第二菌体与用于悬浮第二菌体的液体MRS培养基的体积比为1:1-3。

步骤(2)中，所述曼地亚红豆杉可采用曼地亚红豆杉的枝叶；所述蜘蛛香可采用蜘蛛香枝叶。

所述内生真菌固态发酵培养基每1L中含有2.0g-8.0g曼地亚红豆杉和0.5g-2.5g蜘蛛香。所述内生真菌固态发酵培养基由曼地亚红豆杉、蜘蛛香和发酵基础培养基组成，所述发酵基础培养基采用本领域常规的发酵基础培养基，可采用市售产品，也可采用现有配制方法配制。

所述内生真菌固态发酵培养基的制备方法，包括：将新鲜曼地亚红豆杉、蜘蛛香在自来水下冲洗干净，晾干，切碎；再将2.0g-8.0g曼地亚红豆杉和0.5g-2.5g蜘蛛香用发酵基础培养基定容至1L，混合均匀，pH值自然，得到内生真菌固态发酵培养基。

所述产紫杉醇内生真菌种子液的接入量为内生真菌固态发酵培养基体积的5％-25％。

目前产紫杉醇内生真菌发酵技术普遍存在发酵周期长、菌丝生长萌发慢、特征次生代谢产物含量低等问题。本发明发现将交变磁场处理技术应用于固态发酵中，通过特定培养时期的适当处理等外界因素有效刺激，提高真菌菌丝在曼地亚红豆杉和蜘蛛香培养基料上的生长代谢，缩短发酵时间，有效促进次生代谢产物的生成。所述交变磁场环境中磁场强度为0.2mT-6mT，磁场频率为3Hz-40Hz。

步骤(3)中，所述液体发酵培养基每1L中含有0.2g-1g内生真菌固态发酵产物。所述液体发酵培养基由内生真菌固态发酵产物和发酵基础培养基组成，所述的发酵基础培养基采用本领域常规的发酵基础培养基，可采用市售产品，也可采用现有配制方法配制。

所述液体发酵培养基的制备方法，包括：将0.2g-1g内生真菌固态发酵产物用发酵基础培养基定容至1L，混合均匀，pH值自然，得到液体发酵培养基。

一般发酵基础培养基由以下质量百分比的组分组成：葡萄糖1％-3％、K₂HPO₄0.1％-0.2％、MgSO₄0.05％-0.1％和余量的水。

所述产紫杉醇内生真菌种子液的接入量为液体发酵培养基体积的3％-20％。

所述产紫杉醇内生真菌菌种可采用现有任意一种产紫杉醇内生真菌菌种，可采用市售产品，例如：美丽镰刀菌(Fusariummairei)菌种，购于北京北纳创联生物技术研究院。

所述液体MRS培养基采用本领域常规的液体MRS培养基，可采用市售产品，也可采用现有配制方法配制。一般液体MRS培养基的组成为：蛋白胨10.0g、牛肉浸膏10.0g、酵母浸膏5.0g、葡萄糖20.0g、乙酸钠5.0g、柠檬酸氢二铵2.0g、吐温-801.0ml、磷酸氢二钾2.0g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.05g和蒸馏水1.0升。

所述PBS缓冲液即磷酸缓冲盐溶液，采用本领域常规的PBS缓冲液，可采用市售产品，也可采用现有配制方法配制。一般1LPBS缓冲液：磷酸二氢钾0.27g、磷酸氢二钠1.42g、氯化钠8g和氯化钾0.2g，加适量去离子水充分搅拌溶解，然后加入浓盐酸调pH至7.2，最后定容到1L。

