CN102532026B - 蓝状热素类化合物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及蓝状热素类化合物及其应用，属微生物生物农药技术领域。本发明的生产菌株为嗜热链球菌Talaromyces sp.YM1-4，该菌株已于2009年11月05日保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.3421。本发明由YM1-4经常规发酵、提取分离获得5种具有新骨架的蓝状热素类化合物。本发明的大环内酯生物碱化合物在液体浸泡法的抗线虫活性测试中显示出杀线虫活性，由于此类化合物为同一骨架，得到化合物1-5均能有效毒杀线虫。本发明能作为制备杀虫药制剂和前体物质的应用。本发明具有对环境无污染、成本低、毒杀线虫效果极佳的优点。本发明的蓝状热素类内酯生物碱化合物(Talamidolides)为新结构化合物，为研究开发生物杀虫制剂和仿生生物农药奠定基础。

Description

蓝状热素类化合物及其应用

技术领域：

本发明涉及蓝状热素类化合物及其应用，属微生物生物农药技术领域。

背景技术：

植物病虫害是一种危害严重的植物病害，据Sasser & Freekman(1987)报道，植物病虫害每年造成世界农业生产的损失约1500亿美元。目前，化学防治仍然是控制植物线虫的重要措施之一，但长期使用巨毒化学杀虫剂给环境和人类的健康带来的危害日渐显露。因此，研究开发高效低毒的生物杀虫剂已成为农业可持续发展的重要问题。

本研究对采自云南腾冲热海土壤的嗜热真菌Talaromyces sp.YM1-4进行了化学成分的研究，从中分离得到了五个骨架新颖的十三元蓝状热素类化合物(Talamidolides)。经国内外文献检索，未见与本发明相同的公开报道。

发明内容：

本发明的目的在于提供一类新的蓝状热素类化合物(Talamidolides)及其应用。

本发明对采自云南腾冲热海土壤的嗜热真菌Talaromyces sp.YM1-4进行了化学成分的研究，从中分离得到了五个骨架新颖的十三元蓝状热素类化合物(Talamidolides)。

本发明是这样实现的：

本发明的生产菌株为嗜热链球菌Talaromyces sp.YM1-4，该菌株已于2009年11月05日保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.3421。

YM1-4菌株主要形态特征和生理生化性质为：在PDA培养基上50℃下培养，菌落生长快，毛霉状铺展，初白色，渐灰绿至灰棕色；菌丝纤细，分枝，具隔膜，直径约2.5μm；分生孢子梗茎光滑，常近乎垂直地单侧生于气生菌丝上，很短，单轮状或双轮分枝；分枝顶端生2～4个瓶梗，无规则松散排列，7～11×2～3μm，向上逐渐变细，颈部较短，坛状；分生孢子浅黄至黄绿色，近球形、卵圆形至椭圆形，壁光滑，3.5～4.5×2.2～3.5μm，串生。该菌种的培养常规条件是好氧培养。用于培养菌种的糖质原料碳源是葡萄糖、淀粉或马铃薯材料。氮源是有机氮源，即为无机铵盐、无机硝酸盐或蛋白胨、酵母膏。该菌种的生长温度范围35℃～55℃。pH范围为6.0～8.0。

本发明将YM1-4菌株采用PDA培养基，用常规发酵方法培养，将发酵液低压浓缩后，用甲醇提取。将甲醇提取物经反复硅胶柱，氯仿/甲醇洗脱，得到本发明的一类具有十三元蓝状热素类化合物(Talamidolides)。经核磁共振波谱，质谱，红外光谱和紫外光谱确定该5个化合物的结构分别如下所示(以下分别简称为化合物1-5)：其结构式为：

化合物1-5都为白色无定形粉末。

化合物1-4的H和¹³C NMR数据非常相似，能够推定它们拥有相同的结构骨架和氧化模式。

化合物1-3的Positive HRESI-MS都给出准分子离子峰[M+H]⁺在m/z 546.3640，Negative HRESIMS给出准分子离子峰[M-H]^-在m/z 544.3494，对应于分子式C₂₈H₅₁NO₉，进一步由¹H和¹³C NMR(DEPT)(Table 1)谱证实。

