CN107099463A - 曲霉ZL01b‑14 - Google Patents

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邓贤明
徐庆妍
湛莹
亓双
王跃宙
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Abstract

曲霉ZL01b‑14，涉及曲霉。曲霉(Aspergillus sp.)ZL01b‑14已于2014年12月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏中心保藏编号为CCTCC NO：M 2014668。从一株海藻共附生曲霉中可分离得到4个结构新颖的四环曲霉酮类化合物，细胞水平的抗炎实验表明这四个化合物具有抗炎作用，可在制备治疗抗炎症药物和抗炎症药物组合物中应用，另外，所制备的四环曲霉酮化合物还可在制备生物活性药物先导物中应用。

Description

曲霉ZL01b-14
技术领域
本发明涉及曲霉，尤其是涉及曲霉(Aspergillus sp.)ZL01b-14。
背景技术
炎症反应是机体免疫反应的一部分，是血管或组织对损伤或病原体等有害刺激的局部反应。炎症反应的主要症状有发热、疼痛、肿胀、泛红以及机体功能的丧失等，对患者的生活质量有不同程度的影响。炎症导致风湿性关节炎、炎症性肠病、神经退化性疾病、脓毒性休克、动脉粥样硬化等疾病相关[1]，局部慢性炎症反应还可诱发机体癌变[2]。
目前，抗炎药物的作用机制多种多样，如阻断与炎症有关的前列腺素合成的关键酶环加氧酶-2(COX-2)的作用，或抑制炎症因子如肿瘤坏死因子-α、白细胞介素(IL)、一氧化氮(NO)、自由基等毒性分子的诱导表达[3-5]等。广泛使用的抗炎药主要分为两类：一种是非甾体抗炎药(NSAIDs)，如双氯芬酸、布洛芬、吲哚美辛、萘普生等；另一种是COX-2的选择性抑制剂昔布类，如塞来昔布、依托昔布等[6]。这两类药物在减轻炎症病痛的同时，都存在较强的副作用，如长期服用NSAIDs会导致肠胃糜烂或溃疡以及各种心血管疾病[7]，昔布类药物对凝血功能和肾功能都有影响。
天然产物是一类来源于动物、植物、微生物等生物体的次级代谢产物，因其复杂多样的化学结构以及各种各样的生物活性，始终在新药研发中占有举足轻重的地位。海洋微生物特殊的生存环境，为代谢多样性提供了可能，因此是产生结构新颖、活性多样的天然产物的重要来源。海洋微生物代谢的天然产物，为开发新型治疗效果好、毒副作用低的抗炎药物或其他生物活性药物提供了重要资源。
参考文献：
1.Maranhao,R.C.and A.C.A.Leite,Development of Anti-AtherosclerosisTherapy Based on the Inflammatory and Proliferative Aspects of the Disease[J].Curr.Pharm.Des.,2015.21(9):p.1196-1204.
2.Schwartsburd,P.M.,Chronic inflammation as inductor of pro-cancermicroenvironment:Pathogenesis of dysregulated feedback control[J].CancerMetastasis Rev.,2003.22(1):p.95-102.
3.Warner,T.D.,et al.,Nonsteroid drug selectivities for cyclo-oxygenase-1rather than cyclo-oxygenase-2are associated with humangastrointestinal toxicity:a full in vitro analysis[J].Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,1999.96(13):p.7563-7568.
4.Huang,X.-s.,et al.,Inhibitory effect of momordicin on inflammatoryfactors generation by preventing nuclear translocation of nuclear factor-kappa B[J].Zhongguo Dongmai Yinghua Zazhi,2013.21(7):p.583-588.
5.Matsui,T.,et al.,Hypothermia at 35℃Reduces the Time-DependentMicroglial Production of Pro-inflammatory and Anti-inflammatory Factors thatMediate Neuronal Cell Death[J].Neurocrit.Care,2014.20(2):p.301-310.
6.Shaikh,S.R.and G.M.Nazeruddin,Multi component reactions and non‐steroidal anti‐inflammatory drugs[J].J.Chem.Pharm.Res.,2014.6(12):p.505‐534,30pp.
