CN110498805B - 双呋喃并呫吨酮和双呋喃并蒽醌类化合物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了双呋喃并呫吨酮和双呋喃并蒽醌类化合物及其制备方法和应用。所述的双呋喃并呫吨酮和双呋喃并蒽醌类化合物austocystins J、K、M、N、O和7‑chloro versicolorin A的结构式如式(Ⅰ)所示。化合物austocystins J、K、M、N和7‑chloro versicolorin A是从Asprergillus puniceus SCSIO z021的发酵液和菌丝体中分离得到的,austocystin O是经催化还原得到,经试验证明,本发明的6个化合物austocystins J、K、M、N、O和7‑chloro versicolorin A具有选择性抑制蛋白酪氨酸磷酸酶活性,它们可用于蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂先导化合物的研究。
Description
技术领域
本发明属于海洋生物领域,具体涉及6个双呋喃并呫吨酮和双呋喃并蒽醌类化合物及其制备方法和在制备蛋白酪氨酸磷酸酶(PTPs)抑制剂中的应用。
背景技术
蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)在人体表达水平和活性的异常会导致糖尿病和癌症等人类重大疾病,通过在PTP水平调节控制疾病以及筛选和发现PTP抑制剂具有很大的应用潜力,PTPs在疾病发展和药物靶标潜力中的作用日益引起关注。发现高效的化学小分子PTPs抑制剂不仅对开发与PTPs相关疾病治疗的新药具有重要意义,也可作为探针来研究并解释PTP在特定细胞内信号转导通路中的重要作用。蛋白酪氨酸磷酸酯酶家族(PTPs)的活性异常会导致酪氨酸磷酸化程度调控紊乱,是导致包括糖尿病、风湿性关节炎、紅斑狼疮和癌症、心血管疾病、神经性以及代谢方面疾病等诸多人类疾病的重要原因。PTPs被认为是治疗多种难点疾病的潜在靶标。例如,PTP1B不仅是胰岛素和瘦素信号转导的关键生理调节因子,而且与ER应激以及胰岛β细胞之间也有重要关联,PTP1B功能障碍会导致2型糖尿病和肥胖症等;生殖细胞或体细胞中的SHP2突变可显著激活SHP2的催化活性,导致Noonan综合征和各种儿童白血病。T-细胞蛋白酪氨酸磷酸酶(即TCPTP)对控制肥胖、炎症、肿瘤起重要作用。SHP1和SHP2均与免疫疾病、癌症、神经疾病、感染性疾病有密切关系。PTP-MEG2参与调控造血细胞的同型囊泡融合以及导致吞噬细胞的过程等,也是胰岛素的负调节因子,因此被认为是治疗糖尿病等疾病的潜在靶点。
发明内容
本发明的第一个目的是提供对多种蛋白酪氨酸磷酸酶有抑制作用的6个新双呋喃并呫吨酮和双呋喃并蒽醌类化合物austocystins J、K、M、N、O和7-chloro versicolorinA。
本发明6个新双呋喃并呫吨酮和双呋喃并蒽醌类化合物austocystins J、K、M、N、O和7-chloro versicolorin A,其结构式如式(Ⅰ)所示,
本发明的第二个目的是提供化合物austocystins J、K、M、N和7-chloroversicolorin A的制备方法,它们是从真菌Asprergillus puniceus SCSIO z021的菌丝体中分离得到的。
优选,具体步骤如下:
(a)制备真菌Asprergillus puniceus SCSIO z021的发酵产物;
(b)将步骤(a)得到的发酵产物过滤除去菌液得到菌丝体,菌丝体破碎后用丙酮浸泡,提取液减压浓缩除去丙酮,剩余水相用乙酸乙酯萃取,浓缩得菌体的乙酸乙酯提取物;
(c)将步骤(b)所述的乙酸乙酯提取物经过正相硅胶柱层析,依次用二氯甲烷:甲醇从体积比为100:0,98:2,95:5,92:8,90:10,80:20,70:30的溶剂系统梯度洗脱,结合TLC和HPLC分析结果,合并为9个组分Fr.1~Fr.9。
