CN113620970B - 混源萜类化合物及其制备方法和在制备降脂降胆固醇药物中应用 - Google Patents

混源萜类化合物及其制备方法和在制备降脂降胆固醇药物中应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了混源萜类化合物及其制备方法和在制备降脂降胆固醇药物中应用。化合物talaromynoids A‑I和22‑epoxyberkeleydione的结构式如式(Ⅰ)所示，是从海洋真菌SCSIO 41517的发酵液和菌丝体中分离得到的。本发明的talaromynoid E具有抑制蛋白酪氨酸磷酸酶CDC25B活性；talaromynoids G‑I和22‑epoxyberkeleydione能抑制3T3‑L1前脂肪细胞分化过程中甘油三酯的积累，talaromynoids G‑I和22‑epoxyberkeleydione也能够降低ox‑LDL诱导的巨噬泡沫细胞中脂滴的含量。这些化合物可用于蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂或降脂、抗肥胖和降胆固醇药物中的应用。
Figure DDA0003826953740000011

Description

混源萜类化合物及其制备方法和在制备降脂降胆固醇药物中 应用
技术领域
本发明属于海洋生物领域，具体涉及10个混源萜类化合物及其制备方法和在制备蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂、降血脂、抗肥胖和降胆固醇药物中的应用。
背景技术
蛋白酪氨酸磷酸酶(PTPs)是一类能够催化蛋白酪氨酸磷酸残基去磷酸化的酶，它们被认为是细胞信号转导的关键调节剂。PTPs通过调节细胞内酪氨酸的磷酸化水平来调控细胞的生长、分化、代谢、迁移和凋亡等过程，它们在人体内表达水平的失调和活性的异常都会损害细胞生理功能，从而导致糖尿病、癌症、肥胖症等多种疾病的发生。PTPs在疾病发展和药物靶标中的作用引起了科学家广泛的关注。其中PTPs家族中SHP1、SHP2、CDC25B、TCPTP、CD45等被认为是潜在的抗癌新药筛选靶标。发现高效的化学小分子PTPs抑制剂对开发与PTPs相关疾病治疗的新药具有重要意义。
高脂血症是由于人体中脂质代谢运转紊乱或异常，使血浆中的一种或多种脂质高于正常值而引起的疾病。临床上高脂血症是通过血清中低密度脂蛋白胆固醇、总胆固醇和甘油三酯水平升高以及高密度脂蛋白胆固醇水平降低来诊断的。临床上，成年人空腹血清中总胆固醇含量大于5.72mmol/L，甘油三酯含量大于1.70mmol/L，即可认定为高脂血症。随着人们生活水平的提高，血脂水平也逐步上升，血脂异常患病率明显增加。大量研究显示高脂血症是引发动脉粥样硬化的重要因素之一，动脉粥样硬化又可引起人体组织器官供血不足，从而引发冠心病、脑卒中、心肌梗死、肾衰竭等严重并发症，还能加重糖尿病、高血压、胰腺炎等疾病进展。因此，降脂药物的研发对预防和治疗高脂血症具有重要意义。
3T3-L1脂肪细胞模型是一种成熟的用于筛选与评价化合物的降血脂和抗肥胖活性的模型，该细胞模型可以检测化合物对脂肪细胞的分化、甘油三酯(TG)合成的影响，其中降低TG含量的活性化合物有望应用于抗肥胖、降血脂药物的研发，升高TG的活性化合物有望应用于抗糖尿病(增加胰岛素敏感性)药物的研发。RAW264.7巨噬泡沫细胞模型是一种成熟的用于筛选与评价化合物的降胆固醇活性的模型，该模型可以检测化合物对胆固醇吸收利用的影响，其中降低脂滴积累的活性化合物有望应用于降胆固醇药物的研发。
发明内容
本发明的第一个目的是提供对蛋白酪氨酸磷酸酶有抑制作用，或具有降血脂、抗肥胖和降胆固醇作用的9个新的混源萜类化合物talaromynoids A-I和已知化合物22-epoxyberkeleydione。
本发明9个新的混源萜类化合物talaromynoids A-I和已知化合物22-epoxyberkeleydione，其结构式如式(Ⅰ)所示。
Figure BDA0003191747090000031
本发明的第二个目的是提供化合物talaromynoids A-I和22-epoxyberkeleydione的制备方法，它们是从真菌Talaromyces purpureogenus SCSIO 41517发酵液或菌丝体中分离得到的。
优选，具体步骤如下：
(a)制备真菌Talaromyces purpureogenus SCSIO 41517的发酵液和菌丝体；
