CN114989126A - 一种嗜氮酮类化合物及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种嗜氮酮类化合物或其药学上可接受的盐，具有化学式(I)的化合物。本发明合成的化合物已证实能够有效抑制乙酰胆碱酯酶活性，能够进一步开发作为乙酰胆碱酯酶抑制剂，治疗与相关的疾病制备乙酰胆碱酯酶的抑制剂类治疗阿兹海默症药物。

Description

一种嗜氮酮类化合物及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及医药化学领域，具体地说，涉及一种嗜氮酮类化合物及其制备方法和用途。
背景技术
海洋有着寡营养、含盐量高、缺氧、高压、弱碱性等恶劣的环境条件，在其中生存的海洋真菌因此会产生不同于陆生微生物且结构新颖活性显著的次级代谢产物，成为海洋天然产物的三大来源之一。它们的代谢产物种类繁多，涵盖了聚酮类、萜类、甾体、生物碱、肽类和其他含氮类化合物等等，其中多数化合物表现出了抗菌、抗肿瘤、抗炎、抗氧化、抗疟疾、抑制酶活和蛋白结合等活性。此外，海洋真菌生长速度快，容易培养，可以通过大规模发酵实现工业化培养，所以对海洋真菌的活性次级代谢产物的研究一直是发掘药物先导物方面的研究热点。
海洋来源的青霉属真菌是结构新颖活性显著的海洋天然产物的宝库，从其中分离鉴定的天然产物种类众多，包括聚酯类、甾醇、萜类、生物碱、其他含氮类化合物等等。青霉属来源的天然产物具有的生物活性也十分广泛，包括抗菌、抗病毒、抗炎、细胞毒、抑制酶活和蛋白结合等。此外海洋沉积物和海绵是海洋青霉属真菌的主要来源。
嗜氮酮类化合物具有高度氧化的吡喃醌双环核心和季碳中心，表现出了多种生物活性，包括抗菌、抗炎、抗氧化、抗HIV，细胞毒活性等等。嗜氮酮类化合物易与含氮类化合物发生反应，特别是含有氨基基团的的氨基酸、蛋白质和核苷酸等发生化学反应。治疗阿尔茨海默症(AD)的药物有赖于乙酰胆酯酶(AchE)抑制剂的研发，而嗜氮酮类化合物因其上述特性，在AchE抑制剂的方面有着极大的开发潜力。
发明内容
为了克服现有技术上的问题，本发明提供一种嗜氮酮类化合物化合物、制备方法及其用途，对乙酰胆碱酶活性具有很好的抑制效果，具有制备抗乙酰胆碱酯酶药物的应用。
本发明提供以下技术方案：
一种嗜氮酮类化合物或其药学上可接受的盐，具有化学式(I)的化合物，
Figure BDA0003672673680000021
其中，
Figure BDA0003672673680000022
或R1＝R2＝OH或R1＝OH,R2＝OAc或R1＝OAc，R2为羰基；R3与R4形成双键，或R3＝R4＝H；R5与R6形成双键，或R5＝R6＝OH。
进一步的，根据权利要求1所述的嗜氮酮类化合物，当
Figure BDA0003672673680000023
Figure BDA0003672673680000024
R3与R4形成双键，R5与R6形成双键，化合物为5-bromoisorotiorin。
进一步的，当R1＝R2＝OH，R3＝R4＝H，R5＝R6＝OH，化合物为Penicilazaphilone H。
嗜氮酮类化合物或其药学上可接受的盐，在制备乙酰胆碱酯酶的抑制剂类治疗阿兹海默症药物中的应用。
一种药物组合物，包含嗜氮酮类化合物，和药学上可接受的载体或赋形剂。
一种具有治疗阿兹海默症的药物，含有嗜氮酮类化合物，或其溶剂化物、立体异构体、互变异构体及前药。
一种制备嗜氮酮类化合物的制备方法，包括以下步骤：
步骤1将活化后的真菌Penicillium sclerotiorum E23Y-1A在大米固体培养基中进行培养，完成后用乙酸乙酯浸提，超声辅助，过滤后取滤液，减压浓缩至浸膏，加水混悬后依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，取乙酸乙酯萃取部分；
