CN102329828A

CN102329828A - 用于欧文氏菌制备紫杉醇的培养基及其配制方法和应用

Info

Publication number: CN102329828A
Application number: CN201010538855A
Authority: CN
Inventors: 吴翰桂; 张昕欣; 许玉丽; 李娜; 王玲萍
Original assignee: Taizhou Vocational and Technical College
Current assignee: Taizhou Vocational and Technical College
Priority date: 2010-11-10
Filing date: 2010-11-10
Publication date: 2012-01-25
Anticipated expiration: 2030-11-10
Also published as: CN102329828B

Abstract

本发明涉及一种用于欧文氏菌制备紫杉醇的培养基，所述的培养基的成分是：大豆蛋白胨、工业酵母抽提物、KCl、葡萄糖、MgCl₂、NaAc、苯丙氨酸、调pH；培养基的配制方法包括以下步骤：a、初始培养基的配制；b、配制NaAc母液；c、配制苯丙氨酸母液；d、制成培养基。用于欧文氏菌制备紫杉醇，得到紫杉醇的产量为101.5μg/L～103.0μg/L；生产紫杉醇的周期为3～4天，缩短了生产周期，提高了产量；且本发明所采用的原料廉价易得，从而也大大降低了生产成本。

Description

用于欧文氏菌制备紫杉醇的培养基及其配制方法和应用

技术领域

本发明涉及一种培养基及其配制方法和应用，尤其涉及一种用于欧文氏菌制备紫杉醇的培养基，属于生物技术领域。

背景技术

紫杉醇(Paclitaxel，商品名Taxol)是红豆杉树种中发现的一种天然的抗癌药物，它对乳腺癌、肺癌和白血病细胞等具有强杀伤作用。Wani和Wail等人在J.AM.Chem.Soc.93，2325，(1971)中首次报道了紫杉醇的分离及理化特征，并确定了其优良的抗癌活性，引起了人们广泛的关注。并于1992年底被美国FDA正式批准作为治疗晚期卵巢癌药物进入市场，1993年底被批准用于治疗乳腺癌。此后，临床上陆续发现紫杉醇对卡波济氏肉瘤、结、直肠癌、膀胱癌和转移性乳腺癌等一系列棘手肿瘤均展现出一定的疗效。另外，由于紫杉醇副作用小，药效显著，因此，紫杉醇已成为抗肿瘤的主流药物之一，随之需求量也迅速增加。

现有的紫杉醇的主要制备方法是直接提取法和生化半合成法。直接提取法主要是从红豆杉树中提取得到，但由于紫杉醇在整个红豆杉树木中的含量是极低和其溶解性差。从而使该方法生产紫杉醇需要消耗大量的红豆杉树原料。而生化半合成法的应用也是基于对植物红豆杉生成紫杉醇的分子生物学研究的结果，利用生物酶类将红豆杉原料进行处理，使较易溶于水的紫杉烷环和C-13位侧链中间体得到一定程度富集，提取前体，利用酶法或化学法将这些前体合成紫杉醇。生化半合成法虽然在一定程度上提高了紫杉醇产量，但仍然需要消耗大量红豆杉树原料。由于植物生长周期长，且种植严重受自然条件限制，另一方面，红豆杉植物在我国和世界各国的资源也很少，从而，使得生产紫杉醇的成本极高。为此，制药界和学术界一直在寻找一种更好的原料及方法，来代替现有技术。

1993年，Stierle等人从太平洋红豆杉的韧皮部分离得到一株次级代谢物中含有紫杉醇的内生真菌，使得利用真菌发酵生产紫杉醇成为可能。但是目前报道的生产紫杉醇的菌株大多是红豆杉共生真菌，导致紫杉醇的产量很低；且菌丝体不发达，并不适于发酵生产。

发明内容

本发明针对现有技术中所存在的缺陷，提出了一种用于欧文氏菌制备紫杉醇的培养基。

本发明的目的是通过下列技术方案来实现：一种用于欧文氏菌制备紫杉醇的培养基，所述的培养基中包括以下质量浓度的成分组成：大豆蛋白胨：15～25g/L；工业酵母抽提物：4.5～5.5g/L；NaCl：0.10～1.0g/L；KCl：0.05～0.15g/L；葡萄糖：1.0～8.0g/L；MgCl₂：0.5～1.5g/L；NaAc：0.05～0.15g/L；苯丙氨酸：2.0×10^-4～8.0×10^-4g/L；pH：6.0～7.0。