(b)将步骤(a)得到的发酵液用大孔树脂吸附3-4h，滤除发酵液，先用水冲洗大孔树脂除去培养基成分，再用乙醇冲洗大孔树脂，乙醇冲洗液浓缩后得到菌液提取物；菌丝体破碎后用丙酮或甲醇浸泡提取，减压浓缩除去丙酮或甲醇，剩余水相用乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯相，浓缩后得菌体提取物；
(c)将步骤(b)所述菌液提取物和菌体提取物经过正相硅胶柱层析，依次用二氯甲烷:甲醇体积比为100:0,95:5,92:8,90:10,85:15,80:20,70:30,50:50的溶剂系统梯度洗脱；
收集二氯甲烷:甲醇体积比92:8冲洗下来的样品得到组分Fr.3，经过中压反相柱层析，以甲醇/水/TFA从体积比13:87:0.03-100:0:0.03梯度洗脱，收集甲醇:水体积比为60:40洗脱的样品得到组分Fr.3-12，收集甲醇:水体积比为70:30洗脱的样品得到组分Fr.3-17；
组分Fr.3-12经过凝胶柱，用CH3OH洗脱分为2个组分，其中Fr.3-12-1经过常压正相柱层析，以二氯甲烷/甲醇体积比100:0,250:1,125:1,100:1,62:1为流动相梯度洗脱，收集二氯甲烷/甲醇125:1洗脱的样品得到组分Fr.3-12a和组分Fr.3-12c，收集二氯甲烷/甲醇100:1洗脱的样品得到化合物3、4和组分Fr.3-12b，Fr.3-12a经制备型HPLC纯化得到化合物1和8；Fr.3-12b经制备型HPLC纯化得到得到化合物6和7；Fr.3-12c经制备型HPLC纯化，得到化合物2、5和9；
组分Fr.3-17经过凝胶柱用CH3OH洗脱分为7个组分Fr.3-17-1～Fr.3-17-7，其中Fr.3-17-2经过常压正相柱层析，以二氯甲烷/甲醇体积比100:0,250:1,125:1,100:1,62:1为流动相梯度洗脱，再以甲醇/水66:34等度洗脱得到化合物10。
进一步优选，步骤(a)中所述的发酵液和菌丝体是通过以下方法制备：将真菌Talaromyces purpureogenus SCSIO 41517在真菌适用的平板培养基中生长，待真菌长出孢子后，将真菌接种到发酵培养基中，于室温静置培养28天，得到发酵液和菌丝体，所述的发酵培养基是按照以下比例配制的：葡萄糖10g，淀粉10g，KH2PO4 1g，MgSO4·7H2O 1g，蛋白胨1g，海盐30g，纯水1L，pH＝6.5。
进一步优选，步骤(b)所述的浓缩是采用减压浓缩。
本发明的第三个目的是提供化合物talaromynoid E或其药用盐在制备蛋白酪氨酸磷酸酶CDC25B抑制剂中的应用。
本发的第四个目的是提供化合物talaromynoids G、H、I或22-epoxyberkeleydione或其药用盐在制备降血脂、抗肥胖和降胆固醇药物中的应用。
本发明的第五个目的是提供一种PTPs抑制剂，所述的PTPs抑制剂含有化合物talaromynoid E或其药用盐作为活性成分。
本发明的第六个目的是提供一种降血脂、抗肥胖和降胆固醇药物，所述的降血脂、抗肥胖和和降胆固醇药物含有化合物talaromynoids G-I和22-epoxyberkeleydione中任一化合物或其药用盐作为活性成分。
本发明的第七个目的是提供真菌Talaromyces purpureogenus SCSIO 41517在制备化合物talaromynoids A-I和22-epoxyberkeleydione中的应用。
本发明从一株海洋真菌T.purpureogenus SCSIO 41517的发酵产物中分离得到10个具有抑制蛋白酪氨酸磷酸酶活性或降血脂、抗肥胖和降胆固醇活性的化合物talaromynoids A-I和22-epoxyberkeleydione，它们可用于蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂或降血脂、抗肥胖和降胆固醇药物中应用。
本发明的真菌Talaromyces purpureogenus SCSIO 41517，于2020年5月22日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，其保藏编号为GDMCC No：61032。该菌株也公开于专利申请号CN202010686502X，发明名称为：芳香聚酮类化合物Talaromyoxaones A和B及其制备方法和应用的专利申请中。
附图说明
图1是化合物1(化合物talaromynoid A)的关键COSY，HMBC，以及NOESY相关；
图2为化合物2-9(化合物talaromynoids B-I)的关键COSY，HMBC相关；
图3为化合物2-9(化合物talaromynoids B-I)的关键NOESY相关；