收集二氯甲烷:甲醇体积比98:2冲洗下来的样品得到组分Fr.3(5g)经过凝胶柱(CH2Cl2/CH3OH,1:1)分离得到三个组分,收集在薄层层析上以CH2Cl2:CH3OH=3:0.1为展开剂展开,收集主点Rf=0.25-0.75的组分Fr.3-3,经过中压反相(ODS)柱分离,以甲醇/水/TFA(30:70:0.03-100:0:0.03)梯度洗脱,收集甲醇/水/TFA体积比为55:45:0.03洗脱的样品Fr.3-3-6,经过制备型HPLC纯化(CH3CN/H2O/TFA,62:38:0.03,5mL/min),得到化合物2(austocystin K)(12.9mg,tR=41.4min);收集甲醇/水/TFA体积比为86:14:0.03洗脱的样品Fr.3-3-14,通过HPLC纯化(CH3OH/H2O/TFA,81:19:0.03,5mL/min),得到化合物austocystin H(40.9mg,tR=44min)和3(austocystin M)(22.7mg,tR=50.6min)。
称取austocystin H(4.5mg),溶解于0.6mL的乙醇和少量丙酮的混合溶剂中(注:丙酮可增加样品溶解度),加入10%钯碳15mg做催化剂,给反应体系中通入氢气(稀硫酸与适量的锌粒反应制备,通过气球收集),在30℃条件下搅拌2-3h,至底物反应完全,棉花过滤除去反应混合物中的钯碳,并用乙醇和丙酮冲洗,减压浓缩得到反应粗产物,通过HPLC纯化(YMC-Pack ODS-A column,250×4.6mm),以89%的甲醇/水(含0.03%TFA)为流动相等度洗脱(1mL/min),制备得到化合物5(austocystin O)(4.0mg,tR=12.0min)。
收集二氯甲烷:甲醇体积比92:8冲洗下来的样品得到组分Fr.5(2.7g),经过滤除去甲醇微溶的白色晶体,剩余部分经过中压反相(ODS)柱层析,以甲醇/水/TFA(27:73:0.03-100:0:0.03)梯度洗脱。收集甲醇/水/TFA体积比为58:42:0.03洗脱的样品Fr.5-7,经凝胶柱(CH2Cl2/CH3OH,1:1)和制备型HPLC纯化,以甲醇/水/TFA(68:32:0.03,5mL/min)等度洗脱得到化合物1(austocystin J)(13.8mg,tR=29.2min);收集甲醇/水/TFA体积比为90:10:0.03洗脱的样品Fr.5-13依次经凝胶柱(CH2Cl2/CH3OH,1:1)和HPLC纯化(CH3OH/H2O/TFA,80:10:0.03,5mL/min),得到化合物6(7-chloro versicolorin A)(4.2mg,tR=37.2min)和一对混合物(28.2mg,tR=37.7min),此混合物通过手性柱(CHIRALPAK IA 4.6×250mm,5μm)分离,以乙醇(含0.1%TFA)/正己烷(体积比14:86,1mL/min)等度洗脱,得到化合物4(austocystin N)(13.5mg,tR=22.7min)。
进一步优选,步骤(a)中所述的发酵液是通过以下方法制备:将真菌Asprergilluspuniceus SCSIO z021在真菌适用的平板培养基中生长,待真菌长出孢子后,将真菌接种到发酵培养基中,于室温静置培养30天,得到发酵液,所述的发酵培养基每升是通过以下方法配制的:用500mL的纯水煮200g的马铃薯,煮沸20min,过滤得马铃薯汁,再加入葡萄糖20g、海盐30g,用水补足至1000mL。
进一步优选,步骤(b)所述的浓缩是采用减压浓缩。
本发明的第三个目的是提供化合物austocystin O的制备方法,它是经化合物Austocystin H的催化还原得到的。
本发明的第四个目的是提供化合物austocystins J、K、M、N、O或7-chloroversicolorin A或其药用盐在制备PTPs抑制剂中的应用。
当为化合物austocystins J或其药用盐时,是化合物austocystins J或其药用盐在制备TCPTP、SHP1或MEG2酶抑制剂中的应用;
