CN106008167B - 一种具有抗菌活性的倍半萜及其制备方法 - Google Patents

一种具有抗菌活性的倍半萜及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种具有抗菌活性的倍半萜及其制备方法，所述的倍半萜化合物分子式为C15H26O3，通过液体发酵培养鸡枞菌Termitomyces albuminosus，获取发酵物，然后从发酵物中分离纯化倍半萜，本发明采用的倍半萜及其衍生物制备方法，可以利用真菌菌种鸡枞菌Termitomyces albuminosus经液体发酵制得，培养基原料来源广泛，制备方法简单，容易实现工业化生产。

Description

一种具有抗菌活性的倍半萜及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种具有抗菌活性的倍半萜及其制备方法，属于生物医药领域。
背景技术
倍半萜是指分子中含15个碳原子的天然萜类化合物，是医药、食品、化妆品工业的重要原料。大型真菌中发现的天然产物结构多样，倍半萜是主要的结构类型，且化学结构多样，并具有等多种生物活性。
细菌病害是人类面临的主要病害。虽然目前已有大量抗生素被发现并用来治疗细菌病，但也出现了各种耐药性菌，对人类的健康造成极大的威胁。为寻找安全有效的抗菌药物，特开展本发明的研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有抗菌活性的倍半萜及其制备方法。
本发明的另一目的在于将该倍半萜类化合物作为抗菌药物。
本发明所涉及的真菌为鸡枞菌(Termitomyces albuminosus)，所述菌株为鸡枞菌(Termitomyces albuminosus )ZYB2016，已于2016年5月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2016262；保藏的培养物名称及注明的鉴别特征为鸡枞菌(Termitomyces albuminosus)，地址为武汉大学。
本发明所述倍半萜化合物分子式为C15H26O3，化学结构式如下：
。
本发明所述的倍半萜化合物的制备方法，通过发酵培养鸡枞菌(Termitomyces albuminosus)，获取发酵物，然后从发酵物中分离纯化出该化合物，具体步骤为：
1) 真菌液体发酵：将鸡枞菌(Termitomyces albuminosus)斜面菌种活化后，进行液体深层发酵，培养基配方按重量百分比为：马铃薯5-40%，葡萄糖1-5%，余量为水，于0.1Mpa和121 ℃灭菌30 min。采用恒温摇床或各式发酵罐进行液体发酵，温度设置22-30 ℃，发酵7-30天；
2) 发酵产物处理：液体发酵结束后，除去菌丝体的发酵液用乙酸乙酯萃取，萃取液经脱水、浓缩，得到有机粗提物浸膏；
3) 倍半萜分离纯化：将2)所述的有机粗提物浸膏用甲醇溶解，进行反相硅胶柱层析，用浓度为10-50%的甲醇水或丙酮水为洗脱剂，分管收集，将含有目标化合物的洗脱液浓缩得到亚组分。用甲醇将亚组分溶解，进行凝胶柱层析，用丙酮或甲醇溶液洗脱，分管收集，将含有所述化合物的洗脱液合并，接着进行正相硅胶柱层析，以氯仿装柱，干法上样，用氯仿：甲醇＝100：0.1－10的溶剂洗脱，得到倍半萜。
本发明还保护了所述的倍半萜类化合物在制备抗菌药物中的用途。所述细菌为大肠杆菌。
根据质谱（ESI）、高分辨质谱（HRMS-EI）、圆二色谱（CD）、旋光（[α]）、紫外光谱（UV）、红外光谱（IR）和核磁共振波谱（1H-NMR、13C-NMR、HSQC、HMBC、1H,1H-COSY和NOESY）的数据对化合物进行结构鉴定，可确定化合物结构。利用96孔板法测定化合物的抗菌活性，发现其对大肠杆菌有较强的抑制效果。结果表明，所述的倍半萜化合物具有抗菌活性，可应用于制备抗菌药物或其他生物活性先导物。
本发明采用的倍半萜及其衍生物制备方法，可以利用真菌菌种鸡枞菌Termitomyces albuminosus经液体发酵制得，培养基原料来源广泛，制备方法简单，容易实现工业化生产。
附图说明
图1 所述倍半萜的化学结构式。
图2 化合物1对大肠杆菌生长的抑制，图中黑框为所述的化合物1对大肠杆菌的抑制作用。
具体实施方式
在如下的实施例中所指的化合物1的化学结构：
以下实施例将对本发明作进一步说明。
实施例1
用马铃薯葡萄糖培养基（每升水中含马铃薯200 g，葡萄糖20 g，pH自然，0.1 Mpa，121 ℃灭菌30 min），将活化后的菌株（Termitomyces albuminosus）液体发酵培养37 L，于28 ℃摇床培养 15 d。菌体过滤后，发酵液浓缩至1 L，发酵液用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯部分用无水硫酸钠脱水后浓缩，得到有机粗提物浸膏(3.1 g)。
将上一步骤中得到的3.1g有机粗提物，用甲醇充分溶解，进行反相硅胶(170 g)柱层析，用50%甲醇水洗脱2 L，流速为15 mL/min，每管收集280 mL，用旋转蒸发仪真空浓缩后，分别取样进行薄层层析分析合并（展开剂为氯仿：甲醇＝10：1，显色剂为碘、10%硫酸乙醇或碘化铋钾），得到含有目标化合物的组分（68.3 mg）。
从上一步骤得到的组分（68.3 mg），用甲醇溶解，进行凝胶(120g，Sephadex LH-20)柱层析，甲醇洗脱，流速约为12 s/drop，每管收集4 mL，根据薄层层析检测合并得到含有目标化合物的组分(44.0 mg)。
从上一步骤得到的组分(44.0 mg)，用丙酮溶解，进行凝胶(120 g，Sephadex LH-20)柱层析，丙酮洗脱，流速约为12 s/drop，每管收集4 mL，根据薄层层析检测合并得到目标化合物的组分(7.8 mg)。
从上一步骤得到的组分(7.8 mg)进行正相硅胶层析（1 g 硅胶），氯仿装柱，干法上样，流动相为氯仿：甲醇（60:1），洗脱体积为300 mL，薄层层析检测合并得到目标化合物1（2.8 mg）。
将上一步骤所得的化合物1，进行质谱（ESI）、高分辨质谱（HRMS-EI）、圆二色谱（CD）、旋光（[α]）、紫外光谱（UV）、红外光谱（IR）和核磁共振波谱（1H-NMR、13C-NMR、HSQC、HMBC、1H,1H-COSY和NOESY）测定，并确定化合物结构。
化合物1，浅黄色油状物，可溶于甲醇或丙酮，[α]－18.4 (c=0.085，MeOH)；UV-vis(MeOH)，λ/nm：216；HR ESI-Q-TOF MS: 277.1776 ([M + Na+], C15H26NaO3 +; calc.277.1780)；IR (KBr) νmax：3385, 2965, 2853, 1384 cm-1；结合1H和13C NMR谱数据(表1)确定化合物1的分子式为C15H26O3。分析1H和13C NMR 以及DEPT谱，表明化合物1含有2个甲基，8个亚甲基（其中2个为羟甲基），1个次甲基，4个季碳（其中1个连氧，2个为烯碳）。从HMBC实验中可观察到甲基H3-14与C-10、C-1、C-9和C-5，以及H3-15与C-3、C-4和C-5的碳氢远程相关，从1H-1H COSY 实验中可观察到H-1α/β与H-2α/β及H-2α/β与H-3α/β之间的氢氢相关，可以推测出化合物1含有双甲基和羟基取代的环戊烯结构片段。又从HMBC实验中观察到甲基H２-13与C-12、C-7和C-11，H2-12与C-13、C-12和C-7, H-6α与C-7和C-11, 以及H-8α与C-7和C-11的碳氢远程相关，及C-7和C-11的化学位移值，推测化合物1含有双羟甲基和双烷基四取代乙烯的结构片段。根据H-6β与C-8, C-10和C-5，H-9α与C-15, C-8, C-10和C-5，以及H-8α/β与H-9β的1H-1H COSY相关，可以将上述的两个结构片段连接并推测出化合物1的基本结构。根据NOESY实验中H-1β和H-2β，H-2β和H-3β，以及H-1β和H-5的出现相关，表明这些质子朝向一面；而H3-14和H-2α，H-2α和H-3α，H3-15/14和H-6α，H3-14和H-8α，以及H3-14和H-9α间出现的相关，表明这些质子朝向另一面，并可以建立化合物1的相对构型（图1）。
表1 化合物1的NMR波谱数据（MeOD，500M）
实施例2
采用96孔板法进行抑菌试验。无菌操作下，在96孔板的每孔中加入180 μL细菌培养基（LB：1%牛肉膏，1%蛋白胨， 0.5%氯化钠，定容至1000 mL ，pH 7.2-7.5，121 ℃ 高压灭菌30 min），10 μL大肠杆菌菌液（含菌数约2.0×106），和10 μL溶解于甲醇中供试样品（含50 μg所述的化合物1），设置2个平行，同时用甲醇设置溶剂对照，空白对照为液体培养基，置37 ℃恒温箱内培养24 h，肉眼观察大肠杆菌生长情况。结果表明化合物1对大肠杆菌具有明显抑制作用，抑制浓度为0.25 μg/μL（图2）。