7.Al‐Turki,D.A.,et al.,Therapeutic and toxic effects of new NSAIDsand related compounds:a review and prospective study[J].Int.J.Pharmacol.,2010.6(6):p.813‐825.
发明内容
本发明的目的是提供曲霉(Aspergillus sp.)ZL01b-14。
所述曲霉(Aspergillus sp.)ZL01b-14已于2014年12月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，邮编：430072，保藏中心保藏编号为CCTCC NO：M2014668。
从一株海藻共附生曲霉中可分离得到4个结构新颖的四环曲霉酮类化合物，细胞水平的抗炎实验表明这四个化合物具有抗炎作用，可在制备治疗抗炎症药物和抗炎症药物组合物中应用，另外，本发明所制备的四环曲霉酮化合物还可在制备生物活性药物先导物中应用。
所述四环曲霉酮类化合物包括四个曲霉酮化合物，即四环曲霉酮A、四环曲霉酮B、四环曲霉酮C和四环曲霉酮D；
四环曲霉酮A的分子式为C22H26O9，分子量为434.16，手性碳的绝对构型为5aS、6R、6aR、10aR、11R、11aR；
四环曲霉酮B的分子式为C22H28O8，分子量为420.18，手性碳的绝对构型为5aS、6R、6aR、10aR、11R、11aR；
四环曲霉酮C的分子式为C21H24O9，分子量为420.14，手性碳的绝对构型为5aS、6R、6aR、10aR、11R、11aR；
四环曲霉酮D的分子式为C22H28O9，分子量为436.46，手性碳的绝对构型为5aS、6S、6aR、10aR、11R、11aS、12R；
四环曲霉酮A、四环曲霉酮B、四环曲霉酮C和四环曲霉酮D的化学结构式如下：
所述四环曲霉酮类化合物的制备方法，包括以下步骤：
1)制备马铃薯-葡萄糖-琼脂半海水培养基平板，将曲霉(Aspergillus sp.)ZL01b-14转接到马铃薯-葡萄糖-琼脂半海水培养基平板上，倒置培养得平板菌种；
所述马铃薯-葡萄糖-琼脂半海水培养基的配制方法可为：将去皮的马铃薯切成小块，加水煮沸20～40min，纱布过滤得马铃薯滤液，加入葡萄糖、琼脂和半海水，加水定容至1000mL，灭菌条件为121℃下灭菌20min；所述马铃薯滤液中葡萄糖与马铃薯的质量比可为1∶(10～20)，所述琼脂与马铃薯的质量比可为1∶(15～20)。
2)将步骤1)得到的平板菌种接种于马铃薯-葡萄糖半海水液体培养基中摇床培养，得种子液；
所述马铃薯-葡萄糖半海水液体培养基的配制方法可为：将去皮的马铃薯切成小块，加水煮沸20～40min，纱布过滤得马铃薯滤液，加入葡萄糖和半海水，加水定容至1000mL，灭菌条件为121℃下灭菌20min；所述马铃薯滤液中葡萄糖与马铃薯的质量比可为1∶(10～20)；所述摇床培养的条件可为27～28℃，160～180rpm，培养的时间为4～6天。
3)将步骤2)所得种子液转接到发酵培养基中，倒置发酵后得发酵培养物；
所述发酵培养基可采用马铃薯-葡萄糖-琼脂-20％NaCl培养基，马铃薯-葡萄糖-琼脂-20％NaCl培养基的配制方法可为：将去皮的马铃薯切成小块，加水煮沸20～40min，纱布过滤得马铃薯滤液，加入葡萄糖、NaCl和琼脂，加水定容至1000mL，灭菌条件为121℃下灭菌20min，所述马铃薯滤液中的葡萄糖与马铃薯的质量比可为1∶(10～20)，琼脂与马铃薯的质量比可为1∶(15～20)，马铃薯与NaCl的质量比可为1∶(0.5～1.5)。
