CN114230578B - 一种二酮吗啉生物碱化合物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种二酮吗啉生物碱化合物及其制备方法和应用，属于海洋真菌活性成分分析技术领域。本发明从保藏号为CCTCC M 20211214的曲霉属真菌Aspergillus cf.terreus CXX‑158‑20的发酵培养物中提取、分离获得了3个具有新颖结构的二酮吗啉生物碱化合物，结构式如式(Ⅰ)‑(Ⅲ)所示。所述二酮吗啉生物碱化合物具有较好的抗肿瘤活性，尤其针对宫颈癌和肺癌，在制药领域具有良好的开发前景。
Description
技术领域
本发明涉及海洋真菌活性成分分析技术领域，具体涉及一种结构新型的二酮吗啉生物碱化合物及其制备方法和应用。
背景技术
海洋微生物由于其生存环境的艰难苛刻，如高盐、高压、低氧低光照等，在长期的进化过程中能够代谢产生一些结构独特的次生代谢产物。海洋微生物这种独特的代谢途径和遗传背景，使其成为开发新型药物的丰富资源。随着海洋微生物资源获取技术的进步，给海洋微生物源天然药源化合物的研究带来了前所未有的机遇。
海洋微生物中的海洋真菌是活性次级代谢产物的丰富的来源，海洋真菌的次级代谢产物70-80％具有生物活性，包括小分子内脂化合物；真菌毒素；对中枢神经系统有抑制活性的新物质；1-十二醇、不饱和烃、酸、酯；可抑制植物和人的真菌病毒作用于真菌细胞壁合成新靶位的脂肽类抗生素。以海洋真菌为原料发现具有特定结构类型的天然产物对于海洋药物的研发具有重要意义。
曲霉属真菌土曲霉(Aspergillus cf.terreus)属于半知菌纲，壳霉目，杯霉科。土曲霉是被广泛应用在化学和制药工业上的已知菌种，近年来从其代谢产物中分离并报道的化合物类型多样且具有较好的药理活性，如抗炎、抗菌以及抗肿瘤等。目前国内外报道中针对土曲霉的研究，主要成果集中于聚酮类、萜类和油脂类等。
陈修文等从深海来源土曲霉16-02-1的代谢产物中分离到新曲霉酸、ferrineoaspergillin、(2’S)-4-甲氧基-3-(2’-甲基-3’羟基)丙羟基-苯甲酸甲酯、黄曲霉素等化合物，对人慢性粒细胞白血病K562细胞、人早幼粒白血病 HL-60细胞、人宫颈癌HeLa细胞、人胃腺癌BGC-823细胞有一定抑制作用[深海来源曲霉16-02-1的代谢产物及其抗肿瘤抗真菌活性初步测评，中国海洋药物，2013年6月，第32卷第3期]。
专利文献CN 111499649 A公开从海洋微生物曲霉属真菌Aspergillus terreusCC-S06-18的发酵产物中分离得到一种具有抗肿瘤活性的苯并二呋喃酮类化合物，该化合物具有STAT3抑制活性，对胃癌细胞系有细胞毒性作用，并能诱导细胞周期停滞和凋亡。
迄今还未查到有文献报道从土曲霉代谢产物中分离得到具有抗肿瘤活性的二酮吗啉生物碱化合物。
发明内容
本发明的目的在于从海洋土曲霉菌的代谢产物中提取获得具有药用价值的天然活性物质。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明从中国台湾海洋沉积物中分离得到曲霉属真菌土曲霉(Aspergilluscf.terreus)CXX-158-20，对其在大米固体培养基中培养产生的次级代谢产物的化学成分及其生物活性进行了深入的研究，通过正向柱、反向柱、分子筛、高效液相色谱等手段从该菌代谢产物的乙酸乙酯提取物中分离纯化得到了3个单体二酮吗啉生物碱化合物。所述化合物的结构式选自式 (Ⅰ)-(Ⅲ)，
上述3个化合物为具有二酮吗啉和多取代苯环的二酮吗啉生物碱化合物。结构式如式(Ⅰ)所示的土曲霉吗啉A(化合物I)的分子式为C26H28N2O6，结构式如式(Ⅱ)所示的开环土曲霉吗啉A(化合物II)的分子式为 C27H32N2O6，结构式如式(Ⅲ)所示的开环土曲霉吗啉B(化合物III)的分子式为C27H32N2O7。
