CN102786528B - 一种多氧生物碱类化合物及其制备和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及抑藻剂、杀虫剂和抑菌剂领域,具体地说是一种海藻内生真菌来源的多氧生物碱类化合物及其制备和应用。具体结构式如(I)所示,其制备方法为将米曲霉(Aspergillus oryzae)cf-2接种于真菌液体培养基中发酵培养,发酵产物纯化后,即为式(I)所示的多氧生物碱类化合物。本发明获得的多氧生物碱类化合物,经抑藻活性实验得出化合物半数抑制浓度为13.0微克/毫升,同时该化合物还具有杀虫和抑菌活性。
Description
技术领域
本发明涉及抑藻剂、杀虫剂和抑菌剂领域,具体地说是一种海藻内生真菌来源的多氧生物碱类化合物及其制备和应用。
背景技术
随着国民经济的快速发展,海洋污染问题日益加剧,特别是富营养化程度的提高,导致有害赤潮频繁发生,对海洋环境、海洋生物和沿海养殖业带来了严重的危害,因此,发展有害赤潮微藻抑制剂具有重要的应用价值。
二十世纪以来,化学合成农药的大量使用对水体和土壤带来了严重的污染,超过2/3的农药直接渗透到环境中,残留非常严重,对生物和人类健康都造成直接和潜在的危害。与化学合成农药相比,生物源农药具有环境兼容性好,不易产生抗性等优点,其开发应用对人类健康、环境保护和农业的可持续发展都具有极其重要的意义。
细菌性疾病仍然是人类和其它生物重要的疾病类型。由于致病性细菌的变异速度比较快,并不断产生抗药性等,开发新型细菌抑制剂依然十分迫切。
发明内容
本发明的目的是提供一种多氧生物碱类化合物及其制备和应用。
为实现上述目的,本发明采用的技术方案为:
一种多氧生物碱类化合物,多氧生物碱类化合物如式(I)所示
多氧生物碱类化合物的制备方法,将米曲霉(Aspergillus oryzae)cf-2接种于真菌液体培养基中发酵培养,发酵产物纯化后,即为式(I)所示的多氧生物碱类化合物,所述米曲霉(Aspergillus oryzae)cf-2,其于2010年3月1日保存于中国典型培养物保藏中心CCTCC,保藏编号为CCTCC M2010045
具体制备步骤:
1)将米曲霉(Aspergillus oryzae)cf-2接种于真菌液体培养基中静止发酵10-60天,过滤,发酵液经乙酸乙酯萃取浓缩,收集的菌丝体用有机溶剂提取,而后再经乙酸乙酯萃取浓缩,发酵液所得浓缩物和菌丝体所得浓缩物合并,即为粗提物;
所述米曲霉(Aspergillus oryzae)cf-2,其于201O年3月1日保存于中国典型培养物保藏中心CCTCC,保藏编号为CCTCC M2010045,株号为cf-2:
2)取步骤1)中的粗提物进行硅胶柱层析,用有机溶剂进行梯度洗脱,收集洗脱液,洗脱液经薄层层析检测;
3)收集步骤2)中以洗脱液体积比3-0∶1梯度的洗脱组分,将收集的洗脱组分进行凝胶柱层析、硅胶柱层析和薄层层析分离纯化,纯化收集Rf值为0.5-0.6组分,即得如式(I)所示的多氧生物碱类化合物。
步骤1)中的有机溶剂提取液为庚烷、己烷、戊烷、氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、异丙醇、丙醇、乙醇或甲醇中一种或几种,所述几种物质组合时任意比例。
步骤2)中的有机溶剂为石油醚-乙酸乙酯、氯仿-乙酸乙酯、石油醚-丙酮、氯仿-丙酮或氯仿-甲醇。