4)将步骤3)得到的发酵培养物用混合有机溶剂浸提，将提取液减压浓缩至干，甲醇溶解后过滤，滤液再减压浓缩至干得浸膏，浸膏用乙酸乙酯和水萃取至乙酸乙酯相无色，收集乙酸乙酯相减压浓缩至干得粗提物浸膏，再用甲醇和石油醚萃取至石油醚相无色，收集甲醇相减压浓缩至膏状，然后用甲醇溶解，过滤后再次减压浓缩，得浓缩粗提物浸膏；
所述混合有机溶剂可采用乙酸乙酯/甲醇/甲酸，乙酸乙酯、甲醇、甲酸的体积比可为80∶15∶5；所述乙酸乙酯和水的体积比可为1∶1，甲醇和石油醚的体积比可为1∶1；各次减压浓缩的温度均可为45℃。
5)将步骤4)得到的浓缩粗提物浸膏进行反相中压液相柱层析，以甲醇/水连续梯度洗脱得组分1和组分2，组分1经两次凝胶柱层析和一次半制备型高压液相色谱得四环曲霉酮A和四环曲霉酮B；组分2经一次凝胶柱层析和一次半制备型高压液相色谱得四环曲霉酮C和四环曲霉酮D。
所述甲醇/水连续梯度洗脱的比例变化按体积比可为0/100到100/0；
所述组分1经两次凝胶柱层析和一次半制备型高压液相色谱中的两次凝胶柱层析可采用Sephadex LH-20，洗脱剂分别为甲醇和丙酮/甲醇，丙酮与甲醇的体积比可为4∶1，一次半制备高压液相色谱的洗脱条件可为60％甲醇；
所述组分2经一次凝胶柱层析和一次半制备型高压液相色谱中的凝胶柱层析可采用Sephadex LH–20，洗脱剂为丙酮/甲醇，丙酮与甲醇的体积比可为4∶1，一次半制备高压液相色谱的洗脱剂可为45％甲醇。
采用MTS[3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名噻唑蓝]法，检测所制备的4个四环曲霉素的细胞毒性，四环曲霉酮A、B、C和D在抑制细菌脂多糖诱导的RAW264.7细胞炎症反应中的应用。通过检测细胞前炎症因子的浓度变化，从而判明四环曲霉酮A、B、C和D是否可以抑制RAW264.7细胞炎症反应。实验结果表明：四环曲霉酮可抑制细菌脂多糖诱导的RAW264.7细胞的炎症反应。四环曲霉酮在制备治疗风湿性关节炎、炎症性肠病、神经退化性疾病和脓毒性休克等由促炎症因子介导的炎症性疾病药物中具有广泛的应用。由此可见，所述四环曲霉酮类化合物可在制备抗炎症药物中应用，所述炎症包括但不限于风湿性关节炎、炎症性肠病、神经退化性疾病和脓毒性休克等由促炎症因子介导的炎症。
所述抗炎症药物还包括以四环曲霉酮A、B、C和D作为有效成分并含有常规药用载体的药物组合物。
本发明从一株海藻共附生曲霉中分离得到的4个结构新颖的四环曲霉酮类化合物，细胞水平的抗炎实验表明这四个化合物具有抗炎作用，可在制备治疗抗炎症药物和抗炎症药物组合物中应用，另外，本发明所制备的四环曲霉酮化合物还可在制备生物活性药物先导物中应用。
附图说明
图1为四环曲霉酮A的X-ray晶体衍射结构图。
图2为四环曲霉酮A对炎症因子IL-6的抑制效果。
图3为四环曲霉酮A对炎症因子IL-1β的抑制效果。
图4为四环曲霉酮D对炎症因子IL-6的抑制效果。
图5为四环曲霉酮D对炎症因子IL-1β的抑制效果。
图6为四环曲霉酮B对NO的抑制效果。
图7为四环曲霉酮B对炎症因子TNF-α的抑制效果。
图8为四环曲霉酮C对NO的抑制效果。
图9为四环曲霉酮C对炎症因子TNF-α的抑制效果。
具体实施方式
以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。
所述四环曲霉酮类化合物包括四个曲霉酮化合物，即四环曲霉酮A、四环曲霉酮B、四环曲霉酮C和四环曲霉酮D；
四环曲霉酮A的分子式为C22H26O9，分子量为434.16，手性碳的绝对构型为5aS、6R、6aR、10aR、11R、11aR；
四环曲霉酮B的分子式为C22H28O8，分子量为420.18，手性碳的绝对构型为5aS、6R、6aR、10aR、11R、11aR；
