CN111870620A - 坎巴的炮制工艺及药物组合物 - Google Patents

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Abstract

坎巴的炮制工艺及药物组合物，属于藏药技术领域。坎巴的炮制工艺包括：将炮制原药材进行热水预处理，得到预处理药材，炮制原药材为细叶亚菊和/或白莎蒿；以及将糖化发酵剂、酒精与预处理药材混合进行厌氧发酵，厌氧发酵的发酵温度为18‑45℃、发酵时间为45‑100h。药物组合物原料包括：刺柏、烈香杜鹃、麻黄、水柏枝以及上述的炮制工艺炮制得到的所述细叶亚菊和/或所述白莎蒿。炮制工艺热水预处理使药材能充分发酵，添加酒精进行酒制，添加糖化发酵剂促进分解转化及根霉菌产生，同时在控制合理的温度和时间条件下对药材进行发酵，有效降低毒副作用、增强药效。

Description

坎巴的炮制工艺及药物组合物
技术领域
本申请涉及藏药技术领域，具体而言，涉及一种坎巴的炮制工艺及药物组合物。
背景技术
藏药浴是藏医独特的外治方法之一，五味甘露药浴汤散是藏药浴常用的药物组合物，组方中坎巴的炮制工艺有助于降低毒副作用、增强药效。但是相关技术中对于坎巴的炮制工艺并没有提出规范，因此提供一种合理规范的坎巴的炮制工艺对于其用药安全具有重要意义。
发明内容
本申请的目的在于提供一种坎巴的炮制工艺及药物组合物，采用糖化发酵剂和酒精在控制合理的温度和时间条件下对药材进行发酵，有效降低毒副作用、增强药效。
本申请的实施例是这样实现的：
第一方面，本申请实施例提供一种坎巴的炮制工艺，包括：
将炮制原药材进行热水预处理，得到预处理药材，炮制原药材为细叶亚菊和/或白莎蒿；以及
将糖化发酵剂、酒精与预处理药材混合进行厌氧发酵，厌氧发酵的发酵温度为18-45℃、发酵时间为45-100h。
上述技术方案中，采用热水对炮制原药材进行处理，使炮制原药材得到浸润，有利于发酵阶段进行充分的分解转化。发酵处理中，采用酒精对预处理药材进行酒制，能够改变药材的组织的物理状态，有利于药用成分的浸润、溶解和扩散，能够提高药材的药效，同时有利于糖化发酵剂对药材进行充分的分解，提高发酵的效果。在实现本申请的过程中发明人研究发现，炮制得到的药材在发酵过程中产生的菌种为根霉菌，发酵过程中糖化发酵剂促使样品产生根霉菌，对药材进行分解并转化，把大分子的中间物质分解转化为能够被吸收的小分子物质，发酵的温度和时间的合理控制有利于保证炮制的效果。将发酵温度和发酵时间控制在上述的范围内，该温度条件为根霉菌生长的适宜温度，而该发酵时间为菌种发酵形成新的菌丝提供了适当的时间，使炮制得到的药材具有较好的药效。
在一些可选的实施方案中，热水预处理包括：将炮制原药材用麦水煮沸3-5min后去除水，得到预处理药材。
上述技术方案中，采用煮沸3-5min的方式进行热水预处理操作，使炮制原药材能够得到充分的浸润，有利于后续发酵操作实现充分的分解转化。麦水中溶解的有效成分也能够被糖化发酵剂进行分解转化，利用麦水对炮制原药材进行浸润，有利于促进糖化发酵剂对药材进行发酵，提高分解转化效率。
在一些可选的实施方案中，厌氧发酵的发酵温度为18-38℃、发酵时间为45-75h。
上述技术方案中，发明人在实现本申请的过程中发现，采用麦水煮沸的方法进行炮制原药材的热水预处理时，将发酵温度和发酵时间控制在上述的温度和时间范围内，炮制得到的药材从色泽、气味以及菌丝形态结构各方面而言均具有较好的性状。
在一些可选的实施方案中，厌氧发酵的发酵温度为36-38℃、发酵时间为70-75h。
上述技术方案中，研究发现，采用该麦水煮沸的方法进行热水预处理时，将发酵温度和发酵时间控制在上述的温度和时间范围内，不同发酵周期时菌丝的生长状态更佳，使得炮制得到的药材的性味及药效更佳。
在一些可选的实施方案中，麦水由青稞麦和水混合熬煮得到，糖化发酵剂为青稞麦曲。