图4为化合物1-10降脂和抗肥胖活性测试的实验结果；
图5为化合物7-10降胆固醇活性测试的实验结果。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1
(1)发酵培养基是通过以下比例配制的：葡萄糖10g，淀粉10g，KH2PO4 1g，MgSO4·7H2O 1g，蛋白胨1g，海盐30g，纯水1L，混合均匀后，调pH＝6.5，在121℃高压蒸汽灭菌25分钟制得。按照此方式配置发酵培养基50L，将50L发酵培养基装入约200个1000mL的三角烧瓶中，每瓶约250mL。
(2)发酵液和菌丝体的制备：将真菌Talaromyces purpureogenus SCSIO 41517在真菌适用的平板培养基中生长，待真菌长出孢子后，用无菌竹签将真菌从平板上移至盛有无菌水的三角瓶中，用移液枪将真菌接种到发酵培养基中(1L三角瓶中盛有250mL发酵培养基)，于室温(26℃)静置培养28天后，收取发酵液和菌丝体，用纱布过滤分离发酵液和菌丝体。
(3)化合物分离纯化：将经上述发酵培养基培养得到的发酵液用大孔树脂吸附3-4h，滤除发酵液，先用水冲洗大孔树脂去除培养基成分，再用乙醇冲洗大孔树脂，乙醇冲洗液减压浓缩后得到菌液提取物；菌丝体破碎后用丙酮或甲醇浸泡，重复提取3-4次，合并提取液，减压浓缩除去丙酮或甲醇，剩余水相再用乙酸乙酯萃取4次，合并乙酸乙酯相，浓缩后得菌体提取物。将菌液提取物和菌体提取物用正相硅胶(100-200目)干法拌样后，装入玻璃层析柱(H细硅胶)，常温加压柱层析，依次用二氯甲烷:甲醇体积比为100:0,95:5,92:8,90:10,85:15,80:20,70:30,50:50的溶剂系统梯度洗脱，结合TLC和HPLC分析结果，合并为6个组分Fr.1～Fr.6。
收集二氯甲烷:甲醇体积比92:8冲洗下来的样品得到组分Fr.3(8g)，组分Fr.3经过中压反相(ODS)柱层析，以甲醇/水/TFA(13:87:0.03-100:0:0.03)梯度洗脱得到28个组分Fr.3-1～Fr.3-28。收集甲醇:水体积比为60:40洗脱的样品得到组分Fr.3-12，收集甲醇:水体积比为70:30洗脱的样品得到组分Fr.3-17。
组分Fr.3-12经过凝胶柱(CH3OH，800mL)分为两个组分，收集前400mL甲醇洗脱的样品得到组分Fr.3-12-1，Fr.3-12-1再经过常压正相柱层析，以二氯甲烷/甲醇(100:0,250:1,125:1,100:1,62:1)为流动相梯度洗脱，收集二氯甲烷/甲醇125:1洗脱的样品得到组分Fr.3-12a和组分Fr.3-12c，收集二氯甲烷/甲醇100:1洗脱的样品得到化合物3(12.0mg)、4(18.0mg)和组分Fr.3-12b。Fr.3-12a经制备型HPLC纯化，以甲醇/水/TFA(58:42:0.03,5mL/min)等度洗脱得到化合物1(28.0mg,tR＝31.5min)和化合物8(29.6mg,tR＝22.5min)；Fr.3-12b经制备型HPLC纯化，以甲醇/水/TFA(53:47:0.03,5mL/min)等度洗脱得到化合物6(21.0mg,tR＝37.2min)和7(41.0mg,tR＝31.4min)；Fr.3-12c经制备型HPLC纯化，以甲醇/水/TFA(58:42:0.03,5mL/min)等度洗脱得到化合物2(6.6mg,tR＝20.1min)、5(3.0mg,tR＝23.8min)和9(18.6mg,tR＝26.1min)。
组分Fr.3-17经过凝胶柱(CH3OH，1400mL)分为7个组分Fr.3-17-1～Fr.3-17-7，收集第二个200mL甲醇洗脱液得到组分Fr.3-17-2，Fr.3-17-2再经过常压正相柱层析，以二氯甲烷/甲醇(100:0,250:1,125:1,100:1,62:1)为流动相梯度洗脱，再以甲醇/水(66:34,5mL/min)等度洗脱得到10(38.0mg,tR＝27.6min)。
结构推定：
化合物1-9的核磁数据如表1-3所示。
