CN111979137B - 一种来源于海洋链霉菌的碳磷化合物及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种来源于海洋链霉菌的碳磷化合物，结构如式1所示：
所述碳磷化合物来源于海洋链霉菌菌株Streptomyces sp.M10731。本发明提供的来源于海洋链霉菌的碳磷化合物属于新的碳磷化合物，所用的微生物发酵方法选择了多产抗生素的海洋链霉菌Streptomyces sp.M10731，提取方法成熟，工艺简便，所得产物产率高，经核磁共振、质谱检测，其结构正确。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一种从海洋链霉菌菌株Streptomycessp.M10731中分离得到的特殊碳磷化合物及其制备方法与应用。
背景技术
链霉菌(Streptomyces)是生产抗生素的重要菌株，大量的抗生素从链霉菌中分离鉴定得到，如盘尼西林、万古霉素、平板霉素等。目前从链霉菌Streptomyces sp.M10731中分离得到一个新颖的碳磷化合物，该类化合物是一类含有碳磷键的小分子天然产物。碳磷天然产物应用广泛，在抗生素、除草剂、杀虫剂、细菌及寄生虫的抑制剂等领域有着重要的应用，其成药率是15％，相较于其他天然产物0.1％的成药率来说具有巨大的开发潜力和社会应用价值。因此展开活性碳磷天然产物深入的研究，对发现新结构、新活性的化合物具有重要的意义。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种来源于海洋链霉菌的碳磷化合物。
本发明的第二个目的是提供一种所述来源于海洋链霉菌的碳磷化合物的制备方法。
本发明的第三个目的是提供一种所述来源于海洋链霉菌的碳磷化合物的应用。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明的第一个方面提供了一种海洋链霉菌菌株Streptomyces sp.M10731，已于2019年04月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.17650。
所述海洋链霉菌菌株Streptomyces sp.M10731的培养方法为：
将平板培养基灭菌制成平板，将海洋链霉菌菌株Streptomyces sp.M10731菌种孢子接种于平板培养基，于28℃培养7天，直到产孢丰富且无杂菌污染时可使用，即得到平板菌种。
所述平板培养基由以下成分组成：酵母提取物、麦芽提取物、葡萄糖、琼脂和水；以上成分在所述平板培养基中浓度分别为：酵母提取物4g/L、麦芽提取物10g/L、葡萄糖4g/L和琼脂20g/L；所述平板培养基的pH值为7.2。
所述海洋链霉菌菌株Streptomyces sp.M10731的分离方法如下：
取1.0g土样，来自中国南海深海海拔-2733米的海泥样品，将其放入装有9.0mL无菌水的50mL离心管中，180rpm摇2h，于20KHz、100W功率超声2min；取1.0mL悬浊液，放入装有9.0mL无菌水的50mL离心管中，混匀；取1.0mL悬浊液，放入装有9.0mL无菌水的50mL离心管中，混匀；系列稀释10-3和10-4；盖紧管盖，于100℃保温1h，取0.2mL涂板，将平板放置于28℃培养7天左右，选取菌落清晰且无重叠的平板，根据伯杰氏菌种鉴定手册中链霉菌的菌落外观介绍，粗选出基本符合要求的链霉菌，对选取的单菌落进行菌落摇瓶培养，采用菌株分离培养基培养，培养至观察到实验组组织块边缘有少量菌丝产生，及时采用菌丝尖端挑取法将其转入另一培养平板中培养。
所述菌株分离培养基的配制方法如下：燕麦片20g，人工海水1000mL，小火20min后过滤取滤液，定容到1000mL，加入琼脂粉20g。
本发明的第二个方面提供了一种来源于海洋链霉菌的碳磷化合物，结构如式1所示：
所述碳磷化合物来源于海洋链霉菌菌株Streptomyces sp.M10731，式1所示化合物属于新的含有碳磷键的化合物，未见专利和文献报导。
本发明的第三个方面提供了一种所述来源于海洋链霉菌的碳磷化合物的制备方法，包括以下步骤：
将发酵培养基灭菌后按照体积百分比为5％的接种量将二级种子液接种于所述发酵培养基，于28℃旋转培养7天后收获发酵液，发酵液为容器内的所有物质，采用水提醇沉法纯化发酵液上清，然后依次采用葡聚糖凝胶Sephadex G-10柱层析、葡聚糖凝胶SephadexLH-20柱层析、大孔树脂HP-20柱层析、葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱层析、HPLC分析获得式1所示碳磷化合物。