所述活化后的产紫杉醇内生真菌菌种在液体MRS培养基中培养的温度均为自然环境温度，优选为20℃-30℃。一般1L液体MRS培养基中接入1cm²-4cm²大小的活化后的产紫杉醇内生真菌菌种菌块。所述产紫杉醇内生真菌菌种的活化方法采用本领域常规的菌种活化方法，包括：将斜面保藏的产紫杉醇内生真菌菌种接种到PDA平板培养基上，进行活化培养，培养温度20℃-30℃，培养时间3天-25天，得到活化后的产紫杉醇内生真菌菌种。所述的PDA平板培养基采用本领域种子培养常用的培养基，可采用市售产品。进一步优选，所述的PDA平板培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g和琼脂15g-20g，用水定容至1000mL。

本发明所用的培养基均需灭菌后使用，灭菌的条件采用本领域的常规条件，例如可在120℃-125℃下灭菌20min-30min。

曼地亚红豆杉(Taxusmadia)是一种天然杂交品种，其母本为日本红豆杉(T.cuspidata)，父本为欧洲红豆杉(T.baccata)，在美国、加拿大生长发展已有近100年的历史。现在在中国南方也有。为常绿灌木，生物量十分巨大，生长时间短。其主根不明显，侧根发达，枝叶茂盛，萌发力强，耐低寒，能耐-25℃的低温。其树形奇特，具有很高的观赏性。蜘蛛香3年就可以结果结红豆。3年的曼地亚基本都是带花蕾的，雄性曼地亚的花蕾比较大比较明显，从8月份花蕾开始明显，一直到来年的3月份左右开花，给雌株授粉。雌株花蕾比较小，和芽很相似，开花的时候是一个小水珠，没有花粉。

蜘蛛香(ValerianawallichiiDC.或ValerianajatamansiJone)，又名马蹄香、土细辛、印度缬草等，系败酱草科缬草属植物，植株高20-70cm，根茎粗厚，块柱状，节密，有浓烈香味。传统中医药认为其具有理气止痛、消炎止泻、祛风除湿、镇静安神等功效，可用于治疗脘腹胀痛、消化不良、腹泻、痢疾、风湿痹痛、蛇毒、失眠、肥胖等症。

本发明所用的原料均可采用市售产品。

本发明的有益效果：

1、本发明进行固态发酵时，直接采用经含胆盐的液体MRS培养基孵育处理的产紫杉醇内生真菌种子液，同时在培养基中添加具有协同增产效果的蜘蛛香，能够有效地将红豆杉中的营养成分和有效成分进行生物降解和转化，有助于提高最终产品中紫杉醇的含量。步骤(3)中，再次采用经含胆盐的液体MRS培养基孵育处理的产紫杉醇内生真菌种子液对含有内生真菌固态发酵产物的液体发酵培养基进行深层次发酵，使原料资源得到充分的利用，进一步提高了最终产品中紫杉醇的含量。

2、本发明方法原料来源天然、质量可控，对环境无污染，周期短，成本低，产率高，即保护了自然资源，又可满足临床用药的需要，适于工业化生产。

3、与普通内生真菌发酵产物相比，本发明方法得到的内生真菌发酵终产物中黄酮的含量、紫杉醇的得率均得到了大幅度的提高。与常规培养方法相比，采用本发明方法获得的内生真菌发酵终产物中黄酮含量提高了36.7％-46.0％，紫杉醇得率提高了38.4％-43.0％，紫杉醇得率可达587μg/L-605μg/L。

具体实施方式

下面结合部分具体实施例对本发明内容进行进一步阐明，但本发明的内容并不仅限于下面的实施例。

产紫杉醇内生真菌美丽镰刀菌(Fusariummairei)菌种，购于北京北纳创联生物技术研究院。

胆盐：3号胆盐，即胆酸钠、胆酸-脱氧胆酸钠盐混合物(北京恒业中远化工)。

实施例1

一、材料准备

PDA平板培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g和琼脂15g，用水定容至1000ml，自然pH，在121℃下灭菌20min。

将斜面保藏的产紫杉醇内生真菌菌种接种到PDA平板培养基上，进行活化培养，培养温度22℃，培养时间10天，得到活化后的产紫杉醇内生真菌菌种。

液体MRS培养基的组成为：蛋白胨10.0g、牛肉浸膏10.0g、酵母浸膏5.0g、葡萄糖20.0g、乙酸钠5.0g、柠檬酸氢二铵2.0g、吐温-801.0ml、磷酸氢二钾2.0g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.05g和蒸馏水1.0升。