化合物1：无色固体，高分辨质谱(HRESIMS)在m/z 489.2120给出[M+H]+离子峰，结合NMR数据推测分子式为C26H32O9，不饱和度为11。在1H NMR谱中，有六个处于高场的甲基单峰δH 1.69,1.69,1.35,1.33,1.12,0.74，一个甲氧基δH 3.68，三个亚甲基δH 1.68(1H,m),1.99(1H,dd,J＝14.0,3.0Hz),1.56(1H,d,J＝14.5Hz),2.04(1H,dd,J＝14.5,7.0Hz),3.16(1H,d,J＝5.0Hz),3.25(1H,dt,J＝20.5,1.5Hz)，四个次甲基δH 6.34(1H,d,J＝6.5Hz),4.45(1H,d,J＝7.0Hz),3.79(1H,d,J＝6.5Hz),2.32(1H,br d,J＝12.5Hz)和一个醇羟基δH4.86(s)。13C NMR和DEPT谱显示结构中有26个碳，包括六个甲基δC 28.0,25.9,24.3,17.7,16.5,14.5，一个甲氧基δC 53.0，三个亚甲基δC 36.4,30.5,28.4，四个次甲基δC 99.0,72.9,50.0,39.0，五个sp3杂化的季碳δC 97.5,74.9,50.9,43.2,33.0，四个sp2杂化的季碳δC 137.6,130.9,129.2,129.2，以及三个酯羰基δC 177.4,174.3,172.3。两对碳碳双键和三个羰基共有5个不饱和度，为满足11个不饱和度，结构中应有六个环系。以上数据表明该化合物是由聚酮和萜类杂合而成的混源萜(meroterpenoid)，通过比较1H和13C NMR数据，发现化合物1与已知化合物paraherquonin、miniolutelides、berkeleyacetals和chrysogenolides具有类似的谱图特征，推测1是来源于3,5-二甲基苔色酸的混源萜。
通过分析2D NMR谱图，该化合物与上述类似物的主要区别是基本骨架中A环和F环的结构发生了改变。根据HMBC谱，CH3-17/18(δH 1.12,1.35)、16-OH(δH 4.86)均与C-15/16相关，推测C-15上连接一个异丙醇的结构片段；亚甲基质子H-2(δH 3.25,3.16)分别与季碳C-3(δC 130.9)、C-15(δC 97.5)和酯羰基C-1(δC 174.3)相关，表明A环为一个五元内酯环；连氧的次甲基质子H-14(δH 4.45)分别与C-15和C-10(δC 137.5)相关，表明C-14与C-10之间通过一个氧原子相连并与C-11/12/13组成一个含氧的六元环(F环)。进一步通过HMBC和1H-1H COSY相关信号(图1)确定了该化合物的平面结构，文献报道的类似结构中，A环多为六元内酯环，而F环多为五元氧杂环。
C环中H-5与H-6α的耦合常数为12.5Hz，表明它们在六元环中均处于a键,因此H-5与H-6α为反式构型；在NOESY谱中，H-24与H-22/H-23、H-22与H-19、H-5与H-17、H-14与H-18之间存在NOE相关信号，表明H-5、H-17和H-6β共平面，H-19、H-22、H-23和H-24共平面，初步确定其相对构型。鉴定结果如式(Ⅰ)所示，命名为talaromynoid A。
化合物2：无色固体，高分辨质谱(HRESIMS)在m/z 505.2066给出[M+H]+离子峰，结合NMR数据推测分子式为C26H32O10，不饱和度为11。1H和13C NMR谱与化合物1十分相似，但在化合物2的氢谱中多出一对互相耦合的质子δH 3.43(1H,d,J＝4.5Hz),5.61(1H,d,J＝4.5Hz)，少了两个亚甲基氢，且化学位移4.4ppm附近的一个次甲基氢(H-14)由二重峰变为单峰；13C NMR和DEPT谱提示结构中多了一个氧化的次甲基δC 69.4，少了一个亚甲基碳。HSQC谱表明δH 5.61为一个醇羟基质子，并且分别与C-12/13/14存在HMBC相关，还与H-13有1H-1H COSY相关，表明多出的羟基连接在C-13上；HMBC谱中，H-14(δH 4.38)与C-3/15/13/12/10相关，确定在F环中C-10和C-14之间通过氧原子相连形成六元氧杂环。结合其他的HMBC和1H-1H COSY相关信号(图2)确定了该化合物的平面结构。在NOESY谱中，H-22与H-23/24/19，H-23与H-24，H-19与H-26/6α相关，表明上述氢原子在平面的同侧。在C环中H-5与H-6β、H-6α的耦合常数分别为3.0Hz和13.0Hz，表明在六元环中H-5与H-6α处于直立键，H-6β为平伏键，因此H-5与H-6α为反式构型，根据H-5与H-17有NOE相关，确定H-5与2-羟基异丙基位于平面的另一侧。在F环中，H-14的信号显示为一个单峰，表明它与H-13的耦合常数很小，推测H-13/14位于平伏键，两者为反式构型，根据H-14与H-18有NOE相关，确定H-14、13-OH和H-19在六元环中为顺式构型。鉴定结果如式(Ⅰ)所示，命名为talaromynoid B。