步骤3)所述凝胶柱层析洗脱液为体积比0-2∶1的氯仿-甲醇或氯仿-乙醇;硅胶柱层析洗脱液为体积比3-1∶1的石油醚-乙酸乙酯;薄层层析展开剂为体积比为2-0∶1的氯仿-乙酸乙酯或石油醚-乙酸乙酯。
步骤3)所述凝胶柱和硅胶柱层析时收集淡黄色斑点的组分。
多氧生物碱类化合物的应用,所述多氧生物碱类化合物用于制备抑藻剂、杀虫剂或抑菌剂。
所述多氧生物碱类化合物用于制备抑制赤潮异湾藻的制剂。所述多氧生物碱类化合物用于制备卤虫的杀虫制剂。所述多氧生物碱类化合物用于制备奇异变形杆菌或阴沟肠杆菌的杀菌制剂。
本发明具有以下优点:本发明通过分离于海洋红藻异管藻的米曲霉(Aspergillus oryzae)cf-2发酵经提取、分离获得的多氧生物碱类化合物,经抑藻活性实验得出化合物半数抑制浓度为13.0微克/毫升,同时该化合物还具有杀虫和抑菌活性。
具体实施方式
下面结合实施实例对本发明做进一步阐述。
实施例1
海藻内生真菌来源的多氧生物碱类化合物如式(I)所示。
实施例2
如式(I)所示的生物碱类化合物的制备方法:
取平板上生长良好的真菌米曲霉(Aspergillus oryzae)cf-2菌种,切成小块接种于PDB液体培养基中,每1L三角瓶中放300mL培养基,共30瓶,室温静止发酵23天,加入发酵液二分之一体积的乙酸乙酯杀灭真菌,过滤,分别收集菌丝体和发酵液。所述PDB液体培养基组成为每升含土豆汁200毫升,葡萄糖20克,蛋白胨5克,酵母膏3克,陈海水500毫升,蒸馏水300毫升。真菌米曲霉(Aspergillus oryzae)cf-2菌种2010年3月1日保存于中国典型培养物保藏中心CCTCC,保藏编号为CCTCC M2010045,分类命名:Aspergillus oryzae,株号为cf-2;
收集发酵液约9L,用乙酸乙酯萃取三次,减压浓缩;菌丝体粉碎后用体积比1:1的氯仿-甲醇提取三次,再用乙酸乙酯萃取,减压浓缩;浓缩物经薄层层析检测(石油醚-乙酸乙酯20-0:1,硫酸-茴香醛显色)其结果相似,合并发酵液和菌丝体两部分的浓缩物为粗提物8.0g。
将粗提物进行200-300目的硅胶柱层析,用石油醚-乙酸乙酯以体积比100:0,50:1,20:1,10:1,5:1,2:1到0:100的梯度进行洗脱,分别收集洗脱液,再用薄层层析(TLC)检测(石油醚-乙酸乙酯20-0:1,茴香醛-硫酸作为显色剂),根据Rf值来判断、合并相同或类似部分,获得22个组分(1-22)。
将组分18即以石油醚-乙酸乙酯2:1梯度洗脱下的组分再进行凝胶柱、硅胶柱和薄层层析分离。凝胶柱层析时洗脱液用体积比1:1的氯仿-甲醇,TLC检测(乙酸乙酯,硫酸-茴香醛显色),收集淡黄色斑点的组分;硅胶柱层析洗脱液为体积比2:1的石油醚-乙酸乙酯,TLC检测(乙酸乙酯,硫酸-茴香醛显色),收集淡黄色斑点的组分;薄层层析用乙酸乙酯为展开剂,收集Rf值为0.5-0.6的组分,得式(I)所示化合物(12.6毫克),经TLC检测(乙酸乙酯,硫酸-茴香醛显色),呈单个、均匀淡黄色斑点,确定为纯化合物。经波谱分析,其结构鉴定为一种新的生物碱,结构式如(I)所示。
该化合物具有以下理化和波谱特性:
无色胶状,比旋光度[α]26 D-91.6°(c0.04,MeOH);;核磁共振氢谱(1H-NMR,CDCl3,500MHz)δH2.91,d(15.7),3.10,d(15.7),5.14,d(13.5),6.21,d(13.5),5.58,d(7.4),5.96,m,5.96,m,2.30,s,2.21,s,3.13,s,3.81,d(11.4),4.30,d(11.4),2.11,s;核磁共振碳谱(13C-NMR,CDCl3,125MHz)δC166.4,qC,72.5,qC,72.8,qC,40.2,CH2,133.9,qC,65.4,CH,75.3,CH,127.9,CH,125.3,CH,119.8,CH,15.0,CH3,13.0,CH3,28.7,CH3,164.5,qC,63.7,CH2,170.7,qC,21.3,CH3;高分辨质谱(HREIMS)[M]+m/z366.1422,计算值366.1427。
实施例3
与实施例2不同之处在于
取平板上生长良好的真菌米曲霉(Aspergillus oryzae)cf-2菌种接种于JY液体培养基中,每1L三角瓶中放300mL培养基,共50瓶,室温静止发酵30天,加入发酵液二分之一体积乙酸乙酯杀灭真菌,过滤,分别收集菌丝体和发酵液。所述JY液体培养基组成为每升含菊芋块茎汁500毫升,葡萄糖10克,硝酸钠2.0克,陈海水500毫升。
收集发酵液约15L,用乙酸乙酯萃取三次,减压浓缩;菌丝体粉碎后用乙醇提取三次,再用乙酸乙酯萃取,减压浓缩;浓缩物经薄层层析检测(石油醚-乙酸乙酯20-0:1,硫酸-茴香醛显色)其结果相似,合并发酵液和菌丝体两部分的浓缩物为粗提物14.0g。
将粗提物进行100-200目的硅胶柱层析,用石油醚-丙酮以体积比100:0,50:1,20:1,10:1,5:1,2:1到0:100的梯度进行洗脱,分别收集洗脱液,再用薄层层析(TLC)检测(石油醚-乙酸乙酯20-0:1,硫酸-茴香醛显色),根据Rf值来判断、合并相同或类似部分,获得22个组分(1-22)。
将组分18即以石油醚-丙酮2:1梯度洗脱下的组分再进行凝胶柱、硅胶柱和薄层层析分离。凝胶柱层析时洗脱液用体积比2:1的氯仿-甲醇,TLC检测(乙酸乙酯,硫酸-茴香醛显色),收集淡黄色斑点的组分;硅胶柱层析洗脱液为体积比2:1的石油醚-乙酸乙酯,TLC检测(乙酸乙酯,硫酸-茴香醛显色),收集淡黄色斑点的组分;薄层层析用乙酸乙酯为展开剂,收集Rf值为0.5-0.6的组分,得式(I)所示的多氧生物碱类化合物。
实施例4
赤潮微藻抑制实验:
取指数生长期的赤潮异湾藻,用已灭菌的f/2培养基,稀释至一定初始藻细胞密度(5×104个/mL)的实验藻液,备用。将待测试化合物溶于二甲基亚砜(DMSO)制备成母液,备用。Costar96孔板每孔最终试验体积为200微升,由199微升藻液和1微升待测样品溶液构成,实验藻液中DMSO最终浓度为0.5%,每个浓度设定三个平行样,培养期间每日震荡3次,每隔24小时在显微镜下用血球计数板(或浮游生物计数框)进行藻细胞计数观察,测定藻细胞的浓度(个/mL),计算24h的EC50值。
实验结果:上述实施例中的获得的生物碱类化合物对赤潮异湾藻的半数抑制浓度为13.0微克/毫升。
实施例5
杀虫活性实验:
卤虫卵的孵化:取卤虫卵100毫克置于500毫升烧杯中,加入人工海水400毫升,用一小充气泵缓缓充气,室温孵化24小时,除去卵壳及未孵化的卵,卤虫幼虫继续培养24小时,备用。