当为austocystins K或其药用盐时,是化合物austocystins K在制备TCPTP或SHP1酶抑制剂中的应用;
当为austocystins M或其药用盐时,是化合物austocystins M或其药用盐在制备TCPTP、SHP2、MEG2或PTP1B酶抑制剂中的应用;
当为austocystins N或其药用盐时,是化合物austocystins N或其药用盐在制备TCPTP或SHP1酶抑制剂中的应用;
当为austocystins O或其药用盐时,是化合物austocystins O或其药用盐在制备TCPTP、SHP1、MEG2或PTP1B酶抑制剂中的应用;
当为7-chloro versicolorin A或其药用盐时,是化合物7-chloro versicolorinA或其药用盐在制备TCPTP、SHP1、SHP2、MEG2或PTP1B酶抑制剂中的应用。
由于PTP1B不仅是胰岛素和瘦素信号转导的关键生理调节因子,而且与ER应激以及胰岛β细胞之间也有重要关联,PTP1B功能障碍会导致2型糖尿病和肥胖症等;因此PTP1B酶抑制剂可以用于制备治疗2型糖尿病和/或肥胖症的药物中应用。
生殖细胞或体细胞中的SHP2突变可显著激活SHP2的催化活性,导致Noonan综合征和各种儿童白血病。因此SHP2酶抑制剂可以用于制备治疗Noonan综合征和/或各种儿童白血病的药物中应用。
T-细胞蛋白酪氨酸磷酸酶(即TCPTP)对控制肥胖、炎症、肿瘤起重要作用。因此TCPTP酶抑制剂可以用于制备治疗肥胖、炎症、肿瘤的药物中应用。
SHP1和SHP2均与免疫疾病、癌症、神经疾病、感染性疾病有密切关系。因此SHP1和SHP2酶抑制剂可以用于制备治疗免疫疾病、癌症、神经疾病、感染性疾病的药物中应用。
PTP-MEG2参与调控造血细胞的同型囊泡融合以及导致吞噬细胞的过程等,也是胰岛素的负调节因子,因此被认为是治疗糖尿病等疾病的潜在靶点。因此MEG2酶抑制剂可以用于制备治疗糖尿病的药物中应用。
本发明的第五个目的是提供一种PTPs抑制剂,所述的PTPs抑制剂含有化合物austocystins J、K、M、N、O或7-chloro versicolorin A中任一化合物或其药用盐作为活性成分。
本发明的第六个目的是提供真菌Asprergillus puniceus SCSIO z021在制备化合物austocystins J、K、M、N、O或7-chloro versicolorin A中的应用。
本发明从一株海洋真菌A.puniceus SCSIO z021的发酵产物及其发酵产物的催化还原产物中分离得到新的6个具有抑制多种蛋白酪氨酸磷酸酶活性的化合物austocystinsJ、K、M、N、O和7-chloro versicolorin A,它们可用于蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂先导化合物的研究。
本发明的真菌Asprergillus puniceus SCSIO z021,于2019年3月20日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC),地址:广州市先烈中路100号大院59号楼5楼,其保藏编号为GDMCC No:60611。
附图说明
图1是化合物1(化合物austocystin J)的关键HMBC,COSY相关;
图2为化合物1(化合物austocystin J)的实测ECD与理论计算ECD光谱的对比。
图3为化合物4(化合物austocystin N)的实测ECD与理论计算ECD光谱的对比。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明,而不是对本发明的限制。
实施例1
(1)发酵培养基每升是通过以下方法配制的:用500mL的纯水煮200g的马铃薯,煮沸20min,过滤得马铃薯汁,再加入葡萄糖20g、海盐30g,用水补足至1000mL,在115℃高压蒸汽灭菌25分钟制得。按照此方式配置发酵培养基60L。将60L发酵培养基装入约200个1000mL的三角烧瓶中,每瓶约300mL。