所述发酵培养基成份：可溶性淀粉5g/L，葡萄糖20g/L，黄豆饼粉10g/L，蛋白胨2g/L，酵母提取物2g/L，氯化钠4g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，七水硫酸镁0.5g/L，碳酸钙2g/L，所述发酵培养基的pH值为7.8。
所述二级种子培养液的制备方法如下：将种子培养基灭菌，按照体积百分比为5％的接种量将一级种子培养液接种到其中，于28℃在旋转摇床旋转培养48小时，得到二级种子液。
所述一级种子培养液的制备方法如下：将种子培养基灭菌，由平板菌种挖块接种，于28℃在旋转摇床旋转培养48小时，得到一级种子液。
所述种子培养基由以下成分组成：酵母提取物、麦芽提取物、葡萄糖、琼脂和水；以上成分在所述种子培养基中浓度分别为：酵母提取物4g/L、麦芽提取物10g/L、葡萄糖4g/L和琼脂20g/L；所述种子培养基的pH值为7.2。
所述水提醇沉法纯化发酵液上清包括以下步骤：
将得到的发酵液在温度为4℃的条件下离心分离收集上清液，将上清液蒸干，加入蒸馏水至所述上清液浓度为100mg/mL，然后加入甲醇进行沉淀处理，使溶液中甲醇的终浓度为75％，分别收集上述甲醇醇沉上清和沉淀，将上清液蒸干，加入蒸馏水至该上清液浓度为100mg/mL，重复上述醇沉步骤两次，最终获得上清液蒸干，测得干重记为Fr.1。
所述葡聚糖凝胶Sephadex G-10柱层析包括以下步骤：
将制备的Fr.1组分溶解于水中，使用交联葡聚糖凝胶Sephadex G-10层析柱分离纯化碳磷化合物，用水做洗脱剂得到7个流份，其中碳磷化合物主要存在于第三个流份中记为Fr.1-1。
所述葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱层析包括以下步骤：
将制备的Fr.1-1溶解于水中，使用交联葡聚糖凝胶Sephadex LH-20层析柱进行分离纯化，使用水做洗脱剂共得到5个流份，碳磷化合物主要存在于第三个以及第四个流份中合并后记为Fr.1-1A。
所述大孔树脂HP-20柱层析包括以下步骤：
将制备的Fr.1-1A溶解于水中，使用大孔树脂HP-20层析柱进行分离纯化，依次使用水、80％的甲醇水溶液以及50％的甲醇水溶液作为洗脱剂，分别回收3个流份，碳磷化合物存在于水为洗脱剂的洗脱液中，记为Fr.1-1A-1。
所述葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱层析包括以下步骤：
将制备的Fr.1-1A-1组分使用交联葡聚糖凝胶Sephadex LH-20层析柱分离纯化碳磷化合物，使用水作为洗脱剂共得到4个流份，碳磷化合物存在于第三个流份中，记为Fr.1-1A-1C。
所述HPLC分析包括以下步骤：
将制备的Fr.1-1A-1C溶解于水中，终浓度为75mg/mL，使用反相HPLC进行化合物1的制备，制备条件为：Thermo Hypercarb色谱柱，4.6*150mm，检测波长254nm，流动相为0.1％的氨水和乙腈；流动相梯度为：0min,0％；10min,7％；30min,45％；30.01min,99％；35min,99％；35.01min,0％；42min,0％；收集保留时间在2min的流出液，获得式1所示碳磷化合物。
本发明的第四个方面提供了一种所述来源于海洋链霉菌的碳磷化合物在制备抗生素药物中的用途。
由于采用上述技术方案，本发明具有以下优点和有益效果：
本发明提供的来源于海洋链霉菌的碳磷化合物属于新的碳磷化合物，所用的微生物发酵方法选择了多产抗生素的海洋链霉菌Streptomyces sp.M10731，提取方法成熟，工艺简便，所得产物产率高，经核磁共振、质谱检测，其结构正确。
本发明提供的来源于海洋链霉菌的碳磷化合物为含有碳磷键的小分子化合物，其为微生物来源的化合物，便于大量制备，生产成本低。
本发明提供的来源于海洋链霉菌的碳磷化合物的制备方法使用醇沉水提、Sephadex LH-20凝胶层析、Sephadex G10凝胶层析、HPLC等方法对式1所示化合物进行分离，使用31P-NMR进行追踪分离过程，该方法简单、高效。
目前，碳磷化合物的商品化概率高达15％，本发明提供的来源于海洋链霉菌的碳磷化合物有望成为药物先导化合物，为药物的筛选奠定基础。
生物材料样品的保藏信息：
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所
保藏日期：2019年04月29日
保藏编号：CGMCC NO.17650
分类命名：链霉菌Streptomyces sp.
