CN111235036B - 一种冠突散囊菌及从其中分离纯化二酮哌嗪二聚体的方法 - Google Patents

一种冠突散囊菌及从其中分离纯化二酮哌嗪二聚体的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种冠突散囊菌Eurotium cristatum XD‑05，保藏编号为CGMCC No.19024。另外，本发明还公开了从冠突散囊菌中分离纯化二酮哌嗪二聚体的方法。本发明的冠突散囊菌菌株来源于茯砖茶，该菌株生态安全，本发明首次从茯茶来源的冠突散囊菌中分离纯化出二酮哌嗪二聚体，分离纯化方法简单高效，分离纯化的二酮哌嗪二聚体纯度达98％以上。

Description

一种冠突散囊菌及从其中分离纯化二酮哌嗪二聚体的方法
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种冠突散囊菌及从其中分离纯化二酮哌嗪二聚体的方法。
背景技术
茯砖茶在我国历史上源远流长，从原来的纯手工制作到现代化的机器制茶，从清朝时期只供给特殊人群享用的“官茶”到现在的边销茶，从原来只有在陕西才能生产的特产茶到现在可以在全国生产的茶叶，但茯砖茶是经过“发花”工艺制成的这一点却是亘古不变的，因此在各类茶类饮用品中茯砖茶才会独树一帜。茯砖茶不仅能补充人体所需的一些特殊物质，而且能够降低人体血脂、血糖，并有减肥等功效。研究表明：茯砖茶中的优势微生物是冠突散囊菌，“金花”实际上是该菌产生的黄色闭囊壳。
文献(Phytochemistry Letters,2012,5,717–720)报道分离出了一种新化合物为二酮哌嗪二聚体，其来源于海洋海绵上的冠突散囊菌(Eurotium cristatum KUFC7356)其特点是菌落整体为淡橘色，且呈不规则放射状圆形(如图1)。但文献中并未对二酮哌嗪二聚体有进一步的研究。二酮哌嗪类化合物(Diketopiperazines,DKPs)的基本结构是由2个氨基酸缩合而成的环二肽(DKP),因其骨架具有稳定的六元环结构,且有2个氢键给体和2个氢键受体,使得DKPs在药物化学中成为一个重要的药效团,且它们的研究也为多肽化学方向研究奠定了基础。目前海绵共生微生物中已经发现了大量的活性DKPs，而在茯茶来源的冠突散囊菌中目前很少有发现DKPs。
本实验室研究发现：来源于茯茶的冠突散囊菌也能产生二酮哌嗪二聚体，并且其对糖代谢有明显的调节作用，但目前对于茯茶来源的冠突散囊菌中二酮哌嗪二聚体的制备方法尚无文献报道。因此采用现代分离纯化方法制备二酮哌嗪二聚体，将其应用于二酮哌嗪二聚体单体化合物的多种药理活性研究具有非常重要的价值。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种冠突散囊菌。该菌株来源于茯茶，生态安全，生物活性高，且有明显的降糖降脂等活性功能，可作为一株高活性、高产次级代谢产物的菌株。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种冠突散囊菌，其特征在于，所述冠突散囊菌为Eurotium cristatum XD-05，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.19024，保藏日为2019年11月22日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
1、该菌株具有如下的性质：
形态特征：将其接种于PDA固体平板上，28℃培养24h就可看到白色绒状菌落，48h菌落直径可达15mm，菌落中心位置菌丝开始变黄。72h整个菌落呈亮黄色，直径可达45-50mm。继续培养至144h菌落中央部位有黑褐色渗出液，整个菌落呈褐色，培养基背面也有褐色色素存在，菌落直径50-55mm。将其接种至察氏培养基中菌落形态同PDA平板中基本相同，但生长较慢，最终菌落直径也小，在35-40mm。
