CN103937678B - 一株海洋壳青霉、其衍生的喹啉酮类化合物及其制备和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一株海洋真菌壳青霉、其衍生的喹啉酮类化合物及该化合物的制备和应用。所述喹啉酮类化合物的具体结构式如R1～R6所示，其制备方法为将壳青霉AP2T1CGMCCNo.8516接种于培养基中静止发酵，发酵液经乙酸乙酯萃取，菌丝体由有机溶剂提取，合并后粗提物用有机溶剂进行葡聚糖凝胶柱、反相硅胶柱层析，经薄层层析检测，将含有中间体的洗脱组分进行甲基化处理后，继续进行制备薄层层析、反相硅胶柱层析分离纯化得目标化合物R1～R6；化合物R1～R6显示出在制备抗肿瘤药物、抗细菌剂及农用杀虫剂中具有广泛的应用前景。

Description

一株海洋壳青霉、其衍生的喹啉酮类化合物及其制备和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域；涉及一株海洋真菌壳青霉AP2T1,特别是利用该真菌衍生的喹啉酮类化合物与其制备方法以及其在抗肿瘤药物、抗细菌抗生素及杀虫剂领域的应用。

背景技术

目前在临床治疗中发现肿瘤的耐药性也在不断增强，且出现多药耐药性现象，已有抗肿瘤药物在临床化疗中越来越力不从心；另外临床治疗发现病原微生物的耐药性越来越强，很多传统抗生素已基本丧失疗效，因此有必要寻找新型的抗肿瘤药物和抗生素来满足临床药物研发的需要。此外，在农业生产因为过度使用各种化学合成农药，造成严重的食品、土壤及水污染，并经过食物链危及人体健康和生态平衡，农药残留也严重阻碍了我国的农产品出口；而生物农药具有不易产生抗药性、对非靶生物安全、环境友好且易于自然降解等优点，对于人类健康、环境保护及农业可持续发展具有重要的意义。海洋真菌来源的抗肿瘤药物、抗细菌抗生素及杀虫剂具有易于大规模发酵生产、高效、易于克服抗药性等优点，易于实现药源稳定供给，具有较好的经济、社会与环境效益。

发明内容

本发明通过分离于鲨鱼灰鲭鲨鳃部的真菌壳青霉（Penicillium crustosum）CGMCC No.8516发酵；经提取、分离、甲基化、分离获得的喹啉酮类化合物，经实验得出这些化合物在制备抗肿瘤药物、抗细菌剂及农用杀虫剂中都具有广泛的应用前景，有较好的经济、社会与环境效益。

本发明涉及的海洋真菌壳青霉（Penicillium crustosum）AP2T1是从中国东海渔获的海洋生物灰鲭鲨鳃耙组织中分离获得。该菌株合适的生长盐浓度范围为2.0%～5.0%。依据ITS1-5.8S-ITS2rDNA序列分析比对及《真菌鉴定手册》(魏景超，1979),经鉴定为Penicillium crustosum AP2T1菌株，已于2013年11月27日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（其简称为CGMCC），保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。保藏编号为：CGMCC No.8516。

海洋真菌壳青霉（Penicillium crustosum）AP2T1具有下述性质：接种到海水马铃薯葡萄糖培养基（海水PDA）平板上，28℃培养，菌落开始为白色，圆形，向四周扩展，后从菌落中央向边缘产生灰绿色孢子，整个菌落呈粉粒状，中央凸起，有多道同心纹，边缘颜色较浅、放射状，背面产黄色色素。菌丝生长速度每天0.44cm。基部无足细胞，顶端不形成膨大的顶囊，其分生孢子梗经过多次分枝，产生几轮对称或不对称的小梗，形成典型的帚状分生孢子穗。孢子圆形，绿色；分生孢子梗基部无足细胞。最佳生长温度范围26～30℃，最佳生长pH为6.0～7.0，可利用葡萄糖、蔗糖、乳糖等碳源。该菌株在海水马铃薯蔗糖液体培养基中静置发酵可产生抗肿瘤、抗菌、杀虫活性物质。

海洋真菌壳青霉（Penicillium crustosum）AP2T1的ITS1-5.8S-ITS2rDNA序列（541bp）已向美国国家生物技术信息中心（NCBI）的GenBank基因序列数据库提交，登陆号为JN368448。

本发明还公开了一系列喹啉酮类化合物，其由上文所述的海洋真菌壳青霉（Penicillium crustosum）AP2T1CGMCC No.8516衍生，所述喹啉酮类化合物的结构式为：