上述技术方案中，麦水采用青稞麦熬煮得到，青稞麦经熬煮溶解于麦水中的有效成分含有多种有益的矿物元素及药物活性成分，有利于提高药材的药效。糖化发酵剂匹配性地采用青稞麦曲，有利于对浸润于预处理药材的麦水中的有效成分进行分解和转化，同时有利于促进糖化发酵剂对药材的发酵。
在一些可选的实施方案中，麦水由青稞麦与水按照1:4-6的质量比混合熬煮30-60min得到。
上述技术方案中，将青稞麦与水按照1:4-6的质量比混合熬煮，水的用量适当，使麦水中的有效成分的浓度适当，用水量过多则导致熬煮时间过长或者麦水浓度过低，用水量过少则导致青稞麦中的有效成分难以充分溶出。30-60min的熬煮时间与用水量匹配，保证熬煮充分的同时尽可能地节省时间。
在一些可选的实施方案中，酒精体积为5ml时：糖化发酵剂的质量为4-6g，炮制原药材的质量为8-12g。
上述技术方案中，酒精、糖化发酵剂和炮制原药材按照上述的比例进行混合，保证酒制和发酵都具有较好的效果，保证炮制得到的药材的性状及药效。
在一些可选的实施方案中，酒精的酒精度为40-50％Vol。
上述技术方案中，酒精度为40-50％Vol的酒精对药材的炮制效果较好，酒精度较小则导致浸润不充分，药材的有效成分溶解和扩散不充分，酒精度过大则导致炮制后药材的气味具有一定的刺激性强，同时还可能对糖化发酵剂的发酵具有一定的影响。
在一些可选的实施方案中，酒精为青稞酒。
上述技术方案中，酒精采用青稞酒，青稞酒本身含有的矿物元素及药物活性成分有利于提高炮制后的药材的药效。
第二方面，本申请实施例提供一种药物组合物，其原料包括：刺柏、烈香杜鹃、麻黄、水柏枝以及第一方面实施例提供的炮制工艺炮制得到的细叶亚菊和/或白莎蒿。
上述技术方案中，细叶亚菊和/或白莎蒿采用上述炮制工艺炮制后得到的药材，其色泽、气味及菌丝形态结构等各方面性能佳，药效好，与刺柏、烈香杜鹃、麻黄、水柏枝混合配制成五味甘露药浴汤散，该中药组合物的色泽、气味以及药效佳。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本申请的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本申请实施例提供的坎巴的炮制工艺炮制得到的药材的在10*4的放大倍数下的镜下观察形态图a；
图2为本申请实施例提供的坎巴的炮制工艺炮制得到的药材的在10*4的放大倍数下的镜下观察形态图b；
图3为本申请实施例提供的坎巴的炮制工艺炮制得到的药材的在10*4的放大倍数下的镜下观察形态图c；
图4为本申请实施例提供的坎巴的炮制工艺炮制得到的药材的在10*4的放大倍数下的镜下观察形态图d；
图5为本申请实施例1-27提供的坎巴的炮制工艺炮制得到的细叶亚菊的评分结果；
图6为本申请实施例28-54提供的坎巴的炮制工艺炮制得到的白莎蒿的评分结果。
具体实施方式
为使本申请实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
需要说明的是，本申请中的“和/或”，如“方案A和/或方案B”，均是指可以单独地为方案A、单独地为方案B、方案A加方案B，该三种方式。
下面对本申请实施例的坎巴的炮制工艺及药物组合物进行具体说明。
第一方面，本申请实施例提供一种坎巴的炮制工艺，包括：
步骤a、将炮制原药材进行热水预处理，得到预处理药材，炮制原药材为细叶亚菊和/或白莎蒿；以及
步骤b、将糖化发酵剂、酒精与预处理药材混合进行厌氧发酵，厌氧发酵的发酵温度为18-45℃、发酵时间为45-100h。
