CN111004251B - 海洋来源杂萜化合物i和ii、制备方法及其在制备抗肿瘤药物中的应用 - Google Patents

海洋来源杂萜化合物i和ii、制备方法及其在制备抗肿瘤药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了海洋来源杂萜化合物I和II、制备方法及其在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明所述的化合物I和II是从海洋真菌Phomopsis tersa FS441的发酵培养物中分离制备得到的。经试验证明，化合物I和II对肝癌细胞HepG‑2、乳腺癌细胞MCF‑7、神经胶质瘤细胞SF‑268和非小细胞肺癌细胞A549的IC50值范围为0.5～17.6μM，显示出比较显著的抗肿瘤活性，可以用于制备抗肿瘤药物。

Description

海洋来源杂萜化合物I和II、制备方法及其在制备抗肿瘤药物 中的应用
技术领域
本发明属于医药生物技术领域，具体涉及化合物I和II及其制备方法和在制备抗肿瘤 药物中的应用。
背景技术
癌症正严重威胁着人类的健康。当前，抗肿瘤药物的市场份额也在不断扩大，抗癌药 物占医药市场份额高达30％。然而，目前抗癌药物大多存在特异性差、毒副作用强和价格 昂贵等缺陷，使得癌症患者常因药物昂贵而放弃治疗或副作用大而意外致死。因此，提高 抗癌药物特异性从而降低毒副作用将造福癌症患者，对人类健康和社会发展有着十分重要 的现实意义。抗癌药物的主要来源是天然产物及其衍生物。海洋微生物由于代谢产物丰富、 生长迅速、需求简单、可再生以及目的化合物产量高等优点，正成为新颖天然药物发现的 重要源泉。
发明内容：
本发明的第一个目的是提供具有抗肿瘤活性的海洋来源杂萜化合物I和II。
本发明的杂萜化合物，其结构如式(I)中任一所示：
Figure BDA0002256372020000021
本发明的第二个目的是提供一种化合物I和II的制备方法，该制备方法中所述的化合 物I和II是从海洋真菌Phomopsis tersa FS441的发酵培养物中分离制备得到的，具体包括 以下步骤：
(1)制备海洋真菌Phomopsis tersa FS441的固体发酵培养物，用乙酸乙酯萃取该固体 发酵培养物，将乙酸乙酯萃取液经浓缩后得浸膏；
(2)浸膏经过硅胶柱层析，用石油醚-乙酸乙酯以体积比为10:1，5:1，2:1，1:1，0:1和二氯甲烷-甲醇以体积比为10:1，5:1，0:1分别作为洗脱剂，梯度洗脱，收集石油醚-乙酸乙酯体积比5:1洗脱获得的且经TLC薄层层析以正己烷：乙酸乙酯＝2:1v/v展开得Rf＝0.3-0.4的组分Fr.4；
将组分Fr.4经反相柱色谱，用甲醇-水体积比70:30，80:20，90:10，100:0梯度洗脱， 收集甲醇-水体积比80:20洗脱组分Fr.4.8，收集甲醇-水体积比90:10洗脱组分Fr.4.11；
组分Fr.4.8经硅胶柱色谱，用二氯甲烷-甲醇以体积比为30:1，20:1，10:1，5:1，2:1作 为洗脱剂，梯度洗脱，收集二氯甲烷-甲醇体积比30:1洗脱获得的且经TLC薄层层析以正 己烷：乙酸乙酯＝1:1(v/v)展开得Rf＝0.4-0.5的组分Fr.4.8.1，Fr.4.8.1再经硅胶柱色谱， 以二氯甲烷-甲醇体积比40:1，30:1，20:1，10：1，5:1作为洗脱剂洗脱，收集二氯甲烷-甲 醇体积比30:1洗脱获得的并经TLC薄层层析以正己烷：乙酸乙酯＝1:1(v/v)展开得Rf＝ 0.4-0.5的组分Fr.4.8.1.2，将组分Fr.4.8.1.2用HPLC分离纯化，得到化合物II；
组分Fr.4.11经凝胶柱色谱，以二氯甲烷-甲醇体积比1:1进行洗脱，洗脱物经TLC薄层 层析以正己烷：乙酸乙酯＝1:1(v/v)展开得Rf＝0.3-0.4的组分组分Fr.4.11.3用HPLC 分离纯化，得到化合物I。