附图说明
图1为本发明实施例制备的式1所示碳磷化合物溶于D2O中的1H-NMR(600MHz)谱图。
图2为本发明实施例制备的式1所示碳磷化合物溶于D2O中的13C-NMR(150MHz)谱图。
图3为本发明实施例制备的式1所示碳磷化合物溶于D2O中的31P-NMR谱图。
图4为本发明实施例制备的式1所示碳磷化合物溶于D2O中的1H-31P HMBC谱图。
图5为本发明实施例制备的式1所示碳磷化合物溶于D2O中的1H-1H COSY谱图。
图6为本发明实施例制备的式1所示碳磷化合物溶于D2O中的1H-13C HSQC谱图。
图7为本发明实施例制备的式1所示碳磷化合物溶于D2O中的1H-13C HMBC谱图。
图8为本发明实施例制备的式1所示碳磷化合物溶于D2O中的1H-15N HMBC谱图。
图9为本发明实施例制备的式1所示碳磷化合物溶于D2O中的负离子源下的ESI-MS图。
图10为本发明实施例制备的式1所示碳磷化合物溶于D2O中的正离子源下的ESI-MS图。
图11为海洋链霉菌菌株Streptomyces sp.M10731基于16S rRNA基因序列的系统进化树。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明实施例中可溶性淀粉购自国药集团化学品试剂有限公司，产品目录号为9005-84-9；细菌蛋白胨购自碧迪医疗器械(上海)有限公司，产品目录号为211677；酵母提取物购自北京奥博星生物技术有限责任公司，产品目录号为01-012；麦芽酵母提取物购自北京奥博星生物技术有限责任公司，产品目录号为01-129；葡萄糖购自国药集团化学品试剂有限公司，产品目录号为63005518；氯化钠购自国药集团化学品试剂有限公司，产品目录号为7647-14-5；磷酸氢二钾购自国药集团化学品试剂有限公司，产品目录号为16788-57-1；七水硫酸镁购自国药集团化学品试剂有限公司，产品目录号为10013018；碳酸钙购自国药集团化学品试剂有限公司，产品目录号为471-34-1。
本发明所用的菌种是海洋链霉菌菌株Streptomyces sp.M10731，已于2019年04月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCCNo.17650。
本发明所用试剂的型号、纯度、购买厂家：甲醇(产品编号：011001439，纯度：99.9％，品牌：Adamas，购买厂家：上海泰坦科技股份有限公司)；乙腈(产品编号：01270576，纯度：99.9％，品牌：Adamas，购买厂家：上海泰坦科技股份有限公司)。
实施例1
一、发酵制备式1所示碳磷化合物
1、种子培养
(1)将平板培养基在115℃下灭菌30分钟，制成平板，将海洋链霉菌菌株Streptomyces sp.M10731菌种孢子接种于平板培养基，于28℃培养7天，直到产孢丰富且无杂菌污染时可使用，即得到平板菌种。
所述平板培养基由以下成分组成：酵母提取物、麦芽提取物、葡萄糖、琼脂和水；以上成分在所述平板培养基中浓度分别为(g/L)：酵母提取物4g/L、麦芽提取物10g/L、葡萄糖4g/L和琼脂20g/L。所述平板培养基的pH值为7.2。
所述海洋链霉菌菌株Streptomyces sp.M10731的分离和鉴定方法如下：
菌株来源样品：采自中国南海深海(海拔-2733米)的海泥样品。
菌株分离方法：
湿热稀释涂布法，具体操作方法如下：
取1.0g土样，将其放入装有9.0mL无菌水的50mL离心管中，180rpm摇2h，于20KHz、100W功率超声2min；取1.0mL悬浊液，放入装有9.0mL无菌水的50mL离心管中，混匀；取1.0mL悬浊液，放入装有9.0mL无菌水的50mL离心管中，混匀；系列稀释10-3和10-4；盖紧管盖，于100℃保温1h，取0.2mL涂板，将平板放置于28℃培养7天左右。选取菌落清晰且无重叠的平板，根据伯杰氏菌种鉴定手册中链霉菌的菌落外观介绍，粗选出基本符合要求的链霉菌，对选取的单菌落进行菌落摇瓶培养，采用菌株分离培养基培养，培养至观察到实验组组织块边缘有少量菌丝产生，及时采用菌丝尖端挑取法将其转入另一培养平板中培养。按照伯杰氏手册做理化指标检测，对符合伯杰氏手册理化指标的菌株，进行基因组总DNA的提取，并且通过PCR扩增16S rDNA序列并测序。