生理生化特征：本菌株好气性强，耐剪切性差，搅拌转速超过300rpm时菌丝易断裂，生长变慢。生长的pH范围4.0-7.0，最适pH为6.0。最高生长温度38℃，最适生长温度28℃。该菌株可以利用多种碳源，但最佳碳源为蔗糖；可以利用多种氮源，无机氮源较差，有机氮源中以酵母粉为最佳。
2、该菌株的筛选方法包括：
步骤一、富集：将10g茯砖茶磨成粉末，用生理盐水制成悬液，采用稀释涂布平板法的方法将上述悬液按照10倍进行梯度稀释，并涂布平板，挑取菌落较大而且颜色呈亮黄色的菌落为冠突散囊菌孢子；
步骤二、初筛和纯化：将挑取的冠突散囊菌孢子制成孢子悬液，孢子活力为1*107cfu/mL，取600～800μL接种到PDA平板上培养，在25～38℃恒温培养箱内培养5天后收取得到金黄色孢子；
步骤三、复筛：将上一步所得到的孢子划线于含有PDA平板继续筛选8-10代，PDA斜面培养，置于4℃保藏。
进一步地，本发明还提供了一种从上述的冠突散囊菌中分离纯化二酮哌嗪二聚体的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、制备冠突散囊菌孢子；
步骤二、浸提步骤一中制备的冠突散囊菌孢子，得到孢子浸提液；
步骤三、采用大孔吸附树脂对步骤二中所述孢子浸提液进行吸附，然后进行梯度洗脱，收集目标段洗脱液；
步骤四、利用反相高效液相色谱分离纯化步骤三中收集的目标段洗脱液，收集最大色谱峰的洗脱液，浓缩后冻干，得到二酮哌嗪二聚体。
上述的方法，其特征在于，步骤一中冠突散囊菌孢子的制备方法为：将冠突散囊菌接种到PDA平板上，培养5～7天，挑取冠突散囊菌孢子，将挑取的冠突散囊菌孢子制成孢子悬液，接种到PDA平板上，5～7天后收取得到金黄色冠突散囊菌孢子。
上述的方法，其特征在于，步骤二中浸提所用溶剂为水、乙醇、乙酸乙酯、丙酮和乙醚中的一种或几种，所述溶剂的体积与冠突散囊菌孢子的质量之比为(10～100):1，其中体积的单位为mL，质量的单位为g。
上述的方法，其特征在于，浸提所用溶剂为乙醇和水的混合溶液。
上述的方法，其特征在于，所述乙醇和水的混合溶液中乙醇的体积百分含量为50％。
上述的方法，其特征在于，步骤三中所述大孔吸附树脂的型号为S-8、AB-8、D-101、X-5、NRR或D-3520。
上述的方法，其特征在于，步骤三中梯度洗脱采用的洗脱液为乙醇水溶液。
上述的方法，其特征在于，步骤四中反相高效液相色谱采用XDB-C18反相色谱柱，流动相为体积百分比浓度为25％～45％的乙醇水溶液。
本发明分离纯化得到的二酮哌嗪二聚体的结构式如式下所示：
Figure BDA0002367377470000041
本发明与现有技术相比具有以下优点：
1、本发明的冠突散囊菌菌株来源于茯茶，该菌株生态安全。
2、本发明的冠突散囊菌菌株生物活性高，且有明显的降糖降脂等活性功能，可作为一株高活性、高产次级代谢产物的菌株。
3、本发明首次从茯茶来源的冠突散囊菌中分离纯化出二酮哌嗪二聚体，分离纯化方法简单高效，分离纯化的二酮哌嗪二聚体纯度达98％以上。
4、本发明在分离纯化过程中所使用的溶剂均廉价易得，且纯化工艺简单经济高效，有很高的工业应用价值。
下面通过实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
附图说明
图1为海洋海绵上的冠突散囊菌菌落的形态图。
图2为本发明的冠突散囊菌Eurotium cristatum XD-05的形态图。
图3为本发明实施例2分离纯化的二酮哌嗪二聚体的ESI/MS光谱(负离子)谱图。
图4为本发明实施例2分离纯化的二酮哌嗪二聚体的ESI/MS光谱(正离子)谱图。
图5为本发明实施例2分离纯化的二酮哌嗪二聚体的1H NMR光谱图。
图6为本发明实施例2分离纯化的二酮哌嗪二聚体的13C NMR光谱图。