发酵基础培养基由以下质量百分比的组分组成：葡萄糖1％、K₂HPO₄0.1％、MgSO₄0.05％和余量的水。

1LPBS缓冲液：磷酸二氢钾0.27g、磷酸氢二钠1.42g、氯化钠8g和氯化钾0.2g，加适量去离子水充分搅拌溶解，然后加入浓盐酸调pH至7.2，最后定容到1L。

二、内生真菌发酵制品的制备

(1)取2cm²大小活化后的产紫杉醇内生真菌菌种接种到1L液体MRS培养基中于25℃培养5h，培养液经6000rpm离心10min收集第一菌体；将第一菌体悬浮在胆盐质量百分含量为0.3％的含胆盐的液体MRS培养基中于25℃孵育25h，经6000rpm离心10min收集第二菌体；将第二菌体经PBS缓冲液清洗干净后重新悬浮于液体MRS培养基中，震荡摇匀在25℃再培养6天，得到产紫杉醇内生真菌种子液；

其中，第一菌体与用于悬浮第一菌体的含胆盐的液体MRS培养基的体积比为1:1，第二菌体与用于悬浮第二菌体的液体MRS培养基的体积比为1:1。

(2)将产紫杉醇内生真菌种子液按占内生真菌固态发酵培养基体积15％的接入量接入内生真菌固态发酵培养基中，在22℃培养20天，然后置于磁场强度为3mT、磁场频率为25Hz的交变磁场环境中再培养12天，培养产物经真空冷冻干燥、粉碎后得内生真菌固态发酵产物；

内生真菌固态发酵培养基的制备包括：将新鲜曼地亚红豆杉的枝叶、蜘蛛香枝叶在自来水下冲洗干净，晾干，切碎；然后将5g曼地亚红豆杉和1.8g蜘蛛香用发酵基础培养基定容至1L，混合均匀，pH值自然，得到内生真菌固态发酵培养基。

(3)将产紫杉醇内生真菌种子液按占液体发酵培养基体积10％的接入量接入液体发酵培养基中，调pH值为5，在20℃培养15天，经6000rpm离心10min得到内生真菌发酵终产物；

液体发酵培养基的制备包括：将0.6g内生真菌固态发酵产物用发酵基础培养基定容至1L，混合均匀，pH值自然，得到液体发酵培养基。

实施例2

一、材料准备

PDA平板培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g和琼脂20g，用水定容至1000ml，自然pH，在121℃下灭菌20min。

将斜面保藏的产紫杉醇内生真菌菌种接种到PDA平板培养基上，进行活化培养，培养温度20℃，培养时间25天，得到活化后的产紫杉醇内生真菌菌种。

发酵基础培养基由以下质量百分比的组分组成：葡萄糖3％、K₂HPO₄0.2％、MgSO₄0.1％和余量的水。

液体MRS培养基和PBS缓冲液同实施例1。

二、内生真菌发酵制品的制备

(1)取1cm²大小活化后的产紫杉醇内生真菌菌种接种到1L液体MRS培养基中于20℃培养6h，培养液经6000rpm离心10min收集第一菌体；将第一菌体悬浮在胆盐质量百分含量为0.1％的含胆盐的液体MRS培养基中于20℃孵育40h，经6000rpm离心10min收集第二菌体；将第二菌体经PBS缓冲液清洗干净后重新悬浮于液体MRS培养基中，震荡摇匀，在20℃再培养10天，得到产紫杉醇内生真菌种子液；