菌株分离培养基的配制方法如下：燕麦片20g，人工海水1000mL，小火20min后过滤取滤液，定容到1000mL，加入琼脂粉20g。
菌株保藏方法：于25％甘油冻存管-80℃保藏。
菌株16S rRNA序列测定及其系统发育分析方法如下：
用TINAamp Bacteria DNA Kit试剂盒，按试剂盒说明提取Streptomycessp.M10731的基因组DNA，用通用引物(27f:5’-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；1492r:5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’)对其进行16S rDNA扩序。16S rDNA的PCR扩增反应在TaKaRaPCR Thermal Cycler上进行[25μL扩增体系:0.4μL 20μM引物,2.5μL 10×缓冲液(TaKaRa,中国大连)，2.5μL 2.5nM dNTP(TaKaRa,Dalian,China)，2U rTap聚合酶(TaKaRa，中国大连)，1μL DNA模板]，94℃初次变性5分钟，然后94℃变性1分钟，循环30次，55℃退火1分钟，72℃延伸1分钟15秒，最后72℃延伸10分钟，将PCR扩增产物送测序公司。利用CLSSTAL W序列分析软件对将获得的16S rRNA序列进行多序列比对分析，并利用MEGA6.0软件中的邻接法生成系统发育树，如图11所示，图11为海洋链霉菌菌株Streptomyces sp.M10731基于16S基因序列的系统进化树，步缺值设定：1000。
结果：根据菌落形态特征及16S rRNA基因序列结果表明M10731属于链霉菌属，与模式菌株S.anaadii NRRL B-3590在16S rRNA基因序列相似性达100％。
(2)一级种子培养液：在4个250mL三角玻璃瓶中分别装入40mL种子培养基，于115℃下灭菌30分钟，由平板菌种挖块(1cm*1cm)接种，于28℃在旋转摇床旋转培养(转速为220rpm)48小时，得到一级种子液。
所述种子培养基由以下成分组成：酵母提取物、麦芽提取物、葡萄糖、琼脂和水；
以上成分在所述种子培养基中浓度分别为(g/L)：酵母提取物4g/L、麦芽提取物10g/L、葡萄糖4g/L和琼脂20g/L；所述种子培养基的pH值为7.2。
(3)二级种子培养液：在8个1000mL的三角玻璃瓶中分别装入300mL的种子培养基于115℃下灭菌30分钟，将15mL(按照5％(体积百分比)的接种量)的一级种子培养液接种到其中，于28℃在旋转摇床旋转培养(转速为220rpm)48小时，得到二级种子液。
2、发酵培养
配制发酵培养基(发酵培养基成份：可溶性淀粉5g/L，葡萄糖20g/L，黄豆饼粉10g/L，蛋白胨2g/L，酵母提取物2g/L，氯化钠4g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，七水硫酸镁0.5g/L，碳酸钙2g/L，所述发酵培养基的pH值为7.8)。在1000mL的三角瓶中分装300mL发酵培养基，灭菌(在115℃下灭菌30分钟)后按照5％(体积百分比)的接种量将上述步骤1得到的二级种子液接种于所述发酵培养基，于28℃旋转培养(转速为220rpm)7天后收获发酵液，发酵液为容器内的所有物质。
二、分离式1所示碳磷化合物
1、水提醇沉法纯化发酵液上清
将上述得到的发酵液在温度为4℃的条件下进行离心，8000转/分钟，离心8分钟，收集上清液。将上清液通过旋转蒸发仪回收至干，加入适量蒸馏水至所述上清液浓度为100mg/mL，然后加入甲醇(购自上海泰坦科技股份有限公司)进行沉淀处理，使溶液中甲醇的终浓度为75％，分别收集上述甲醇醇沉上清和沉淀，将上清液通过旋转蒸发仪蒸干，加入适量蒸馏水至该上清液浓度为100mg/mL，重复上述醇沉步骤两次，最终获得含有所述式1所示碳磷化合物的上清液，并通过旋转蒸发仪蒸干后，测得干重为9.4g，记为Fr.1。
2、Fr.1的葡聚糖凝胶Sephadex G-10柱层析