化合物1的¹HNMR谱显示有7个甲基双峰氢信号[δ_H 1.21d，6.8；0.99d，6.7；0.89d，6.7；0.81d，6.7；0.95d，6.7；0.80d，6.7，1.29d，6.8]和一个乙酰甲基单峰[δ_H 1.96s]，七个含氧或含氮次甲基氢信号[δ_H 4.76q，7.0；4.24td，8.8，2.6；3.55m；4.58dd，8.3，3.1；3.34dd，9.3，2.3；3.78ddd，10.3，6.2，2.1；5.09m]。¹³C NMR谱上显示有八个甲基碳峰，五个亚甲基碳峰，12个次甲基碳峰(包含六个含氧次甲基碳)，在低场区域有三个羰基碳峰[δ_C 172.6；169.7；171.1]。通过¹H-¹H COSY谱的相关信息确定了以下三个片断：

在HMBC谱(图1)中的甲基氢-22[δ_H 1.29d，H3-22]分别与羰基碳-1[δ_C 172.6s，C-1]和次甲基碳-2[δ_C 47.3d，C-2]有¹H-¹³C远程相关点，以及H-2[δ_H 4.76q，H-2]与甲基碳-22[δ_C 16.7q，C-22]，羰基碳-1[δ_C 172.6s，C-1]和羰基碳-4[δ_C 169.7s，C-4]有¹H-¹³C远程相关点，再结合上述a片段和分子中含有一个氮原子，说明有以下结构片段d的存在：：

亚甲基氢-10[δ_H 1.38brt，H-10]分别与两个次甲基碳[δ_C 34.8d，C-9；δ_C 31.0d，C-11]，两个甲基碳[δ_C 17.1q，C-23；17.4q，C-24]，两个含氧次甲基碳[δ_C 75.8d，C-8；84.5d，C-12]有¹H-¹³C远程相关点；另外，H₃-23[δ_H 0.99d]与C-8和C-9有¹H-¹³C远程相关点，再结合上述b片段，能够推出有以下结构片段e的存在：：

含氧次甲基氢-12[δ_H 4.58dd，H-12]与羰基碳-1[δ_C 172.6s，C-1]有¹H-¹³C远程相关，和亚甲基氢-5[δ_H2.57dd，H-5]与羰基碳-4[δ_C 169.7s，C-4]有¹H-¹³C远程相关说明片段d和f相连接形成了结构片段f：

含氧次甲基氢-16[δ_H 3.34dd，H-16]分别与两个次甲基碳[δ_C 33.2d，C-15；δ_C 42.1d，C-17]，两个甲基碳[δ_C 17.5q，C-26；12.6q，C-27]，一个含氧次甲基碳[δ_C 71.2d，C-18]，和一个亚甲基[δ_C 32.8t，C-14]有¹H-¹³C远程相关；另外，含氧次甲基氢-18[δ_H 3.78ddd]与C-17，C-27和C-16[δ_C 80.2d，C-16]有¹H-¹³C远程相关点，再结合上述c片段，能够推出有以下结构片段g的存在：

甲基氢-25[δ_H 0.81d，H₃-25]分别与一个次甲基碳[δ_C 32.1d，C-13]，C-12[δ_C 84.5d，C-12]，和一个亚甲基[δ_C 32.8t，C-14]有¹H-¹³C远程相关；这些¹H-¹³C远程相关点将两个片段f和g的连接起来给出化合物1-3所含有的骨架结构和氧化模式(h)：

根据化合物1的H-20，化合物2的H-18，化合物3的H-16的化学位移分别偏移向低场，能够推出分子中含有的唯一的一个乙酰基分别在C-20(化合物1)，C-18(化合物2)，和C-16(化合物3)，以及根据化合物4不含有乙酰基，，因此，化合物1-4被鉴定为：

化合物5的H和¹³C NMR数据与化合物4的非常相似，能够推定它们拥有相似的结构骨架和氧化模式化合物。

5的¹H NMR和¹³C NMR谱上显示有9个甲基峰和13个次甲基峰(包含六个含氧次甲基)，比化合物4多出一个甲基和一个次甲基峰，并确定了多出的基团发生在化合物4中片段a中。通过¹H-¹H COSY谱的相关信息确定化合物5中的该片段为：