图7为本发明实施例2分离纯化的二酮哌嗪二聚体的高效液相色谱图。
图8为本发明分离纯化的二酮哌嗪二聚体对细胞活性影响图。
图9为本发明分离纯化的二酮哌嗪二聚体对高糖和胰岛素诱导的Hep-G2细胞葡萄糖摄取的影响图。
具体实施方式
实施例1冠突散囊菌菌株的筛选与鉴定
菌株的筛选：
步骤一、富集：将10g茯砖茶磨成粉末，用生理盐水制成悬液，采用稀释涂布平板法的方法将上述悬液按照10倍进行梯度稀释，并涂布平板，挑取菌落较大而且颜色呈亮黄色的菌落为冠突散囊菌孢子；
步骤二、初筛和纯化：将挑取的冠突散囊菌孢子制成孢子悬液，孢子活力为1×107cfu/mL，取800μL接种到PDA平板上培养，在28℃恒温培养箱内培养5天后收取得到金黄色孢子；
步骤三、复筛：将上一步所得到的孢子划线于含有PDA平板继续筛选8代，PDA斜面培养，置于4℃保藏。
菌株的鉴定：
(1)形态学鉴定：将其接种于PDA固体平板上，28℃培养24h就可看到白色绒状菌落，48h菌落直径可达15mm，菌落中心位置菌丝开始变黄。72h整个菌落呈亮黄色，直径可达45mm。继续培养至144h菌落中央部位有黑褐色渗出液，如图2所示，菌落整体呈亮黄色，菌落中央呈黑褐色，且呈较规则圆形结构较致密，培养基背面也有褐色色素存在，菌落直径50mm。将其接种至察氏培养基中菌落形态同PDA平板中基本相同，但生长较慢，最终菌落直径也小，在35mm。
(Eurotium cristatum XD-05)其特点为
(2)生理生化鉴定：菌株好气性强，最适pH为6.0。最高生长温度38℃，最适生长温度28℃。该菌株可以利用多种碳源，但最佳碳源为蔗糖；可以利用多种氮源，无机氮源较差，有机氮源中以酵母粉为最佳。
(3)18SrDNA的扩增与测序：
该菌种的鉴定由中国工业微生物菌种保藏管理中心鉴定完成。
菌种的鉴定过程包括菌株DNA的提取，PCR扩增，凝胶电泳，纯化回收，连接，感受态细胞的制备，连接产物转化，质粒提取与测序，经纯化后18SrDNA序列在核糖体数据库上比对；其中PCR扩增的引物序列为：
上游引物：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’
下游引物：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’
PCR扩增的反应体系
试剂 体积(μL)
Template(基因组DNA20-50ng/μL) 0.5
10×Buffer(with Mg<sup>2+</sup>) 2.5
Dntp(各2.5mM) 1
酶 0.2
F(10μM) 0.5
R(10μM) 0.5
加双蒸水至 25
菌株18SrDNA序列分析及比对：PCR扩增的产物的片段大小519bp，测序得到的18SrDNA部分基因序列(SEQ ID NO.3)与GenBank中已发表的冠突散囊菌相关片段序列100％同源。
综合生理生化鉴定结果和18SrDNA序列分析鉴定结果，鉴定本发明的菌株XD-05为冠突散囊菌(Eurotium cristatum)。
实施例2从冠突散囊菌中分离纯化二酮哌嗪二聚体
步骤一、将冠突散囊菌接种到PDA平板上，培养5天，收取金黄色冠突散囊菌孢子；将挑取的冠突散囊菌孢子制成孢子悬液，孢子活力为1*107cfu/mL，取800μL接种到PDA平板上，6天后收取得到金黄色冠突散囊菌孢子；
步骤二、取50g步骤一中收取的冠突散囊菌孢子于1升烧杯中，按料液比为1:20(w/v)加入1000mL体积百分含量为50％的乙醇水提取液，超声处理15分钟，重复提取3次，得到孢子浸提液；
步骤三、将步骤二中所述孢子浸提液上D-101(也可采用S-8、AB-8、X-5、NRR或D-3520代替)大孔吸附树脂吸附，然后以30％乙醇水溶液洗脱5个柱体积，再以60％乙醇水溶液洗脱5个柱体积，将60％乙醇水洗脱液在温度为55℃，真空度为0.8MPa的条件下进行减压浓缩，得到二酮哌嗪二聚体粗品；