本申请中坎巴炮制工艺中的坎巴，是指藏药五味甘露药浴汤散中的称为坎巴的入药组分，本申请中特指药材细叶亚菊和/或白莎蒿。其中，细叶亚菊在藏药中称作白坎巴、砍阿仲，本申请中使用的细叶亚菊，2016年6月于青海省同仁县采集，方位坐标：北纬N35°41′28″，东经E102°4′1″，海拔2241.50m；阴干后共3.5kg药材，粗分后冷藏留用；药材由青海民族大学毛继祖教授鉴定，标本存于青海民族大学药学院。白莎蒿在藏药中称作白察尔榜，本申请中使用的白莎蒿，2016年6月于青海省同仁县采集，方位坐标：北纬N35°22′13″，东经E101°58′4″，海拔2869.82m；阴干后共3.7kg药材，粗分后冷藏留用；药材由青海民族大学毛继祖教授鉴定，标本存于青海民族大学药学院。
步骤a中，炮制原药材的热水预处理是指将炮制原药材用热水浸泡或者熬煮。热水预处理中的热水可选地为温度高于80℃的水，进一步可选地为沸水。
在一个示例性的实施例中，热水预处理例如采用水直接进行煮沸，该直接用水煮沸的方法以下简称工艺一，工艺一的热水预处理中煮沸的时间可选地为3-5min，热水预处理后滤去热水使药材降温至待发酵的温度。本申请中所使用的水可选地购自杭州娃哈哈公司的纯净水，或者将自来水进行纯化后使用。
在另一个示例性的实施例中，热水预处理例如采用麦水进行煮沸，该采用麦水煮沸的方法以下简单工艺二，工艺二的热水预处理中煮沸的时间可选地为3-5min，热水预处理后滤去热水使药材降温至待发酵的温度。
可选的，工艺二中采用的麦水由青稞麦和水混合熬煮得到。在其他实施例中，也可以采用其他麦类作为原料，例如小麦、大麦、燕麦、黑麦等，选择其中的一种或多种，单独与水混合熬煮得到麦水，或者与青稞麦混合使用与水混合熬煮得到麦水。
采用青稞麦与水混合熬煮制备麦水时，可选的，青稞麦与水的质量比为1:4-6，例如但不限于1:4、1:5、1:6；熬煮的时间为30-60min，或40-50min，例如但不限于30min、40min、50min、60min。
在再一个示例性的实施例中，热水预处理例如直接采用沸水进行浸泡，该采用沸水浸泡的方法以下简称工艺三，工艺三的热水预处理中浸泡的时间可选的为8-12min，例如但不限于8min、9min、10min、11min、12min，热水预处理后滤去热水使药材降温至待发酵的温度。
在一些可选的实施例中，步骤a中的热水预处理操作之前，还包括：将备取的炮制原药材除去粗皮和杂质，去除粗皮利于热水预处理及炮制过程中充分浸润，杂质的去除有利于较少药材杂质含量从而降低杂质的影响；然后将药材切段，例如采用购自天津市泰斯特仪器的FZ102微型植物试样粉碎机进行，要求段长≤6cm，能够更加方便地进行热水预处理及后续的发酵操作。
步骤b中，厌氧发酵可以是在无氧的保护气环境下进行，也可以在密封条件下进行。在一些可选的实施例中，厌氧发酵在密封条件下进行，可选的例如在购自广州惠而信商用设备有限公司的PP(Polypropylene，聚丙烯)材质密封盆中进行，密封发酵的方式操作方便，且发酵体系稳定、发酵效果好。
发酵过程中，通过微生物的生长使药材发生物理变化和化学变化，从而产生和积累大量代谢产物。研究过程中，请参阅图1-4，经光学高倍显微镜观察，发现炮制得到的菌丝无色透明，单细胞，无隔膜，具各种细胞器，多核有核膜包围，不长气生菌丝。在基质表面上有弧形菌丝即匍匐菌丝横生，弧形菌丝膨大的地方向下有假根生出，向上生出有数条直立的孢子囊梗，无分隔，直径22-32微米，长900-2700微米，细胞壁平滑，其顶端膨大形成孢子囊。孢子囊期初为黄白色，成熟后变黑色等形态结构，明确发酵过程产生的菌种为接合菌亚门(Zygomycota)，接合菌纲(Zygomycetes)，毛霉目(Mucorales)，毛霉科(Mucoraceae)，根霉属(Rhizopus)根霉菌。