化合物3：无色固体，高分辨质谱(HRESIMS)在m/z 537.2325给出[M+H]+离子峰，结合NMR数据推测分子式为C27H36O11，不饱和度为10。1H和13C NMR谱与已知化合物22-deoxyminiolutelide B类似，主要区别是在氢谱中多出一个甲氧基δH 3.52，一个活泼质子δH 4.50，两个亚甲基氢δH 3.42,3.21和一个连氧的次甲基氢δH 3.36，少了两个烯氢信号和一个脂肪族的次甲基氢；13C NMR和DEPT谱显示结构中多了一个亚甲基碳δC 35.4(C-2)，一个氧化的次甲基δC 61.5(C-14)和一个氧化的季碳δC 64.4(C-15)，少了一对碳碳双键和一个sp3杂化的次甲基碳；由此推测化合物3的A环和B环的结构可能发生了改变。HMBC谱中，醇羟基质子δH 4.50分别与C-16/17/18相关，H-17/18与C-15/16相关，表明2-羟基异丙基与C-15相连；亚甲基质子H-2分别与C-1/3/15相关，甲氧基H-27与酯羰基C-1相关，表明C-3上连接一个乙酸甲酯侧链；H-14与C-13/15相关，并且为了满足该化合物的分子式和不饱和度，推测C-14和C-15通过一个氧原子相连形成三元氧环；根据H-5与C-3，H-25与C-3/4/5相关，结合化学位移确定C-3与C-4之间形成双键。结合图2所示的HMBC和1H-1H COSY信号确定了该化合物的平面结构，与类似物相比，其基本骨架上A环中的内酯键被打开。该化合物的相对构型通过NOESY谱确定，H-24与H-22/26，H-23与H-22/9，H-9与10-OH，H-13与19-H/10-OH相关，表明上述基团在平面的同一侧；根据H-14与H-21/5，H-5与H-17相关，表明它们在平面的另一侧。鉴定结果如式(Ⅰ)所示，命名为talaromynoid C。
化合物4：白色粉末，高分辨质谱(HRESIMS)在m/z 505.2070给出[M+H]+离子峰，结合NMR数据推测分子式为C26H32O10，不饱和度为11。1H和13C NMR谱与化合物3相似，但4比3少一个连氧的甲基和一个羟基信号，增加一个不饱和度，推测该化合物的A环为一个六元内酯环，化合物3可能是化合物4的醇解反应产物。HMBC谱中，甲基H-17/18与C-15/16，亚甲基H-2与C-1/3/4/15相关证实了上述推测，根据图2所示的HMBC和1H-1H COSY信号确认了该化合物的平面结构。NOESY谱中，在平面的一侧H-24与H-22/26，H-23与H-22/9，H-9与10-OH，H-13与19-H/10-OH相关；平面的另一侧H-14与H-21/5，H-5与H-17相关，确定该化合物的相对构型。鉴定结果如式(Ⅰ)所示，命名为talaromynoid D。
化合物5：无色固体，高分辨质谱(HRESIMS)在m/z 521.2013给出[M+H]+离子峰，结合NMR数据推测分子式为C26H32O11，不饱和度为11。1H和13C NMR谱与已知化合物miniolutelide B的谱图相似，主要区别是谱图中多出一个醇羟基质子δH 5.45(s)和一个被氧化的季碳δC 72.9，少了一个脂肪族次甲基信号，由此推测miniolutelide B的一个次甲基氢被羟基取代。醇羟基质子δH 5.45分别与C-3(δC 161.8)、C-4(δC 72.9)、C-5(δC49.6)和C-25(δC 26.3)存在HMBC相关，表明羟基与C-4相连，进一步通过2D NMR谱(图2)确认了该化合物的平面结构。NOESY谱中，22-OH与H-24/23，H-23与H-9，H-19与H-26/10-OH相关；H-13与H-21/5，4-OH与H-6β/17相关；在C环中，H-5与H-6α具有较大的耦合常数(J＝9.0Hz)，表明这两个氢均处于直立键，因此H-5与H-6β在六元环的同侧，由此确定了该化合物的相对构型。鉴定结果如式(Ⅰ)所示，命名为talaromynoid E。
化合物6：无色固体，高分辨质谱(HRESIMS)在m/z 575.2097给出[M+Na]+离子峰，结合NMR数据推测分子式为C27H36O12，不饱和度为10。1H和13C NMR谱与化合物3基本相同，但氢谱中少了两个次甲基的二重峰，出现一个次甲基氢的单峰δH 5.38(s)和一个醇羟基质子δH 5.98(s)；碳谱中少了一个次甲基碳，多出一个被氧化的季碳δC 79.0，推测化合物6比3多一个羟基。HMBC谱中，多出的羟基质子信号(δH 5.98)与C-22/23/11相关，确定羟基与C-22相连。根据图2-3所示的HMBC、1H-1H COSY和NOESY信号确认了该化合物的平面结构和相对构型，但在NOESY谱中只观察到H-24与H-6α/6β相关，因此不能判断C-7的相对构型，由于化合物6与5类似结构片段上碳和氢的化学位移基本相同，推测H-24与H-6α/23、22-OH在同一侧。鉴定结果如式(Ⅰ)所示，命名为talaromynoid F。