步骤2对乙酸乙酯萃取部分进行硅胶柱色谱分离，采用石油醚-乙酸乙酯系统和二氯甲烷-甲醇系统梯度。洗脱梯度为石油醚-乙酸乙酯(1:0、20:1、10:1、8:2、7:3、6:4、5:5、3:7、0:1，v/v)；二氯甲烷-甲醇(9:1、8:2、0:1，v/v)，收集洗脱剂为石油醚-乙酸乙酯(8:2、5:5，v/v)时的馏分，得到馏分N10、N18；
步骤3将馏分N10、N18反复经硅胶柱色谱、葡聚糖凝胶柱色谱、半制备液相色谱进行纯化分离，最终得到所述嗜氮酮类化合物。
一种制备嗜氮酮类化合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)将活化后的真菌Penicillium sclerotiorum E23Y-1A在大米固体培养基中进行培养，完成后用乙酸乙酯浸提，超声辅助，过滤后取滤液，减压浓缩至浸膏，加水混悬后依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，取乙酸乙酯萃取部分；
(2)将乙酸乙酯萃取部分过硅胶H柱色谱，干法上样，依次采用石油醚-乙酸乙酯系统，二氯甲烷-甲醇系统梯度洗脱，梯度为石油醚-乙酸乙酯(1:0、20:1、10:1、8:2、7:3、6:4、5:5、3:7、0:1，v/v)；二氯甲烷-甲醇(9:1、8:2、0:1，v/v)，收集每个馏分，再经过薄层色谱TLC检测，根据斑点情况合并馏分，各自旋转蒸干，得到馏分N10；
(3)将馏分N10溶于石油醚-氯仿-甲醇的混合溶剂中，溶剂体积比为2:1:1(v/v)，使其浓度达到60mg/mL，过凝胶柱sephadex LH-20，收集每个馏分，再经过薄层色谱TLC检测，根据斑点情况合并馏分，各自旋转蒸干，得到待分离的馏分N10D；
(4)将待分离的洗脱馏分N10D过300-400目硅胶柱色谱，石油醚-氯仿-甲醇系统梯度洗脱，体积比依次为10:2:0.2(v/v)、8:4:0.2(v/v)。收集洗脱液，分别收集，再进行TLC检测，根据斑点情况合并馏分，各自旋转蒸干，得到待分离的馏分N10D4；
(5)将待分离的洗脱馏分N10D4过300-400目硅胶柱色谱，纯氯仿作为洗脱剂，收集洗脱液，再进行TLC检测根据斑点情况合并馏分，各自旋转蒸干，得到待分离的馏分N10D4B；
(6)将待分离的洗脱馏分N10D4B溶于色谱甲醇中，经过半制备高效液相色谱纯化，得到馏分N10D4B；
(7)将待分离的馏分N10D4B过300-400目硅胶柱色谱，石油醚-乙酸乙酯系统作为洗脱剂，溶剂体积比为15:1(v/v)，收集洗脱液再进行TLC检测根据斑点情况合并馏分，各自旋转蒸干，得到待分离的馏分N10D4B1；
(8)将待分离的馏分N10D4B1过300-400目硅胶柱色谱，石油醚-乙酸乙酯系统作为洗脱剂，溶剂体积比为15:1(v/v)，洗脱剂中加入三氟乙酸，比例为500:1(v/v)，收集洗脱液，再进行TLC检测，根据斑点情况合并馏分，各自旋转蒸干，得到馏分N10D4B1B，此馏分为权利要求2所述的化合物5-bromoisorotiorin。
一种制备嗜氮酮类化合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)将活化后的真菌Penicillium sclerotiorum E23Y-1A在大米固体培养基中进行培养，完成后用乙酸乙酯浸提，超声辅助，过滤后取滤液，减压浓缩至浸膏，加水混悬后依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，取乙酸乙酯萃取部分；
(2)将乙酸乙酯萃取部分过硅胶H柱色谱，干法上样，依次采用石油醚-乙酸乙酯系统，二氯甲烷-甲醇系统梯度洗脱，洗脱梯度为石油醚-乙酸乙酯(10:1、8:2、7:3、6:4、5:5、3:7、0:1，v/v)；二氯甲烷-甲醇(9:1、8:2、0:1，v/v)，收集每个馏分，各自旋转蒸发，再经过薄层色谱TLC检测，根据斑点情况合并馏分，各自旋转蒸干，得到馏分N18；