发明人研究发现，通过糖化发酵剂促使预处理药材产生根霉菌。从菌种的适宜生存条件来分析，20℃至37℃为根霉菌生长的适宜温度，故在本申请可选的实施例中，发酵温度为18-45℃，或20-42℃，或18-38℃，或20-37℃，或36-38℃，例如但不限于18℃、20℃、30℃、36℃、37℃、38℃、42℃、45℃。由于不同发酵周期为菌种萌发成新的菌丝体提供了充足的时间，初期为平贴基料表面匍匐生长菌丝，呈灰白色或黄白色；后期在基料上形成了许多球形的小颗粒体，是孢子囊；成熟后基料表面形成黑色颗粒状霉层，呈灰黑色或黑色。故在本申请可选的实施例中，发酵时间为45-100h，或48-96h，或45-75h，或48-72h，或70-75h，例如但不限于45h、48h、50h、60h、70h、72h、75h、90h、96h、100h，为菌丝各发酵周期提供了适当的时间。
示例性的，例如步骤a中采用工艺二的麦水煮沸的方法对炮制原药材进行热水预处理时，可选的，发酵温度为18-38℃，或20-37℃，发酵时间为45-75h，或48-72h。进一步可选的，发酵温度为36-38℃，发酵时间为70-75h。
在一些可选的实施例中，步骤b中，为了保证具有较好的发酵效果，酒精、糖化发酵剂和炮制原药材按照以下比例进行配置。当酒精体积为5ml时：糖化发酵剂的质量为4-6g，例如但不限于4g、4.5g、5g、5.5g、6g；炮制原药材的质量为8-12g，例如但不限于8g、9g、10g、11g、12g。
示例性的，例如步骤a中采用工艺二的麦水煮沸的方法对炮制原药材进行热水预处理时，糖化发酵剂采用青稞麦曲，购自玉树州藏医院，在其他实施例中还可以采用其他的麦曲。另外在一些可选的实施例中，例如采用工艺一和工艺三的方法对炮制原药材进行热水预处理时，糖化发酵剂可以采用青稞麦曲，也可以采用其他的糖化发酵剂例如米曲、麸曲等。
在一些可能的实施例中，酒精的酒精度为40-50％Vol，或42-48％Vol，或44-46％Vol，例如但不限于40％Vol、42％Vol、44％Vol、45％Vol、46％Vol、48％Vol、50％Vol。
示例性的，酒精为青稞酒，在其他实施中，酒精也可以采用其他的酒精，例如大麦酒、玉米酒、高粱酒等，可选地采用以麦类作为原料酿制得到的酒。
第二方面，本申请实施例提供一种药物组合物，其原料包括：刺柏、烈香杜鹃、麻黄、水柏枝以及第一方面实施例提供的炮制工艺炮制得到的细叶亚菊和/或白莎蒿。
以下结合实施例对本申请的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1-9
一种坎巴的炮制工艺，包括：称取10g细叶亚菊作为炮制原药材，采用工艺一的方法对炮制原药材进行热水预处理，热水预处理后滤去热水使药材降温至待发酵的温度，得到预处理药材。将预处理药材置于密封发酵容器内，均匀洒上5g青稞麦曲，再均匀喷洒5ml酒精度为46％Vol的青稞酒，密封发酵。密封发酵的温度和时间如表1所示。
实施例10-18
一种坎巴的炮制工艺，其与实施例1-9的不同之处在于，采用工艺二的方法对炮制原药材进行热水预处理。
实施例19-27
一种坎巴的炮制工艺，其与实施例1-9的不同之处在于，采用工艺三的方法对炮制原药材进行热水预处理。
实施例28-36
一种坎巴的炮制工艺，其与实施例1-9的不同之处在于，称取10g白莎蒿作为炮制原药材。
实施例37-45
一种坎巴的炮制工艺，其与实施例28-36的不同之处在于，采用工艺二的方法对炮制原药材进行热水预处理。
实施例46-54
一种坎巴的炮制工艺，其与实施例28-36的不同之处在于，采用工艺三的方法对炮制原药材进行热水预处理。
表1发酵温度和发酵时间统计表
Figure BDA0002624938020000091
Figure BDA0002624938020000101
试验例
一、感官实验
邀请青海玉树州藏医院制剂科主任万玛热旦药师，对实施例1-54提供的坎巴的炮制工艺炮制得到的药材进行感官评价分析及打分。评分标准如表2所示。
表2发酵炮制效果评分表
Figure BDA0002624938020000102