四环曲霉酮C的分子式为C21H24O9，分子量为420.14，手性碳的绝对构型为5aS、6R、6aR、10aR、11R、11aR；
四环曲霉酮D的分子式为C22H28O9，分子量为436.46，手性碳的绝对构型为5aS、6S、6aR、10aR、11R、11aS、12R；
四环曲霉酮A、四环曲霉酮B、四环曲霉酮C和四环曲霉酮D的化学结构式如下：
所述四环曲霉酮类化合物的制备方法，包括以下步骤：
1)制备马铃薯-葡萄糖-琼脂半海水培养基平板，将曲霉(Aspergillus sp.)ZL01b-14转接到马铃薯-葡萄糖-琼脂半海水培养基上，倒置培养得平板菌种；所述马铃薯-葡萄糖-琼脂半海水培养基的配制方法可为：将去皮的马铃薯切成小块，加水煮沸20～40min，纱布过滤得马铃薯滤液，加入葡萄糖、琼脂和半海水，加水定容至1000mL，灭菌条件为121℃下灭菌20min；所述马铃薯滤液中葡萄糖与马铃薯的质量比可为1∶(10～20)，所述琼脂与马铃薯的质量比可为1∶(15～20)。
2)将步骤1)得到的平板菌种接种于马铃薯-葡萄糖半海水液体培养基中摇床培养，得种子液；所述马铃薯-葡萄糖半海水液体培养基的配制方法可为：将去皮的马铃薯切成小块，加水煮沸20～40min，纱布过滤得马铃薯滤液，加入葡萄糖和半海水，加水定容至1000mL，灭菌条件为121℃下灭菌20min；所述马铃薯滤液中葡萄糖与马铃薯的质量比可为1∶(10～20)；所述摇床培养的条件可为27～28℃，160～180rpm，培养的时间为4～6天。
3)将步骤2)所得种子液转接到发酵培养基中，倒置发酵后得发酵培养物；所述发酵培养基可采用马铃薯-葡萄糖-琼脂-20％NaCl培养基，马铃薯-葡萄糖-琼脂-20％NaCl培养基的配制方法可为：将去皮的马铃薯切成小块，加水煮沸20～40min，纱布过滤得马铃薯滤液，加入葡萄糖、NaCl和琼脂，加水定容至1000mL，灭菌条件为121℃下灭菌20min，所述马铃薯滤液中的葡萄糖与马铃薯的质量比可为1∶(10～20)，琼脂与马铃薯的质量比可为1∶(15～20)，马铃薯与NaCl的质量比可为1∶(0.5～1.5)。
4)将步骤3)得到的发酵培养物用混合有机溶剂浸提，将提取液减压浓缩至干，甲醇溶解后过滤，滤液再减压浓缩至干得浸膏，浸膏用乙酸乙酯和水萃取至乙酸乙酯相无色，收集乙酸乙酯相减压浓缩至干得粗提物浸膏，再用甲醇和石油醚萃取至石油醚相无色，收集甲醇相减压浓缩至膏状，然后用甲醇溶解，过滤后再次减压浓缩，得浓缩粗提物浸膏；所述混合有机溶剂可采用乙酸乙酯/甲醇/甲酸，乙酸乙酯、甲醇、甲酸的体积比可为80∶15∶5；所述乙酸乙酯和水的体积比可为1∶1，甲醇和石油醚的体积比可为1∶1；各次减压浓缩的温度均可为45℃。
5)将步骤4)得到的浓缩粗提物浸膏进行反相中压液相柱层析，以甲醇/水连续梯度洗脱得组分1和组分2，组分1经两次凝胶柱层析和一次半制备型高压液相色谱得四环曲霉酮A和四环曲霉酮B；组分2经一次凝胶柱层析和一次半制备型高压液相色谱得四环曲霉酮C和四环曲霉酮D。所述甲醇/水连续梯度洗脱的比例变化按体积比可为0/100到100/0；所述组分1经两次凝胶柱层析和一次半制备型高压液相色谱中的两次凝胶柱层析可采用Sephadex LH-20，洗脱剂分别为甲醇和丙酮/甲醇，丙酮与甲醇的体积比可为4∶1，一次半制备高压液相色谱的洗脱条件可为60％甲醇；所述组分2经一次凝胶柱层析和一次半制备型高压液相色谱中的凝胶柱层析可采用Sephadex LH–20，洗脱剂为丙酮/甲醇，丙酮与甲醇的体积比可为4∶1，一次半制备高压液相色谱的洗脱剂可为45％甲醇。