本发明的另一方面，在于保护上述喹啉酮类化合物的制备方法，其包括如下操作步骤：

Ⅰ.发酵

从壳青霉（Penicillium crustosum）CGMCC No.8516发酵产物中提取、分离纯化viridicatol；

Ⅱ.甲基化

a.将步骤Ⅰ获得的viridicatol干燥后加入密闭反应容器，在氩气或干燥氮气保护下，按照每0.1g viridicatol加入0.5～1.5mL无水二甲基甲酰胺的比例添加，室温下磁力搅拌8～20min；更优选的，按照每0.1g viridicatol加入1mL无水二甲基甲酰胺的比例添加，室温下磁力搅拌10min；

b.搅拌状态下，向步骤a产物中分三次，每次间隔15～25min，逐滴加入三甲基硅重氮甲烷的2.0M二乙醚溶液，其每次加入的体积与步骤a中viridicatol的质量比为0.2～0.3mL：0.1～0.15mL：0.1～0.15mL：0.1g；更优选的，向步骤a产物中分三次，每次间隔20min，逐滴加入三甲基硅重氮甲烷的2.0M二乙醚溶液，其每次加入的体积与步骤a中viridicatol的质量比为0.2mL：0.1mL：0.1mL：0.1g。

c.继续搅拌2～4小时，TLC监测反应进程；

d.真空抽干溶剂以终止反应；

e.按照每0.1g viridicatol加入0.1～0.5mL水的比例添加水，以达到分解残余三甲基硅重氮甲烷的目的，真空抽干；

f.分离纯化得到化合物R1-R6；

或者，化合物R6从步骤Ⅰ获得的发酵产物中，经过柱层析得到；

所述化合物R1-R6在薄层层析板上，于254nm紫外线照射下均呈单个的深紫色斑点，在365nm紫外线照射下均呈单个的紫色荧光斑点，硫酸茴香醛显色均为浅橙色；其高效液相色谱-质谱联用分析的保留时间及分子量依次为15.2min、M=295；12.7min、M=295；12.7min、M=281；11.2min、M=281；10.2min、M=281；9.0min、M=267；

所述的检测用高效液相色谱分析条件为Nucleosil C-18柱，填料粒径3微米，柱尺寸2.0mm×100mm，流动相为A相：0.1%甲酸水溶液，B相：0.06%甲酸乙腈溶液，0-15min10%B线性梯度增至100%B，15-20min为100%B，流速0.4mL/min；检测器为阵列二极管检测器、电喷雾质谱仪。

利用本发明上述的制备方法获得六种喹啉酮类化合物，其在常温常压下为无色粉末。

优选的情况下，在上述喹啉酮类化合物的制备方法技术方案中，步骤Ⅰ中所述的提取包括以下操作步骤：过滤发酵产物，分别收集菌丝体和发酵液，并将获得的发酵液经乙酸乙酯萃取并浓缩，将获得的菌丝体用有机溶剂提取并浓缩，将所得浓缩物合并，即为粗提物；其中，所述有机溶剂为丙酮、乙酸乙酯、乙醇、甲醇中一种或几种。进一步优选的情况下，所述的发酵液用乙酸乙酯萃取三次，减压浓缩；菌丝体粉碎后用甲醇提取三次，减压浓缩。

优选的情况下，在上述喹啉酮类化合物的制备方法技术方案中，步骤Ⅰ中所述的分离纯化包括以下操作步骤：将步骤Ⅰ中所获得的提取产物经色谱分离手段，得到在Si-60F254薄层层析板上Rf值为0.27、254nm紫外光下呈暗紫色、365nm紫外线下有紫色荧光的物质viridicatol，层析展开剂为体积比为9:1的氯仿-甲醇混合溶液。

其中，本发明实施例中选用的色谱分离手段为葡聚糖凝胶柱层析和反相硅胶柱层析，其选用的实验条件为：

a.将步骤Ⅰ中所获得的提取产物经Sephadex LH-20葡聚糖凝胶柱层析，用甲醇进行洗脱，流速0.07个柱体积/小时，收集0.7～0.9个柱体积之间的洗脱液；

b.将步骤a收集的洗脱组分再进行反相硅胶柱层析，洗脱液为体积比60:40的甲醇-水，流速0.66个柱体积/小时，收集1.6～3.4个柱体积之间的洗脱液，其主成分为Si-60F254薄层层析板上Rf值为0.27、254nm紫外光下呈暗紫色、365nm紫外线下有紫色荧光的物质，即viridicatol，3-羟基-4-(3-羟基苯基)喹啉-2(1氢)-酮，层析展开剂为体积比为9:1的氯仿-甲醇。

优选的情况下，在上述喹啉酮类化合物的制备方法技术方案中，所述步骤Ⅰ中的发酵所用培养基组成为：每升含土豆汁500mL，天然粗海盐配制的30～50g/L盐水500mL，蔗糖15～25g。更优选的，培养基组成为：每升中含土豆汁500mL，天然粗海盐配制的40g/L盐水500mL，蔗糖20g。

