CN101293886A - 白木香内生真菌产物螺光黑壳菌酮a的制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于化学和生物工程技术领域，涉及一种真菌次生代谢产物螺光黑壳菌酮A(Spiropreussione A)的制备方法及其在抗生素和抗肿瘤药物中的应用，内容包括产生化合物螺光黑壳菌酮A的光黑壳菌(Preussia sp.)AS－5的液体发酵培养工艺；从发酵生产的AS－5菌丝体和发酵液中制备该化合物的方法；该化合物的结构和物理化学性质；该化合物对金黄色葡萄球菌和肿瘤细胞的抑制活性。该项技术中，真菌AS－5生长速度快，发酵工艺简单，生产成本低，AS－5的次生代谢产物螺光黑壳菌酮A结构新颖，在发酵产物中的含量高，制备工艺简单。

Description

白木香内生真菌产物螺光黑壳菌酮A的制备方法及应用

技术领域

本发明内容属于化学和生物工程技术领域，具体的说涉及一种真菌来源的螺环化合物螺光黑壳菌酮A(Spiropreussione A)；

本发明还涉及化合物螺光黑壳菌酮A的制备方法；

本发明还涉及化合物螺光黑壳菌酮A在制备抗生素和抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

白木香[Aquilaria sinensis(Lour.)Gilg](又称沉香)是瑞香科(Thymelaeaceae)白木香属(Aquilaria)多年生常绿木本植物，其含有黑色树脂的木质部入药，名为沉香。沉香具有行气止痛，温中止呕，纳气平喘的功效，临床用于治疗胸腹胀闷疼痛，呕吐呃逆，肾虚气喘。

对中药沉香的化学成分研究表明其主要含有两种类型的化学成分：即挥发性成分和2-苯乙基色酮类。现代药理研究证明沉香中的挥发性成分，如白木香酸及沉香螺旋醇，对神经系统的药理模型活性很强；2-苯乙基色酮类具有抗过敏的活性；苄基丙酮是镇咳的有效成分，这些结果与沉香传统用药的主治功能相吻合。目前国内对白木香的研究主要集中于药理活性、化学成分、引种栽培和组织培养等方面，对其内生真菌的研究，以及内生真菌的化学成分的研究均未见有报道。

内生真菌具有独特的生理学和生态学特点，更容易产生特殊的次生代谢产物。真菌具有生长速度快，培养条件易于实现人工控制，可以进行工业化生产的优点。对真菌的研究和开发利用对生态环境造成的影响小，不会受到自然资源的限制。这些特点使研究真菌的化学成分及次生代谢产物的生物活性成为寻找新结构的先导化合物的重要途径之一，为开发新药、保健食品等提供了重要的科学依据。自然界存在的真菌种类繁多，从这些真菌的发酵产物中寻找到结构独特，作用机理新颖的活性成分，是新药研制的基础性工作。

发明内容

本发明的目的在于提供一种化合物螺光黑壳菌酮A(SpiropreussioneA)。

本发明的另一目的在于提供一种从光黑壳菌(Preussia sp.)AS-5的液体发酵培养物中制备化合物螺光黑壳菌酮A的方法。该方法中AS-5的发酵工艺简单、生产周期短、成本低，可用于大规模发酵培养；AS-5的次生代谢产物螺光黑壳菌酮A的结构新颖，在发酵产物中的含量高，制备工艺简单。

本发明的再一目的在于提供螺光黑壳菌酮A用于抗生素和抗肿瘤药物的研究和应用。

用于实现本发明目的的化合物螺光黑壳菌酮A是从真菌AS-5的液体发酵物中分离得到的。真菌AS-5由多年生木本植物白木香[Aquilaria sinensis(Lour.)Gilg]的茎中分离纯化得到，经培养鉴定为光黑壳菌(Preussia sp.)。该菌种于2007年4月27日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏单位地址：北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为：CGMCC No.2022。保藏和存活证明见附件。

