CN103045488B - 一种白僵菌as-70菌株及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物农药制剂，具体的说是一种白僵菌AS-70菌株及其应用。白僵菌AS-70（Beauveria felina）保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏日期：2012年9月29日，保藏号为：CGMCC 6643。所述白僵菌的发酵产物用于制备农业杀虫剂。本发明菌株分离自福建苏澳岛采集的苔藓虫，通过测定其ITS1-5.8S-ITS2序列，并与Genbank数据库中已知菌株相应序列信息比较，其与菌株Beauveria felina(Accession number:AY261369)的相似度为99%。该菌株发酵产物可用于制备农业杀虫剂，具有生产工艺简单、周期短、产品成本低等特点。
Description
技术领域
本发明涉及微生物农药制剂，具体的说是一种白僵菌AS-70菌株及其应用。
背景技术
随着化学农药的大量使用，植物病虫害对其抗药性也越来越明显，随之也带来了环境污染、人畜中毒与三致（致癌、致畸、致突变）等问题。近年来，因化学农药残留而导致的“绿色壁垒”严重制约着我国农产品的出口，传统农业产业也面临着更大的风险与挑战。而与传统的化学合成农药相比，微生物源农药具有对人畜和非靶标生物安全，环境兼容性好，不易产生抗性等优点。
白僵菌（Beauveria）是一类寄主范围广、致病性与适应性很强的昆虫病原真菌，对昆虫致病机制独特。应用其防治植物病虫害具有对人畜无害，环境友好，无农药残留等优点，符合未来绿色农业发展的趋势。
发明内容
本发明目的在于提供一种白僵菌AS-70菌株及其应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种白僵菌AS-70菌株，白僵菌AS-70（Beauveria felina）保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2012年9月29日，保藏号为：CGMCC6643。
将所述白僵菌于发酵培养基中静置或摇床发酵培养15-50天，发酵产物待用。所述发酵培养基比例为大米100g蛋白胨0.6g，天然海水100mL。白僵菌AS-70菌株的应用，所述白僵菌经发酵培养基的发酵产物用于制备农业杀虫剂。
将所述白僵菌于发酵培养基中静置或摇床发酵培养15-50天，发酵产物待用。将发酵产物用溶剂提取，提取物进行柱层析分离，分离产物用于制备农业杀虫剂。所述溶剂为：石油醚、乙酸乙酯、氯仿、丙酮、甲醇、乙醇、正丁醇或水中的一种或几种。所述发酵产物进行柱层析分离，以石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，收集石油醚-乙酸乙酯体积比5:1与2:1梯度的洗脱组分I与Ⅱ用于制备农业杀虫剂；以氯仿-甲醇进行梯度洗脱进行柱层析分离，收集氯仿-甲醇体积比50:1与20:1梯度的洗脱组分Ⅲ与Ⅳ用于制备农业杀虫剂。所述柱层析可采用硅胶柱层析、凝胶柱层析、反相柱层析及大孔吸附树脂柱层析中的一种或几种。所述石油醚-乙酸乙酯洗脱梯度为100:1至1:1；氯仿-甲醇洗脱梯度为100:1至1:1。
本发明所具有的优点：
本发明所述的白僵菌AS-70菌株分离自福建苏澳岛采集的苔藓虫，通过测定其ITS1-5.8S-ITS2序列，并与Genbank数据库中已知菌株相应序列信息比较，其与菌株Beauveria felina(Accession number:AY261369)的相似度为99%。该菌株发酵产物具有较好杀虫活性，可用于制备农业杀虫剂，具有生产工艺简单、周期短、产品成本低及环境友好等特点，具有较好开发应用前景。
具体实施方式
为阐明对本发明特征的理解，下面结合一些非限定性的实施实例对本发明做进一步阐述。
本发明所述白僵菌（Beauveria felina），保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2012年9月29日，保藏号为：CGMCC6643；保藏单位地址：北京市朝阳区大屯路。
实施例1：海洋来源白僵菌（Beauveria felina）AS-70菌株分类。
1)菌种培养
按照微生物的常规培养方法，挑取少量保存于琼脂－麦芽膏培养基的白僵菌（Beauveria felina）AS-70，接种于PDA平板表面，28℃培养7天，初期菌落呈平茸状，后期形成乳白色分生孢子梗。
2)菌种初步鉴定
按照文献方法（J. Nat.Prod.2006,69,1622.），通过克隆真菌核糖体rDNA基因转录间隔序列(ITS1-5.8S-ITS2全长序列)、测序，并与Genbank数据库中已知菌株相应序列信息比较，其与菌株Beauveria felina(Accessionnumber:AY261369)的相似度为99%。序列信息如下：