所述的制备海洋真菌Phomopsis tersa FS441的固体发酵培养物具体步骤为：挑取FS441 的菌丝接种于马铃薯葡萄糖液体培养基中，在28℃、120r/min条件下培养5天，制得种 子液，然后将种子液按0.1mL/g的接种量接种于大米培养基中，28℃条件下培养30天，制得FS441的固体发酵培养物，所述的马铃薯葡萄糖液体培养基，每升是通过以下方法配制的：用500mL的纯水煮200g的马铃薯，煮沸20min，过滤得马铃薯汁，再加入葡萄糖 20g、KH2PO43 g、MgSO41.5 g、维生素B110 mg，用水补足至1000mL，灭菌制得；所述 的大米培养基是通过以下方法配制的：按每280g大米与300mL质量体积比为0.5％g/ml 的粗海盐水溶液混合灭菌制得。
本发明的第三个目的是提供化合物I和/或II，或其药用盐在制备抗肿瘤药物中的应用。 所述的抗肿瘤药物优选为抗肝癌、乳腺癌、神经胶质瘤或非小细胞肺癌药物。
本发明通过实验发现，化合物I和II对肝癌细胞HepG-2、乳腺癌细胞MCF-7、神经胶质瘤细胞SF-268和非小细胞肺癌细胞A549的IC50值范围为0.5～17.6μM。阳性对照物阿 霉素对以上四种肿瘤细胞株的IC50值分别为1.2、1.5、1.1和1.4μM。此结果表明：本发明 的化合物I和II均具有比较显著的抗肿瘤活性。
本发明的第四个目的是提供一种抗肿瘤药物，该抗肿瘤药物包含化合物I和II中的至 少一种，或其药用盐作为活性成分。优选，所述的抗肿瘤药物为抗肝癌、乳腺癌、神经胶 质瘤或非小细胞肺癌药物。
本发明的第五个目的是提供海洋真菌Phomopsis tersa FS441在制备化合物I和/或II中 的应用。
与现有技术相比，本发明的优势在于：
本发明从海洋真菌Phomopsis tersa FS441中分离制备得到化合物I和II，该类化合物I 和II具有比较显著的抗肿瘤活性，可以用于制备抗肿瘤药物，为研究与开发新的抗肿瘤药 物提供了候选化合物，为开发利用海洋微生物来源的天然活性物质提供了科学依据。
本发明的海洋真菌Phomopsis tersa FS441已公开于Shanchong Chen,ZhaomingLiu, Haibo Tan,Yuchan Chen,Saini Li,Haohua Li,H.Guo,Shuang Zhu,Hongxin Liu,Weimin Zhang. Tersone A-G,new pyridone alkaloids from the deep-sea fungusPhomopsis tersa.Marine Drugs, 2019,17,394。该菌株本申请人也持有，并保证自申请日起20年内向公众提供。
附图说明
图1是化合物I的1HNMR谱；
图2是化合物I的13C NMR谱；
图3是化合物I的DEPT谱；
图4是化合物I的HSQC谱；
图5是化合物I的HMBC谱；
图6是化合物I的NOESY谱；
图7是化合物I的HR-ESIMS谱；
图8是化合物I的CD谱；
图9是化合物I的UV谱；
图10是化合物I的IR谱；
图11是化合物II的1HNMR谱；
图12是化合物II的13C NMR谱；
图13是化合物II的COSY谱；
图14是化合物II的HSQC谱；
图15是化合物II的HMBC谱；
图16是化合物II的NOESY谱
图17是化合物II的HR-ESIMS谱；
图18是化合物II的CD谱；
图19是化合物II的UV谱；
图20是化合物II的IR谱；
图21是化合物I(1)和II(2)的1H-1H COSY和HMBC相关图。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1
1、海洋真菌Phomopsis tersa FS441的分离纯化和鉴定
本发明的海洋真菌Phomopsis tersa FS441是2016年5月，从印度洋深海沉积物(88° 58.640'N,0°00.307'E，水深3000米)中分离得到的，经ITS序列分析鉴定，GenBank基因登录号为：MK592793，经blast比对，同源分析，鉴定该菌株属于Phomopsis属真菌， 命名为Phomopsis tersa FS441。
2、Phomopsis tersa FS441的固体发酵
将活化的深海真菌Phomopsis tersa FS441菌丝体接种于马铃薯葡萄糖液体培养基(每 升培养基是通过以下方法配制的：用500mL的纯水煮200g的马铃薯，煮沸20min，过滤得马铃薯汁，再加入葡萄糖20g、KH2PO43 g、MgSO41.5 g、维生素B110 mg，用水补足 至1000mL，灭菌制得)中，在28℃、120r/min条件下培养5天，制得种子液，然后将种 子液按0.1mL/g大米培养基的接种量接种于大米培养基(该培养基是通过以下方法配制的： 将280g大米与300mL质量体积比为0.5％mg/ml的粗海盐水溶液混合，121℃高压灭菌20 min，冷却，制得)中，28℃条件下培养30天，制得FS441的固体发酵培养物。