采用MTS[3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名噻唑蓝]法，检测所制备的4个四环曲霉素的细胞毒性，四环曲霉酮A、B、C和D在抑制细菌脂多糖诱导的RAW264.7细胞炎症反应中的应用。通过检测细胞前炎症因子的浓度变化，从而判明四环曲霉酮A、B、C和D是否可以抑制RAW264.7细胞炎症反应。实验结果表明：四环曲霉酮可抑制细菌脂多糖诱导的RAW264.7细胞的炎症反应。四环曲霉酮在制备治疗风湿性关节炎、炎症性肠病、神经退化性疾病和脓毒性休克等由促炎症因子介导的炎症性疾病药物中具有广泛的应用。由此可见，所述四环曲霉酮类化合物可在制备抗炎症药物中应用，所述炎症包括但不限于风湿性关节炎、炎症性肠病、神经退化性疾病和脓毒性休克等由促炎症因子介导的炎症。
所述抗炎症药物还包括以四环曲霉酮A、B、C和D作为有效成分并含有常规药用载体的药物组合物。
本发明提供了四个新结构化合物的结构确定参数：
四环曲霉酮A：白色粉末，高分辨质谱(HR-FT-MS)测出m/z 457.1469[M+Na]+，得到分子式C22H26O9。在600MHz核磁共振仪上以氘代甲醇为溶剂，以TMS(三甲基硅烷)做内标，1H-NMR和13C-NMR数据见表1。1H-NMR数据为：δ4.53(1H,s)、δ3.31(1H,d,32.2)、δ2.83(1H，17.1)、δ2.76(1H,d，17.1)、δ2.30(3H，s)、δ2.12(1H，dq，5.6，11.8)、δ1.99(3H，s)、δ1.48(3H,s)、δ1.36(3H,s)、δ1.31(3H,s)、δ1.25(3H,d，6.3)。[α]97.6°(c 0.25，MeOH)；UV(MeOH):225nm和314nm；IR(KBr):1733.83、1699.95、1539.66、1533.24、1436.61cm-1。
四环曲霉酮B：白色粉末，高分辨质谱(HR-FT-MS)测出m/z 421.1857[M+H]+，得到分子式C22H28O8。在600MHz核磁共振仪上以氘代丙酮为溶剂，以TMS(三甲基硅烷)做内标，1H-NMR和13C-NMR数据见表1。1H-NMR数据为：δ5.72(1H，s)、δ5.63(1H，d，4.7)、δ4.72(1H，d，2.3)、δ4.60(1H，d，3.9)、δ2.85(1H，d，2.6)、δ2.82(1H，d，2.6)、δ2.72(1H，d，16.7)、δ2.62(1H，dd，5.2，16.7)、δ2.19(3H，s)、δ2.18(1H，m)、δ2.01(1H，dd，12.4，16.4)、δ1.90(1H，m)、δ1.89(3H，s)、δ1.41(3H，s)、δ1.32(3H，s)、δ1.29(3H，s)、δ1.08(3H，d，6.7)。[α]67.4°(c0.46，MeOH)；UV(MeOH):205nm和290nm；IR(KBr)：1682.74、1570.56、1414.32和1382.90cm-1。
四环曲霉酮C：白色粉末，高分辨质谱(HR-FT-MS)测出m/z 421.1493[M+H]+，得到分子式C21H24O9。在600MHz核磁共振仪上以氘代丙酮为溶剂，以TMS(三甲基硅烷)做内标，1H-NMR和13C-NMR数据见表1。1H-NMR数据为：δ6.02(1H，s)、δ4.66(1H，s)、δ3.33(1H，d，11.7)、δ2.84(1H，d，2.1)、δ2.75(1H，s)、δ2.26(3H，s)、δ2.15(1H，m)、δ1.54(3H，s)、δ1.32(3H，s)、δ1.29(3H，s)、δ1.28(3H，d，6.49)。[α]88°(c 0.1，MeOH)；UV(MeOH)：215nm、229nm、245nm、275nm和325nm；IR(KBr)：1734.07、1698.73、1539.67、1455.77、1222.63cm-1。