其中，第一菌体与用于悬浮第一菌体的含胆盐的液体MRS培养基的体积比为1:2，第二菌体与用于悬浮第二菌体的液体MRS培养基的体积比为1:2。

(2)将产紫杉醇内生真菌种子液按占内生真菌固态发酵培养基体积25％的接入量接入内生真菌固态发酵培养基中，在16℃培养30天，然后置于磁场强度为0.2mT、磁场频率为3Hz的交变磁场环境中再培养20天，培养产物经真空冷冻干燥、粉碎后得内生真菌固态发酵产物；

内生真菌固态发酵培养基的制备包括：将新鲜曼地亚红豆杉的枝叶、蜘蛛香枝叶在自来水下冲洗干净，晾干，切碎；再将8.0g曼地亚红豆杉、和2.5g蜘蛛香用发酵基础培养基定容至1L，混合均匀，pH值自然，得到内生真菌固态发酵培养基。

(3)将产紫杉醇内生真菌种子液按占液体发酵培养基体积20％的接入量接入液体发酵培养基中，调pH值为7，在25℃培养5天，经6000rpm离心10min得到内生真菌发酵终产物；

液体发酵培养基的制备包括：将1g内生真菌固态发酵产物用发酵基础培养基定容至1L，混合均匀，pH值自然，得到液体发酵培养基。

实施例3

一、材料准备

PDA平板培养基、液体MRS培养基和PBS缓冲液同实施例1。

将斜面保藏的产紫杉醇内生真菌菌种接种到PDA平板培养基上，进行活化培养，培养温度30℃，培养时间3天，得到活化后的产紫杉醇内生真菌菌种。

发酵基础培养基由以下质量百分比的组分组成：葡萄糖2％、K₂HPO₄0.15％、MgSO₄0.08％和余量的水。

二、内生真菌发酵制品的制备

(1)取4cm²大小活化后的产紫杉醇内生真菌菌种接种到1L液体MRS培养基中于30℃培养4h，培养液经6000rpm离心10min收集第一菌体；将第一菌体悬浮在胆盐质量百分含量为0.5％的含胆盐的液体MRS培养基中于30℃孵育3h，经6000rpm离心10min收集第二菌体；将第二菌体经PBS缓冲液清洗干净后重新悬浮于液体MRS培养基中，震荡摇匀，在30℃再培养2天，得到产紫杉醇内生真菌种子液；

其中，第一菌体与用于悬浮第一菌体的含胆盐的液体MRS培养基的体积比为1:3，第二菌体与用于悬浮第二菌体的液体MRS培养基的体积比为1:3。

(2)将产紫杉醇内生真菌种子液按占内生真菌固态发酵培养基体积5％的接入量接入内生真菌固态发酵培养基中，在30℃培养3天，然后置于磁场强度为6mT、磁场频率为40Hz的交变磁场环境中再培养5天，培养产物经真空冷冻干燥、粉碎后得内生真菌固态发酵产物；

内生真菌固态发酵培养基的制备包括：将新鲜曼地亚红豆杉的枝叶、蜘蛛香枝叶在自来水下冲洗干净，晾干，切碎；再将2.0g曼地亚红豆杉和0.5g蜘蛛香用发酵基础培养基定容至1L，混合均匀，pH值自然，得到内生真菌固态发酵培养基。

(3)将产紫杉醇内生真菌种子液按占液体发酵培养基体积3％的接入量接入液体发酵培养基中，调pH值为3，在15℃培养25天，经6000rpm离心10min得到内生真菌发酵终产物；

液体发酵培养基的制备包括：将0.2g内生真菌固态发酵产物用发酵基础培养基定容至1L，混合均匀，pH值自然，得到液体发酵培养基。

对比例1

一、材料准备

PDA平板培养基、活化后的内生真菌菌种、液体MRS培养基和发酵基础培养基均同实施例1。

二、内生真菌发酵制品的制备

(1)取2cm²大小活化后的产紫杉醇内生真菌菌种接种到1L液体MRS培养基中于25℃培养5天，得到产紫杉醇内生真菌液体种子液。

(2)将产紫杉醇内生真菌液体种子液按占内生真菌发酵基础培养基体积15％的接入量接入内生真菌发酵基础培养基中，在25℃培养10天，培养产物经真空冷冻干燥、粉碎后得内生真菌发酵产物；