在HMBC谱(图1)中的次甲基氢-22[δ_H 1.29m，H-22]分别与羰基碳-1[δ_C 172.6s，C-1]和次甲基碳-2[δ_C 58.5d，C-2]有¹H-¹³C远程相关点，以及两个甲基[δ_H 0.97d，H₃]和[δ_H 0.94d H₃][δ_H 4.76q，H-2]与次甲基碳-22[δ_C 30.4d，C-22]和次甲基碳-2[δ_C 58.5d，C-2]有¹H-¹³C远程相关点，再结合上述a1片段，说明有化合物5中有以下结构片段d1的存在：：

再结合上述化合物4中的片段f，和化合物5的相关¹H-¹³C远程相关点，说明有化合物5中有以下相似结构片段f1：

最后根据化合物5中其它部分与化合物4的相同，最终确定化合物5的结构为：

本发明的活性化合物1-5的理化性质：

物化特征为：

外观：无色固体状物质；，

溶解性：溶于丙酮、二甲亚砜等，不溶于己烷和水等；

化合物1-4的氢谱和碳谱数据见下表。

核磁谱特征见表1，其溶解溶剂为CD₃COCD₃，400MHz，δ：ppm.

化合物1：Colorless oil；[α]-37.73°；(c 0.1，MeOH)；UV(MeOH)λmax(log ε)202.0(3.68)；IR(KBr)v_max3407，2956，2924，2854，1738，1657，1548，1463，1378，1254，1217，1121，1076，981，910，722，610cm^-1；Negative HRESI-MS m/z 544.3494[M-H]^-，calculated544.3491 for C₂₈H₅₀NO₉；Positive HRESI-MS m/z 546.3640[M+H]⁺，calculated 546.3636 forC₂₈H₅₂NO₉；.

化合物2：Colorless oil；[α]-49.88°；(c 0.1，MeOH)；UV(MeOH)λmax(log ε)202.4(3.69)；IR(KBr)v_max3407，3073，2966，2929，2878，1737，1657，1550，1460，1381，1323，1260，1217，1173，1119，1077，1046，1025，981，962，940，910，873，846，803，607cm^-1；Negative HRFABMS m/z 502.3362[M-H]^-，Positive HRESI-MS m/z 504.3536，calculated504.3536 for C₂₆H₅₀NO₈..

化合物3：Colorless oil；[α]-24.13°；(c 0.1，MeOH)；UV(MeOH)λmax(log ε)202.6(3.69)；IR(KBr)v_max3425，2956，2924，2853，1737，1656，1563，1548，1462，1379，1256，1173，1121，1077，982，963，940，911，874，722，671，587cm^-1；Negative HRFABMS m/z544.3496[M-H]^- calculated 544.3491 for C₂₈H₅₀NO₉.

化合物4：Colorless oil；[α]-°；(c 0.1，MeOH)；UV(MeOH)λmax(log ε)202.6(3.69)；IR(KBr)v_max3441，2957，2921，2852，1724，1630，1464，1384，553cm^-1；NegativeHRFABMS m/z 544.3496[M-H]^-，calculated 544.3491 for C₂₈H₅₀NO₉.

化合物5：Colorless oil；[α]-46.55°；(c 0.1，MeOH)；UV(MeOH)λmax(log ε)203.0(3.65)；IR(KBr)v_max3422，3067，2967，2933，2877，1735，1655，1542，1458，1375，1313，1202，1131，1072，981，936，902，668，615，547cm^-1；Negative HRFABMS m/z 530.3686[M-H]^-，calculated 530.3693 for C₂₈H₅₂NO₈.

表1：化合物1-5的NMR数据(acetone-d₆).