(2)发酵液和菌丝体的制备:将真菌A.puniceus SCSIO z021在真菌适用的平板培养基中生长,待真菌长出孢子后,用竹签将真菌从平板上移至盛有水的三角瓶中,用移液枪将真菌接种到发酵培养基中(1L三角瓶中盛有300mL发酵培养基),于室温(26℃)静置培养25天后,收取发酵液和菌丝体,用纱布过滤除去菌液得到菌丝体。
(3)化合物分离纯化:将经上述发酵培养基培养得到的菌丝体破碎后用丙酮浸泡,重复提取三次,合并提取液,减压浓缩除去丙酮,剩余水相用乙酸乙酯萃取,浓缩得菌体的乙酸乙酯提取物,将乙酸乙酯提取物用正相硅胶(100-200目)干法拌样后,装入玻璃层析柱(H细硅胶),常温减压柱层析,依次用二氯甲烷:甲醇体积比分别为100:0,98:2,95:5,92:8,90:10,80:20,70:30的二氯甲烷-甲醇系统梯度洗脱,最后洗脱液通过TLC和HPLC检测合并得到9个组分(Fr.1~Fr.9),结合TLC和HPLC分析结果,合并为9个组分Fr.1~Fr.9。
收集二氯甲烷:甲醇体积比98:2冲洗下来的样品得到组分Fr.3(5g)和收集二氯甲烷:甲醇体积比92:8冲洗下来的样品得到组分Fr.5;
组分Fr.3经过凝胶柱(CH2Cl2/CH3OH,1:1)分离得到三个组分,收集在薄层层析上以CH2Cl2:CH3OH=3:0.1(体积比)为展开剂展开,收集主点Rf=0.25-0.75的组分Fr.3-3,经过中压反相(ODS)柱分离,以甲醇/水/TFA(30:70:0.03-100:0:0.03)梯度洗脱,收集甲醇/水/TFA体积比为55:45:0.03洗脱的样品Fr.3-3-6,经过制备型HPLC纯化(CH3CN/H2O/TFA,62:38:0.03,5mL/min),得到化合物2(12.9mg,tR=41.4min);收集甲醇/水/TFA体积比为86:14:0.03洗脱的样品Fr.3-3-14,通过HPLC纯化(CH3OH/H2O/TFA,81:19:0.03,5mL/min),得到化合物austocystin H(40.9mg,tR=44min)和化合物3(22.7mg,tR=50.6min)。
称取austocystin H(4.5mg),溶解于0.6mL的乙醇和少量丙酮的混合溶剂中(注:丙酮可增加样品溶解度),加入按质量分数10%的钯碳15mg做催化剂,给反应体系中通入氢气(稀硫酸与适量的锌粒反应制备,通过气球收集),在30℃条件下搅拌2-3h,至底物反应完全,棉花过滤除去反应混合物中的钯碳,并用乙醇和丙酮冲洗,减压浓缩得到反应粗产物,通过HPLC纯化(YMC-Pack ODS-A column,250×4.6mm),以体积分数89%的甲醇/水(含0.03%TFA)为流动相等度洗脱(1mL/min),制备得到化合物5(4.0mg,tR=12.0min)。
收集二氯甲烷:甲醇体积比92:8冲洗下来的样品得到组分Fr.5(2.7g)经过滤,除去甲醇微溶的白色晶体,剩余部分经过中压反相(ODS)柱层析,以甲醇/水/TFA(27:73:0.03-100:0:0.03)梯度洗脱。收集甲醇/水/TFA体积比为58:42:0.03洗脱的样品Fr.5-7,顺序经凝胶柱(CH2Cl2/CH3OH,1:1)和制备型HPLC纯化(YMC-Pack ODS-A column,250×20mm,5μm,12nm),以甲醇/水/TFA(68:32:0.03,5mL/min)等度洗脱得到化合物1(13.8mg,tR=29.2min);收集甲醇/水/TFA体积比为90:10:0.03洗脱的样品Fr.5-13,依次经凝胶柱(CH2Cl2/CH3OH,1:1)和HPLC纯化(YMC-Pack ODS-A column,250×20mm,5μm,12nm;CH3OH/H2O/TFA,80:10:0.03,5mL/min),得到化合物6(4.2mg,tR=37.2min)和一对混合物(28.2mg,tR=37.7min),此混合物通过手性柱(CHIRALPAK IA 4.6×250mm,5μm)分离,以乙醇(含0.1%TFA)/正己烷(体积比14:86,1mL/min)等度洗脱,得到化合物4(13.5mg,tR=22.7min)。