(3)将馏分N18过硅胶300-400目柱色谱，干法上样，依次采用石油醚-乙酸乙酯系统，二氯甲烷-甲醇系统梯度洗脱，洗脱梯度为石油醚-乙酸乙酯(10:1、8:1、6:1、8:2、7:3、6:4、5:5、3:7、0:1，v/v)；二氯甲烷-甲醇(9:1、8:2、0:1，v/v)，收集每个馏分，各自旋转蒸发，再经过薄层色谱TLC检测，根据斑点情况合并馏分，各自旋转蒸干，得到馏分N18-10；
(4)将馏分N18-10溶于甲醇中，使其浓度达到60mg/mL，过凝胶柱sephadex LH-20，收集每个馏分，再经过薄层色谱TLC检测，根据斑点情况合并馏分，各自旋转蒸干，得到待分离的馏分N18-10E；
(5)将待分离的馏分N18-10E过300-400目硅胶柱色谱，二氯甲烷-甲醇系统作为洗脱剂，溶剂体积比依次为70:1、50:1(v/v)，收集每份洗脱液，再进行TLC检测，根据斑点情况合并馏分，各自旋转蒸干，得到馏分N18-10E4；
(6)将待分离的洗脱馏分N18-10E4溶于色谱甲醇中，经过半制备高效液相色谱纯化，得到馏分N18-10E4B。此馏分为权利要求3中所述的化合物Penicilazaphilone H。
嗜氮酮类化合物的制备方法，在步骤1中用3.75g麦芽提取物，2.5gNaBr，250mL去离子水配制成麦芽种子液，pH值为7.4-7.8，再用80g大米，120mL 3.3％的NaBr溶液配成大米固体培养基，温度121℃，20min条件下灭菌。
采用上述技术方案，本发明具有如下有益效果：
1、本发明中因真菌Penicillium sclerotiorum E23Y-1A具有生长周期智短、生长条件易控制、生长规模易放大等优点，保证了化合物获取的低成本、高产量；对各种色谱分离手段的充分组合运用，保证了可以从发酵产物中得到高纯度化合物单体，且提取分离工艺简单高效，为其进一步的药物开发提供了坚实的基础。
2、本发明制备的化合物已证实能够有效抑制乙酰胆碱酯酶活性，能够进一步开发作为乙酰胆碱酯酶抑制剂，制备乙酰胆碱酯酶抑制剂类的阿兹海默症药物。
附图说明
图1为本发明5-bromoisorotiorin的1H-NMR图谱；
图2为本发明5-bromoisorotiorin的13C-NMR图谱；
图3为本发明5-bromoisorotiorin的DEPT135图谱；
图4为本发明5-bromoisorotiorin的HSQC图谱；
图5为本发明5-bromoisorotiorin的1H-1H COSY图谱；
图6为本发明5-bromoisorotiorin的HMBC图谱；
图7为本发明5-bromoisorotiorin的NOESY图谱；
图8为本发明5-bromoisorotiorin的HR-ESI-MS图谱；
图9为本发明5-bromoisorotiorin的电子圆二色(ECD)图谱；
图10为本发明5-bromoisorotiorin的紫外吸收(UV)图谱；
图11为本发明Penicilazaphilone H的1H-NMR图谱；
图12为本发明Penicilazaphilone H的13C-NMR图谱；
图13为本发明Penicilazaphilone H的DEPT135图谱；
图14为本发明Penicilazaphilone H的HSQC图谱；
图15为本发明Penicilazaphilone H的1H-1H COSY图谱；
图16为本发明Penicilazaphilone H的HMBC图谱；
图17为本发明Penicilazaphilone H的NOESY图谱；
图18为本发明Penicilazaphilone H的HR-ESI-MS图谱；
图19为本发明Penicilazaphilone H的电子圆二色(ECD)图谱；
图20为本发明Penicilazaphilone H的紫外吸收(UV)图谱；
图21为本发明5-bromoisorotiorin的分子对接结果图；