优选的情况下，在上述喹啉酮类化合物的制备方法技术方案中，所述的发酵，具体是将壳青霉（Penicillium crustosum）CGMCC No.8516接种于真菌液体培养基中静止发酵，过滤，分别收集菌丝体和发酵液；26～30℃培养箱静止发酵25～35天，发酵结束时加入发酵液一半体积的乙酸乙酯。更优选的是，在28℃培养箱静止发酵30天，发酵结束时加入发酵液一半体积的乙酸乙酯。

优选的情况下，在上述喹啉酮类化合物的制备方法技术方案中，步骤Ⅱf中所述的分离纯化方法为薄层层析和反相柱层析法，其具体如下：

a.将步骤Ⅱe获得的中间体甲基化产物用有机溶剂（优选为甲醇和/或氯仿）溶解后，加样至Si-60F254制备薄层层析板，以体积比20：1的氯仿-甲醇为展开剂进行层析后，分别刮取Rf值为0.90、0.79、0.67、0.43和0.15的带，研磨后用2～10：1的氯仿-甲醇洗脱（氯仿-甲醇优选比例为10：1），收集洗脱液并浓缩干燥。其中Rf值为0.79、0.67及0.15的条带洗脱物为所述的化合物R2、R3、和R6；

b.将步骤a中Rf值为0.90条带洗脱物，再次使用Si-60F254制备薄层层析板分离，以体积比2：1的石油醚-丙酮为展开剂，刮取Rf值为0.60的条带，研磨后用2～10：1的氯仿-甲醇洗脱（氯仿-甲醇优选比例为10：1），收集洗脱液浓缩干燥得到所述的化合物R1；

c.将步骤a中Rf值为0.43条带洗脱物，使用反向硅胶柱层析分离，洗脱液为体积比80:20～60:40的甲醇-水，流速0.50～0.60个柱体积/小时，分别收集1.5～3.0及2.5～4.0个柱体积之间的洗脱液（更优选条件下，甲醇-水体积比为70:30，流速为0.55个柱体积/小时，分别收集1.8～2.5及2.8～3.6个柱体积之间的洗脱液），收集洗脱液浓缩干燥分别得到所述的化合物R4和R5。

在本发明上述喹啉酮类化合物的制备方法技术方案中，还提供了化合物R6的另一种制备方法：

a.将步骤Ⅰ中所获得的提取产物经Sephadex LH-20葡聚糖凝胶柱层析，用甲醇进行洗脱，流速0.06～0.08个柱体积/小时，收集0.30～0.65个柱体积之间的洗脱液（优选条件下，流速为0.07个柱体积/小时，收集0.40～0.55个柱体积之间的洗脱液）；

b.将步骤a收集的洗脱组分再进行反相硅胶柱层析，洗脱液为体积比80:20～60:40的甲醇-水，流速0.45～0.65个柱体积/小时，收集0.8～2.5个柱体积之间的洗脱液（优选条件下，甲醇-水体积比为70:30，流速为0.57个柱体积/小时，收集1.0～2.2个柱体积之间的洗脱液）；该洗脱液组分再进行硅胶柱层析（40～63微米粒径硅胶），洗脱液为体积比15～25:1的氯仿-甲醇，流速0.40～0.50个柱体积/小时，收集1.5～3.8个柱体积之间的洗脱液（优选条件下，氯仿-甲醇体积比为20:1，流速为0.46个柱体积/小时，收集1.8～3.1个柱体积之间的洗脱液）；该洗脱液组分再使用Si60F254制备薄层层析板分离，展开剂为体积比3:4的环己烷-丙酮，展开后，割取Rf值为0.36、254nm紫外光下呈暗紫色的物质的条带，并用氯仿洗脱得到洗脱液；该洗脱液组分最后进行反相液相色谱制备层析（色谱柱Kromasil C-18，7微米填料,尺寸250mm*20mm），洗脱液为体积比50：50的甲醇甲酸溶液-甲酸水溶液，其中甲醇甲酸溶液-甲酸水溶液中均添加0.05%体积浓度的甲酸，流速10mL/min，收集保留时间为39min的色谱峰，即为所述的化合物R6。

对于上文所述的化合物R1-R6的前体原料viridicatol是结构明确的化合物，其化学系统命名为：3-羟基-4-(3-羟基苯基)喹啉-2(1氢)-酮，也可用其他菌株发酵或通过其他化学合成途径得到，但均可用上文所述的甲基化方法来制备化合物R1-R6。

