CN102031277B - 金轮霉素类代谢产物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一类金轮霉素类代谢产物及其应用，属微生物农药技术领域。本发明的生产菌株厚垣孢轮枝孢(Verticillium chlamydosporium)ZK7已于1999年9月22日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.0418。本发明由ZK7经常规发酵、提取分离获得4种结构相似的金轮霉素类代谢产物。本发明的金轮霉素类代谢产物在液体浸泡法的抗线虫活性测试中显示出杀线虫活性，由于此类化合物为同一骨架，得到化合物1-4均能有效毒杀线虫。本发明的金轮霉素类代谢产物具有对环境无污染、成本低、毒杀线虫效果佳的优点，能作为制备杀线虫药剂的应用。

Description

金轮霉素类代谢产物及其应用

技术领域：

本发明涉及一种金轮霉素类代谢产物及其应用，属微生物农药技术领域。

背景技术：

植物寄生线虫是一种危害严重的植物病害，据Sasser&Freekman(1987)报道，植物寄生线虫每年造成世界农业生产的损失约1000亿美元。目前，化学防治仍然是控制植物线虫的重要措施之一，但长期使用巨毒化学杀线虫剂给环境和人类的健康带来的危害日渐显露。因此，研究开发高效低毒的生物杀线虫剂已成为农业可持续发展的重要问题。

在线虫生防研究中，20世纪70年代以来，线虫生物防治引起了人们的关注，各国政府也给予了极大支持，第一代线虫生物防治剂的活菌剂如捕食线虫真菌、内寄生真菌和寄生性细菌应运而生，但它受环境因素影响大、稳定性较差、货架期短等问题，使其应用受到限制。为克服这一弊病，国内外研究者更加关注第二代线虫生防因子即菌株代谢产物研究开发。近年来由于线虫、真菌等造成植物侵染性病害的各种病原物的抗性、原有的农用抗菌素、杀线剂抗生素治疗效果在减退，需要不断开发新的抗生素，而发现新的天然抗生素活性成份是问题的关键。

国内外文献检索表明，目前没有将金轮霉素(aurovertin)类化合物作为线虫生防剂的报道。因此利用金轮霉素类化合物制备杀线虫剂是一条值得探索的途径。

发明内容：

本发明的目的是从具有毒杀植物寄生线虫功能的真菌中筛选出高毒力ZK7菌株，从ZK7菌株的次生代谢产物中提取高毒力杀线虫化合物，为研究开发生物杀线虫制剂和研究开发仿生生物农药奠定基础。

本发明是这样实现的：

本发明人在前期研究中，筛选获得了具有良好杀植物寄生线虫功能的真菌Verticillium chlamydosporium ZK7，菌株已于1999年9月22日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.0418。

本发明将ZK7菌株采用PDA培养基，用常规发酵方法培养，将发酵液低压浓缩后，用氯仿、乙酸乙酯萃取，然后将两部分合并浓缩后，再通过硅胶(氯仿/甲醇洗脱)和Sephedex-LH20凝胶柱(甲醇洗脱)层析，即得到本发明的黄色的金轮霉素类化合物，该类化合物是经核磁共振波谱，质谱，红外光谱紫外和旋光光谱确定为4种结构相似的金轮霉素类代谢产物；其中产物1为一个结构新颖的化合物，命名为金轮霉素I(aurovertin I)，化合物2-4为金轮霉素E，金轮霉素F和金轮霉素D(aurovertinsE，F和D)。该4种金轮霉素类代谢产物的结构如下式1-4所示(以下分别简称为化合物1-4)：

本发明的活性化合物1-4的理化性质：

物化特征为：

外观：黄色油脂状物质；

溶解性：溶于氯仿、丙酮、二甲亚砜等，不溶于己烷和水等；

化合物1-3的氢谱和碳谱数据见下表。化合物4的数据已有文献报道，不在此累述。

核磁谱特征见表1，其溶解溶剂为CD₃COCD₃，400MHz，δ：ppm.

金轮霉素I(Aurovertin I，1)：分子式为：C₂₂H₂₈O₇，分子量为404；高分辨正离子ESI-MS质谱：实测值为405.1906[M+H]⁺，计算值为405.1913(calculated forC₂₂H₂₉O₇，).