化合物7：无色固体，高分辨质谱(HRESIMS)在m/z 505.2063给出[M+H]+离子峰，结合NMR数据推测分子式为C26H32O10，不饱和度为11。1H和13C NMR谱与化合物4谱图类似且分子式相同。但两个化合物中组成D环和E环的碳的化学位移有明显差别，在氢谱中E环上H-22和H-23的耦合常数由化合物4中的8.0Hz变为0.5和3.5Hz，其中H-23与醇羟基质子δH 6.80(d,J＝3.5Hz)耦合常数相同，推测羟基连在C-23上，而为满足分子的不饱和度，推测C-8与C-10之间通过内酯键连接，与C-11/22/7组成一个六元环(D环)。HMBC谱中，H-22(δH 2.73)与C-10/11/6/7/23/24相关，羟基质子(δH 6.80)与C-22/23相关，次甲基H-23(δH 5.22)与C-9相关，H-9/21与C-10相关；1H-1H COSY信号表明E环中存在C22-C23-OH和C21-C9两个自旋体系；以上相关信号证实该化合物的D环为六元环，是C-7连接的羧基与C-10上的羟基脱水成酯的产物，图2所示的2D NMR信号进一步确认了该化合物的平面结构。NOESY谱中，H-22与H-23/24/6α，H-23与H-26/6α，H-19与H-13/6α相关；H-5与H-14/6β相关；再结合六元环中H-5与H-6α和H-6β的耦合常数分别为13.5和4.0Hz，表明H-5与H-6α处于反式，由此确定了该化合物的相对构型，但在NOESY谱中没有观察到H-21和H-9与其它氢的相关信号，因此C-9的相对构型还未确定。鉴定结果如式(Ⅰ)所示，命名为talaromynoid G。
化合物8：无色固体，高分辨质谱(HRESIMS)在m/z 489.1763给出[M+H]+离子峰，结合NMR数据推测分子式为C25H28O10，不饱和度为12。1H和13C NMR谱与化合物4存在相似之处，主要区别是谱图中少了一个次甲基质子和一个连氧的甲基信号，但多了一个不饱和度，推测结构中可能多了一个环系。2D NMR谱(图2)表明该化合物的基本骨架与4相同，其中羟基质子δH 6.92与C-9/10/11/20存在HMBC相关，表明这个羟基连接在C-10上，推测化合物8的C-11和C-22之间形成四元内酯环，由此确定其平面结构。根据NOESY谱，平面一侧H-23与H-24/9，H-13与H-19/10-OH相关；另一侧H-14与H-5/17相关，初步确定其相对构型。鉴定结果如式(Ⅰ)所示，命名为talaromynoid H。
化合物9：无色固体，高分辨质谱(HRESIMS)在m/z 521.2021给出[M+H]+离子峰，结合NMR数据推测分子式为C26H32O11，不饱和度为11。化合物8和9在酸性环境中可以互变，它们具有相似的1H和13C NMR谱图特征，主要区别是化合物9比8少一个不饱和度，核磁谱图中多一个甲氧基和一个醇羟基信号，结合分子式确定结构中多了一分子CH3OH，推测化合物9的A环是打开的，根据甲基H-27与C-1，羟基OH-16与C-15/16/17/18存在HMBC相关，证实了上述推测。进一步通过图2所示的2D NMR信号确认了该化合物的平面结构，NOESY谱显示(图3)化合物9与8具有类似的NOE相关信号，表明它们的相对构型相同。鉴定结果如式(Ⅰ)所示，命名为talaromynoid I。
化合物10：白色粉末，高分辨质谱(HRESIMS)在m/z 473.2169给出[M+H]+离子峰，结合NMR数据推测分子式为C26H32O8，不饱和度为11。通过对比文献，发现该化合物的波谱数据与22-epoxyberkeleydione基本一致，鉴定结果如式(Ⅰ)所示。
表1化合物1-2和4的1H NMR(500MHz)和13C NMR(125MHz)数据(DMSO-d6,δppm)
Figure BDA0003191747090000141
表2化合物3和5-6的1H和13C NMR数据(DMSO-d6,δppm)
Figure BDA0003191747090000151
a500MHz for 1H NMR,125MHz for 13C NMR.
b700MHz for 1H NMR,175MHz for 13C NMR.
表3化合物7-9的1H和13C NMR数据(DMSO-d6,δppm)
Figure BDA0003191747090000161
a500MHz for 1H NMR,125MHz for 13C NMR.
b700MHz for 1H NMR,175MHz for 13C NMR.