卤虫生物致死法:依照Solis的改良法,取96孔细胞培养板,每孔加190微升含10个左右卤虫幼虫的人工海水液,制成测试培养板。空白对照组和每个浓度的样品组各设三个平行孔,空白对照组加10微升溶剂二甲基亚砜(DMSO),样品组加10微升式(I)所示的二倍半萜类化合物的溶液(DMSO为溶剂)。室温培养24小时后,在双目解剖镜下检测计数卤虫死亡个体数目。
卤虫生物致死活性以校正死亡率表示,计算公式如下:
校正死亡率=(对照组存活率-处理组存活率)/对照组存活率×100%
实验结果:上述实施例中的获得的生物碱类化合物在80微克/毫升时对卤虫的致死率为100%,半数致死浓度为10.5微克/毫升。
实施例6
抑菌活性实验:
具体为:实验所用的细菌培养基为LB培养基,分别用无菌棉签浸取奇异变形杆菌和阴沟肠杆菌的菌悬液,均匀涂于培养基上,测试样品溶解于DMSO中,浓度为6.0毫克/毫升,取5微升样品加到直径为5毫米的无菌滤纸片上(每片30微克);并用加有相同体积DMSO的滤纸片做阴性对照,用氯霉素作为抗细菌的阳性对照,各三个平行。加有样品的平板培养基置于28℃静置培养24小时,观察实验结果,出现抑菌圈的测量其抑菌圈直径。
实验结果:上述获得的生物碱化合物对奇异变形杆菌和阴沟肠杆菌的抑菌圈直径分别为8.0毫米和6.0毫米,具有抑制奇异变形杆菌和阴沟肠杆菌的活性。
Claims (3)
2.一种权利要求1所述的多氧生物碱类化合物的制备方法,其特征在于:将米曲霉(Aspergillus oryzae)cf-2接种于真菌液体培养基中发酵培养,发酵产物纯化后,即为式(I)所示的多氧生物碱类化合物,所述米曲霉(Aspergillus oryzae)cf-2,其于2010年3月1日保存于中国典型培养物保藏中心CCTCC,保藏编号为CCTCC M2010045
具体制备步骤:
1)将米曲霉(Aspergillus oryzae)cf-2接种于真菌液体培养基中静止发酵10-60天,过滤,发酵液经乙酸乙酯萃取浓缩,收集的菌丝体用有机溶剂提取,而后再经乙酸乙酯萃取浓缩,发酵液所得浓缩物和菌丝体所得浓缩物合并,即为粗提物;
所述有机溶剂提取液为氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、异丙醇、丙醇、乙醇或甲醇中一种或几种;
2)取步骤1)中的粗提物进行硅胶柱层析,用有机溶剂进行梯度洗脱,收集洗脱液,洗脱液经薄层层析检测;
所述有机溶剂为石油醚-乙酸乙酯、氯仿-乙酸乙酯、石油醚-丙酮、氯仿-丙酮或氯仿-甲醇;
3)收集步骤2)中以洗脱液体积比3-0:1梯度的洗脱组分,将收集的洗脱组分进行凝胶柱层析、硅胶柱层析和薄层层析分离纯化,纯化收集Rf值为0.5-0.6组分,即得如式(I)所示的多氧生物碱类化合物;
所述凝胶柱层析洗脱液为体积比0-2:1的氯仿-甲醇或氯仿-乙醇;硅胶柱层析洗脱液为体积比3-1:1的石油醚-乙酸乙酯;薄层层析展开剂为体积比为2-0:1的氯仿-乙酸乙酯或石油醚-乙酸乙酯;
所述凝胶柱和硅胶柱层析时收集淡黄色斑点的组分。
3.一种权利要求1所述的多氧生物碱类化合物的应用,其特征在于:所述多氧生物碱类化合物用于制备抑制赤潮异湾藻的制剂、卤虫的杀虫制剂、奇异变形杆菌或阴沟肠杆菌的杀菌制剂。
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