结构推定:
化合物1:浅黄色固体,高分辨质谱(HRESIMS)在m/z 763.1260给出[2M+Na]+离子峰,结合NMR数据(表1)推测分子式为C19H14O8,存在13个不饱和度,1H NMR谱显示结构中存在两个活泼质子δH 12.38(1H,s),6.61(1H,s),两个氧甲基δH 3.99(3H,s),3.87(3H,s),两个烯烃质子δH 5.59(1H,d,J=3.0Hz),6.80(1H,d,J=3.0Hz),两个邻位耦合的苯环质子δH7.41(1H,d,J=9.0Hz),6.69(1H,d,J=9.0Hz),以及两个次甲基质子δH 6.98(1H,s),6.41(1H,s)。13C NMR和DEPT谱显示结构中有19个碳,包括两个连氧的甲基δC 62.9,56.7,六个低场次甲基,十个低场季碳,以及一个羰基δC 180.5。这些NMR数据表明化合物1和austocystins F、I等一系列austocystin类化合物结构相似,推测也含有呫吨酮(xanthone)骨架。
HMBC谱中(图1),H-6与C-10a相关,H-7与C-8a相关,H-4分别与C-2/3/9/4a/9a相关,证实化合物1中存在呫吨酮骨架;此外,HMBC谱显示活泼质子δH 12.38与C-8相关,氧甲基质子δH 3.99和δH 3.87分别与C-1和C-5相关,表明酚羟基连在C-8位,C-5和C-1分别与一个氧甲基相连;H-1′与C-4′,H-3′与C-1′/2′/4′,H-4′与C-2′分别存在HMBC相关,且H-3′和H-4′存在1H-1H COSY相关,表明结构中存在一个双呋喃环(bishydrofuran)片段,另一个活泼氢δH 6.61(s)与C-2′/3′的HMBC相关信号表明C-2′与一个羟基相连,此外H-1′与C-2/3,2′-OH与C-2存在HMBC相关,推测双呋喃环连接在呫吨酮骨架的C-2和C-3位。综上所述,确定了化合物1的平面结构,通过与文献结构对比发现1与austocystin I结构非常类似,仅在C-5位比austocystin I多了一个氧甲基。由于H-1′(δH 6.41)与2′-OH(δH 6.61)的化学位移非常接近,在NOESY谱中无法观察到两个氢的相关信号,因此不能以此为依据确定C-1′/2′的相对构型,于是通过与已知化合物austocystin D的ECD谱图对比确定了C-1′和C-2′的绝对构型均为R,并进一步通过量子化学理论计算ECD光谱的方法来证实,结果表明实测谱图与1′R、2′R的计算ECD谱图基本一致(图2),化合物1鉴定结果如式(I)所示,命名为austocystin J。
化合物2:白色固体,高分辨质谱(HRESIMS)在m/z 425.0397给出[M+Na]+离子峰,结合NMR数据(表1)推测分子式为C20H15O7Cl,存在13个不饱和度。1H和13C NMR数据与化合物1相似,主要区别是2的氢谱中多了一对裂分为二重峰的次甲基氢信号δH4.84(1H,d,J=6.5Hz),6.88(1H,d,J=7.0Hz)和一个氧甲基信号δH3.79(3H,s),少了两个活泼氢和一个芳香质子信号,且其中一个芳香质子δH7.49(1H,s)由1中的二重峰转变为单峰,结合质谱推测呫吨酮骨架的6位或7位的一个氢被氯原子取代。HMBC谱中,氧甲基氢δH 3.79与C-8(δC146.8)相关,表明C-8位的羟基被甲氧基取代;H-6(δH7.49,s)与C-5/7/8/10a相关,表明氯原子连在C-7位。1H-1H COSY谱中,H-2′与H-1′/3′,H-3′与H-4′相关,确定了C1′-C4′的呋喃结构;由于H-1′/2′分别与C-2和C-3存在HMBC相关,双呋喃环片段通过C-2和C-3与呫吨酮骨架并和。NOESY谱中,H-1′与H-2′存在NOE相关信号,表明两个呋喃环通过顺式(cis)并合而成。进一步与已知化合物austocystin A的ECD谱图对比,发现两者趋势一致,确定C-1′为R构型,C-2′为S构型。化合物2鉴定结果如式(I)所示,命名为austocystin K。