Figure BDA0003191747090000171
实施例2化合物1-10的抑制蛋白酪氨酸磷酸酶活性测试
将人蛋白酪氨酸磷酸酶CDC25B,PTP1B,SHP1,SHP2,MEG2,CD45或TCPTP克隆到大肠杆菌(Escherichia coli)并纯化。酶抑制活性的测定是在96孔板中使用对硝基苯磷酸(pNPP)作为底物，每孔板含100μL的反应混合物。将人类重组CDC25B,PTP1B,SHP1,SHP2,MEG2,CD45或TCPTP(0.05μg)添加到50μL含有50mM HEPES，100mM NaCl，1mM EDTA及1mMdithiothreitol(DTT)的反应缓冲液中(pH 6.5)，再在96孔板中分别添加待测的化合物样品(化合物1-10)。Na3VO4作为阳性对照，DMSO作为阴性对照。在室温下预孵育15分钟后，添加50μL含有50mM pNPP的缓冲液，并继续在37℃下培养60分钟。磷酸酶活性是通过测定所产生的对硝基苯酚在405nm处的吸光度来测定的。IC50值使用Gen5软件计算(Synergy2 Multi-Mode Microplate Reader,BioTek Instruments,Inc.,headquartered in Winooski,VT,USA)，每个实验重复3次。
测试结果显示化合物5对蛋白酪氨酸磷酸酶CDC25B有选择性抑制作用，IC50值为12.7μM。
实施例3化合物1-10降血脂、抗肥胖和降胆固醇活性测试
(1)化合物1-10抑制脂肪细胞分化活性实验(采用3T3-L1脂肪细胞模型)
待测化合物用DMSO配制成浓度为10mM母液，测试时稀释成不同浓度的工作液；为校正溶剂DMSO的影响，以0.1％DMSO作为空白对照，以小檗碱(BBR)作为阳性对照。
参照文献方法(Li,C.；Cheng,B.；Fang,S.；Zhou,H.；Gu,Q.；Xu,J.,Design,syntheses and lipid accumulation inhibitory activities of novel resveratrolmimics.European Journal of Medicinal Chemistry 2018,143,114-122)，3T3-L1(小鼠胚胎成纤维细胞，前脂肪细胞)采用DMEM培养基(其中添加10％胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素)在含5％CO2的培养箱(37℃)中培养。然后将3T3-L1接种于48孔板中培养至完全接触(第0天)，将培养基换成分化培养基Ⅰ或加入一定浓度待测化合物的分化培养基Ⅰ培养3天(第3天)。分化培养基Ⅰ是按以下比例配制的：DMEM培养基中添加10％胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、0.5μg/mL胰岛素、100ng/mL地塞米松、0.5mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤和10ng/mL生物素。第3天将培养基换成分化培养基Ⅱ或加入一定浓度待测化合物的分化培养基Ⅱ继续培养3天(第6天)。分化培养基Ⅱ是按以下比例配制的：DMEM培养基中添加10％胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、0.5μg/mL胰岛素。第6天收获3T3-L1细胞，首先用冰磷酸盐缓冲液(PH＝7.4)洗涤细胞两次，超声破碎细胞，再用甘油三酯试剂盒和多功能酶标仪检测细胞裂解液中甘油三酯的含量，实验结果以空白对照细胞中甘油三酯含量百分比的形式表示。每个处理3个重复。
测试结果如图4所示，化合物7-10均能不同程度降低3T3-L1细胞内甘油三酯含量，IC50值分别为20.64±3.56,37.19±2.54,29.46±0.64,42.58±1.31μM。
(2)化合物7-10降胆固醇实验(采用RAW264.7巨噬泡沫细胞模型)
待测化合物用DMSO先配制成浓度为10mM的母液，测试时稀释成10μM和1μM的工作液；为校正溶剂DMSO的影响，以0.1％DMSO作为空白对照，以阳性药物GW3965(5μM,1μM)作为阳性对照。
参照文献方法(Li,C.；Chen,H.；Chen,X.；Li,Y.；Hua,P.；Wei,J.；Song,C.；Gu,Q.；Zhou,H.；Zhang,J.；Xu,J.,Discovery of tissue selective liver X receptoragonists for the treatment of atherosclerosis without causing hepaticlipogenesis.European journal of medicinal chemistry2019,182,111647)，RAW264.7(小鼠单核巨噬细胞)采用DMEM培养基(其中添加10％胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素)在含5％CO2的培养箱(37℃)中培养。将RAW264.7细胞以6×104个/孔的浓度接种于96孔板中，并在37℃下培养过夜。然后将细胞用25μg/mL ox-LDL处理48h，诱导其形成巨噬泡沫细胞。细胞内脂滴积累采用油红O染色分析方法进行检测。巨噬泡沫细胞以4％多聚甲醛溶液室温固定0.5h，再以新鲜配制的油红O溶液室温染色1h，蒸馏水洗涤三次，最终脂滴被油红O染成红色。脂滴染色结果以装配数码相机的EVOS FL自动显微镜观察并拍照。油红O溶液是按以下方法配制的：以异丙醇配制0.35％油红O母液，以双蒸水按体积比3:2进行稀释，最后以0.22μm滤膜过滤即得。每个处理3个重复。