CTCCTTTGTGACATACCTATCGTTGCTTCGGCGGGTCCGTCCCGGAGCTGGCAGTGCACGGCCAGCCCCGGAACCAGACGCCCGCCGAGGACCCCAAACTCTTGTTTTTATAGTGGATCTTCTGAGTCTTATACAAAATAAATTAAAACTTTCAGCAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTACTCTGGCGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCAGGGCCCGTCCGCGGGACCTGGCGTTGGGGATCGGCTGCCCCTGGCGGCTGCCGGCCCTGAAATACAGTGGCGGTCTCTTCGCGACCTCCCCTGCGTAGTAGTGATACCTCGCAGCCGGATAGCGGAGCGGCCACGCCGTAAAACCCCCTACTTCTCAAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAA。
实施例2：
白僵菌（Beauveria felina）AS-70菌株的发酵培养：
1)发酵培养
菌种培养：按照微生物的常规培养方法，挑取少量保存于琼脂－麦芽膏培养基的白僵菌（Beauveria felina）AS-70，接种于PDA平板表面，28℃培养3天，作为规模发酵培养的菌种，待用。
切取上述PDA平板表面的菌种适量，接种至已灭菌的、盛有大米培养基的锥形瓶中，室温静置培养30天后采用乙酸乙酯灭菌，待用。
所述大米培养基为大米100g/瓶，蛋白胨0.6g/瓶，天然海水100mL/瓶。
2)发酵产物分离与纯化
将上述白僵菌经大米培养基发酵培养的产物用乙酸乙酯超声提取3次，合并提取液，减压蒸馏得浸膏。按照洗脱液极性递增顺序，分别以石油醚-乙酸乙酯（体积比100:1至1:1）和氯仿-甲醇（体积比100:1至1:1）为梯度洗脱剂进行硅胶柱层析分离。分别收集以石油醚-乙酸乙酯为洗脱液的体积比5:1与2:1梯度的洗脱组分I与Ⅱ，用于制备农业杀虫剂；收集以氯仿-甲醇为洗脱液的体积比50:1与20:1梯度的洗脱组分Ⅲ与Ⅳ，用于制备农业杀虫剂。
实施例3：杀虫活性试验
卤虫（brine shrimp）也称盐水丰年虫，分类上属于节肢动物门，甲壳纲，无甲目，盐水丰年虫科，卤虫属。卤虫作为一种杀虫剂筛选模型，国内外已经有相关报道，王再强等[农药,2011,50(4):261–263]以卤虫作为模型生物评价了14种常见杀虫剂的杀虫活性，结果表明用卤虫筛选具有杀虫活性的化合物，方法简便，且对多种不同作用机制的杀虫剂敏感；胡志钰等[海洋通报,2000,19(4):36-41]以卤虫作为指示生物，快速筛选海洋放线菌中具有杀虫活性的化合物；Blizzard T.A.等[J.Antibiot,1989,42(8):1304-1307]以卤虫快速筛选杀虫剂阿维菌素的类似物。总之，卤虫作为杀虫活性测定的模型生物具有来源广泛、操作简单、所需化合物的量少等优势，可以提高筛选效率，对新农业杀虫剂的研发具有重要意义。
1)卤虫卵的孵化
取卤虫卵100mg置于500mL烧杯中，加入人工海水400mL，用充气泵缓缓充气，室温孵化24h，除去卵壳及未孵化的卵，卤虫继续培养24h，备用。
2)样品溶液的制备
将上述实施例分离纯化的发酵产物组分I-Ⅳ分别以DMSO溶解，配制为4mg/mL溶液，并依此稀释至2,1与0.5mg/mL溶液，备用。
3)试验方法
按照Solis改良法（Bioorg.Med.Chem.Lett.2010,20:5677-5680)，取96孔细胞培养板，每孔加195μL含10-15个卤虫的人工海水液，制成测试培养板。空白对照组和各浓度样品组各设三个平行孔，空白对照组加5μL人工海水，样品组加5μL所需浓度的样品液。室温培养24小时后，在双目解剖镜下检测计数卤虫死亡个体数目。
卤虫致死活性用校正死亡率表示，计算公式如下：
校正死亡率＝(对照组存活率－处理组存活率)/对照组存活率×100%，并计算半数致死率LD50值。
试验结果为组分I-Ⅳ的LD50值分别为21.96、17.27、4.56与11.67μg/mL，具有较好杀虫活性。
上述实验结果证明本发明所涉及的发酵产物具有较好杀虫活性，它们可用于制备农业杀虫剂。
Claims (6)
1.一种Beauveria felina AS-70菌株，其特征在于：Beauveria felineAS-70保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏日期：2012年9月29日，保藏号为：CGMCC No.6643。
2.一种权利要求1所述的Beauveria feline AS-70菌株的应用，其特征在于：所述白僵菌经发酵培养基的发酵产物用于制备农业杀虫剂。
3.按权利要求2所述的Beauveria feline AS-70菌株的应用，其特征在于：将所述白僵菌于发酵培养基中静置或摇床发酵培养15-50天，发酵产物待用。
4.按权利要求2所述的Beauveria felin aAS-70菌株的应用，其特征在于：将发酵产物用乙酸乙酯提取，提取物进行硅胶柱层析分离，分离产物用于制备农业杀虫剂。
5.按权利要求4所述的Beauveria feline AS-70菌株的应用，其特征在于：所述发酵产物进行硅胶柱层析分离，以石油醚—乙酸乙酯梯度洗脱，收集石油醚—乙酸乙酯体积比5:1与2:1梯度的洗脱组分I与Ⅱ用于制备农业杀虫剂；以氯仿—甲醇进行梯度洗脱进行硅胶柱层析分离，收集氯仿—甲醇体积比50:1与20:1梯度的洗脱组分Ⅲ与Ⅳ用于制备农业杀虫剂。
6.按权利要求5所述的Beauveria feline AS-70菌株的应用，其特征在于：所述石油醚—乙酸乙酯洗脱梯度为100:1至1:1；氯仿—甲醇洗脱梯度为100:1至1:1。
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