对实施例1-27提供的坎巴的炮制工艺炮制得到的细叶亚菊的评分结果如图5所示，对实施例28-54提供的坎巴的炮制工艺炮制得到的白莎蒿的评分结果如图6所示。
根据图5及图6可知，细叶亚菊和白莎蒿在上述的发酵温度和发酵时间条件下进行发酵，多组实施例炮制得到的药材感官评价的评分高于6分，表现出较好的感官评价结果。对细叶亚菊和白莎蒿的炮制中，采用工艺二的方法处理后，控制发酵温度为20-37℃、发酵时间为48-72h，感官评价的评分基本都能达到6分及以上。其中，评分最高的均为采用工艺二的方法处理后，在37℃/72h的发酵条件下发酵炮制得到的药材。
二、抑菌活性实验
1、供试材料制备
取未炮制的细叶亚菊生品、实施例1-27炮制得到的细叶亚菊炮制品，制备石油醚部分、乙酸乙酯部位、甲醇部位和水部位的供试样品。取未炮制的白莎蒿生品、实施例28-54炮制得到的白莎蒿菊炮制品，制备石油醚部分、乙酸乙酯部位、甲醇部位和水部位的供试样品。将上述各供试样品配置为浓度为1mg/ml的供试溶液，两种药材的石油醚部位和乙酸乙酯部位使用丙酮作为溶剂，甲醇部位使用甲醇作为溶剂，水部位使用蒸馏水做溶剂。
2、供试菌种
供试菌种1.2021，2.3854购于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(China General Microbiological Culture Collection Center，CGMCC)；其余供试菌种均购于中国食品药品检定研究院中国医学微生物菌种保藏管理中心(China MedicalCulture Collection，CMCC)。菌种信息表如表3所示。
表3供试菌种汇总表
Figure BDA0002624938020000111
Figure BDA0002624938020000121
3、培养基的制备
液体培养基的制备：称取牛蛋白胨0.50g、肉膏0.25g、氯化钠0.25g置于锥形瓶中，用50ml蒸馏水加热溶解，PH调节至7.0-7.2。先用纱布包扎，外层再用牛皮纸包扎，经25min的高压蒸汽灭菌。
营养琼脂培养基的制备(用于培养细菌)：称取牛肉膏3.0g、蛋白胨10.0g、氯化钠5.0g、琼脂粉18.0g，用1000mL水溶解，pH调节至7.2-7.4。
改良马丁氏琼脂培养基的制备(用于培养真菌)：称取蛋白胨5.0g、酵母浸出粉2.0g、硫酸镁0.5g、琼脂粉18.0g、磷酸氢二钾1.0g、葡萄糖20.0g，用1000mL水溶解，pH调节至6.8。
4、菌种活化
超净台经紫外灭菌25min，在通风的状态下，将接种环在酒精灯上灼烧灭菌后，从冷冻保藏的供试菌斜面上挑取少量菌苔接种于液体培养基中。
接种藤黄微球菌、乙型副伤寒沙门菌、大肠埃希菌、乙型溶血性链球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、肺炎克雷伯菌、产气肠杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中或营养琼脂培养基上。30-35℃培养18-24h。
接种白色念球菌、酿酒酵母菌和黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁培养基上，23-28℃培养2-3d。
5、菌悬液的制备
调试菌悬液，用0.9％的无菌氯化钠溶剂将上述细菌培样物配制成108cfu/ml浓度(菌落形成单位)。
将配置好的含0.05％(v/v)聚山梨酯取80的0.9％的无菌氯化钠溶液取用3-5ml，放入真菌培养物将孢子洗脱。用无菌移液枪将孢子悬液吸出至无菌试管内，用无菌的含0.05％(v/v)聚山梨酯80的0.9％氯化钠溶液制成浓度为108cfu/ml的孢子悬液。
6、抑菌圈的测定