本发明还提供了所述二酮吗啉生物碱化合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)将保藏号为CCTCC NO：M 20211214的曲霉属真菌(Aspergillus cf. terreus)CXX-158-20活化后接种于大米固体培养基中，20-30℃静态培养 10-40天；
(2)发酵培养结束后，分离得到菌丝体和发酵液；
(3)将菌丝体加入甲醇中浸提，分离得到浸提液，浸提液浓缩后用蒸馏水混悬，得到水混悬液，然后用乙酸乙酯对水混悬液进行萃取，萃取液分离纯化后，制得二酮吗啉生物碱化合物；
利用乙酸乙酯对发酵液进行萃取，分离纯化制得二酮吗啉生物碱化合物；
所述分离纯化包括：a、将萃取液进行正相硅胶柱层析分离，依次以体积比9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:3、1:9的正己烷/ 乙酸乙酯的混合液或者石油醚/乙酸乙酯混合液进行梯度洗脱，收集体积比 6:1和5:1的馏分；b、5:1的馏分用氯仿重结晶得到粗结晶a，再利用高效液相色谱分离，流动相为65％甲醇/水，流速为3mL/min，收集保留时间 23.3min的馏分，得到结构式如式(Ⅰ)的化合物I，收集保留时间28.0min 的馏分，得到结构式如式(Ⅱ)的化合物II；6:1的馏分用体积比为1:5的甲醇/氯仿重结晶得到粗结晶b，再利用高效液相色谱分离，流动相为68％甲醇/水，流速为3mL/min，收集保留时间34.2min的馏分，得到结构式如式(Ⅲ)的化合物III；
或者，步骤b中，合并6:1和5:1的馏分，进行反相硅胶柱层析，依次以体积比1:9、2:8、3:7、4:6、5:5、6:4、7:3、8:2、9:1的甲醇/水混合液进行梯度洗脱，收集7:3馏分，再利用凝胶LH-20尺寸排阻色谱分离获得目标馏分，继而用高效液相色谱分离，流动相为体积比40％-90％的甲醇/ 水梯度洗脱，流速为10mL/min，保留时间45分钟的峰为化合物I，保留时间47分钟的峰为化合物II，保留时间50分钟的峰为化合物III。
步骤(1)中，对真菌土曲霉Aspergillus cf.terreus CXX-158-20进行发酵培养。
作为优选，菌种活化采用PDA培养基，以体积1L计，包括以下原料：土豆200g、葡萄糖20g、琼脂20g、余量为H2O，pH自然。
发酵培养采用大米固体培养基，具体的，包括以下原料：每60g大米中添加海盐2g，水90mL，pH为自然。
优选的，发酵培养的温度为22-26℃。更优选为25℃培养20天。
步骤(2)和(3)中，分离获得菌丝体和发酵液，所述的菌丝体和发酵液中均能提取分离得到二酮吗啉生物碱化合物。
其中，利用菌丝体获取生物碱化合物时，将菌丝体置于甲醇中浸泡 7-14天，菌丝体充分破壁，使胞内物质有效溶出。
利用发酵液获取生物碱化合物时，将发酵液与硅藻土搅拌后，采用乙酸乙酯回流进行萃取。
所述的分离纯化为：对萃取液进行正相硅胶柱层析分离，所得馏分再进行反相硅胶柱层析、排阻色谱分离和高效液相色谱分离。通过多步分离纯化，能获得纯度较高的二酮吗啉生物碱化合物。
本发明研究表明，利用上述方法从土曲霉Aspergillus cf.terreus CXX-158-20发酵培养物中分离得到的二酮吗啉生物碱化合物具有较好的抗肿瘤活性，针对宫颈癌Hela细胞，化合物I的IC50值为13.0μM，化合物II的IC50值为21.6μM，化合物II的IC50值为28.9μM；针对肺癌细胞 A549，化合物I的IC50值为12.9μM，化合物II的IC50值为16.3μM，化合物II的IC50值为19.3μM，优于临床化疗药5-氟脲嘧啶(5-FU)。
因此，本发明还提供了所述的二酮吗啉生物碱化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。具体地，所述肿瘤为宫颈癌或肺癌。
本发明还提供了一种药物组合物，包括有效剂量的二酮吗啉生物碱化合物和药剂学上可接受的辅料。