步骤四、采用孔径为10μm，尺寸为20×250mm的XDB-C18反相色谱柱，分离纯化步骤三中收集的目标段洗脱液，柱温为30℃，流动相为体积百分比浓度为35％的乙醇水溶液，流速为25mL/min，收集最大色谱峰的洗脱液，将收集的洗脱液在温度为55℃，真空度为0.8MPa的条件下进行减压浓缩，冻干，得到250mg二酮哌嗪二聚体，纯度98.8％。
对本实施例分离纯化的二酮哌嗪二聚体进行ESI/MS光谱测试，结果见图3和图4，(A)M+H：m/z 591.2757，(B)M+Na：m/z 603.1984，从图中可以看出，样品的ESI/MS光谱(负离子)显示m/z 567.2249与测试样品的ESI/MS光谱[M+H]m/z 567.2720一致；样品的ESI/MS光谱(正离子)显示m/z 591.2757与测试样品的ESI/MS光谱[M+Na]m/z 591.2696一致。
对本实施例分离纯化的二酮哌嗪二聚体进行NMR光谱分析(DMSO，600MHz)，结果见图5和图6，图5为1H NMR光谱图，图6为13C NMR光谱图，1H NMR谱图显示总共18个质子信号，与待测样品中的质子数相同。13C NMR光谱显示总共有16个有效的单体峰，其中8个叔碳峰，1个仲碳峰，5个季碳峰和2个伯碳。
对本实施例分离纯化的二酮哌嗪二聚体进行高效液相色谱分析，结果见图7，液相纯度显示纯度达98.8％。
实施例3从冠突散囊菌中分离纯化二酮哌嗪二聚体
步骤一、将冠突散囊菌接种到PDA平板上，培养7天，收取金黄色冠突散囊菌孢子；将挑取的冠突散囊菌孢子制成孢子悬液，孢子活力为1*107cfu/mL，取800μL接种到PDA平板上，5天后收取得到金黄色冠突散囊菌孢子；
步骤二、取50g步骤一中收取的冠突散囊菌孢子于1升烧杯中，按料液比为1:20(w/v)加入1000mL体积百分含量为60％的乙醇水提取液，超声处理20分钟，重复提取3次，得到孢子浸提液；
步骤三、将步骤二中所述孢子浸提液上D-101(也可采用S-8、AB-8、X-5、NRR或D-3520代替)大孔吸附树脂吸附，然后以40％乙醇水溶液洗脱5个柱体积，再以70％乙醇水溶液洗脱5个柱体积，将70％乙醇水洗脱液在温度为60℃，真空度为0.8MPa的条件下经减压浓缩得到二酮哌嗪二聚体粗品；
步骤四、采用孔径为10μm，尺寸为20×250mm的XDB-C18反相色谱柱，分离纯化步骤三中收集的目标段洗脱液，柱温为30℃，流动相为体积百分比浓度为25％的乙醇水溶液，流速为20mL/min，收集最大色谱峰的洗脱液，将收集的洗脱液在温度为50℃，真空度为0.7MPa的条件下进行减压浓缩，冻干，得到230mg二酮哌嗪二聚体，纯度98.4％。
实施例4从冠突散囊菌中分离纯化二酮哌嗪二聚体
步骤一、将冠突散囊菌接种到PDA平板上，培养6天，收取金黄色冠突散囊菌孢子；将挑取的冠突散囊菌孢子制成孢子悬液，孢子活力为1*107cfu/mL，取800μL接种到PDA平板上，7天后收取得到金黄色冠突散囊菌孢子；
步骤二、浸提步骤一中收取的冠突散囊菌孢子，得到孢子浸提液；浸提所用溶剂为水、乙醇、乙酸乙酯、丙酮和乙醚中的一种或几种，优选乙醇和水的混合溶液，乙醇和水的混合溶液中乙醇的体积百分含量为50％，所述溶剂的体积与冠突散囊菌孢子的质量之比为100:1，其中体积的单位为mL，质量的单位为g；
步骤三、将步骤二中所述孢子浸提液上D-101(也可采用S-8、AB-8、X-5、NRR或D-3520代替)大孔吸附树脂吸附，然后以20％乙醇水溶液洗脱5个柱体积，再以70％乙醇水溶液洗脱5个柱体积，将50％乙醇水洗脱液在温度为60℃，真空度为0.8MPa的条件下经减压浓缩得到二酮哌嗪二聚体粗品；