采用滤纸片琼脂平板扩散办法。用移液枪从已制备好的待试菌悬液中精确吸取0.2mL，加入到200mL的营养琼脂培养基或马丁氏培养基中，混合均匀。将混合好带有菌悬液的培养基依次倒入培养器皿中，培养基等待凝固。用移液枪分别吸取供试样品1mL浸透在直径为6mm的已灭菌滤纸片上，用已灭菌的镊子将浸有供试样品的滤纸片贴在含不同菌的培养基上，每个平板中同一个样品平行三次。将贴好的培养基倒置在培养箱中。细菌35-37℃培养18-24h，真菌23-28℃的环境下培养2-3d，培养过程中每隔一小时观察微生物生长和抑菌情况，出现抑菌圈时以最大直径作为最终数据。实验结果取每个菌种三个平行组结论的平均值。
统计各实验组石油醚部位、乙酸乙酯部位、甲醇部位、水部位四个粗分部位对常见13中致病微生物的抑菌效果及有效部位MIC结果。
炮制前，细叶亚菊和白莎蒿：各部位抑菌活性如表4所示；有效部位MIC结果如表5所示。炮制后，细叶亚菊：不同炮制工艺及各部位抑菌活性如表6所示，有效工艺各部位MIC结果如表7所示。炮制后，白莎蒿：不同炮制工艺及各部位抑菌活性如表8所示，有效工艺各部位MIC结果如表9所示。表4、6、8中，滤纸片直径为6mm，其中“-”代表未发现；表5、7、9中，未写出的实验组为其抑菌活性未检测到。
表4炮制前两种药材各部位抑菌活性(mm)
Figure BDA0002624938020000131
Figure BDA0002624938020000141
表5炮制前两种药材有效部位MIC结果(mm)
Figure BDA0002624938020000142
Figure BDA0002624938020000151
表6细叶亚菊不同炮制工艺及部位抑菌活性
Figure BDA0002624938020000152
Figure BDA0002624938020000161
表7细叶亚菊有效工艺各部位MIC结果(mm)
Figure BDA0002624938020000162
Figure BDA0002624938020000171
表8白沙蒿不同炮制工艺及部位抑菌活性
Figure BDA0002624938020000172
Figure BDA0002624938020000181
表9白沙蒿工艺炮制后有效部位MIC结果(mm)
Figure BDA0002624938020000182
Figure BDA0002624938020000191
根据表5-9可知，采用本申请实施例提供给的坎巴的炮制工艺对细叶亚菊和/或白莎蒿进行炮制，炮制品各粗分部位的抑菌活性与未炮制的生品相比，抑菌效果更佳。
经滤纸片扩散抑菌法结果发现，两种坎巴炮制前抑菌效果以及抑菌最低浓度都不同，其中细叶亚菊水部位对乙型副伤寒沙门菌具有抑菌效果且抑菌最低浓度为25μg/μl，白沙蒿水部位对藤黄微球菌、产气肠杆菌有抑菌效果且抑菌最低浓度均为14.5μg/μl。
通过对54个炮制品不同粗提部位的抑菌效果及最低抑菌浓度分析，其中细叶亚菊工艺一：20℃/72h水部位对肺炎克雷伯菌；工艺二：37℃/72h水部位对肺炎克雷伯菌；工艺二：42℃/48h水部位对金黄色葡萄球菌、白色念球菌；工艺二：42℃/72h水部位对藤黄微球菌、白色念球菌；工艺三：42℃/72h水部位对产气肠杆菌；等都有抑菌效果，并且最低抑菌浓度为14.5μg/μl。其中白沙蒿工艺一：20℃/48h水部位对酿酒酵母菌；工艺一：20℃/72h水部位对乙型溶血性链球菌；工艺二：37℃/72h水部位对肺炎克雷伯菌；工艺三：37℃/72h水部位对酿酒酵母菌；工艺一：42℃/48h水部位对酿酒酵母菌等都有抑菌效果且最低抑菌浓度均为14.5μg/μl。
通过以上水部位炮制品的抑菌效果分析，炮制品抑菌效果及抑菌最低浓度都比生品效果明显增强，而且工艺二在37℃/72h条件下的抑菌效果最佳，与感官实验评价结果一致。
三、炮制品中绿原酸成分分析实验