根据以上本发明所述的培养基，其中大豆蛋白胨和葡萄糖为欧文氏菌培养提供主要的碳源、氮源和生长因子；其中所含的NaCl、KCl和MgCl₂，主要是提供欧文氏菌生长所需要的矿物质；其中所述的pH值可以通过调节KHPO₄/KH₂PO₄缓冲剂来控制，因为微生物在生长繁殖或代谢过程中，由于营养物质被分解利用和代谢产物的形成或积累，会导致培养基pH值发生变化，若不对pH值进行控制，pH值过高或过低，都会导致微生物生长速度降低或代谢产物产量降低；如果没有以上所述的碳源、氮源、生长因子和矿物质及pH值环境，那么欧文氏菌就不能通过培养生长繁殖来实现；而NaAc和苯丙氨酸，都是合成紫杉醇的必须原料，如果没有这两种原料，就不能合成紫杉醇，从而不能实现本发明的目的。

作为优选，所述的培养基中包括以下成分及质量浓度：大豆蛋白胨：18～22g/L；工业酵母抽提物：4.8～5.2g/L；NaCl：0.30～0.80g/L；KCl：0.08～0.12g/L；葡萄糖：3.0～5.0g/L；MgCl₂：0.8～1.2g/L；NaAc：0.02～0.13g/L；苯丙氨酸：3.0×10^-4～7.0×10^-4g/L；PH：6.3～6.8。

进一步的优选，所述的培养基中包括以下成分及质量浓度：大豆蛋白胨：20g/L；工业酵母抽提物：5g/L；NaCl：0.5g/L；KCl：0.10g/L；葡萄糖：4.0g/L；MgCl₂：1.0g/L；NaAc：0.10g/L；苯丙氨酸：5.0×10^-4g/L；pH：6.5。

根据以上所述的培养基，其中所含的NaAc和苯丙氨酸是合成紫杉醇的必须原料，如果所含的质量浓度过少，则会使合成的紫杉醇产量过低；若所含的质量浓度过高，一方面，合成紫杉醇的产量反而会降低，另一方面，在产量降低的情况下，提高其所含的质量浓度，从而使所需的成本增高。

本发明的另一个目的在于提供一种用于欧文氏菌制备紫杉醇的培养基的制备方法，该方法包括以下步骤：

a、初始培养基的配制：称取大豆蛋白胨；工业酵母抽提物；NaCl；KCl；葡萄糖；MgCl₂；将称量好的成分和水混合均匀后，调节pH，灭菌，制成初始培养基；

b、称取NaAc，用水配制成母液，灭菌后，备用；

c、称取苯丙氨酸，用水配制成苯丙氨酸母液，灭菌后，备用；

d、将欧文氏菌接种于步骤a中所述的初始培养基后，加入步骤b中所述的NaAc母液，发酵8～20小时后，再加入苯丙氨酸母液，制成培养基。

在上述用于欧文氏菌制备紫杉醇的培养基的制备方法中，所述的灭菌处理是采用高压蒸汽灭菌法。要获得纯微生物培养，就必须避免杂菌污染，所以必须对培养基进行严格的灭菌处理。

本发明采用的欧文氏菌是现有普通的欧文氏菌，如美国发明专利(公开号：US5561055A)公开的欧文氏菌，保藏的编号为：ATCC：55669。该欧文氏菌可以从市场上购得。

在上述培养基制备方法中，作为优选，步骤d所述的发酵时间为10～14小时，所述的发酵时间太短，则使合成的紫杉醇的反应不完全，影响到下一步合成反应，使产量降低，同时也浪费了原料；另一方面，如果发酵的时间过长，则使能耗增加，从而提高了生产成本；而利用本发明所述的培养基在欧文氏菌制备紫杉醇中，既提高了紫杉醇的产量，又达到了降低生产成本的目的。

本发明的另一个目的在于提供了一种本发明所述的培养基在欧文氏菌制备紫杉醇中的应用，所述的培养基在制备紫杉醇中的应用得到紫杉醇的产量为101.5μg/L～103.0μg/L。

具体的应用过程在于：将欧文氏菌按5％的接种量接种于上述步骤b所述的初始培养基中，同时，设定发酵温度为22℃，通气量为200L/h，转速为100r/min，发酵8～20小时后，加入步骤c中所述的苯丙氨酸，设定发酵温度为22℃，通气量为200L/h，转速为50r/min，发酵60小时，停止发酵，得到的含有紫杉醇的发酵液，产量为101.5μg/L～103.0μg/L。