化合物螺光黑壳菌酮A具有以下理化性质：

(1)形状：黄色针状结晶；

(2)熔点：153-154℃；

(3)分子量：320；

(4)分子式：C₁₉H₁₂O₅；

(5)化学结构式：

制备上述化合物采用的技术方法主要包括以下步骤：

(1)AS-5的液体发酵培养：

将真菌AS-5自低温保藏的斜面试管菌种活化后，转接于含PDA培养基的平皿中，于24-26℃暗培养5-10天，分别在菌落边缘打孔成菌片，并以小碎块接入液体培养基进行发酵培养；

液体培养的培养基组成为：葡萄糖1-4％，KH₂PO₄ 0.1-0.5％，MgSO₄ 0.1-0.3％，麦麸1-5％(煮汁)，以上组分均按重量百分含量计算，其余成分为水，培养基pH 5.0-6.5。三角瓶或其他容器振荡培养真菌，容器装量30-60％。振荡转速90-130转/分钟，20-26℃暗培养4-10天收获。

(2)真菌AS-5发酵培养物的获得：

真菌AS-5经发酵培养后，用尼龙网过滤，分离菌丝体和发酵液，按下列方法分别处理菌丝体和发酵液部分：

①菌丝体部分用清水冲洗2-3遍，挤压除去大量水分，晾干或55-65℃烘干，适当粉碎成粗颗粒；

②发酵液部分冷冻干燥得到发酵液冻干粉，或60-65℃减压浓缩至小体积得到发酵液浓缩物；

(3)化合物螺光黑壳菌酮A的制备：

①菌丝体粗颗粒和发酵液冻干粉，用甲醇、95％乙醇、丙酮、乙酸乙酯、石油醚、二氯甲烷、三氯甲烷、二氯甲烷-甲醇或三氯甲烷-甲醇等有机溶剂浸泡提取、超声波提取或渗漉提取，提取液55-65℃减压浓缩至小体积，60-65℃水浴除去有机溶剂，得到提取浸膏；

②发酵液浓缩物加入95％乙醇或无水乙醇进行醇沉，使混合物中含有70-80％的乙醇，震摇或剧烈搅拌后放置分层，收集上清液，沉淀部分加入95％乙醇或无水乙醇，重复以上操作2-4次，收集上清液后55-65℃减压浓缩至小体积，60-65℃水浴除去残留乙醇，得到提取浸膏；③提取浸膏用蒸馏水分散，石油醚萃取；萃取液55-65℃减压浓缩后经100-200目硅胶柱分离，流动相为石油醚至石油醚-乙酸乙酯(2∶1)梯度洗脱，经过重结晶纯化，得到化合物螺光黑壳菌酮A。

化合物螺光黑壳菌酮A对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度(MIC)为8μg·mL^-1，对人肝癌细胞Bel-7402的IC₅₀为0.95μg·mL^-1，对人卵巢癌细胞A2780的IC₅₀为0.77μg·mL^-1。

具体实施方式

实施例

将光黑壳菌(Preussia sp.)AS-5自低温保藏的斜面试管菌种活化后，转接于含PDA培养基的平皿中，于25℃恒温培养6天，在菌落边缘打孔成菌片，并以小碎块接入液体培养基进行发酵培养。真菌液体培养的培养基组成为：葡萄糖2％，KH₂PO₄ 0.3％，MgSO₄ 0.15％，麦麸3％(煮汁)，培养基pH 6.0。250mL三角瓶装培养基100mL，121℃灭菌20分钟，接入真菌AS-5。培养条件：摇床振荡转速100转/分钟；24℃暗培养7天。

发酵培养结束后，用100目尼龙网过滤，将发酵产物分为菌丝体和发酵液两部分。菌丝体部分用水冲洗干净，挤压除去大部分水分，60℃烘干。干燥的菌丝体略碎后，用95％乙醇浸泡24小时，并不时搅拌，超声波提取3次，每次提取30分钟，每次提取溶剂用量(V)分别为菌丝体重量(W)的10倍、7倍和6倍。合并3次提取液，60℃减压(真空度0.6)浓缩至浸膏密度为1.15(50℃)，得到菌丝体提取浸膏。