将步骤1制备的所述9.4g Fr.1组分溶解于50mL水中，使用1.3L的交联葡聚糖凝胶Sephadex G-10层析柱(交联葡聚糖凝胶Sephadex G-10，规格：GE healthcare，厂家：北京索莱宝；Sephadex G-10层析柱：货号C184264CT026，厂家：北京欣维尔玻璃仪器有限公司)分离纯化碳磷化合物，用水做洗脱剂，洗脱剂的流速为8秒/滴，得到7个流份，其中碳磷化合物主要存在于第三个流份中(873.9mg)，记为Fr.1-1，其他流份中含有少量的碳磷化合物(612.2mg)，合并后记为Fr.1-2。
3、Fr.1-1的葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱层析
将步骤2制备的所述873.9mg Fr.1-1溶解于1mL水中，使用400mL的交联葡聚糖凝胶Sephadex LH-20层析柱(交联葡聚糖凝胶Sephadex LH-20，厂家：北京索莱宝；SephadexLH-20层析柱：规格C184264CT026，厂家北京欣维尔玻璃仪器有限公司)进行分离纯化，使用水做洗脱剂，洗脱剂的流速为7秒/滴，共得到5个流份，碳磷化合物主要存在于第三个以及第四个流份中(共计593.9mg)，合并后记为Fr.1-1A。第二个流份中含有少量的碳磷化合物(47.8mg)，记为Fr.1-1B。
4、Fr.1-1A的大孔树脂HP-20柱层析
将步骤3制备的所述Fr.1-1A溶解于4mL水中，使用30mL大孔树脂HP-20层析柱(大孔树脂购自北京慧德易科技有限公司；层析柱：规格C184264CT026，厂家：北京欣维尔玻璃仪器有限公司)进行分离纯化，依次使用90mL水、80％的甲醇水溶液以及50％的甲醇水溶液作为洗脱剂，洗脱剂的流速为2秒/滴，分别回收3个流份，碳磷化合物存在于水为洗脱剂的洗脱液中，记为Fr.1-1A-1。
5、Fr.1-1A-1的葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱层析
将步骤4制备的所述Fr.1-1A-1组分使用400mL交联葡聚糖凝胶Sephadex LH-20层析柱分离纯化碳磷化合物(交联葡聚糖凝胶Sephadex LH-20，厂家：北京索莱宝；SephadexLH-20层析柱：规格C184264CT026，厂家北京欣维尔玻璃仪器有限公司)，使用水作为洗脱剂，洗脱剂的流速为7秒/滴，共得到4个流份，碳磷化合物存在于第三个流份中(75.2mg)，记为Fr.1-1A-1C。
6、式1所示碳磷化合物的制备
将步骤5制备的所述Fr.1-1A-1C溶解于1.002mL水中，终浓度为75mg/mL，使用反相HPLC进行化合物1的制备，制备条件为：Thermo Hypercarb色谱柱，4.6*150mm，检测波长254nm，流动相为0.1％的氨水和乙腈。流动相梯度为：0min,0％；10min,7％；30min,45％；30.01min,99％；35min,99％；35.01min,0％；42min,0％。收集保留时间在2min的流出液，获得式1所示碳磷化合物。
三、鉴定式1所示碳磷化合物
将上述得到的式1所示碳磷化合物进行鉴定：
1、质谱：如图9和图10所示，图9为本发明实施例制备的式1所示碳磷化合物溶于D2O中的负离子源下的ESI-MS图，图10为本发明实施例制备的式1所示碳磷化合物溶于D2O中的正离子源下的ESI-MS图。图9是式1所示碳磷化合物在负离子源下的质谱图，显示其[M-H]-峰为m/z 210.0，图10是式1所示碳磷化合物在正离子源下的质谱图，显示其[M+H]+峰为m/z 212.0，质谱图采集是使用Agilent HPLC 1100/MS G1956B。
2、核磁共振谱：如图1～3所示，图1为本发明实施例制备的式1所示碳磷化合物溶于D2O中的1H-NMR(600MHz)谱图，图2为本发明实施例制备的式1所示碳磷化合物溶于D2O中的13C-NMR(150MHz)谱图，图3为本发明实施例制备的式1所示碳磷化合物溶于D2O中的31P-NMR谱图，根据化合物的1H-NMR、13C-NMR、31P-NMR、1H-31P HMBC(下面结构式中位置3-P)(如图4所示，图4为本发明实施例制备的式1所示碳磷化合物溶于D2O中的1H-31P HMBC谱图。)，1H-1H COSY下面结构式中位置2、3、4(如图5所示，图5为本发明实施例制备的式1所示碳磷化合物溶于D2O中的1H-1H COSY谱图。)，1H-13C HSQC(如图6所示，图6为本发明实施例制备的式1所示碳磷化合物溶于D2O中的1H-13C HSQC谱图。)和HMBC(如图7和图8所示，图7为本发明实施例制备的式1所示碳磷化合物溶于D2O中的1H-13C HMBC谱图。图8为本发明实施例制备的式1所示碳磷化合物溶于D2O中的1H-15N HMBC谱图。)(下面结构式中位置2和5、4和5、3和5)，对式1所示碳磷化合物的核磁共振谱进行了研究并对13C信号进行了归属，见表1所示，并最终确定其结构如下：