所述的欧文氏菌是经过活化、一级种子培养、二级种子培养得到的欧文氏菌二级种子接种于上述培养基中，所述的活化是将欧文氏菌原种接种于活化培养基斜面，设定温度在30℃，进行活化培养48h后，将斜面活化两次，将活化两次后的菌种单菌落划线接种于上述的活化培养基平板上，设定温度在30℃，培养24h，划线平板上得到活化后的欧文氏菌种。所述的活化培养基包括以下成分及其质量浓度：Tryptone：20g/L；Yeast Extract：5g/L；NaCl：0.5g/L；KCl：2.5mM；MgCl₂：10mM；Glucose：20mM；Agar：20g/L；PH：7.2。所述的一级种子培养是将上述活化后的欧文氏菌种接种于一级种子液体培养基，并调整其初始菌浓度为0.1OD，设定温度为30℃，设定摇床的转速为250r/min，进行摇床培养12h，获得欧文氏菌一级种子，所述的一级种子液体培养基包括以下成分及其质量浓度：Tryptone：20g/L；YeastExtract：5.0g/L；NaCl：0.5g/L；KCl：2.5mM；Glucose：20mM；PH：7.2。所述的二级种子培养是将将获得的一级种子按10％的接种量接种于由上述成分组成的二级种子培养基，设定温度为30℃，设定摇床的转速为250r/min，摇床培养12h，获得菌文氏菌二级种子，所述的二级种子培养基包括以下成分及其含量：Tryptone：5.0g/L；大豆蛋白胨：12g/L；Yeast Extract：2g/L；工业酵母抽提物：3g/L；NaCl：0.5g/L；KCl：0.1g/L；葡萄糖：4g/L；MgCl₂：21g/L；pH：7.2。

在上述培养基在欧文氏菌制备紫杉醇中的应用中，生产周期为3～4天，大大的缩短了紫杉醇的生产周期，且所采用的培养基原料也廉价易得，从而也大大降低了生产成本；同时，也提高了紫杉醇的产量。

上述培养基在用于欧文氏菌制备紫杉醇应用中，培养发酵后得到的发酵液，经过离心后收集上清液，将大孔吸附树脂(AB-8)加入到上清液中，吸附、干燥后，将大孔吸附树脂(AB-8)上层析柱，用乙醇洗脱，洗脱流速为5～10ml/min，收集乙醇洗脱液。然后控制浓缩温度≤42℃，将所得到的乙醇洗脱液进行减压蒸馏浓缩。浓缩结束后，向浓缩液内加入100～200目的硅胶，搅拌混匀，控制温度在40℃，干燥48hr(干燥过程中，每4hr翻动一次)。干燥后，将料胶上层析柱，用75％～35％(v/v)氯仿-丙酮洗脱，洗脱流速为5～10ml/min，收集中段洗脱液。然后控制浓缩温度≤42℃，将所得到的中段洗脱液进行减压蒸馏浓缩后，将所得的浓缩液经真空冷冻干燥，得到纯化后的紫杉醇。

综上所述，本发明具有以下优点：

1、本发明所述的培养基原料易得，成本低廉，营养价值高适合欧文氏菌制备紫杉醇。

2、本发明培养基的配制方法操作简单，易于实现；有利于实现工业化的生产。

3、本发明所述的培养基在欧文氏菌制备紫杉醇的应用，得到的紫杉醇产量高，从而也降低了生产成本。

附图说明

图1是紫杉醇标准品的HPLC谱图；

图2是用LB培养基培养发酵所得发酵液的HPLC谱图；

图3是用SOC培养基培养发酵所得发酵液的HPLC谱图；

图4是用本发明的培养基培养发酵所得发酵液的HPLC谱图；

图5是紫杉醇标准品的HPLC-MS的谱图；

图6是用本发明的培养基培养发酵所得发酵液的HPLC-MS的谱图。

具体实施方式

下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的说明，但本发明并不限于该实施例。

表1：实施例1-3所述的培养基的成分及质量浓度

实施例1

初始培养基的配制：按表1中实施例1的成分及其质量浓度称取大豆蛋白胨：15g；工业酵母抽提物：4.5g；NaCl：0.10g；KCl：0.05g；葡萄糖：1.0g；MgCl₂：0.5g；蒸馏水1000ml，分开放置；将称量好的成分和水混合均匀后，加入KHPO₄/KH₂PO₄缓冲剂调节pH：6.3，采用高压蒸汽灭菌20分钟，制成初始培养基；