具体的，对于上文所述的反相硅胶柱层析，所用填料为RP-18,粒径为60μm。

本发明的化合物R1～R6经生物活性测试得出，化合物R1-R5对人结肠癌细胞株HCT116的IC50（24小时）依次为104、278、30、133、189μmol/L（分别为30.7、82.3、8.4、37.4、53.0μg/mL）。化合物R1-R6在25μg/滤纸片的剂量下显示均有一定程度的平板抗金黄色葡萄球菌生长的活性，其抑菌圈直径在6.5～7.5mm；在微量稀释法测试中化合物R1、R6在0.125～125μg/mL浓度范围内，虽然不能彻底抑制金黄色葡萄球菌的生长，但化合物R1在8μg/mL仍有明显抑制活性，抑菌率达22.5%；化合物R6在1μg/mL仍有明显抑制活性，抑菌率达41.3%。化合物R6在0.125～125μg/mL浓度范围内对野生型大肠杆菌无明显抑制能力，对DNA损伤修复基因缺陷型大肠杆菌则显示了部分抑制其生长的活性，在稀释至8μg/mL仍有抑制活性，抑菌率可达45.1%，其显示的选择抑制活性表明该化合物具有损伤DNA的能力。化合物R2、R4对卤虫幼虫的48h半致死剂量LC50依次为62、125μg/mL（其中化合物2在125μg/mL浓度下24h致死率达到100%）。总之，化合物R1-R5可抑制人结肠癌细胞株HCT116生长，化合物R1-R6对金黄色葡萄球菌具有一定抑制活性，化合物R6可选择性抑制DNA损伤修复基因缺陷型大肠杆菌，化合物R2、R4可杀死卤虫幼虫，具有作为抗肿瘤药物、抗细菌抗生素及杀虫剂的潜在用途。

因此，上文所述的喹啉酮类化合物在制备抗肿瘤药物、抗细菌剂及农用杀虫剂中具有广泛的应用前景。尤其是化合物R1-R5在制备抗肿瘤药物中的应用，化合物R1-R6在制备抗细菌抗生素中的应用，化合物R2、R4在制备农用杀虫剂中的应用。

附图说明

图1、4、7、10、13、16：化合物R1-R6的核磁共振氢谱(¹H NMR，CDCl₃,500MHz)，其化学位移归属、耦合常数详见图19;

图2、5、8、11、14、17：化合物R1-R6的核磁共振碳谱(¹³C NMR，CDCl₃,125MHz)，其化学位移归属、耦合常数详见图19;

图3：高分辨ESI质谱显示化合物R1准分子离子峰[M+H]⁺质荷比为m/z296.1290，理论计算值为m/z296.1281，表明吻合程度很好；

图6：高分辨ESI质谱显示化合物R2准分子离子峰[M+H]⁺质荷比为m/z296.1282，理论计算值为m/z296.1281，表明吻合程度很好；

图9：高分辨ESI质谱显示化合物R3准分子离子峰[M+H]⁺质荷比为m/z282.1127，理论计算值为m/z282.1125，表明吻合程度很好；

图12：高分辨ESI质谱显示化合物R4准分子离子峰[M+H]⁺质荷比为m/z282.1125，理论计算值为m/z282.1125，表明吻合程度很好；

图15：高分辨ESI质谱显示化合物R5准分子离子峰[M+H]⁺质荷比为m/z282.1126，理论计算值为m/z282.1125，表明吻合程度很好；

图18：高分辨ESI质谱显示化合物R6准分子离子峰[M+H]⁺质荷比为m/z268.0969，理论计算值为m/z268.0968，表明吻合程度很好；

图19化合物R1-R6的¹H和¹³C核磁共振数据(¹H:400MHz,¹³C:100MHz)

具体实施方式

下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

本发明实施例中所用试剂如无特殊说明，均由常规方法制备或者由商业途径购买获得。

真菌壳青霉（Penicillium crustosum）AP2T1菌种，于2013年11月27日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.8516，株号为AP2T1；

实施例1

该喹啉酮类化合物的制备方法：

Ⅰ.发酵

将壳青霉（Penicillium crustosum）CGMCC No.8516接种于真菌液体培养基中静止发酵，过滤，分别收集菌丝体和发酵液；

其中，所述真菌液体培养基组成，每升中含：土豆汁500mL，天然粗海盐配制的40g/L盐水500mL，蔗糖20g；

Ⅱ.粗提

将步骤Ⅰ获得的发酵液经乙酸乙酯萃取并浓缩，将步骤Ⅰ获得的菌丝体用有机溶剂提取并浓缩，将所得浓缩物合并，即为粗提物；

其中，所述有机溶剂为氯仿、丙酮、乙酸乙酯、乙醇、甲醇中一种或几种；

Ⅲ.中间体的分离纯化

a.将步骤Ⅱ获得的粗提物经Sephadex LH-20葡聚糖凝胶柱层析，用甲醇进行洗脱，流速0.07个柱体积/小时，收集0.7～0.9个柱体积之间的洗脱液；

b.将步骤a收集的洗脱组分再进行反相硅胶柱层析，洗脱液为体积比60:40的甲醇-水，流速0.66个柱体积/小时，收集1.6～3.4个柱体积之间的洗脱液，其主成分为Si-60F254薄层层析板上Rf值为0.27、254nm紫外光下呈暗紫色、365nm紫外线下有紫色荧光的物质（即viridicatol），层析展开剂为体积比为9:1的氯仿-甲醇；