所述药物以本发明的二酮吗啉生物碱化合物为主要活性成分，添加药剂学上可接受的辅料制成，可按照药剂学上记载的制剂制备方法制成制剂。所述的制剂可以为注射液、滴注液、粉针剂、颗粒剂、片剂、冲剂、散剂、口服液、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、口含剂、颗粒剂、丸剂、膏剂、丹剂、喷雾剂、滴丸剂、崩解剂、口崩片、微丸等。
本发明具备的有益效果：
(1)本发明从海洋真菌Aspergillus cf.terreus CXX-158-20在含有海盐的大米培养基中发酵培养产生的次级代谢产物中提取、分离获得了一种具有新颖结构的二酮吗啉生物碱化合物，该方法操作简便、提取得率高、产物纯度高，适合规模化生产。
(2)通过体外抗肿瘤试验，表明本发明提供的二酮吗啉生物碱化合物具有较好的抗肿瘤活性，可将其用于制备抗肿瘤药物，具有良好的开发前景。
附图说明
图1为本发明化合物I的1H NMR图谱(in CD3OD)。
图2为本发明化合物I的13C NMR图谱(in CD3OD)。
图3为本发明化合物II的1H NMR图谱(in CD3OD)。
图4为本发明化合物II的13C NMR图谱(in CD3OD)。
图5为本发明化合物III的1H NMR图谱(in CD3OD)。
图6为本发明化合物III的13C NMR图谱(in CD3OD)。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。以下实施例仅用于说明本发明，不用来限制本发明的适用范围。在不背离本发明精神和本质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所做的修改或替换，均属于本发明的范围。
下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例中采用的真菌土曲霉(Aspergillus cf.terreus)CXX-158-20分离自中国台湾海洋沉积物，经分子生物学与菌落形态鉴定为曲霉属真菌土曲霉。于2021年9月24日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国，武汉，武汉大学，保藏号为：CCTCC NO：M20211214，于2021年10月 9日检测为存活。
PDA固体培养基的制备：土豆200g、葡萄糖20g、琼脂20g、dd H2O 补齐1L，121℃灭菌30min，pH自然。
大米固体培养基的制备：大米60g，海盐2g，水90mL，121℃灭菌 30min，PH自然。
实施例1真菌土曲霉Aspergillus cf.terreus CXX-158-20的分离
先将海底沉积物样品放在无菌的培养皿中，在自然环境中风干，然后称取1g风干沉积物样品，用10mL 50％的海水溶解得10-1溶液，继续稀释到10-2、10-3，得三个梯度的样品液。分别取100μL涂布在分离培养基GPY 培养基、Martin培养基、CA培养基、PDA培养基、SDA培养基及察氏培养基上，每个不同稀释浓度的分离培养基2个平行，在28℃下培养1～8周。观察并挑取其中的单菌落，接种在察氏培养基上，获得纯培养菌株，经分子生物学与菌落形态鉴定为曲霉属真菌土曲霉，命名为Aspergillus cf. terreus CXX-158-20。
实施例2真菌土曲霉Aspergillus cf.terreus CXX-158-20的发酵培养
将真菌土曲霉Aspergillus cf.terreus CXX-158-20制成孢子悬浮液，接种到PDA固体培养基中活化，再接种到在大米固体培养基中进行大量发酵，在室温下静置发酵20天。
实施例3化合物的制备