以取未炮制的细叶亚菊生品、实施例1-27炮制得到的细叶亚菊炮制品；取未炮制的白莎蒿生品、实施例28-54炮制得到的白莎蒿炮制品，作为实验材料。分别将56种供试样品的干燥粉末(过40目筛)称取0.50g，加入到100m L量瓶中，准确加入75％色谱甲醇60ml，准确称取总质量并记录。60℃超声提取1.5h并抽滤，滤液浓缩后定容至50m L量瓶中，使用0.45μm滤膜过滤即得56种供试品溶液。
选择328nm作为检测波长，对各供试品溶液进行高效液相色谱分析。流动相采用甲醇-水系统，在流动相水中添加0.04％磷酸，以改善峰拖尾现象。以15％甲醇、85％磷酸水溶液洗脱20分钟。
使用1000μl、200μl移液枪，分别移取1000μl、500μl、250μl、125μl、72.5μl和36.2μl对照品溶液于安捷伦自动进样瓶中，再用移液枪依次移取哇哈哈纯净水0μl、500μl、750μl、875μl、927.5μl和963.8μl加入到对应上述进样瓶中，超声3min充分混匀，即得到6级不同浓度的标准品溶液。
以上6份对照品溶液，按照上述方法序列进样，对细叶亚菊和白沙蒿的生品及不同工艺下所得炮制品中绿原酸含量进行测定，其结果如表10所示，其中未写出炮制工艺的表示其绿原酸含量成分未测到。
表10生品及炮制品含量比较
Figure BDA0002624938020000201
Figure BDA0002624938020000211
根据表10可知，通过本申请实施例提供的坎巴的炮制工艺炮制后，细叶亚菊和白莎蒿的绿原酸含量都降低了。其中，细叶亚菊27个炮制品中，4个炮制品含量降低了60-70％，23个炮制品含量降低了70-100％。白沙蒿27个炮制品中，2个炮制品其含量降低了50-70％，其它炮制品中绿原酸含量都降低了100％。临床报道的中药注射剂中绿原酸致敏不良反应事件中，绿原酸虽不是注射剂中的致敏原，但会对肝脏和肾脏产生毒性。绿原酸具有一定的致敏反应，采用本申请提供的坎巴的炮制工艺炮制得到的炮制品，在提高药效的同时，还能够降低其副作用。
四、炮制前后总黄酮、总酚类化合物含量分析实验
分别精密称取或移取芦丁对照品20mg、使用75％乙醇定容至100mL的容量瓶得标准溶液；取没食子酸对照品20mg用75％乙醇定容至100mL的容量瓶，作为本实验中混合标准对照品母液。
样品溶液总黄酮含量的测定：分别将56种各供试品干燥粉末(过40目筛)称取1.0g，将上述供试品分别加入到100mL圆底烧瓶中，加入75％乙醇30mL并加热回流1.5h，反复提3次，过滤且滤液用75％乙醇定容于100mL容量瓶中，将得到黄酮提取液1.0mL，置于10mL容量瓶中，加入5％NaNO2溶液0.5mL，摇匀，放置6min；再加入10％Al(NO3)3溶液0.5mL，摇匀，放置6min；加入5％NaOH溶液5mL，再加水至刻度，摇匀，放置15min。以试剂空白作为参比溶液，用比色皿在510nm处测定其吸光度；
样品溶液总酚含量的测定:分别将56种各供试品干燥粉末(过40目筛)称取1.0g，将上述供试品分别加入到100mL圆底烧瓶中，加入75％乙醇30mL并加热回流1.5h，反复提3次，过滤且滤液用75％乙醇定容于100mL容量瓶中，得到提取液并吸取0.1mL置于试管中，加入3mL蒸馏水，摇匀，再加入0.1mLFC试剂，摇匀，过15min后加入2％Na2CO3溶液0.3mL，充分混合后定容，室温避光静置2h，以蒸馏水作为参比溶液，用比色皿在750nm处测定其吸光度。
炮制前后两种药材总黄酮含量如表11所示，炮制前后两种药材总黄分类化合物含量如表12所示。
表11炮制前后两种药材总黄酮含量(mg·g－1)
Figure BDA0002624938020000221
Figure BDA0002624938020000231
表12炮制前后两种药材总酚含量(mg·g－1)
Figure BDA0002624938020000232