3、化合物I和/或II的制备
(1)往FS441的固体发酵培养物中加入乙酸乙酯，浸泡提取24小时，重复提取3次，提取液合并后经浓缩后得浸膏(177.9g)。
(2)浸膏经过硅胶柱层析(直径8cm玻璃柱，100-200目硅胶)，用石油醚-乙酸乙 酯以体积比为10:1，5:1，2:1，1:1，0:1和二氯甲烷-甲醇以体积比为10:1，5:1，0:1分别作 为洗脱剂，梯度洗脱，收集石油醚-乙酸乙酯体积比5:1洗脱获得的且经TLC薄层层析以正 己烷：乙酸乙酯＝2:1v/v展开得Rf＝0.3-0.4的组分Fr.4；
将组分Fr.4(41.8g)经反相柱色谱(直径3.5cm玻璃柱，填料为Rp-C18反相硅胶)，用甲醇-水70:30，80:20，90:10，100:0v/v梯度洗脱，得到15个亚组分Fr.4.1-Fr.4.15。收集甲醇-水80:20v/v洗脱下来的组分Fr.4.8，收集甲醇-水体积比90:10洗脱下来的组分Fr.4.11；
组分Fr.4.8再经硅胶柱色谱(直径2.5cm玻璃柱，100-200目硅胶)，用二氯甲烷-甲醇以体积比为30:1，20:1，10:1，5:1，2:1作为洗脱剂，梯度洗脱，收集二氯甲烷-甲醇体积比30:1洗脱获得的且经TLC薄层层析以正己烷：乙酸乙酯＝1:1(v/v)展开得Rf＝0.4-0.5的组分Fr.4.8.1，Fr.4.8.1再经硅胶柱色谱(直径2.5cm玻璃柱，100-200目硅胶)，以二氯甲烷-甲醇体积比40:1，30:1，20:1，10:1，5:1作为洗脱剂洗脱，收集二氯甲烷-甲醇体积比30:1洗脱获得的并经TLC薄层层析以正己烷：乙酸乙酯＝1:1(v/v)展开得Rf＝0.4-0.5 的组分Fr.4.8.1.2，将组分Fr.4.8.1.2经半制备HPLC在YMC-ODS-A/AQ柱，流动相为体积 比60:40的乙腈/水，流速为2mL/min，收集保留时间为34.8min的洗脱组分，得到化合物 II。
组分Fr.4.11经凝胶柱色谱(Sephadex LH-20)，以二氯甲烷-甲醇体积比1:1进行洗脱， 洗脱的组分经TLC薄层层析以正己烷：乙酸乙酯＝1:1(v/v)展开得Rf＝0.3-0.4的组分 Fr.4.11.3，Fr.4.11.3经半制备HPLC，使用YMC-ODS-A/AQ柱，流动相为体积比60:40的甲醇/水，流速为2mL/min，收集保留时间为40.7min的洗脱组分，得到化合物I。
4、化合物I和II的结构鉴定
1H-NMR、13C-NMR、HMBC核磁共振谱图用BrukerAdvance-600核磁共振光谱仪测定，以四甲基硅烷(TMS)为内标；ESI-MS数据用VGAutospec-3000型质谱仪测定；紫外光谱 用岛津UV-2600分光光度计测定，其结构鉴定如下：
如图1-21所示，图1是化合物I的1HNMR谱；图2是化合物I的13C NMR谱；图3 是化合物I的COSY谱；图4是化合物I的HSQC谱；图5是化合物I的HMBC谱；图6 是化合物I的NOESY谱；图7是化合物I的HR-ESIMS谱；图8是化合物I的CD谱；图 9是化合物I的UV谱；图10是化合物I的IR谱；
图11是化合物II的1HNMR谱；图12是化合物II的13C NMR谱；图13是化合物II 的COSY谱；图14是化合物II的HSQC谱；图15是化合物II的HMBC谱；图16是化合 物II的NOESY谱图17是化合物II的HR-ESIMS谱；图18是化合物II的CD谱；图19 是化合物II的UV谱；图20是化合物II的IR谱。