本发明的活性化合物在液体浸泡法的抗线虫活性测试中，在处理时间为24小时、化合物1-5对Panagrellus redivivus和Bursaphelenehus xylophilus有抑制作用。因此，本发明的化合物能作为制备杀虫药制剂和前体物质的应用。

本发明与现有的杀线虫农药相比，具有对环境无污染、成本低、毒杀线虫效果极佳的优点。本发明的十三元蓝状热素类(Talamidolides)为新结构化合物，为研究开发生物杀虫制剂和研究开发仿生生物农药奠定基础。

附图说明：

图1为化合物1-4的碳骨架的HMBC谱。

具体实施方式：

实施例1：

化合物1-5的分离制备：

对嗜热链球菌YM1-4进行菌种活化培养，从斜面培养基中取一菌种移植块，接种到PDA培养基上(PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15g，水1000mL，自然PH，灭菌后倒成平板)，在45℃下培养5天左右。

利用上述步骤获得的活化菌种进行发酵，发酵采用PDB液体培养基，培养基组成：马铃薯200～300克，葡萄糖20克；500ml三角瓶，内装250ml，121℃高温灭菌30分钟，冷却后接入液体种子拌匀，在45℃条件180r/min摇床培养21d。

发酵后的菌液与菌丝体过滤分离，将发酵液过滤，经旋转蒸发仪低压浓缩、再用相同体积的乙酸乙酯萃取3次，将乙酸乙酯萃取液部分合并然后浓缩至干。将萃取出的组分用相同质量的硅胶拌样上硅胶柱，洗脱剂依次为氯仿→氯仿∶甲醇15∶1→氯仿∶甲醇9∶1→氯仿∶甲醇4∶1→甲醇，将氯仿部分合并减压浓缩。将浓缩液再进行反复硅胶色谱柱(石油醚∶丙酮5∶1)分离和多次凝胶柱(甲醇)层析，即分离得到化合物1-5。

实施例2：

用液体浸入法检测本发明化合物的单体抗线虫活性的实验：

1.试验用药剂

将化合物1-2溶于10μL丙酮，再加入10％浓度的吐温-20溶液，分别制备400μg·mL^-1、200μg·mL^-1、100μg·mL^-1、50μg·mL^-1和25μg·mL^-1浓度的供试液，在该溶液中，丙酮的终浓度不超过3％，吐温-20的终浓度不超过0.5％。另将相同浓度的丙酮溶解于含有0.5％(v/v)的吐温-20水溶液作为对照。

2.线虫的培养与制备

将线虫Panagrellus redivevus和Bursaphelenehus xylophilus分别接种于燕麦培养基上(燕麦20g，水80mL)，于28℃培养5～7天。用贝尔曼漏斗法洗出所需线虫，经1％次氯酸钠消毒2分钟后，用无菌蒸馏水将线虫稀释为6000/mL作为线虫悬液。

3.试验方法

将供试液3ml放于6cm平板中，加入活线虫18000条，置于28℃恒温培养箱，分别于6，12，18，24，36小时和48小时在光学显微镜下检查计算线虫死亡率。并在双目显微镜下观察线虫体壁消解的情况。

鉴定死亡的方法：死亡线虫僵直或呈“J”型，活线虫则卷曲扭动。用针尖拨动静止线虫身体各部，线虫仍未做出任何反应则鉴定为死亡。

死亡率＝(死亡线虫数/(死亡线虫数+活线虫数))×100％

校正死亡率＝供试样品死亡率-对照组死亡率

以未加样品的测试溶液为对照，整个实验重复三次，取三次平均值，计算出平均死亡率和校正死亡率。

4.实验结果

表1 供试化合物对P.redivevus线虫的毒杀性结果

由于化合物1和2是菌株发酵液中该类结构的主要成分，故选择1和2进行杀线虫活性实验。

结果表明：化合物1-2对P.redivevus线虫的具有良好的毒杀活性。由于此类化合物为同一骨架，得到的化合物1-5均能有效毒杀线虫。

本发明的化合物能作为制备杀虫药制剂和前体物质的应用。

Claims (3)

1.蓝状热素类内酯生物碱化合物，由生产菌株经常规发酵、提取分离获得；其特征在于：

a.生产菌株为嗜热链球菌Talaromyces sp.YM1-4，该菌株已于2009年11月05日保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.3421；

b.蓝状热素类内酯生物碱化合物由5种化合物组成，其结构式为：

1R₁＝Ac，R₂＝R₃＝H

2R₂＝Ac，R₁＝R₃＝H

3R₃＝Ac，R₁＝R₂＝H

4R₃＝R₁＝R₂＝H

2.权利要求1所述的内酯生物碱化合物，其特征在于内酯生物碱化合物中拥有如下结构片段：

3.权利要求2所述的内酯生物碱化合物，其特征在于拥有如下结构片段：

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