CN102675293B - 一种吲哚二酮哌嗪类衍生物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物来源杀虫剂,具体的说是一种吲哚二酮哌嗪类衍生物及其制备方法和应用。吲哚二酮哌嗪类衍生物如式I所示,其中R1为氢、甲基、C1-C6酰基或2-6个碳原子的直链或支链的烷基或烯基;R2为氢或异戊烯基;R3为氢或异戊烯基;R4为氢或异戊烯基;R3与R4至少其一为异戊烯基。本发明所涉及的吲哚二酮哌嗪类化合物由冠突散囊菌(Eurotium cristatum)经发酵培养、提取分离而获得,其化学结构经超导核磁共振和质谱等技术鉴定,具有较好杀虫活性。
Description
技术领域
本发明涉及微生物来源杀虫剂,具体的说是一种吲哚二酮哌嗪类衍生物及其制备方法和应用。
背景技术
随着化学农药的大量使用,植物病虫害对其抗药性也越来越明显,随之也带来了环境污染、人畜中毒与三致(致癌、致畸、致突变)等问题。近年来,因化学农药残留而导致的“绿色壁垒”严重制约着我国农产品的出口,传统农业产业也面临着更大的风险与挑战。而与传统的化学合成农药相比,生物源天然产物农药具有对人畜和非靶标生物安全,环境兼容性好,不易产生抗性等优点。所以生物源农药的开发与应用对人类健康、环境保护和农业的可持续发展具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种吲哚二酮哌嗪类衍生物及其制备方法和应用。
为实现上述目的,本发明所采用的技术方案为:
一种吲哚二酮哌嗪类衍生物,吲哚二酮哌嗪类衍生物如式I所示,
式I
其中:
R1为氢、甲基、C1-C6酰基或2-6个碳原子的直链或支链的烷基或烯基;
R2为氢或异戊烯基;
R3为氢或异戊烯基;
R4为氢或异戊烯基;
R3与R4至少其一为异戊烯基;
所述吲哚二酮哌嗪类衍生物,其R1为甲基或2-6个碳原子的直链或支链的烷基或烯基,R2与R4为H或异戊烯基,R3为异戊烯基。
所述吲哚二酮哌嗪类衍生物,其R1为甲基,R2与R4为H,R3为异戊烯基。
吲哚二酮哌嗪类衍生物的制备方法:
1)将冠突散囊菌(Eurotium cristatum)接种于真菌固体培养基中静置发酵,经有机溶剂提取,获得提取物,待用;
2)将上述提取物进行硅胶柱层析,以石油醚-丙酮及氯仿-甲醇进行梯度洗脱,收集洗脱液,洗脱液经薄层层析检测;
3)将上述步骤2)中石油醚-丙酮体积比2~1∶1梯度的洗脱组分,依次进行反相硅胶柱层析、凝胶柱层析与制备高效液相色谱分离纯化,收集保留时间tR值为10-30min的组分,即得式I所示吲哚二酮哌嗪类化合物;
所述步骤3)收集保留时间tR值为15.8-20.8min的组分。
所述步骤3)收集保留时间tR值为17.8min的组分。
所述步骤1)发酵时间为25-30天,固体培养基为大米培养基,有机溶剂为乙酸乙酯、丙酮、氯仿、甲醇、乙醇、水中的一种或几种。
所述步骤2)中石油醚-丙酮洗脱梯度为100∶1至1∶1,氯仿-甲醇洗脱梯度为40∶1至1∶1。
所述步骤3)中反向硅胶柱层析洗脱液为体积比1∶1的甲醇-水,凝胶柱层析洗脱液为甲醇,制备高效液相色谱条件为体积比7∶3的甲醇-水,流速为5mL/min,检测波长为235nm。
吲哚二酮哌嗪类衍生物的应用,所述式I所示吲哚二酮哌嗪类衍生物可用于制备农用杀虫剂。
本发明所具有的优点:
1)本发明所涉及的吲哚二酮哌嗪类衍生物具有较好杀虫活性,对卤虫LD50值为19.4μg/mL。
2)本发明所涉及的吲哚二酮哌嗪类衍生物(如结构式I所示)可以作为具有杀虫作用的新农药成分或先导化合物。
3)本发明所涉及的吲哚二酮哌嗪类衍生物可以利用微生物进行规模发酵,具有生产工艺简单,周期短、产品成本低等特点。
具体实施方式
为阐明对本发明特征的理解,下面结合一些非限定性的实施实例对本发明做进一步阐述。
实施例1:吲哚二酮哌嗪类衍生物如式I所示。
其中:
R1为氢、甲基、C1-C6酰基或2-6个碳原子的直链或支链的烷基或烯基;
R2为氢或异戊烯基;
R3为氢或异戊烯基;
R4为氢或异戊烯基;
R3与R4至少其一为异戊烯基;
吲哚二酮哌嗪类化合物1的化学结构为(结构式中的阿拉伯数字是化学结构中的碳原子的标位):
其中:
化合物1为通式(I)中R1为甲基,R2与R4为氢,R3为异戊烯基所代表的化合物。
实施例2:化合物1的发酵生产及分离纯化:
1)发酵培养
菌种培养:按照微生物的常规培养方法,挑取少量保存于琼脂-麦芽膏培养基的冠突散囊菌(Eurotium cristatum)菌种,接种于PDA平板表面,28℃培养3天,作为规模发酵培养的菌种,待用。
切取上述PDA平板表面的菌种适量,接种至已灭菌的、盛有大米培养基的锥形瓶中,室温静置培养30天。加入乙酸乙酯灭菌,待用。
所述大米培养基为大米100g/瓶,蛋白胨0.6g/瓶,天然海水100mL/瓶。
2)化合物的分离纯化