真菌土曲霉Aspergillus cf.terreus CXX-158-20发酵培养后，取5L发酵培养液，离心取沉淀得到菌丝体；菌丝体用甲醇浸泡1周，浸泡液经浓缩后用1L蒸馏水混悬，水混悬液合并，用6L乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯萃取液经浓缩得到浸膏10g；用硅胶(100目，100g)拌样，进行正相硅胶柱层析分离(200-300目，100g；硅胶柱尺寸L 50mm，)，依次以体积比9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:3、1:9的石油醚/乙酸乙酯混合液和乙酸乙酯进行梯度洗脱，每次300mL；TLC检测馏分；收集5:1馏分再用氯仿重结晶得到主要为化合物I和化合物II的粗结晶a。粗结晶a采用制备型HPLC(YMC-Pack ODS-A，65％甲醇/水，3mL/min) 得到化合物I(保留时间Rt:23.3min)和化合物II(保留时间Rt:28.0min)。收集6:1馏分再用甲醇：氯仿(1：5)重结晶得到主要为化合物III的粗结晶 b。粗结晶b采用制备型HPLC(YMC-Pack ODS-A，68％甲醇/水，3mL/min) 得到化合物III(保留时间Rt:34.2min)。
实施例4化合物的制备
真菌土曲霉Aspergillus cf.terreus CXX-158-20发酵培养后，取5L发酵培养液，离心取上清得到发酵液；发酵液浓缩，用10g硅藻土拌样，1L 乙酸乙酯回流，进行正相硅胶柱层析分离(200-300目，1kg；硅胶柱尺寸L 50mm，)，依次以体积比9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、 1:1、1:3、1:9的正己烷与乙酸乙酯的混合液或者石油醚/乙酸乙酯混合液和乙酸乙酯进行梯度洗脱，收集体积比6:1和5:1的石油醚/乙酸乙酯混合液或正己烷与乙酸乙酯的混合液洗脱出的馏分；收集的馏分再进行反相硅胶柱层析，依次以体积比1:9、2:8、3:7、4:6、5:5、6:4、7:3、8:2、9:1的甲醇/水混合液进行梯度洗脱，收集7:3馏分，合并7:3馏分洗脱液；反相硅胶柱层析收集的7:3合并馏分继续使用凝胶LH-20尺寸排阻色谱分离，以甲醇为洗脱剂，0.5mL/min，收集60份馏分，每份10mL，合并第20-35 馏分，继而用高效液相色谱分离，流动相为体积比40％-90％甲醇/水梯度洗脱，流速为10mL/min，保留时间45.3分钟的峰为化合物I，保留时间 47.2分钟的峰为化合物II，保留时间50.0分钟的峰为化合物III。
实施例5化合物I的结构鉴定
采用HPLC对制得的化合物进行纯度鉴定，纯度大于98％的样品运用质谱和核磁共振技术进行结构鉴定，核磁共振用日本电子公司JEOL 600MHz NMR Sectrometer测定，TMS作内标；高分辨质谱用美国Agilent 公司6230TOF LC/MS Spectrometer测定。
化合物I为棕色固体粉末，分子旋光其高分辨质谱(HRESIMS)测定结果为m/z 463.1872[M-H]+，结合13C-NMR数据推测其分子式为C26H28N2O6，不饱和度为17。
该化合物的氢谱、碳谱和HSQC表明其含有1个甲氧基[δH 3.72(s, OCH3-8,δC56.3)]，2个甲基[δH 1.29(s,CH3-16,δC 24.9)，δH 1.32(s,CH3-17, δC 25.1)]，3个亚甲基，10个次甲基，10个季碳[δC 169.3,87.7,125.6,149.1, 131.9,137.2,95.0,45.1,166.5,137.4]以及3个可交换质子信号[δH 5.56(s, OH-4),8.51(s,OH-9),6.36(s,NH-10)]。分析该化合物的核磁共振数据(表1) 可以确定该化合物是二酮吗啉类化合物类似物。通过OCH3-8(δH 3.72,s,δC 56.3)与C-8，H-6(δH 6.60,d,J＝8.2,δC 115.3)与C-8，OH-4(δH5.56,s)与 C-8/C-10的HMBC相关信号；H-6与H-7(δH 6.34,d,J＝8.2,δC 104.3)1H-1H COSY相关信号证明了C-8(δC 149.1)号位氢的丢失，且被甲氧基取代。由此我们确定了化合物I的结构如下所示：