菌丝体提取浸膏用1.5倍体积的蒸馏水分散，石油醚萃取，萃取液55℃减压(真空度0.6)浓缩后，经100-200目硅胶柱分离，流动相为石油醚至石油醚-乙酸乙酯(2∶1)梯度洗脱，收集石油醚-乙酸乙酯(7∶2)的流分，经过葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱净化，流动相为三氯甲烷-甲醇(1∶1)，重结晶，得到化合物螺光黑壳菌酮A。

螺光黑壳菌酮A具有以下理化性质：

(1)形状：黄色针状结晶；

(2)熔点：153-154℃；

(3)分子量：320；

(4)分子式：C₁₉H₁₂O₅；

(5)比旋度：

(6)紫外吸收光谱： ${\mathrm{\λ}}_{\max }^{\mathrm{MeOh}}\left(\log \mathrm{\ϵ}\right)=225.6\mathrm{nm}\left(3.63\right);$

(7)红外吸收光谱：γ_max ^KBr cm^-1：3510，3346，3061，1749，1705，1608，1587，1416，1379，1344，1321，1277，1246，1204，1078，1059，1041，1003，970，933；

(8)高分辨电子轰击质谱(HREI-MS)m/z：320.0690(Calc.Mass for C₁₉H₁₂O₅ 320.0685)；电子轰击质谱(EI-MS)m/z：320(100)，303，291，275，265，237，197，170；

(9)氢核磁共振谱(¹H-NMR)和碳核磁共振谱(¹³C-NMR)数据见表1

表1螺光黑壳菌酮A的NMR数据(600MHz for ¹H-NMR and 150MHz for ¹³C-NMR in CDCl₃)

(10)推定化学结构式：

经以上物理方法和波谱数据测定，螺光黑壳菌酮A(Spiropreussione A)的结构为二螺[3-环戊烯-1，1’-[4]环戊烯-3’，2”-萘并[1，8-d，e][1，3]二氧杂芑]-2，5-二酮，2’-羟基(Despiro[3-cyclopentene-1，1’-[4]cycolpentene-3’，2”-naphtha[1，8-d，e][1，3]dioxin]-2，5-dione，2’-hydroxy-[9C1])。

比较例

1.从AS-5发酵液中制备螺光黑壳菌酮A

将经过PDA平板活化的真菌AS-5接入麦麸液体培养基，24℃摇床振荡暗培养8天。培养结束后，用100目尼龙网过滤，将发酵产物分为菌丝体和发酵液两部分。发酵液冷冻干燥成冻干粉。将发酵液冻干粉以石油醚(60-90℃)渗漉提取，溶剂用量(V)为冻干粉重量(W)的15倍。渗漉液于55℃减压回收溶剂，得到发酵液提取浸膏。提取浸膏经100-200目硅胶柱分离，流动相为石油醚至石油醚-乙酸乙酯(2∶1)梯度洗脱，收集石油醚-乙酸乙酯(7∶2)的流分，经过葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱净化，流动相为三氯甲烷-甲醇(1∶1)，重结晶，可得到化合物螺光黑壳菌酮A。

2.螺光黑壳菌酮A的抗菌活性

用纸片法测定，纸片(Φ6mm)含螺光黑壳菌酮A 5μg时对金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的抑菌圈直径为16-17mm。用倍比稀释法测定螺光黑壳菌酮A对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度(MIC)为8μg·mL^-1。以苄基青霉素钠为标准品，用管蝶法测定螺光黑壳菌酮A的抗生素效价为0.05U。

3.螺光黑壳菌酮A的抗肿瘤活性

采用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT法)测定螺光黑壳菌酮A对人大肠癌细胞HCT-8，人胃癌细胞BGC-823，人肺癌细胞A549，人卵巢癌细胞A2780和人肝癌细胞Bel-7402的半数抑制浓度(IC₅₀)，结果表明螺光黑壳菌酮A对人肝癌细胞Bel-7402的IC₅₀为0.95μg·mL^-1，对人卵巢癌细胞A2780的IC₅₀为0.77μg·mL^-1，对其他三种癌细胞的IC₅₀均高于3.2μg·mL^-1。