步骤四、采用孔径为10μm，尺寸为20×250mm的XDB-C18反相色谱柱，分离纯化步骤三中收集的目标段洗脱液，柱温为30℃，流动相为体积百分比浓度为35％的乙醇水溶液，流速为30mL/min，收集最大色谱峰的洗脱液，将收集的洗脱液在温度为60℃，真空度为0.8MPa的条件下进行减压浓缩，冻干，得到250mg二酮哌嗪二聚体，纯度98.2％。
实施例5从冠突散囊菌中分离纯化二酮哌嗪二聚体
步骤一、将冠突散囊菌接种到PDA平板上，培养6天，收取金黄色冠突散囊菌孢子；将挑取的冠突散囊菌孢子制成孢子悬液，孢子活力为1*107cfu/mL，取800μL接种到PDA平板上，7天后收取得到金黄色冠突散囊菌孢子；
步骤二、浸提步骤一中收取的冠突散囊菌孢子，得到孢子浸提液；浸提所用溶剂为水、乙醇、乙酸乙酯、丙酮和乙醚中的一种或几种，优选乙醇和水的混合溶液，乙醇和水的混合溶液中乙醇的体积百分含量为50％，所述溶剂的体积与冠突散囊菌孢子的质量之比为50:1，其中体积的单位为mL，质量的单位为g；
步骤三、将步骤二中所述孢子浸提液上AB-8(也可采用S-8、D-101、X-5、NRR或D-3520代替)大孔吸附树脂吸附，然后以40％乙醇水溶液洗脱5个柱体积，再以70％乙醇水溶液洗脱5个柱体积，将70％乙醇水洗脱液在温度为60℃，真空度为0.8MPa的条件下经减压浓缩得到二酮哌嗪二聚体粗品；
步骤四、采用孔径为10μm，尺寸为20×250mm的XDB-C18反相色谱柱，分离纯化步骤三中收集的目标段洗脱液，柱温为30℃，流动相为体积百分比浓度为45％的乙醇水溶液，流速为25mL/min，收集最大色谱峰的洗脱液，将收集的洗脱液在温度为60℃，真空度为0.8MPa的条件下进行减压浓缩，冻干，得到230mg二酮哌嗪二聚体，纯度98.5％。
实施例6从冠突散囊菌中分离纯化二酮哌嗪二聚体
步骤一、将冠突散囊菌接种到PDA平板上，培养6天，收取金黄色冠突散囊菌孢子；将挑取的冠突散囊菌孢子制成孢子悬液，孢子活力为1*107cfu/mL，取800μL接种到PDA平板上，7天后收取得到金黄色冠突散囊菌孢子；
步骤二、浸提步骤一中收取的冠突散囊菌孢子，得到孢子浸提液；浸提所用溶剂为水、乙醇、乙酸乙酯、丙酮和乙醚中的一种或几种，优选乙醇和水的混合溶液，乙醇和水的混合溶液中乙醇的体积百分含量为50％，所述溶剂的体积与冠突散囊菌孢子的质量之比为10:1，其中体积的单位为mL，质量的单位为g；
步骤三、将步骤二中所述孢子浸提液上S-8(也可采用D-101、AB-8、X-5、NRR或D-3520代替)大孔吸附树脂吸附，然后以40％乙醇水溶液洗脱5个柱体积，再以70％乙醇水溶液洗脱5个柱体积，将70％乙醇水洗脱液在温度为60℃，真空度为0.8MPa的条件下经减压浓缩得到二酮哌嗪二聚体粗品；
步骤四、采用孔径为10μm，尺寸为20×250mm的XDB-C18反相色谱柱，分离纯化步骤三中收集的目标段洗脱液，柱温为30℃，流动相为体积百分比浓度为35％的乙醇水溶液，流速为20mL/min，收集最大色谱峰的洗脱液，将收集的洗脱液在温度为60℃，真空度为0.8MPa的条件下进行减压浓缩，冻干，得到240mg二酮哌嗪二聚体，纯度98.7％。
实施例7
采用本发明分离纯化得到的二酮哌嗪二聚体进行体外降糖实验
实验细胞：Hep-G2人肝癌细胞购自上海博古生物科技有限公司，代数在10代以内。
试验方法及结果：
二酮哌嗪二聚体单体对高糖诱导的Hep-G2胰岛素抵抗细胞葡萄糖消耗作用的影响。
人肝癌细胞Hep-G2 10000个/孔接种于96孔板，每孔100μL培养液。24h后，将培养液换成含不同浓度二酮哌嗪二聚体单体、0.5mM棕榈酸、0.5％BSA、1nM胰岛素、不含血清的高糖DMEM培养基，实验另设无细胞空白组(无细胞、含0.5％BSA、1nM胰岛素的无血清低糖DMEM培养基)、对照组(含0.5％BSA、1nM胰岛素的无血清低糖DMEM培养基)、模型组(0.5mM棕榈酸、0.5％BSA、1nM胰岛素、不含血清的高糖DMEM培养基)和阳性药组(1mM二甲双胍、0.5mM棕榈酸、0.5％BSA、1nM胰岛素、不含血清的高糖DMEM培养基)。孵育24h后，每孔取2μL上清液，用葡萄糖测定试剂盒(葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法)测定每孔的葡萄糖消耗量。移去96孔板中的培养液，MTT比色法于570nM波长下测定各孔吸光度值。