表1式1所示碳磷化合物的NMR各峰归属
式1所示碳磷化合物的NMR测试采用Bruker 600MHz(1H 600MHz；13C 150MHz)。溶剂为D2O。
本发明提供的式1所示碳磷化合物，属于新的碳磷化合物，未见专利和文献报导。
式1所示碳磷化合物的用途：式1所述化合物为碳磷化合物，碳磷小分子天然产物的成药率为15％，式1所述化合物有望成为新型抗生素。
以上所述仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专利的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述提示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明方案的范围内。
Claims (5)
1.一种海洋链霉菌菌株Streptomycessp.M10731，已于2019年04月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.17650。
2.根据权利要求1所述的海洋链霉菌菌株Streptomycessp.M10731，其特征在于：所述海洋链霉菌菌株Streptomycessp.M10731的培养方法为：
将平板培养基灭菌制成平板，将海洋链霉菌菌株Streptomycessp.M10731菌种孢子接种于平板培养基，于28℃培养7天，直到产孢丰富且无杂菌污染时可使用，即得到平板菌种。
3.根据权利要求2所述的海洋链霉菌菌株Streptomycessp.M10731，其特征在于：所述平板培养基由以下成分组成：酵母提取物、麦芽提取物、葡萄糖、琼脂和水；以上成分在所述平板培养基中浓度分别为：酵母提取物4g/L、麦芽提取物10g/L、葡萄糖4g/L和琼脂20g/L；所述平板培养基的pH值为7.2。
4.一种利用权利要求 1 所述海洋链霉菌菌株Streptomycessp.M10731制备碳磷化合物的方法，包括以下步骤：
将发酵培养基灭菌后按照体积百分比为5％的接种量将二级种子液接种于所述发酵培养基，于28℃旋转培养7天后收获发酵液，发酵液为容器内的所有物质，采用水提醇沉法纯化发酵液上清，然后依次采用葡聚糖凝胶Sephadex G-10柱层析、葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱层析、大孔树脂HP-20柱层析、葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱层析、HPLC分离获得目标物；
其中，所述碳磷化合物为式1所示化合物：
所述发酵培养基成份：可溶性淀粉5g/L，葡萄糖20g/L，黄豆饼粉10g/L，蛋白胨2g/L，酵母提取物2g/L，氯化钠4g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，七水硫酸镁0.5g/L，碳酸钙2g/L，所述发酵培养基的pH值为7.8；
所述二级种子液的制备方法如下：
将种子培养基灭菌，按照体积百分比为5％的接种量将一级种子培养液接种到其中，于28℃在旋转摇床旋转培养48小时，得到二级种子液；
所述一级种子培养液的制备方法如下：
将种子培养基灭菌，由平板菌种挖块接种，于28℃在旋转摇床旋转培养48小时，得到一级种子培养液。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，其中种子培养基由以下成分组成：
酵母提取物、麦芽提取物、葡萄糖、琼脂和水；以上成分在所述种子培养基中浓度分别为：酵母提取物4g/L、麦芽提取物10g/L、葡萄糖4g/L和琼脂20g/L；所述种子培养基的pH值为7.2。
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