表1生物碱化合物I的NMR数据
实施例6化合物II的结构鉴定
采用HPLC对制得的化合物进行纯度鉴定，纯度大于98％的样品运用质谱和核磁共振技术进行结构鉴定，核磁共振用日本电子公司JEOL 600MHz NMR Sectrometer测定，TMS作内标；高分辨质谱用美国Agilent 公司6230TOF LC/MS Spectrometer测定。
化合物II为黄色油状液体，分子旋光其高分辨质谱(HRESIMS)测定结果为m/z 481.2340[M+H]+,结合13C-NMR数据推测其分子式为C27H32N2O6，不饱和度为13。
该化合物的氢谱表明其含有2个sp杂化的亚甲基，1个sp2杂化的亚甲基(δH 5.02,1H,d,J＝8.3；5.11,1H,d,J＝11.6)，2个sp3杂化的次甲基(δH 4.00,1H,dd,J＝3.9,10.4；4.03,1H,dd,J＝3.1,9.7)，9个sp2杂化的次甲基(δH 6.05,1H,dd,J＝17.5,10.8；6.47,1H,d,J＝2.4；6.59,1H,dd,J＝8.3,8.4；7.19, 1H,dq,J＝4.2,8.7；7.26,4H,d,J＝4.3)，2个甲基(δH 1.01,3H,s；1.11,3H,s) 和2个携氧甲基(δH 3.57,3H,s；3.78,3H,s)。根据其碳谱和HSQC表明其含有3个羰基碳(δC 173.0,176.3,183.1)，3个亚甲基，11个次甲基，6个季碳， 2个甲基和2个甲氧基。这与已知化合物seco-shornephine A methyl ester 表现出十分相似的结构特征，区别在于C-8明显向低场移动，且 C8-OCH3(δH 3.78,3H,s,δC 55.9)对C-8存在的明显HMBC信号，C-9明显向高场移动且C9-H(δH 6.47,1H,d,J＝2.4Hz)取代了C9-OH，H-9对H-5/ H-7/H-8的HMBC信号证明了化合物II的结构如下所示：
表2生物碱化合物II的NMR数据
实施例7化合物III的结构鉴定
采用HPLC对制得的化合物进行纯度鉴定，纯度大于98％的样品运用质谱和核磁共振技术进行结构鉴定，核磁共振用日本电子公司JEOL 600MHz NMR Sectrometer测定，TMS作内标；高分辨质谱用美国Agilent 公司6230TOF LC/MS Spectrometer测定。
化合物III为黄色油状液体，分子旋光其高分辨质谱(HRESIMS)测定结果为m/z 497.2293[M+H]+,结合13C-NMR数据推测其分子式为C27H32N2O7，不饱和度为13。
该化合物的核磁数据(表3)表现出与化合物II相似的结构特征，不同的是C-9的化学位移明显向低场移动，C-10的化学位移明显向高场移动且H-7的裂分从dd峰(J＝8.3,2.4Hz)变成了d峰(J＝8.2Hz)，结合确定了化合物II中C9-H(δC 98.0,δH 6.47)被C9-OH(δC132.2)取代，由此确定了化合物III的结构如下所示：
表3生物碱化合物III的NMR数据
实施例8化合物抗肿瘤活性分析
Hela和A549细胞培养于含10％小牛血清、青霉素100IU/mL及链霉素100g/mL的RP-MI 1640培养基中，每3d换液1次，每5d传代1次。细胞均置于37℃。取对数生长期细胞，以RPMI 1640培养基稀释成 5×104/mL单细胞悬液，接种于96孔细胞培养板，每个浓度复种3孔，每孔180μL。置培养箱温育12h后，药物组每孔加不同浓度供试液20μL，平行设空白对照组(用等体积的RPMI 1640培养基代替受试药物)，阳性对照组(5-FU)共培养48h。每孔加入1mg/mL MTT溶液50μL，继续培养4h 后，吸尽上清液，每孔加入二甲基亚砜(DMSO)150μL，充分溶解MTT还原产物。置酶标仪上于492nm波长处测定各药物组和空白组的光密度(D)，按公式计算得到药物对肿瘤细胞的半数抑制浓度(IC50)，并对药效进行初步的评价。