将上述大米培养基用乙酸乙酯超声提取3次,合并乙酸乙酯提取液,减压蒸馏得浸膏。将其进行硅胶VLC(vacuum liquid chromatography)柱层析,按照洗脱液极性递增顺序,以石油醚-丙酮体积比100∶1至1∶1,氯仿-甲醇体积比40∶1至1∶1进行梯度洗脱。收集洗脱液,并经薄层层析(TLC)检测,检测时以茴香醛-浓硫酸作为显色剂,根据Rf值以及显色情况来合并相同或类似部分。收集石油醚-丙酮体积比2~1∶1梯度的洗脱组分,将收集的组分进行反相硅胶柱层析,合并体积比为1∶1的甲醇-水洗脱组分。该组分经甲醇凝胶柱层析与制备高效液相色谱分离纯化,色谱条件为体积比7∶3的甲醇-水,流速为5mL/min,检测波长为235nm,收集保留时间tR值为17.8min的组分,即得式I所示吲哚二酮哌嗪类化合物1。
化合物1,淡黄色粉末状固体;UV(MeOH)λmax(log ε)228(4.51),262(4.02),288(3.95),355(3.98)nm;ESIMS m/z 444[M+Na]+;HRESIMS m/z444.2250[M+Na]+(calcd for C25H31N3O3Na,444.2263);1H-and 13C-NMR,见表1。
表1.化合物1的1HNMR(500MHz)和13CNMR(125MHz)谱图数据
NMR测试所用溶剂:DMSO-d6。
实施例3:杀虫活性试验
卤虫(brine shrimp)也称盐水丰年虫,分类上属于节肢动物门,甲壳纲,无甲目,盐水丰年虫科,卤虫属。卤虫作为一种杀虫剂筛选模型,国内外已经有相关报道,王再强等[农药,2011,50(4):261-263]以卤虫作为模型生物评价了14种常见杀虫剂的杀虫活性,结果表明用卤虫筛选具有杀虫活性的化合物,方法简便,且对多种不同作用机制的杀虫剂敏感;胡志钰等[海洋通报,2000,19(4):36-41]以卤虫作为指示生物,快速筛选海洋放线菌中具有杀虫活性的化合物;Blizzard T.A.等[J.Antibiot,1989,42(8):1304-1307]以卤虫快速筛选杀虫剂阿维菌素的类似物。总之,卤虫作为杀虫活性测定的模型生物具有来源广泛、操作简单、所需化合物的量少等优势,可以提高筛选效率,对新农用杀虫剂的研发具有重要意义。
1)卤虫卵的孵化
取卤虫卵100mg置于500mL烧杯中,加入人工海水400mL,用充气泵缓缓充气,室温孵化24h,除去卵壳及未孵化的卵,卤虫继续培养24h,备用。
2)样品溶液的制备
待测化合物以DMSO溶解,配制为4mg/mL溶液,并依此稀释至2,1与0.5mg/mL溶液,备用。
3)试验方法
按照Solis改良法,取96孔细胞培养板,每孔加195μL含10-15个卤虫的人工海水液,制成测试培养板。空白对照组和各浓度样品组各设三个平行孔,空白对照组加5μL人工海水,样品组加5μL所需浓度的样品液。室温培养24小时后,在双目解剖镜下检测计数卤虫死亡个体数目。
卤虫致死活性用校正死亡率表示,计算公式如下:
校正死亡率=(对照组存活率-处理组存活率)/对照组存活率×100%,并计算半数致死率LD50值。
试验结果为化合物1的LD50值为19.4μg/mL,具有较好杀虫活性。
上述实验结果证明本发明所涉及的化合物具有较好杀虫活性,它们可用于制备农用杀虫剂。
Claims (7)
2.一种权利要求1所述的吲哚二酮哌嗪类衍生物的制备方法,其特征在于:
1)将冠突散囊菌(Eurotium cristatum)接种于真菌固体培养基中静置发酵,经有机溶剂提取,获得提取物,待用;
2)将上述提取物进行硅胶柱层析,以石油醚–丙酮及氯仿–甲醇进行梯度洗脱,收集洗脱液,洗脱液经薄层层析检测;
3)将上述步骤2)中石油醚–丙酮体积比2~1∶1梯度的洗脱组分,依次进行反相硅胶柱层析、凝胶柱层析与制备高效液相色谱分离纯化,收集保留时间tR值为10–30min的组分,即得式I所示吲哚二酮哌嗪类化合物;
所述步骤3)中反向硅胶柱层析洗脱液为体积比1∶1的甲醇–水,凝胶柱层析洗脱液为甲醇,制备高效液相色谱条件为体积比7∶3的甲醇–水,流速为5mL/min,检测波长为235nm。
3.按权利要求2所述的吲哚二酮哌嗪类衍生物的制备方法,其特征在于:所述步骤3)收集保留时间tR值为15.8-20.8min的组分。
4.按权利要求2或3所述的吲哚二酮哌嗪类衍生物的制备方法,其特征在于:所述步骤3)收集保留时间tR值为17.8min的组分。
5.按权利要求2所述的吲哚二酮哌嗪类衍生物的制备方法,其特征在于:所述步骤1)发酵时间为25-30天,固体培养基为大米培养基,有机溶剂为乙酸乙酯、丙酮、氯仿、甲醇、乙醇中的一种或几种。
6.按权利要求2所述的吲哚二酮哌嗪类衍生物的制备方法,其特征在于:所述步骤2)中石油醚–丙酮洗脱梯度为100∶1至1∶1,氯仿–甲醇洗脱梯度为40∶1至1∶1。
7.一种权利要求1所述的吲哚二酮哌嗪类衍生物的应用,其特征在于:所述式I所示吲哚二酮哌嗪类衍生物可用于制备农用杀虫剂。
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