IV.甲基化

a.将步骤III获得的中间体物质充分干燥后加入密闭反应容器，在氩气或干燥氮气保护下每0.1g原料加入1mL无水二甲基甲酰胺，室温下磁力搅拌10min；

b.继续搅拌，以20min为间隔，以2：1：1的体积比分三次逐滴加入0.4mL三甲基硅重氮甲烷的2.0M二乙醚溶液（按a中每0.1g原料计）；

c.继续搅拌3小时，TLC监测反应进程；

d.真空抽干溶剂以终止反应；

e.加入0.5mL水分解残余三甲基硅重氮甲烷，真空抽干；

V.产物分离纯化

a.将步骤IV得到的干物质溶解后，加样至Si-60F254制备薄层层析板，以体积比20：1的氯仿-甲醇为展开剂进行层析后，分别刮取Rf值为0.90、0.79、0.67、0.43和0.15的带，研磨后用10：1的氯仿-甲醇洗脱，收集洗脱液并浓缩干燥。其中Rf值为0.79、0.67及0.15的条带洗脱物为所述的化合物R2、R3、和R6；

b.将步骤a中Rf值为0.90条带洗脱物，再次使用Si-60F254制备薄层层析板分离，以体积比2：1的石油醚-丙酮为展开剂，刮取Rf值为0.60的条带，研磨后用10：1的氯仿-甲醇洗脱，收集洗脱液浓缩干燥得到所述的化合物R1；

c.将步骤a中Rf值为0.43条带洗脱物，使用反向硅胶柱层析分离，洗脱液为体积比70:30的甲醇-水，流速0.55个柱体积/小时，分别收集1.8～2.5及2.8～3.6个柱体积之间的洗脱液，收集洗脱液浓缩干燥分别得到所述的化合物R4和R5。

VI.化合物R6的另一种制备方法

a.将步骤Ⅱ获得的粗提物经Sephadex LH-20葡聚糖凝胶柱层析，用甲醇进行洗脱，流速0.07个柱体积/小时，收集0.40～0.55个柱体积之间的洗脱液；

b.将步骤a收集的洗脱组分再进行反相硅胶柱层析，洗脱液为体积比70:30的甲醇-水，流速0.57个柱体积/小时，收集1.0～2.2个柱体积之间的洗脱液；该洗脱液组分再进行硅胶柱层析（40～63微米粒径硅胶），洗脱液为体积比20:1的氯仿-甲醇，流速0.46个柱体积/小时，收集1.8～3.1个柱体积之间的洗脱液；该洗脱液组分再使用Si60F254制备薄层层析板分离，展开剂为体积比3:4的环己烷-丙酮，展开后，割取Rf值为0.36、254nm紫外光下呈暗紫色的物质的条带，并用氯仿洗脱得到洗脱液；该洗脱液组分最后进行反相液相色谱制备层析（色谱柱Kromasil C-18，7微米填料,尺寸250mm*20mm），洗脱液为体积比50：50的甲醇甲酸溶液-水甲酸水溶液，其中甲醇甲酸溶液-甲酸水溶液，流速10mL/min，收集保留时间为39min的色谱峰，即为所述的化合物R6。

化合物R1-R6在254nm紫外线照射下均呈单个、均匀的深紫色斑点，硫酸茴香醛显色均为无色。其高效液相色谱-质谱联用分析的保留时间及分子量依次为15.2min(M=295)、12.7min(M=295)、12.7min(M=281)、11.2min(M=281)、10.2min(M=281)、9.0min(M=267).

所述的检测用高效液相色谱分析条件为Nucleosil C-18柱，填料粒径3微米，柱尺寸2.0mm×100mm,流动相为A相：0.1%甲酸水溶液，B相：0.06%甲酸乙腈溶液，0-15min10%B线性梯度增至100%B，15-20min为100%B，流速0.4mL/min；检测器为阵列二极管检测器、电喷雾质谱仪。

这些化合物具有以下理化和波谱特性：

化合物R1：无色粉末，熔点164～166℃；UVλmax nm(logε)(CHCl₃):215(5.07),225(5.07),235(4.67),280(3.41),320(3.27)；IR v_max:2935,2852,1593,1577,1471,1455,1404,1388,1241,1038,1022,771,764cm^-1;核磁共振氢谱、碳谱数据见图19；图3为高分辨ESI质谱显示化合物R1准分子离子峰[M+H]⁺质荷比为m/z296.1290，理论计算值C₁₈H₁₈NO₃ ⁺为m/z296.1281，表明吻合程度很好；