Claims (9)

1.一种化合物螺光黑壳菌酮A(SpiropreussioneA)，具有以下理化性质：

(1)形状：黄色针状结晶；

(2)熔点：153-154℃；

(3)分子量：320；

(4)分子式：C₁₉H₁₂O₅；

(5)化学结构式：

2.一种制备化合物螺光黑壳菌酮A(Spiropreussione A)的方法，包括步骤：

(1)真菌AS-5的发酵培养：

将光黑壳菌(Preussia sp.)AS-5自低温保藏的斜面试管菌种活化后，转接于含PDA培养基的平皿中，于24-26℃暗培养5-10天，分别在菌落边缘打孔成菌片，并以小碎块接入液体培养基进行培养和发酵；

液体培养的培养基组成为葡萄糖、KH₂PO₄、MgSO₄、麦麸；三角瓶或其他容器振荡培养真菌；

(2)真菌AS-5发酵培养物的获得：

真菌AS-5经发酵培养后，用尼龙网过滤，分离菌丝体和发酵液，按下列方法分别处理菌丝体和发酵液部分：

①菌丝体部分用水冲洗干净，挤压除去大量水分，晾干或烘干，适当粉碎成粗颗粒；

②发酵液部分冷冻干燥得到发酵液冻干粉，或减压浓缩至小体积得到发酵液浓缩物；

(3)螺光黑壳菌酮A(Spiropreussione A)的制备：

①菌丝体粗颗粒和发酵液冻干粉，用有机溶剂提取；提取液减压浓缩至小体积，水浴除去有机溶剂，得到提取浸膏；

②发酵液浓缩物加入95％乙醇或无水乙醇进行醇沉，使混合物中含有70-80％的乙醇，震摇或剧烈搅拌后放置分层，收集上清液，沉淀部分加入95％乙醇或无水乙醇，重复以上操作1-3次，收集上清液后减压浓缩至小体积，水浴除去残留乙醇，得到提取浸膏；

③提取浸膏用蒸馏水分散，石油醚萃取；萃取液浓缩后经100-200目硅胶柱分离，流动相为石油醚至石油醚-乙酸乙酯(2∶1)梯度洗脱，经过重结晶纯化，得到化合物螺光黑壳菌酮A。

3.如权利要求2所述的培养方法，其中所述的真菌为光黑壳菌(Preussia sp.)AS-5，保藏编号CGMCC No.2022。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于：真菌AS-5液体培养的培养基组分按重量计为葡萄糖1-4％，KH₂PO₄ 0.1-0.5％，MgSO₄ 0.1-0.3％，麦麸1-5％(煮汁)，其余成分为水，培养基pH 5.0-6.5，培养容器装量30-60％，振荡转速90-130转/分钟，20-26℃暗培养4-10天收获。

5.如权利要求2所述的方法，其特征在于：AS-5菌丝体或发酵液的干燥、提取、浓缩等处理过程，菌丝体提取浸膏、发酵液提取浸膏或发酵液浓缩物的萃取、溶剂回收、水浴加热等处理过程，其中的处理温度不得高于70℃。

6.如权利要求2所述的方法，其特征在于：提取干燥菌丝体和发酵液冻干粉的有机溶剂可以是甲醇、95％乙醇、丙酮、乙酸乙酯、石油醚、二氯甲烷、三氯甲烷、二氯甲烷-甲醇和三氯甲烷-甲醇。

7.如权利要求2所述的方法，其特征在于：提取干燥菌丝体和发酵液冻干粉的方法可以是浸泡提取、超声波提取或渗漉提取。

8.如权利要求1和2所述的化合物螺光黑壳菌酮A，具有抗金黄色葡萄球菌和抗肿瘤细胞的活性，可用于抗生素和抗肿瘤药物的制备及应用。

9.用于任一权利要求2-8的真菌为光黑壳菌(Preussia sp.)AS-5，保藏编号CGMCC No.2022。