Figure BDA0002624938020000241
根据表11可知，在测总黄酮实验中，通过不同工艺炮制后：细叶亚菊的27个炮制品中，工艺三：37℃/72h；工艺二：37℃/72h两种炮制品含量均未发生改变，其它工艺黄酮含量都降低了。白沙蒿的27个炮制品中，工艺一：37℃/48h；工艺一：37℃/72h；工艺二：37℃/48h；工艺二：37℃/72h等4种工艺的炮制品中黄酮含量明显增多。
根据表12可知，在总酚含量测定实验中，采用不同工艺炮制后：细叶亚菊的27个炮制品中，工艺一：20℃/96h；工艺一：42℃/72h；工艺二：20℃/48h；工艺二：37℃/96h；工艺二：42℃/72h；工艺三：20℃/48h；工艺三：37℃/72h等7种炮制品中总酚含量均增多，其它工艺的炮制品中含量降低。白沙蒿的27个炮制品中，工艺一：37℃/48h；工艺一：37℃/72h；工艺二：37℃/72h；工艺二：42℃/96h；工艺三：42℃/96h等5种炮制品的含量均增多。
根据表11和表12可知，通过不同工艺炮制后细叶亚菊的27个炮制品中两种炮制品含量均未发生改变，其它工艺黄酮含量都降低了。白沙蒿的27个炮制品中4种工艺的炮制品中黄酮含量明显增多。其中，在工艺二37℃/72h条件下进行炮制，不论是进行细叶亚菊的炮制，还是进行白莎蒿的炮制，总黄酮含量和总酚类化合物的含量均没有降低，体现出较好的炮制效果。
综上所述，本申请实施例的坎巴的炮制工艺及药物组合物，炮制工艺热水预处理使药材能充分发酵，添加酒精进行酒制，添加糖化发酵剂促进分解转化及根霉菌产生，同时在控制合理的温度和时间条件下对药材进行发酵，有效降低毒副作用、增强药效。
以上所描述的实施例是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。本申请的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本申请的范围，而是仅仅表示本申请的选定实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。

Claims (10)

1.一种坎巴的炮制工艺，其特征在于，包括：
将炮制原药材进行热水预处理，得到预处理药材，所述炮制原药材为细叶亚菊和/或白莎蒿；以及
将糖化发酵剂、酒精与所述预处理药材混合进行厌氧发酵，厌氧发酵的发酵温度为18-45℃、发酵时间为45-100h。
2.根据权利要求1所述的炮制工艺，其特征在于，热水预处理包括：将所述炮制原药材用麦水煮沸3-5min后去除水，得到所述预处理药材。
3.根据权利要求2所述的炮制工艺，其特征在于，厌氧发酵的发酵温度为18-38℃、发酵时间为45-75h。
4.根据权利要求3所述的炮制工艺，其特征在于，厌氧发酵的发酵温度为36-38℃、发酵时间为70-75h。
5.根据权利要求2所述的炮制工艺，其特征在于，所述麦水由青稞麦和水混合熬煮得到，所述糖化发酵剂为青稞麦曲。
6.根据权利要求5所述的炮制工艺，其特征在于，所述麦水由所述青稞麦与所述水按照1:4-6的质量比混合熬煮30-60min得到。
7.根据权利要求1-6任一项所述的炮制工艺，其特征在于，所述酒精体积为5ml时：所述糖化发酵剂的质量为4-6g，所述炮制原药材的质量为8-12g。
8.根据权利要求7所述的炮制工艺，其特征在于，所述酒精的酒精度为40-50％Vol。
9.根据权利要求7所述的炮制工艺，其特征在于，所述酒精为青稞酒。
10.一种药物组合物，其特征在于，其原料包括：刺柏、烈香杜鹃、麻黄、水柏枝以及权利要求1-9任一项所述的炮制工艺炮制得到的所述细叶亚菊和/或所述白莎蒿。
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