Claims (3)

1.一种具有抗菌活性的倍半萜，其特征在于：所述的倍半萜化合物分子式为C15H26O3，结构式如下：
。
2.一种如权利要求1所述的倍半萜类化合物的制备方法，其特征在于：通过液体发酵培养鸡枞菌Termitomyces albuminosus，获取发酵物，然后从发酵物中分离纯化倍半萜；所述鸡枞菌为鸡枞菌(Termitomyces albuminosus )ZYB2016，已于2016年5月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2016262；具体步骤为：
1) 真菌液体发酵：将所述的鸡枞菌斜面菌种活化后，进行液体深层发酵，培养基配方按重量百分比为：马铃薯5-40%，葡萄糖1-5%，余量为水，于0.1 Mpa和121 ℃灭菌30 min；采用恒温摇床或各式发酵罐进行液体发酵，温度设置22-30℃，发酵7-30天；
2) 发酵产物处理：液体发酵结束后，除去菌丝体的发酵液用乙酸乙酯萃取，萃取液经脱水、浓缩，得到有机粗提物浸膏；
3) 倍半萜的分离纯化：将2)所述的有机粗提物浸膏用甲醇溶解，进行反相硅胶柱层析，用浓度为10-50%的甲醇水或丙酮水为洗脱剂，分管收集，将含有目标化合物的洗脱液浓缩得到亚组分；用甲醇将亚组分溶解，进行凝胶柱层析，用丙酮或甲醇溶液洗脱，分管收集，将含有所述化合物的洗脱液合并，接着进行正相硅胶柱层析，以氯仿装柱，干法上样，用氯仿：甲醇＝100：0.1-10的溶剂洗脱，得到目标化合物。
3.如权利要求1所述的倍半萜在制备抗大肠杆菌药物上的应用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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