紫外吸收UV(MeOH)λmax(log ε)257(3.92)，269(4.06)，277(4.07)，358(3.91)nm；

红外吸收IR(KBr)v_max3425，2975，2935，1694，1632，1640，1554，1560，1455，1407，1379，1310，1252，1191，1149，1130，1088，1040，1016，943，911，891，822，758，731，697，661，589，479cm^-1；

金轮霉素E(Aurovertin E，2)：¹H NMR and ¹³C NMR see Table 1；EI-MS：m/z 418[M]⁺。

金轮霉素F(Aurovertin F，3)：¹H NMR and ¹³C NMR see Table 1；EI-MS：m/z 434[M]⁺。

金轮霉素D(Aurovertin D，4)：EI-MS：m/z 448[M]⁺。

表1.化合物1-3的¹H and ¹³C NMR数据^a

^aData were measured in acetone-d₆ at 400MHz for ¹H and 100MHz for ¹³C with reference to the solvent signals，δin ppm and J in Hz.

实验表明：本发明的活性化合物在液体浸泡法的抗线虫活性测试中，在处理时间为48小时时，化合物对Panagrellus redivevus线虫的LC₅₀(半致死率)分别为41.7μg·ml^-1和88.6μg·ml^-1，表现了杀线虫活性，由于此类化合物为同一骨架，得到的化合物1-4均能有效毒杀线虫。

因此，该类化合物可以作为制备杀线虫药剂的应用。

本发明具有对环境无污染、成本低、毒杀线虫效果佳的优点。

具体实施方式：

实施例1：

化合物1-4的分离制备：

1.真菌ZK7的种子培养：

PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15g，水1000ml，自然PH，灭菌后倒成平板。将ZK7菌块接种到平板上，28℃培养5～7天。

2.真菌ZK7的液体发酵培养：

PD培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，水1000ml，自然PH.将平板菌种接种到500ml三角瓶中(每瓶装250ml)液体培养基，在28℃下摇床培养，转速180rpm，培养时间12天。

3.将发酵液过滤，滤液即发酵原液减压浓缩后，分别用氯仿、乙酸乙酯萃取，然后将两部萃取物合并后进行硅胶色谱分离，以甲醇/氯仿＝0-25％为洗脱剂梯度洗脱。

4.收集2％～10％的甲醇/氯仿洗脱液，减压浓缩。将浓缩液再进行反复硅胶色谱分离

5.收集TLC板上硫酸显色为紫色的洗脱液浓缩得黄色粉末，经甲醇Sephedex-LH 20反复分离后得到化合物1-4。

实施例2：

用液体浸入法检测本发明化合物的单体抗线虫活性的实验：

1.试验用药剂

将化合物3和4溶于10μl丙酮，再加入10％浓度的吐温-20溶液，分别制备400μg·ml^-1、200μg·ml^-1、100μg·ml^-1、50μg·ml^-1和25μg·ml^-1浓度的供试液，在该溶液中，丙酮的终浓度不超过3％，吐温-20的终浓度不超过0.5％。另将相同浓度的丙酮溶解于含有0.5％(v/v)的吐温-20水溶液作为对照。

2.线虫的培养与制备

将P.redivevus线虫接种于燕麦培养基上(燕麦20g，水80ml)，于28℃培养5～7天。用贝尔曼漏斗法洗出所需线虫，经1％次氯酸钠消毒2分钟后，用无菌蒸馏水将线虫稀释为6000/ml作为线虫悬液。

3.试验方法

将供试液3ml放于6cm平板中，加入活线虫18 000条，置于28℃恒温培养箱，分别于6，12，18，24，36小时和48小时在光学显微镜下检查计算线虫死亡率。并在双目显微镜下观察线虫体壁消解的情况。

鉴定死亡的方法：死亡线虫僵直或呈“J”型，活线虫则卷曲扭动。用针尖拨动静止线虫身体各部，线虫仍未做出任何反应则鉴定为死亡。

死亡率＝(死亡线虫数/(死亡线虫数+活线虫数))×100％

校正死亡率＝供试样品死亡率-对照组死亡率

以未加样品的测试溶液为对照，整个实验重复三次，取三次平均值，计算出平均死亡率和校正死亡率。

4.实验结果

表1供试化合物对P.redivevus线虫的毒杀性结果

由于化合物3和4是菌株发酵液中的主要成分，故选择3和4进行杀线虫活性实验。结果表明：化合物3和4对P.redivevus线虫的LC₅₀(半致死率)在48小时分别为41.7μg·ml^-1和88.6μg·ml^-1，对腐生线虫具有良好毒杀活性。

Claims (2)

1.用于杀线虫的金轮霉素类代谢产物，由生产菌株经常规发酵、提取分离获得；其特征在于：

a.生产菌株厚垣孢轮枝孢(Verticillium chlamydosporium)ZK7已于1999年9月22日保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.0418；

b.金轮霉素类代谢产物由4种化合物组成，其结构式为：

2.权利要求1所述的金轮霉素类代谢产物的用途，其特征在于所述金轮霉素类代谢产物用于制备杀线虫的药物。