化合物3:浅黄色粉末,在甲醇溶液中不稳定,高分辨质谱(HRESIMS)在m/z417.0934给出[M+Na]+离子峰,结合NMR数据(表2)推测分子式为C22H18O7,不饱和度为14。通过分析1H、13C NMR和二维谱图,发现结构中也有类似于化合物1的呫吨酮并双呋喃环的骨架。但与1相比,氢谱谱图中缺少了2个连氧甲基信号,但在氢谱高场出现两个甲基单峰,结合13C NMR和DEPT谱可知3的结构中还多出一个亚甲基,一个次甲基和一个季碳。结合HMBC谱推测3中呫吨酮骨架上有一个异戊烯基取代基。1H NMR谱中,存在两个邻位耦合的苯环质子δH 6.92(1H,d,J=8.5)和δH 7.52(1H,d,J=8.5),推测含有一个1,2,3,4-四取代苯环。HMBC谱中,8-OH与C-7/8/8a相关,H-1″与C-6/7/8相关,因此判断化合物3的异戊烯基与8-OH处于邻位,连接在C-7上。化合物3与austocystin I具有相似的比旋光度和ECD谱图,确定C-1′和C-2′的绝对构型为R,鉴定结构如式(I)所示,命名为austocystin M。
化合物4:浅黄色粉末,高分辨质谱(HRESIMS)在m/z 399.1429给出[M+H]+离子峰,结合NMR数据(表2)推测分子式为C22H22O7,不饱和度为12。1H和13C NMR谱图与化合物3存在相似性,在氢谱中,化合物4比3缺少了双呋喃环上3′和4′位的两个互相耦合的烯烃质子,以及一个异戊烯基链上2″位的烯烃质子信号,但在高场区域多了亚甲基氢信号,分析DEPT谱可知化合物4中有四个亚甲基,推测呋喃环和异戊烯基片段上的C=C在化合物4中均被还原为单键,1H-1H COSY谱中,H-1″与H-2″相关,H-1′/2′/3′/4′存在连续相关信号证实了上述推测。HMBC谱中,活泼氢δH 4.27(1H,s)与C-1″(δC23.6)、C-2″(δC43.7)、C-3″(δC68.7)、C-4″(δC29.2)和C-5″(δC29.1)存在相关;次甲基氢δH 4.04(1H,m,H-2′)与C-4′(δC67.2)和C-2(δC109.1)相关,因此C-3″与一个醇羟基相连,被还原的双呋喃环的2′位为一个次甲基。NOESY谱中,H-1′与H-2′存在NOE相关信号,表明两个五元氧杂环通过顺式(cis)并合而成。化合物4的绝对构型通过计算ECD光谱确定(图3),C-1′为R构型,C-2′为S构型。鉴定结果如式(I)所示,命名为austocystin N。
化合物6:橙黄色粉末,高分辨质谱(HRESIMS)在m/z 370.9965给出[M-H]-离子峰,结合NMR数据(表1)推测分子式为C18H9O7Cl,不饱和度为14。紫外光谱在223,289,325,439nm处存在吸收峰,与蒽醌类化合物的特征吸收相同,通过与上述具有xanthone骨架的衍生物相比,碳谱中δC 180.4,189.0出现两个羰基信号,暗示结构中存在蒽醌骨架;低场的季碳信号δC 163.9,161.0,159.4,158.4表明蒽醌骨架上有四个连氧季碳。比较1H和13C NMR数据,发现与文献中化合物versicolorin A十分相似,两者的主要区别是versicolorin A中的一个芳香质子被一个氯原子取代,由于化合物6的C-6(δC 161.0)、C-7(δC 113.0)和C-8(δC159.4)的化学位移与versicolorin A(δC-6165.0;δC-7107.8;δC-8164.0)差异明显,而且H-5(δH 7.28)与C-6/7/10/8a/10a存在HMBC相关,确定氯原子连在C-7上。