化合物R2：无色粉末，熔点179～181℃；UVλmax nm(logε)(CHCl₃):210(4.69),230(4.65),280(3.79),330(3.72)；IR v_max:2937,2836,1738,1645,1599,1463,1230,1108,1044,754cm^-1;核磁共振氢谱、碳谱数据见图19；图6为高分辨ESI质谱显示化合物R2准分子离子峰[M+H]⁺质荷比为m/z296.1282，C₁₈H₁₈NO₃ ⁺理论计算值为m/z296.1281，表明吻合程度很好；

化合物R3：无色粉末，熔点183～184℃；UVλmax nm(logε)(CHCl₃):205(4.67),210(4.61),225(4.61),240(4.56),280(3.85),310(3.72),320(3.69)；IR v_max:3065,2938,1590,1580,1471,1454,1404,1387,1348,1329,1238,1209,1137,1038,1022,1005,782,762cm^-1;核磁共振氢谱、碳谱数据见图19；图9为高分辨ESI质谱显示化合物R3准分子离子峰[M+H]⁺质荷比为m/z282.1127，C₁₇H₁₆NO₃ ⁺理论计算值为m/z282.1125，表明吻合程度很好；

化合物R4：无色粉末，熔点150～151℃；UVλmax nm(logε)(CHCl₃):210(4.62),220(4.63),240(4.58),280(4.10),325(4.07)；IR v_max:3004,2938,2894,2836,1650,1599,1562,1487,1431,1285,1222,1042,1015,780,755cm^-1;核磁共振氢谱、碳谱数据见图19；图12为高分辨ESI质谱显示化合物R4准分子离子峰[M+H]⁺质荷比为m/z282.1125，C₁₇H₁₆NO₃ ⁺理论计算值为m/z282.1125，表明吻合程度很好；

化合物R5：无色粉末，熔点199～201℃；UVλmax nm(logε)(CHCl₃):205(5.35),215(4.92),225(4.92),280(3.98),330(3.91)；IR v_max:3177,2936,2833,1631,1594,1461,1445,1323,1279,1266,1227,1107,1043,1024,997,779,753,709cm^-1;核磁共振氢谱、碳谱数据见图19；图15为高分辨ESI质谱显示化合物R5准分子离子峰[M+H]⁺质荷比为m/z282.1126，C₁₇H₁₆NO₃ ⁺理论计算值为m/z282.1125，表明吻合程度很好；

化合物R6：无色粉末，熔点242～247℃；UVλmax nm(logε)(MeOH):205(4.56),220(4.52),280(3.88),325(3.84)；IR v_max:3212,2938,2888,1739,1650,1597,1454,1410,1352,1284,1227,1041,1022,784,759cm^-1;核磁共振氢谱、碳谱数据见图19；图18为高分辨ESI质谱显示化合物R6准分子离子峰[M+H]⁺质荷比为m/z268.0969，C₁₆H₁₄NO₃ ⁺理论计算值为m/z268.0968，表明吻合程度很好；

其中：图1、4、7、10、13、16为化合物R1-R6的核磁共振氢谱(¹H NMR，CDCl₃,500MHz)，其化学位移归属、耦合常数详见图19;

图2、5、8、11、14、17为化合物R1-R6的核磁共振碳谱(¹³C NMR，CDCl₃,125MHz)，其化学位移归属、耦合常数详见图19。

实施例2

抑制肿瘤细胞生长实验：

采用抗肿瘤药物筛选常用的人结肠癌细胞株HCT116进行体外抗肿瘤活性试验。

方法：根据细胞生长速率，将处于对数生长期的肿瘤细胞接种于96孔培养板，贴壁生长24小时再加入待测喹啉酮类化合物。浓度设置500～4μM，每个浓度设两复孔。并设相应浓度的生理盐水溶媒对照及无细胞调零孔。肿瘤细胞在37℃、5%CO₂条件下培养24小时，然后倾去培养液，磷酸盐缓冲液洗涤一次倾去，用冷甲醇固定细胞，0℃放置10min后倾去甲醇，加入0.25mg/mL结晶紫染液室温染色5min后倾去染液，用蒸馏水洗涤5次，空气中自然干燥。然后加入DMSO，酶标仪570nm波长下测定A值。根据A值计算每孔抑制率，

每孔抑制率=(A_对照-A_处理)/A_对照×100%，并取平均值。

以抑制率—浓度作图，取对数趋势线，计算半抑制浓度IC50（参照文献CancerResearch,2004,64,7065–7072）。

实验结果：上述获得的喹啉酮类化合物中，化合物R1、R2、R3、R4、R5的IC50（24小时）依次为104、278、30、133、189μmol/L（分别为30.7、82.3、8.4、37.4、53.0μg/mL），表明其具有一定强度的抗肿瘤活性。