测试结果如图5所示，化合物7-10均能不同程度降低ox-LDL诱导的巨噬泡沫细胞内脂滴含量，其中化合物10具有显著的降低巨噬细胞对胆固醇的吸收利用的作用，表现出显著的降胆固醇活性。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.如式(Ⅰ)所示中的任一化合物：
Figure FDA0003826953730000011
2.一种权利要求1所述的化合物talaromynoids A-I和22-epoxyberkeleydione的制备方法，其特征在于，是从真菌Talaromyces purpureogenus SCSIO 41517GDMCC No:61032的发酵液或菌丝体中分离得到的，包括以下步骤：
(a)制备真菌Talaromyces purpureogenus SCSIO 41517GDMCC No:61032的发酵液和菌丝体；
(b)将步骤(a)得到的发酵液用大孔树脂吸附，滤除发酵液，先用水冲洗大孔树脂除去培养基成分，再用乙醇冲洗大孔树脂，乙醇冲洗液浓缩后得到菌液提取物；菌丝体破碎后用丙酮或甲醇浸泡，重复提取，合并提取液，浓缩除去丙酮或甲醇，剩余水相用乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯相，浓缩后得菌体提取物；
(c)将步骤(b)所述菌液提取物和菌体提取物经过正相硅胶柱层析，依次用二氯甲烷:甲醇体积比为100:0,95:5,92:8,90:10,85:15,80:20,70:30,50:50的溶剂系统梯度洗脱；
收集二氯甲烷:甲醇体积比92:8冲洗下来的样品得到组分Fr.3，经过中压反相柱层析，以甲醇/水/TFA从体积比13:87:0.03-100:0:0.03梯度洗脱，收集甲醇:水体积比为60:40洗脱的样品得到组分Fr.3-12，收集甲醇:水体积比为70:30洗脱的样品得到组分Fr.3-17；
组分Fr.3-12经过凝胶柱，用CH3OH洗脱分为2个组分，其中Fr.3-12-1经过常压正相柱层析，以二氯甲烷/甲醇体积比100:0,250:1,125:1,100:1,62:1为流动相梯度洗脱，收集二氯甲烷/甲醇125:1洗脱的样品得到组分Fr.3-12a和组分Fr.3-12c，收集二氯甲烷/甲醇100:1洗脱的样品得到化合物3、4和组分Fr.3-12b，Fr.3-12a经制备型HPLC纯化得到化合物1和8；Fr.3-12b经制备型HPLC纯化得到化合物6和7；Fr.3-12c经制备型HPLC纯化，得到化合物2、5和9；
组分Fr.3-17经过凝胶柱用CH3OH洗脱分为7个组分Fr.3-17-1～Fr.3-17-7，其中Fr.3-17-2经过常压正相柱层析，以二氯甲烷/甲醇体积比100:0,250:1,125:1,100:1,62:1为流动相梯度洗脱，再以甲醇/水66:34等度洗脱得到化合物10。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(a)中所述的发酵液和菌丝体是通过以下方法制备：将真菌Talaromyces purpureogenus SCSIO 41517在真菌适用的平板培养基中生长，待真菌长出孢子后，将真菌接种到发酵培养基中，于室温静置培养28天，得到发酵液和菌丝体，所述的发酵培养基每升是按照以下比例配制的：葡萄糖10g，淀粉10g，KH2PO4 1g，MgSO4·7H2O 1g，蛋白胨1g，海盐30g，纯水1L，pH＝6.5。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(b)中所述的浓缩是采用减压浓缩。
5.权利要求1中所述的化合物talaromynoid E或其药用盐在制备蛋白酪氨酸磷酸酶CDC25B抑制剂中的应用。
6.权利要求1中所述的化合物talaromynoids G、H、I或22-epoxyberkeleydione或其药用盐在制备降血脂、抗肥胖和降胆固醇药物中的应用。
7.一种蛋白酪氨酸磷酸酶CDC25B抑制剂，其特征在于，含有权利要求1中所述的化合物talaromynoid E或其药用盐作为活性成分。
8.一种降血脂、抗肥胖和降胆固醇药物，其特征在于，含有权利要求1中所述的化合物talaromynoids G、H、I和22-epoxyberkeleydione中任一化合物或其药用盐作为活性成分。
9.真菌Talaromyces purpureogenus SCSIO 41517在制备权利要求1中式(Ⅰ)所示的化合物中的应用，所述的真菌Talaromyces purpureogenus SCSIO 41517，其保藏编号为GDMCC No:61032。
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