称取NaAc 0.05g，用蒸馏水配制成质量浓度为0.05g/L的NaAc母液，采用高压蒸汽灭菌20分钟，备用；

称取苯丙氨酸2.0×10^-4g，用蒸馏水配制成质量浓度为2.0×10^-4g/L苯丙氨酸母液，采用高压蒸汽灭菌20分钟，备用；

将欧文氏菌接种于初始培养基后，加入NaAc母液0.05g/L，发酵12小时后，再加入苯丙氨酸母液2.0×10^-4g/L，制成培养。

应用实施例1

将欧文氏菌按5％的接种量接种于上述初始培养基中，同时别入NaAc母液0.05g/L，设定发酵温度为22℃，通气量为200L/h，转速为100r/min，发酵12小时后，加入苯丙氨酸母液2.0×10^-4g/L，设定发酵温度为22℃，通气量为200L/h，转速为50r/min，发酵60小时，停止发酵，得到的含有紫杉醇的发酵液，将所得的发酵液进行检测分析，产量为101.6μg/L。

实施例2

初始培养基的配制：按表1中实施例2的成分及其质量浓度称称取大豆蛋白胨：25g；工业酵母抽提物：5.5g；NaCl：1.00g；KCl：0.15g；葡萄糖：8.0g；MgCl₂：1.5g；蒸馏水1000ml，分开放置；将称量好的成分和蒸馏水混合均匀后，加入KHPO₄/KH₂PO₄缓冲剂调节pH：6.8，采用高压蒸汽灭菌20分钟，制成初始培养基；

称取NaAc 0.15g，用蒸馏水配制成质量浓度为0.15g/L的NaAc母液，采用高压蒸汽灭菌20分钟，备用；

称取苯丙氨酸8.0×10^-4g，用蒸馏水配制成质量浓度为8.0×10^-4g/L苯丙氨酸母液，采用高压蒸汽灭菌20分钟，备用；

将欧文氏菌接种于初始培养基后，加入NaAc母液0.15g/L，发酵12小时后，再加入苯丙氨酸母液8.0×10^-4g/L，制成培养基。

应用实施例2

将欧文氏菌按5％的接种量接种于初始培养基中，同时NaAc母液0.15g/L，设定发酵温度为22℃，通气量为200L/h，转速为100r/min，发酵12小时后，加入苯丙氨酸8.0×10^-4g/L，设定发酵温度为22℃，通气量为200L/h，转速为50r/min，发酵60小时，停止发酵，得到的含有紫杉醇的发酵液，将所得的发酵液进行检测分析，产量为101.8μg/L。

实施例3

初始培养基的配制：按表1中实施例3的成分及其质量浓度称取大豆蛋白胨：22g；工业酵母抽提物：5.0g；NaCl：0.50g；KCl：0.10g；葡萄糖：4.0g；MgCl₂：1.0g；蒸馏水1000ml，分开放置；将称量好的成分和蒸馏水混合均匀后，加入KHPO₄/KH₂PO₄缓冲剂调节pH：6.5，采用高压蒸汽灭菌20分钟，制成初始培养基；

称取NaAc0.10g，用蒸馏水配制成质量浓度为0.10g/L的NaAc母液，采用高压蒸汽灭菌20分钟，备用；

称取苯丙氨酸5.0×10^-4g，用蒸馏水配制成质量浓度为5.0×10^-4g/L苯丙氨酸母液，采用高压蒸汽灭菌20分钟，备用；

将欧文氏菌接种于初始培养基后，加入NaAc母液0.10g/L，发酵12小时后，再加入苯丙氨酸母液5.0×10^-4g/L，制成培养基。

应用实施例3

将欧文氏菌按5％的接种量接种于初始培养基中，同时别入NaAc母液0.10g/L，设定发酵温度为22℃，通气量为200L/h，转速为100r/min，发酵12小时后，加入苯丙氨酸母液5.0×10^-4g/L，设定发酵温度为22℃，通气量为200L/h，转速为50r/min，发酵60小时，停止发酵，得到的含有紫杉醇的发酵液，将所得的发酵液进行检测分析，产量为102.1μg/L。