内生真菌发酵基础培养基的制备包括：将新鲜曼地亚红豆杉的枝叶、蜘蛛香枝叶在自来水下冲洗干净，晾干，切碎；然后将5g曼地亚红豆杉和1.8g蜘蛛香用发酵基础培养基定容至1L，混合均匀，pH值自然，得到内生真菌发酵基础培养基。

对比例2

除了“内生真菌发酵基础培养基的制备包括：将新鲜曼地亚红豆杉的枝叶在自来水下冲洗干净，晾干，切碎；然后将5g曼地亚红豆杉用发酵基础培养基定容至1L，混合均匀，pH值自然，得到内生真菌发酵基础培养基。”之外，其余操作同对比例1，得到内生真菌发酵产物。

活性成分的测定

(1)黄酮含量的测定

精确称取120℃条件下干燥至恒重的芦丁标准品10.0mg，用质量百分浓度70％的乙醇水溶液溶解并定容至100mL，配成0.1mg/mL标准溶液。分别取标准溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL于10mL容量瓶中，分别补加质量百分浓度70％乙醇水溶液至5.0mL后，加入0.3mL质量百分浓度5％的NaNO₂水溶液，摇匀放置6min；再加0.4mL质量百分浓度10％的Al(NO₃)₃水溶液，摇匀放置6min；再加4.0mL质量百分浓度4％NaOH水溶液，质量百分浓度60％乙醇水溶液定容至刻度，摇匀放置15min，冷却至室温后在510nm处测定标准品的吸光度，以标准品溶液质量浓度C(mg/mL)为横坐标，吸光度A为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程。

称取适量样品干粉，粉碎后过40目，先按料液比1:30(质量比)加入质量百分浓度70％的乙醇水溶液，在70℃下提取2h，提取液离心过滤后定容至50ml，从中取1ml样品进行含量测定。

(2)紫杉醇含量的测定

发酵产物细胞超生破碎后的混合抽提物。HPLC色谱条件：色谱柱为AgilentEclipseXDB-C18柱(4.6mm×150mm)，流动相为甲醇-水(体积比65:35)，检测波长为228nm，流速为0.8mL/min，柱温为35℃，进样量为20μL。

表1各实施例和对比例主要成分检测结果

注：与对比例1、对比例2比较，Δ：P<0.05。

表1的数据显示，本发明方法得到的内生真菌发酵终产物中黄酮的含量、紫杉醇的得率均得到了大幅度的提高。与常规培养方法相比，采用本发明方法获得的内生真菌发酵终产物中黄酮含量提高了36.7％-46.0％，紫杉醇得率提高了38.4％-43.0％。

在本发制备方法限定的范围内各参数的变化并不影响本发明内生真菌发酵产物中紫杉醇、黄酮等产量的提高，因此本发明制备方法中任意参数的组合均可提高内生真菌发酵产物中紫杉醇和黄酮等的产量。在此不再赘述。

Claims

1.一种提高内生真菌发酵产物中紫杉醇产量的方法，其特征在于，包括步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述内生真菌固态发酵培养基每1L中含有2.0g-8.0g曼地亚红豆杉和0.5g-2.5g蜘蛛香。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述液体发酵培养基每1L中含有0.2g-1g内生真菌固态发酵产物。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述含胆盐的液体MRS培养基中胆盐的质量百分含量为0.1％-0.5％。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述第一菌体与用于悬浮第一菌体的含胆盐的液体MRS培养基的体积比为1:1-3，第二菌体与用于悬浮第二菌体的液体MRS培养基的体积比为1:1-3。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述交变磁场环境中磁场强度为0.2mT-6mT，磁场频率为3Hz-40Hz。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述产紫杉醇内生真菌种子液的接入量为内生真菌固态发酵培养基体积的5％-25％。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述产紫杉醇内生真菌种子液的接入量为液体发酵培养基体积的3％-20％。