实施例3

抑革兰氏阳性细菌活性实验：

金黄色葡萄球菌是非常常见的病菌，有时候它会进入人体内而引起感染。这种感染轻微的会在皮肤上长疮和丘疹，严重的则可引起肺炎或血液感染。因此金黄色葡萄球菌是新抗生素研发的重要靶标病原微生物。

方法：使用国际标准的滤纸片法进行抗菌活性初筛，以抑菌圈直径衡量抗菌活性强弱（Clinical and Laboratory Standards Institute.2012.Performance Standardsfor Antimicrobial Disk Susceptibility Tests;Approved Standard.EleventhEdition M2–A11.）；复筛使用96孔板，采用国际标准的微量肉汤稀释法（NationalCommittee for Clinical Laboratory Standards.2012.Methods for dilutionantimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically,9thed.Approved standard M7–A6.），培养24h后加入MTT染色，540nm读取吸光度，测定化合物对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度（MIC值）及不同浓度下的抑菌率，培养基为标准的Muller-Hinton肉汤培养基。

抑菌率=100*（不加药孔菌液吸光度—加药孔菌液吸光度）/不加药孔菌液吸光度

实验结果：上述获得的喹啉酮类化合物中，化合物R1、R2、R3、R4、R5、R6在25μg/滤纸片的剂量下显示均有一定程度的平板抗金黄色葡萄球菌生长的活性，其抑菌圈直径在6.5～7.5mm；在微量稀释法测试中化合物R1、R6在0.125～125μg/mL浓度范围内，能部分抑制金黄色葡萄球菌的生长，化合物R1在8μg/mL仍有明显抑制活性，抑菌率达22.5%；化合物R6在1μg/mL仍有明显抑制活性，抑菌率达41.3%。说明这些化合物具有弱的抗菌活性。

实施例4

以大肠杆菌为靶标的DNA损伤修复实验：

DNA损伤修复实验的机理为采用两株由美国耶鲁大学大肠杆菌菌种库赠与的大肠杆菌进行对照抗菌试验，一株为DNA损伤修复基因正常的野生型大肠杆菌AB1157，一株为DNA损伤修复基因缺陷型的大肠杆菌AB3027,如果测试样品表现出对缺陷型菌株的显著选择抑制，则表明该样品可能具有损伤DNA的机制，由于很多抗菌、抗肿瘤药物均具有损伤DNA的作用机制，故该对照试验可用于筛选抗菌、抗肿瘤候选药物。

方法:使用96孔板采用国际标准的微量肉汤稀释法（National Committee forClinical Laboratory Standards.2003.Methods for dilution antimicrobialsusceptibility tests for bacteria that grow aerobically,5th ed.Approvedstandard M7–A6.），培养24h后加入MTT染色，540nm读取吸光度，测定化合物对野生型大肠杆菌和DNA损伤修复基因缺陷型大肠杆菌的MIC和不同浓度下的抑菌率，培养基为标准的营养肉汤培养基（NB）。

抑菌率=100*（不加药孔菌液吸光度—加药孔菌液吸光度）/不加药孔菌液吸光度

实验结果：上述获得的喹啉酮类化合物中，化合物R6在0.125～125μg/mL浓度范围内对野生型大肠杆菌无明显抑制能力，对DNA损伤修复基因缺陷型大肠杆菌则显示了部分抑制其生长的活性，在稀释至8μg/mL仍有抑制活性，抑菌率可达45.1%，其显示的选择抑制活性表明该化合物具有损伤DNA的能力，有可能作为抗菌或抗肿瘤药物。

实施例5

杀虫活性实验：

卤虫（Artemia salina）又称盐水丰年虫，属节肢动物门、甲壳纲、无甲目、盐水丰年虫科、卤虫属，是一种具有较高经济价值的鱼类饵料生物，也是一种对于毒素较为敏感的重要实验动物，其实验室培养的2～3龄幼虫可用于评价杀虫剂的活性强弱。

杀虫活性实验方法：

卤虫孵化与收集：经过室内自然光刺激复苏的冻存卤虫卵加入一个梨形玻璃漏斗中培养，其中盛有天然粗海盐配制的海水（30g/L），卵投放量为1g/L，用软管伸入底部柔和通入空气流。经28℃下约2000勒克斯光照24小时孵化后，对漏斗上半部分遮光，停止通气，使活的幼虫聚集到漏斗底部。开启阀门，用干净烧杯收集幼虫，用开口光润的移液枪头吸取烧杯中的卤虫幼虫进行后续试验。

卤虫生物致死法：将样品在96孔板中用无水甲醇连续倍半稀释成系列浓度，真空干燥除去有机溶剂，每孔加入200微升卤虫幼虫悬液（含20～30只虫体），并设置空白对照组，28℃培养24、48h后在双目体视显微镜下计数每孔中幼虫总数及死亡数，计算每孔的校正死亡率，