四环曲霉酮D：白色粉末，高分辨质谱(HR-FT-MS)测出m/z 459.1626[M+Na]+，得到分子式C22H28O9。在600MHz核磁共振仪上以氘代丙酮为溶剂，以TMS(三甲基硅烷)做内标，1H-NMR和13C-NMR数据见表1。1H-NMR数据为：δ5.69(1H，s)、δ5.66(1H，d，4.1)、δ4.71(1H，d，3.52)、δ4.67(1H，d，2.5)、δ4.54(1H，d，3.69)、δ3.97(1H，bs)、δ2.88(1H，dd，2.51，16.9)、δ2.75(1H，d，16.9)、δ2.32(1H，dq，6.37，12.08)、δ2.22(1H，d，4.0)、δ2.21(3H，s)、δ1.91(3H，s)、δ1.64(3H，s)、δ1.32(3H，s)、δ1.29(3H，s)、δ1.21(3H，d，6.9)。[α]65.6°(c 0.25，MeOH)；UV(MeOH)：220nm、275nm和299nm；IR(KBr)：1684.56、1569.02、1428.54、1257.90cm-1。
表1.四环曲霉酮A、B、C和D的1H-NMR和13C-NMR数据(data in ppm)
以下给出具体实施例。
1.培养基配方：
1)马铃薯-葡萄糖-琼脂半海水培养基配方：取200g马铃薯去皮，切成小块，加水煮沸30min，8层纱布过滤，滤液中加20g葡萄糖，20g琼脂，500mL海水，自来水定容至1000mL。
2)马铃薯-葡萄糖半海水液体培养基：取200g马铃薯去皮，切成小块，加水煮沸30min，8层纱布过滤，滤液中加20g葡萄糖，500mL海水，自来水定容至1000mL。
3)发酵培养基：取200g马铃薯去皮，切成小块，加水煮沸30min，8层纱布过滤，滤液中加20g葡萄糖和20g琼脂，200g NaCl加适量水煮沸使其全部溶解后加入土豆滤液中，自来水定容至1000mL。
2.发酵工艺：
按上述斜面培养基配方配置培养基，分装试管，121℃灭菌20min，制成斜面培养基。挑取甘油管保种的曲霉Aspergillus sp.ZL01b-14转接至斜面培养基上，28℃培养4d；按种子培养基的配方配置培养基，灭菌，冷却，将上述培养的斜面菌种转接到种子培养基中，28℃，180rpm摇床培养后得到种子液。发酵培养基按配方配置好后，将上述培养好的种子液转接到发酵培养基上，28℃培养30d。
3.四环曲霉酮A、B、C、和D的精制：
曲霉(Aspergillus sp.)ZL01b-14发酵产物粗提物用中压液相柱层析，甲醇/水从0/100到100/0(体积比)梯度变化。在甲醇/水比例为30/70时洗脱得到组分1和组分2。组分1经两次Sephadex LH-20凝胶柱层析和一次半制备型高压液相色谱得四环曲霉酮A和四环曲霉酮B；组分2经一次Sephadex LH-20凝胶柱层析和一次半制备型高压液相色谱得四环曲霉酮C和四环曲霉酮D。组分1的两次凝胶柱层析洗脱剂分别为甲醇和丙酮：甲醇(4∶1，体积比)，半制备高压液相色谱的洗脱条件为60％甲醇；组分2的凝胶柱层析采用的是SephadexLH-20洗脱剂为丙酮∶甲醇(4∶1，体积比)，半制备高压液相色谱的洗脱剂为45％甲醇。
4.四环曲霉酮A的重结晶
将步骤3所得四环曲霉酮A用甲醇全部溶解，取适量溶解液进行重结晶，并挑取晶体进行晶体X-Ray分析测定，根据晶体数据确定其绝对构型。
5.四环曲霉酮A、B、C和D对RAW264.7细胞的抑制活性测试：