H-1′/2′/3′/4′之间存在连续的1H-1H COSY相关信号,H-4′(δH 6.78,s)与C-1′/2′,H-4(δH 7.16,s)与C-2/9/10存在HMBC相关信号,表明结构中也有双呋喃环片段,虽然在HMBC谱中,没有观察到H-1′/2′与其相邻碳的任何相关信号,但是结构中C、D和E三个环上碳的化学位移与versicolorin A几乎一致,推测他们具有相同的结构片段,由此确定蒽醌母核通过C-2和C-3与双呋喃环稠合。化合物6的ECD谱图分别在227、290和382nm波长处呈现负的Cotton效应,与versicolorin A的谱图趋势一致,进一步通过计算ECD谱图,确认其绝对构型为1′R、2′S。结构鉴定结果如式(I)所示,命名为7-chloro versicolorin A。
表1化合物1-2和6的1H和13C NMR数据(DMSO-d6,δppm)
a 500MHz for 1H NMR,125MHz for 13C NMR.
表2化合物3-4的1H(500MHz)和13C NMR(125MHz)数据(DMSO-d6,δppm)
实施例2.催化氢化反应产物化合物5的制备
化合物austocystin D的双呋喃环上的双键被还原为单键后,细胞毒活性会显著降低,黄曲霉毒素(aflatoxin)是austocystin D的类似物,其双呋喃环上的双键被还原后毒性也会降低。为探讨实验中分离的化合物结构与毒性的关系,以化合物Austocystin H为底物,10%钯碳为催化剂,通过催化氢化反应,获得了还原产物。实验方法:称取2-7mg反应底物,溶解于0.6mL的乙醇和少量丙酮的混合溶剂中(注:丙酮可增加样品溶解度),加入10%钯碳15mg做催化剂,给反应体系中通入氢气(稀硫酸与适量的锌粒反应制备,通过气球收集),在30℃条件下搅拌2-3h,至底物反应完全,棉花过滤除去反应混合物中的钯碳,并用乙醇和丙酮冲洗,减压浓缩得到反应粗产物,通过HPLC纯化(YMC-Pack ODS-A column,250×4.6mm),以体积分数89%的甲醇/水(含0.03%TFA)为流动相等度洗脱(1mL/min),得到还原产物化合物5(4.5mg,tR=12.0min)。
经过上述方法分离的目标化合物1-4和化合物6、以及催化还原得到的目标化合物5分别命名为化合物austocystin J、austocystin K、austocystin M、austocystin N和7-chloro versicolorin A、以及austocystin O,其结构式如式(I)所示:
实施例2化合物1-6抑制蛋白酪氨酸磷酸酶的活性测试
(将人蛋白酪氨酸磷酸酶PTP1B,SHP1,SHP2,MEG2或TCPTP克隆到大肠杆菌(Escherichia coli)并纯化。酶抑制活性的测定是在96孔板中使用对硝基苯磷酸(pNPP)作为底物,每孔板含100μL的反应混合物。将人类重组PTP1B,SHP1,SHP2,MEG2或TCPTP(0.05μg)添加到50μL含有50mM HEPES,100mM NaCl,1mM EDTA及1mM dithiothreitol(DTT)的反应缓冲液中(pH 6.5),再在每个96孔板中分别添加待测的化合物样品(化合物1-7)。Na3VO4作为阳性对照,DMSO作为阴性对照,用于评价此高通量筛选系统。在室温下预孵育15分钟后,添加50μL含有50mM pNPP的缓冲液,并继续在37℃下培养60分钟。磷酸酶活性是通过测定所产生的对硝基苯酚在405nm处的吸光度来测定的。IC50值是使用Gen5软件计算(Synergy2Multi-Mode Microplate Reader,BioTek Instruments,Inc.,headquarteredin Winooski,VT,USA)。每个实验重复3次。
测试结果显示:化合物1-5对五种蛋白酪氨酸磷酸酶PTP1B,SHP1,SHP2,MEG2或TCPTP有选择性抑制作用,化合物6对这五种蛋白酪氨酸磷酸酶都有抑制作用。
表3.化合物1-6对五种蛋白磷酸酶的抑制活性(IC50μg/mL)
“—”指没有活性。Na3VO4的IC50单位为μM