校正死亡率=（对照组死亡率—处理孔死亡率）/对照组存活率×100%；

以校正死亡率—浓度做图，取对数趋势线，计算半致死剂量LC₅₀。

实验结果：上述获得的喹啉酮类化合物中，化合物R2、R4的48h半致死剂量LC50依次为62、125μg/mL（其中化合物R2在125μg/mL浓度下24h致死率达到100%），表明其具有杀虫活性。

Claims (8)

1.喹啉酮类化合物，其特征在于：由海洋真菌壳青霉（Penicillium crustosum）AP2T1保藏编号为 CGMCC No.8516 衍生，所述喹啉酮类化合物的结构式为：

。

2.如权利要求1 所述的喹啉酮类化合物的制备方法，其特征在于包括如下操作步骤：

Ⅰ. 发酵从壳青霉（Penicillium crustosum）AP2T1 保藏编号为CGMCC No.8516 发酵产物中提取、分离纯化viridicatol；

Ⅱ. 甲基化

a. 将步骤Ⅰ获得的viridicatol 干燥后加入密闭反应容器，在氩气或干燥氮气保护下，按照每0.1g viridicatol 加入0.5~1.5mL 无水二甲基甲酰胺的比例添加，室温下磁力搅拌8~20min；

b. 搅拌状态下，向步骤a 产物中分三次，每次间隔15~25min，逐滴加入三甲基硅重氮甲烷的2.0M 二乙醚溶液，其每次加入的体积与步骤a 中viridicatol 的质量比为0.2~0.3mL：0.1~0.15mL：0.1~0.15mL：0.1g；

c. 继续搅拌2~4 小时，TLC 监测反应进程；

d. 真空抽干溶剂以终止反应；

e. 按照每0.1g viridicatol 加入0.1~0.5mL 水的比例加水，真空抽干；

f. 分离纯化得到化合物R3；

所述化合物 R3 在薄层层析板上，于254nm 紫外线照射下呈单个的深紫色斑点，在365nm 紫外线照射下呈单个的紫色荧光斑点，硫酸茴香醛显色为浅橙色；其高效液相色谱-质谱联用分析的保留时间及分子量为12.7 min、M=281；

检测用高效液相色谱分析条件为Nucleosil C-18 柱，填料粒径3 微米，柱尺寸2.0 mm×100 mm，流动相为A 相：0.1%甲酸水溶液，B 相：0.06%甲酸乙腈溶液，0-15min 10%B 线性梯度增至100%B，15-20min 为100%B，流速0.4 mL/min ；检测器为阵列二极管检测器、电喷雾质谱仪。

3.根据权利要求2 所述的制备方法，其特征在于，步骤Ⅰ中所述的提取包括以下操作步骤：过滤发酵产物，分别收集菌丝体和发酵液，并将获得的发酵液经乙酸乙酯萃取并浓缩，将获得的菌丝体用有机溶剂提取并浓缩，将所得浓缩物合并，即为粗提物；

其中，所述有机溶剂为丙酮、乙酸乙酯、乙醇、甲醇中一种或几种。

4.根据权利要求2 所述的制备方法，其特征在于，步骤Ⅰ中所述的分离纯化包括以下操作步骤：

将步骤Ⅰ中所获得的提取产物经色谱分离，得到在Si-60 F254 薄层层析板上Rf 值为0.27、254nm 紫外光下呈暗紫色、365nm 紫外线下有紫色荧光的物质viridicatol，层析展开剂为体积比为9:1 的氯仿-甲醇混合溶液。

5.根据权利要求2 所述的制备方法，其特征在于，步骤Ⅰ中的发酵所用培养基组成为：每升含土豆汁500 mL ，天然粗海盐配制的30~50 g/L 盐水500 mL ，蔗糖15~25 g。

6.根据权利要求3 所述的制备方法，其特征在于：步骤Ⅰ中发酵的条件是：26~30℃培养箱静止发酵25~35 天，发酵结束时加入发酵液一半体积的乙酸乙酯。

7.根据权利要求2 所述的制备方法，其特征在于：步骤Ⅱf中所述的分离纯化方法为薄层层析和反相柱层析法，其具体如下：

将步骤Ⅱe获得的中间体甲基化产物用有机溶剂溶解后，加样至Si-60 F254 制备薄层层析板，以体积比20：1 的氯仿-甲醇为展开剂进行层析后，刮取Rf 值为0.67 的带，研磨后用2~10：1 的氯仿-甲醇洗脱，收集洗脱液并浓缩干燥；其中Rf 值为0.67 的条带洗脱物为所述的化合物R3。

8.如权利要求1 所述的喹啉酮类化合物在制备抗肿瘤药物、抗细菌抗生素中的应用。