将RAW264.7细胞(1×105个/mL)接入96孔培养板内，每孔190μL，置于37℃，5％CO2培养箱培养12h，加入不同浓度的四环曲霉酮10μL，使其终浓度为100、33.3、11.1、3.7μM，每组均设3个重复，继续培养24h。加入20μL 5mg/mL MTT溶液，继续培养4h。在酶标仪570nm处测量各孔的吸光值，其中以DMSO作为阴性对照，计算样品对细胞的抑制率。根据测量的细胞抑制率利用GradPad Prism 5软件计算化合物作用于细胞的半抑制浓度(IC50值)。
细胞抑制率％(Inhibition％)＝[1-(OD实验组-OD空白组)/(OD阴性组-OD空白组)]×100％
实验结果表明，四环曲霉酮A、B、C和D对RAW264.7细胞生长抑制的IC50值均大于100μM，表明这一系列化合物对RAW264.7细胞不存在细胞毒，在抑制炎症因子的试验中可以忽略细胞毒的影响。
6.四环曲霉酮A、B、C、D抑制LPS诱导RAW264.7细胞释放炎症因子的影响
通过检测细胞前炎症因子的浓度变化，判明四环曲霉素是否可以抑制RAW264.7细胞释放致炎因子。具体试验方法如下：
调整细胞悬液浓度为5×105/mL，取1mL加于24孔板内，置37℃、5％CO2培养箱培养，待24h细胞融合度达到80％左右，每孔加入不同浓度的四环曲霉酮，使其终浓度为20、40、80μM(或3.7、11.1、33.3、100μM)，DMSO为空白对照，每组均设3个重复。继续培养4h后，加入终浓度为0.5μg/mL的LPS，置37℃继续培养20h，每孔取200μL上清，置-20℃保存。
6.1ELISA法测细胞因子TNF-α，IL-6，IL-1β的浓度
参照三种炎症因子Mouse TNF-α(BOSTER公司，Code#：EK0527)、Mouse IL-1β(BOSTER公司，Code#：EK0394)和Mouse IL-6(BOSTER公司，Cat#：EK0411)ELISA试剂盒说明书，检测细胞培养上清液中的三种炎症因子的浓度。其中以氢化可的松(hydrocotisone)为阳性对照，计算样品对炎症因子的抑制率(inhibition)。
抑制率％(Inhibition％)＝[1-(OD实验组-OD空白组)/(ODLPS组-OD空白组)]×100％
6.2四环曲霉酮化合物对RAW264.7细胞NO含量的影响
通过现有的Griess方法检测一氧化氮(NO)的含量(根据说明书操作)，一氧化氮检测试剂盒购至碧云天生物试剂公司，产品编号：S0021。
6.3实验结果显示四环曲霉酮对细菌脂多糖诱导的RAW264.7细胞炎症因子表现出不同的抑制效果，其中四环曲霉酮A和D对IL-6和IL-1β具有较好的抑制活性(如图2～图5所示)，而对NO和TNF-α在浓度为40μM时无显著抑制活性(小于30％)。；四环曲霉酮B和C对NO和TNF-α具有较好的抑制活性(如图6～图9所示)，而对IL-6在浓度为33.3μM时无显著抑制活性(小于15％)。
实验结果表明：四环曲霉酮可抑制细菌脂多糖诱导的RAW264.7细胞的炎症反应。四环曲霉酮在制备治疗风湿性关节炎、炎症性肠病、神经退化性疾病和脓毒性休克等由促炎症因子介导的炎症性疾病药物中具有广泛的应用。
将所制得四环曲霉酮A用甲醇全部溶解，取适量溶解液进行重结晶，并挑取晶体进行晶体X-Ray分析测定，根据晶体数据确定其绝对构型。其立体构型图如图1所示。重结晶所用溶剂为甲醇。

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1.曲霉(Aspergillus sp.)ZL01b-14，已于2014年12月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏中心保藏编号为CCTCC NO：M 2014668。
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