IR(％)＝(1-加药组平均D值/对照组平均D值)×100％。
实验结果知，上述化合物具有较好的抗肿瘤活性，针对肿瘤细胞Hela，化合物I的IC50值为13.0μM，化合物II的IC50值为21.6μM，化合物II 的IC50值为28.9μM，阳性对照5-FU的IC50值为18.3μM；针对肿瘤细胞A549，化合物I的IC50值为12.9μM，化合物II的IC50值为16.3μM，化合物II的IC50值为19.3μM，阳性对照5-FU的IC50值为24.2μM。表明该化合物具有较好的抗肿瘤作用，可用于制备抗肿瘤药物，具有良好的开发前景。
Claims (7)
1.一种二酮吗啉生物碱化合物，其特征在于，所述化合物的结构式选自式(Ⅰ)-(Ⅲ)，
2.如权利要求1所述的二酮吗啉生物碱化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将保藏号为CCTCC NO：M 20211214的真菌土曲霉(Aspergillus cf.terreus)CXX-158-20活化后接种于大米固体培养基中，20-30℃静态培养10-40天；
(2)发酵培养结束后，分离得到菌丝体和发酵液；
(3)将菌丝体加入甲醇中浸提，分离得到浸提液，浸提液浓缩后用蒸馏水混悬，得到水混悬液，然后用乙酸乙酯对水混悬液进行萃取，萃取液分离纯化后，制得二酮吗啉生物碱化合物；
利用乙酸乙酯对发酵液进行萃取，分离纯化制得二酮吗啉生物碱化合物；
所述分离纯化包括：a、将萃取液进行正相硅胶柱层析分离，依次以体积比9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:3、1:9的正己烷/乙酸乙酯的混合液或者石油醚/乙酸乙酯混合液进行梯度洗脱，收集体积比6:1和5:1的馏分；b、5:1的馏分用氯仿重结晶得到粗结晶a，再利用高效液相色谱分离，流动相为65％甲醇/水，流速为3mL/min，收集保留时间23.3min的馏分，得到结构式如式(Ⅰ)的化合物I，收集保留时间28.0min的馏分，得到结构式如式(Ⅱ)的化合物II；6:1的馏分用体积比为1:5的甲醇/氯仿重结晶得到粗结晶b，再利用高效液相色谱分离，流动相为68％甲醇/水，流速为3mL/min，收集保留时间34.2min的馏分，得到结构式如式(Ⅲ)的化合物III；
或者，步骤b中，合并6:1和5:1的馏分，进行反相硅胶柱层析，依次以体积比1:9、2:8、3:7、4:6、5:5、6:4、7:3、8:2、9:1的甲醇/水混合液进行梯度洗脱，收集7:3馏分，再利用凝胶LH-20尺寸排阻色谱分离获得目标馏分，继而用高效液相色谱分离，流动相为体积比40％-90％的甲醇/水梯度洗脱，流速为10mL/min，保留时间45分钟的峰为化合物I，保留时间47分钟的峰为化合物II，保留时间50分钟的峰为化合物III。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述活化采用PDA培养基，以体积1L计，所述的PDA培养基包括以下原料：土豆200g、葡萄糖20g、琼脂20g、余量为H2O，pH自然。
4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述大米固体培养基包括以下原料：每60g大米中添加海盐2g，水90mL，pH为自然。
5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，发酵培养条件为25℃下静态培养20天。
6.如权利要求1所述的二酮吗啉生物碱化合物在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述肿瘤为宫颈癌或肺癌。
7.一种药物组合物，其特征在于，包括有效剂量的如权利要求1所述的二酮吗啉生物碱化合物和药剂学上可接受的辅料。
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