以无细胞空白组的葡萄糖含量减去接种细胞的测试孔中的葡萄糖含量，即得各孔的葡萄糖消耗量。同时，除以各孔细胞的MTT值进行细胞数量的校正。实验结果显示：二酮哌嗪二聚体在15μM和30μM的给药剂量对胰岛素抵抗Hep-G2细胞无毒副作用。如图8和图9所示，二酮哌嗪二聚体在15μM和30μM的给药剂量对胰岛素抵抗Hep-G2细胞的葡萄糖消耗均有显著的促进作用，并且高剂量比低剂量葡萄糖消耗的效果更显著。说明本发明的冠突散囊菌菌株分离纯化的二酮哌嗪二聚体具有明显的降糖活性，该菌株可作为一株高活性、高产次级代谢产物的菌株。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何限制，凡是根据发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效结构变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。

Claims (6)

1.一种冠突散囊菌，其特征在于，所述冠突散囊菌为Eurotiumcristatum XD-05，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 19024。
2.一种从权利要求1所述的冠突散囊菌中分离纯化二酮哌嗪二聚体的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、制备如权利要求1所述的冠突散囊菌孢子；
步骤二、浸提步骤一中制备的冠突散囊菌孢子，得到孢子浸提液；浸提所用溶剂为水、乙醇、乙酸乙酯、丙酮和乙醚中的一种或几种，所述溶剂的体积与冠突散囊菌孢子的质量之比为(10～100):1，其中体积的单位为mL，质量的单位为g；
步骤三、采用大孔吸附树脂对步骤二中所述孢子浸提液进行吸附，然后进行梯度洗脱，收集目标段洗脱液；梯度洗脱采用的洗脱液为乙醇水溶液；
步骤四、利用反相高效液相色谱分离纯化步骤三中收集的目标段洗脱液，收集最大色谱峰的洗脱液，浓缩后冻干，得到二酮哌嗪二聚体；反相高效液相色谱采用XDB-C18反相色谱柱，流动相为体积百分比浓度为25％～45％的乙醇水溶液；
所述二酮哌嗪二聚体的结构式如下所示：
Figure 239941DEST_PATH_IMAGE001
。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤一中所述冠突散囊菌孢子的制备方法为：将冠突散囊菌接种到PDA平板上，培养5～7天，挑取冠突散囊菌孢子，将挑取的冠突散囊菌孢子制成孢子悬液，接种到PDA平板上，5～7天后收取得到金黄色冠突散囊菌孢子。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤二中浸提所用溶剂为乙醇和水的混合溶液。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述乙醇和水的混合溶液中乙醇的体积百分含量为50％。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤三中所述大孔吸附树脂的型号为S-8、AB-8、D-101、X-5、NRR或D-3520。
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