以上仅是本发明的优选实施方式,应当指出的是,上述优选实施方式不应视为对本发明的限制,本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明的精神和范围内,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (3)
1.一种化合物austocystins J、K、M、N、O或7-chloro versicolorin A的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(a)制备真菌Asprergillus puniceus SCSIO z021 GDMCC No:60611的发酵产物;
(b)将步骤(a)得到的发酵产物过滤除去菌液得到菌丝体,菌丝体破碎后用丙酮或甲醇浸泡,提取液浓缩除去丙酮或甲醇,剩余水相用乙酸乙酯萃取,浓缩得菌体的乙酸乙酯提取物;
(c)将步骤(b)的乙酸乙酯提取物经过正相硅胶柱层析,依次用二氯甲烷:甲醇体积比为100:0, 98:2, 95:5, 92:8, 90:10, 80:20, 70:30的溶剂系统梯度洗脱,结合TLC和HPLC分析结果,合并为9个组分Fr.1~Fr.9;
收集二氯甲烷:甲醇体积比98:2冲洗下来的样品得到组分Fr.3,二氯甲烷:甲醇体积比92:8冲洗下来的样品得到组分Fr.5;
组分Fr.3经过凝胶柱分离,收集在薄层层析上以体积比CH2Cl2:CH3OH=3:0.1为展开剂展开,主点Rf=0.25-0.75的组分Fr.3-3,Fr.3-3经过中压反相柱分离,以甲醇/水/三氟乙酸体积比30: 70: 0.03-100: 0: 0.03梯度洗脱,收集甲醇/水/三氟乙酸体积比为55:45:0.03洗脱的样品Fr.3-3-6,经过制备型HPLC纯化得到austocystin K;收集甲醇/水/三氟乙酸体积比为86:14: 0.03洗脱的样品Fr.3-3-14,通过HPLC纯化,得到化合物austocystin H和austocystin M;
将austocystin H溶解于乙醇和丙酮的混合溶剂中,加入钯碳做催化剂,给反应体系中通入氢气,反应至底物反应完全,过滤除去反应混合物中的钯碳,并用乙醇和丙酮冲洗,减压浓缩得到反应粗产物,通过HPLC纯化制备得到austocystin O;
组分Fr.5经过滤,除去甲醇微溶的白色晶体,剩余部分经过中压反相(ODS)柱层析,以甲醇/水/TFA体积比27:73:0.03-100:0:0.03梯度洗脱,收集甲醇/水/TFA体积比为58:42:0.03洗脱的样品Fr.5-7,经凝胶柱层析、制备型HPLC纯化得到austocystin J;收集甲醇/水/TFA体积比为90:10:0.03洗脱的样品Fr.5-13,依次经凝胶柱、HPLC纯化,得到7-chloroversicolorin A和一对混合物,此混合物通过手性柱分离,以乙醇/正己烷体积比14:86等度洗脱,得到austocystin N;
步骤(a)中所述的真菌Asprergillus puniceus SCSIO z021 GDMCC No:60611的发酵产物是通过以下方法制备:将真菌Asprergillus puniceus SCSIO z021在真菌适用的平板培养基中生长,待真菌长出孢子后,将真菌接种到发酵培养基中,于室温静置培养25天,得到发酵液和菌丝体,所述的发酵培养基每升是通过以下方法配制的:用500 mL的纯水煮200g的马铃薯,煮沸20 min,过滤得马铃薯汁,再加入葡萄糖20 g、海盐30 g,用水补足至1000mL;
所述的化合物austocystins J、K、M、N、O或7-chloro versicolorin A的结构式如下所示:
2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤(b)中所述的浓缩是采用减压浓缩。
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