化合物I为黄色粉末(其核磁数据如表1所示)；根据HRESIMS[M–H]–m/z 535.2723，C23H33O3，计算值为535.2701，确定化合物的分子式为C32H40O7，不饱和度为13；1H-NMR 谱显示一个典型的四取代苯环信号[δH 6.16(1H,d,J＝2.4Hz,H-28),6.27(1H,d,J＝2.4Hz, H-30)]以及6个甲基氢信号[δH 1.43(3H,s,H3-20),1.01(3H,s,H3-21),1.09(3H,s,H3-22),1.02(3H,s,H3-23),1.54(3H,d,J＝1.5Hz,H3-24),2.10(3H,s,H3-32)]。13C-NMR谱以及DEPT谱显示有32个碳信号(表2)，包括12个季碳(包括6个连氧季碳)，9个次甲基，5个 亚甲基，以及6个甲基。化合物I的平面结构结构通过进一步分析其COSY、HSQC以及 HMBC等二维谱图得以确定(图21)，化合物I的绝对构型是通过计算ECD法得以确定。
化合物II为黄色粉末(其核磁数据如表1所示)；根据高分辨质谱(HRESIMS)[M+ H]+m/z 595.2906，C34H43O9，计算值为595.2902，确定化合物的分子式为C34H42O9，不饱和 度为14；通过分析其1D和2D谱图发现化合物II的谱图与化合物I的谱图具有极大的相似 度，化合物II具有与化合物I相同的B-D环系。进一步通过仔细分析化合物II的HMBC和 COSY相关谱图推测出化合物II和化合物I之间的差别主要存在于A环和E环上。A环由 苯环变成了庚三烯环，E环则为一个furan-2(5H)-one环，通过系统分析其二维谱确定了化 合物II的平面结构。化合物II的绝对构型是通过分析其NOESY谱及计算ECD法进行确定 的。
表1化合物I和II的核磁数据(600MHz/150MHz,δin ppm,Jin Hz)
Figure BDA0002256372020000091
Figure BDA0002256372020000101
aCD3COCD3.bCDCl3
经过上述方法分离的目标化合物I和II的结构式如式(I)所示：
Figure BDA0002256372020000102
实施例2
采用SRB法(Skehan P,Storeng R,Dominic S.New colorimetric cytotoxicityassay for anticancer-drug screening[J].JNatl Cance Inst,1990,82:1107–1112.)测试化合物I和II的抗 肿瘤活性。
1、试验用试剂：将本发明制备的化合物I和II用二甲基亚砜(DMSO)溶解得浓度为10mg/mL的母液，再用RPMI-1640培养基稀释至所需浓度。阳性对照为顺铂水溶液。
本实验所用肿瘤细胞株为肝癌细胞HepG-2、乳腺癌细胞MCF-7、神经胶质瘤细胞SF-268和非小细胞肺癌细胞A549。
2、实验方法：取对数生长期的HepG-2、MCF-7、SF-268和A549细胞，用胰酶消化，台盼蓝染色计数，台盼蓝排斥实验检测细胞活力大于95％后，用新鲜RPMI-1640培养基调整细胞浓度为3×104个/mL，细胞接种于96孔板，每孔加入180μL的细胞悬液，并设3个空白孔调零，于37℃、5％CO2培养箱培养24h。待细胞贴壁后，每孔加入20μL一定浓度的上述化合 物化合物I和II的溶液，阴性对照加20μLRPMI-1640培养基，以阿霉素作阳性对照，每个做 三个重复。置于37℃、5％CO2培养箱中培养72h后，加入50μL体积分数为50％的冷三氯醋 酸水溶液固定细胞，4℃放置1h后用蒸馏水洗涤5次，空气中自然干燥。然后加入由体积分 数1％冰醋酸水溶液配制的磺酰罗丹明B(Sulforhodamine B，SRB)4mg/mL溶液100μL/ 孔，室温中染色30min，去上清，用1％冰醋酸洗涤5次，空气干燥。最后加入200μL/孔，浓 度为10mmol/mL的Tris溶液，用酶标仪测定570nm处的吸光值(A)，用以下公式计算药物 对细胞生长的抑制率：细胞生长抑制率(％)＝(1-A样品组/A对照组)×100％。
3、实验结果：本发明制备的化合物I和II对四株肿瘤细胞的细胞毒性如表2所示。此 结果表明：本发明的化合物I和II具有比较显著的抗肿瘤活性，因此，本发明为研究与开发新的抗肿瘤药物提供了候选化合物，为开发利用深海微生物来源的天然活性物质提供了科学依据。
表2化合物I和II的对癌细胞的抑制效果
Figure BDA0002256372020000121