比较例1

将发酵罐灭菌后，待罐内温度降至24℃以下时，按5％的接种量将欧文氏菌接种于LB培养基中，同时加入NaAc母液0.10g/L，设定发酵温度22℃，通气量200L/h，转速100r/min，培养12小时后，加入苯丙氨酸5.0×10^-4g/L，并将转速降至50r/min。培养60小时后，停止发酵，得发酵液。将所得的发酵液进行HPLC检测。

比较例2

将发酵罐灭菌后，待罐内温度降至24℃以下时，按5％的接种量将欧文氏菌接种于SOC培养基中，同时同时加入NaAc母液0.10g/L，设定发酵温度22℃，通气量200L/h，转速100r/min，培养12小时后，加入苯丙氨酸5.0×10^-4g/L，并将转速降至50r/min。培养60小时后，停止发酵，得发酵液。将所得的发酵液进行HPLC检测。

随机抽取上述实施例1-3和比较例1-2中所述的发酵液，分别采用HPLC和HPLC-MS分析法检测，定量的分析紫杉醇的产量。HPLC谱图图1、图2、图3、图4所示，图1是紫杉醇标准品的谱图，图2、图3、图4是分别是本发明实施例、比较例1和比较例2所得的发酵液的HPLC谱图；可以看出，采用本发明的培养基发酵得到的紫杉醇产量高。另外，采用HPLC-MS分析法对实施3所得的发酵液和紫杉醇标准品进行检测分析，其HPLC-MS谱图如图5和图6所示。可以看出，采用本发明的培养基应用于欧文氏菌制备得到的紫杉醇与标准的紫杉醇样品一致。

上述HPLC分析法的检测条件是：柱温：35℃；检测波长：227nm；流动相：甲醇∶95％乙腈∶蒸馏水(V/V/V)20∶40∶40；流速1.2ml/min；进样量20μl。

上述HPLC-MS分析法的检测条件是：柱温：35℃；检测波长：227nm；流动相：95％乙腈∶蒸馏水(V/V)50∶50；流速1.0ml/min；进样量10μl。

综上所述，如图1～图4所示，利用本发明所述的培养基在欧文氏菌制备紫杉醇中的应用，得到的紫杉醇产量高；根据图5和图6所示，说明本发明的培养基利用欧文氏菌发酵能够制得紫杉醇。

本发明中所描述的具体实施例仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。

尽管对本发明已作出了详细的说明并引证了一些具体实施例，但是对本领域熟练技术人员来说，只要不离开本发明的精神和范围可作各种变化或修正是显然的。

Claims

1.一种用于欧文氏菌制备紫杉醇的培养基，所述的培养基包括以下质量浓度的成分：大豆蛋白胨：15～25g/L；工业酵母抽提物：4.5～5.5g/L；NaCl：0.10～1.0g/L；KCl：0.05～0.15g/L；葡萄糖：1～8g/L；MgCl₂：0.5～1.5g/L；NaAc：0.05～0.15g/L；苯丙氨酸：2×10^-4～8×10^-4g/L；pH：6.0～7.0。

2.根据权利要求1所述的一种用于欧文氏菌制备紫杉醇的培养基，其特征在于：所述的培养基包括以下质量浓度的成分：大豆蛋白胨：18～22g/L；工业酵母抽提物：4.8～5.2g/L；NaCl：0.30～0.80g/L；KCl：0.08～0.12g/L；葡萄糖：3～5g/L；MgCl₂：0.8～1.2g/L；NaAc：0.02～0.13g/L；苯丙氨酸：3×10^-4～7×10^-4g/L；pH：6.3～6.8。

3.根据权利要求2所述的一种用于欧文氏菌制备紫杉醇的培养基，其特征在于：所述的培养基包括以下质量浓度的成分：大豆蛋白胨：20g/L；工业酵母抽提物：5g/L；NaCl：0.5g/L；KCl：0.1g/L；葡萄糖：4g/L；MgCl₂：1g/L；NaAc：0.1g/L；苯丙氨酸：5×10^-4g/L；pH：6.5。

4.一种如权利要求1或2或3所述的培养基的配制方法，该方法包括以下步骤：

b、称取NaAc，用水配制成母液，灭菌后，备用；

5.根据权利要求4所述的培养基的配制方法，其特征在于步骤d中所述的苯丙氨酸，是在发酵10～14小时后，加入苯丙氨酸母液。

6.一种根椐权利要求1所述的培养基在欧文氏菌制备紫杉醇中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：如权利要求1或2或3所述的培养基在用于欧文氏菌制备紫杉醇中，得到紫杉醇的产量为101.5μg/L～103.0μg/L。