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发 明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通 技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进 和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.如式(I)所示的任一化合物：
Figure FDA0003467467870000011
2.一种权利要求1所述的化合物I和II的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备海洋真菌Phomopsis tersa FS441的固体发酵培养物，用乙酸乙酯萃取该固体发酵培养物，将乙酸乙酯萃取液经浓缩后得浸膏；
(2)浸膏经过硅胶柱层析，用石油醚-乙酸乙酯以体积比为10:1，5:1，2:1，1:1，0:1和二氯甲烷-甲醇以体积比为10:1，5:1，0:1分别作为洗脱剂，梯度洗脱，收集石油醚-乙酸乙酯体积比5:1洗脱获得的且经TLC薄层层析以正己烷：乙酸乙酯＝2:1v/v展开得Rf＝0.3-0.4的组分Fr.4；
将组分Fr.4经反相柱色谱，用甲醇-水体积比70:30，80:20，90:10，100:0梯度洗脱，收集甲醇-水体积比80:20洗脱组分Fr.4.8，收集甲醇-水体积比90:10洗脱组分Fr.4.11；
组分Fr.4.8经硅胶柱色谱，用二氯甲烷-甲醇以体积比为30:1，20:1，10:1，5:1，2:1作为洗脱剂，梯度洗脱，收集二氯甲烷-甲醇体积比30:1洗脱获得的且经TLC薄层层析以正己烷：乙酸乙酯＝1:1v/v展开得Rf＝0.4-0.5的组分Fr.4.8.1，Fr.4.8.1再经硅胶柱色谱，以二氯甲烷-甲醇体积比40:1，30:1，20:1，10：1，5:1作为洗脱剂洗脱，收集二氯甲烷-甲醇体积比30:1洗脱获得的并经TLC薄层层析以正己烷：乙酸乙酯＝1:1v/v展开得Rf＝0.4-0.5的组分Fr.4.8.1.2，将组分Fr.4.8.1.2用HPLC分离纯化，得到化合物II；
组分Fr.4.11经凝胶柱色谱，以二氯甲烷-甲醇体积比1:1进行洗脱，洗脱物经TLC薄层层析以正己烷：乙酸乙酯＝1:1v/v展开得Rf＝0.3-0.4的组分Fr.4.11.3用HPLC分离纯化，得到化合物I；
所述的将组分Fr.4.8.1.2用HPLC分离纯化具体为：将组分Fr.4.8.1.2经半制备HPLC在YMC-ODS-A/AQ柱，流动相为体积比60:40的乙腈/水，流速为2mL/min，收集保留时间为34.8min的洗脱组分，得到化合物II；
所述的将组分Fr.4.11.3用HPLC分离纯化具体为：将组分Fr.4.11.3经半制备HPLC，使用YMC-ODS-A/AQ柱，流动相为体积比60:40的甲醇/水，流速为2mL/min，收集保留时间为40.7min的洗脱组分，得到化合物I。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤(1)制备海洋真菌Phomopsis tersa FS441的固体发酵培养物具体步骤为：挑取FS441的菌丝体接种于马铃薯葡萄糖液体培养基中，在28℃、120r/min条件下培养5天，制得种子液，然后将种子液按0.1mL/g的接种量接种于大米培养基中，28℃条件下培养30天，制得FS441的固体发酵培养物，所述的马铃薯葡萄糖液体培养基，每升是通过以下方法配制的：用500mL的纯水煮200g的马铃薯，煮沸20min，过滤得马铃薯汁，再加入葡萄糖20g、KH2PO4 3g、MgSO4 1.5g、维生素B1 10mg，用水补足至1000mL，灭菌制得；所述的大米培养基是通过以下方法配制的：按每280g大米与300mL质量体积比为0.5％g/mL的粗海盐水溶液混合灭菌制得。
4.权利要求1所述的化合物I和/或II或其药用盐在制备抗肿瘤药物中的应用；所述的抗肿瘤药物为抗肝癌、乳腺癌、神经胶质瘤或非小细胞肺癌药物。
5.一种抗肿瘤药物，其特征在于，包含权利要求1中的化合物I和/或II或其药用盐作为活性成分。
6.海洋真菌Phomopsis tersa FS441在制备权利要求1中的化合物I和/或II中的应用。
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