图22为本发明Penicilazaphilone H分子对接结果图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的结构图及具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
一种嗜氮酮类化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，具有化学式(I)的化合物，
Figure BDA0003672673680000071
其中，
Figure BDA0003672673680000072
或R1＝R2＝OH或R1＝OH,R2＝OAc或R1＝OAc，R2为羰基；R3与R4形成双键，或R3＝R4＝H；R5与R6形成双键，或R5＝R6＝OH
当
Figure BDA0003672673680000073
R3与R4形成双键，R5与R6形成双键，该化合物具有(Ⅱ)所示结构：
Figure BDA0003672673680000074
为5-bromoisorotiorin。当R1＝R2＝OH，R3＝R4＝H，R5＝R6＝OH，该化合物具有(III)结构：
Figure BDA0003672673680000075
为Penicilazaphilone H。
本发明提供了上述嗜氮酮类化合物在制备乙酰胆碱酯酶的抑制剂类治疗阿兹海默症药物中的应用。
本发明提供了一种药物组合物，包含上述一种或多种嗜氮酮类化合物和药学上可接受的载体或赋形剂。
一种具有治疗阿兹海默症的药物，含有上述一种或多种嗜氮酮类化合物，或其溶剂化物、立体异构体、互变异构体及前药。
在药学上可接受的载体或赋形剂选自填充剂、润湿剂、黏合剂、崩解剂、润滑剂、溶剂、增溶剂、防腐剂、矫味剂、着色剂、pH调节剂和抗氧化剂中的一种或多种。
药物为临床可用的不同剂型的药物，剂型为散剂、注射剂、糖浆剂、悬浮剂、溶液、胶囊、丸剂、微胶囊、片剂、膏剂、栓剂、气雾剂、酊剂、口服液或颗粒剂中的一种。
嗜氮酮类化合物的制备方法，包括以下步骤：
步骤1将活化后的真菌Penicillium sclerotiorum E23Y-1A在大米固体培养基中进行培养，完成后用乙酸乙酯浸提，超声辅助，过滤后取滤液，减压浓缩至浸膏，加水混悬后依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，取乙酸乙酯萃取部分；
步骤2对乙酸乙酯萃取部分进行硅胶柱色谱分离，采用石油醚-乙酸乙酯系统和二氯甲烷-甲醇系统梯度。洗脱梯度为石油醚-乙酸乙酯(1:0、20:1、10:1、8:2、7:3、6:4、5:5、3:7、0:1，v/v)；二氯甲烷-甲醇(9:1、8:2、0:1，v/v)，收集洗脱剂为石油醚-乙酸乙酯(8:2、5:5，v/v)时的馏分，得到馏分N10、N18；
步骤3将馏分N10、N18反复经硅胶柱色谱、葡聚糖凝胶柱色谱、半制备液相色谱进行纯化分离，最终得到上述嗜氮酮类化合物。
实施例2
制备5-bromoisorotiorin的方法如下：
(1)将活化后的真菌Penicillium sclerotiorum E23Y-1A在大米固体培养基中进行培养，完成后用乙酸乙酯浸提，超声辅助，过滤后取滤液，减压浓缩至浸膏，加水混悬后依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，取乙酸乙酯萃取部分。菌株分离自海绵Holoxea sp.，目前保藏在中国热带农业科学院热带生物技术研究所热带海洋生物功能成分研究与利用研究组。
编号为Penicillium sclerotiorum E23Y-1A的菌种分离自西沙全富岛附近海域采集到的海绵样品，并经过分子生物学研究鉴定为Penicillium sclerotiorum。海绵样品E-23于2019年3月采自西沙全富岛。
样品先用自来水简单冲洗干净，拍照记录。取适量样品入超净台后放入1L烧杯内，倒入无菌水，用镊子夹稳来回涮洗，稍沥干水后放入装有75％酒精的500mL烧杯中，来回搅动充分消毒后取出，沥干酒精，放入无菌培养皿上，酒精灯下挥发干剩余酒精。用无菌剪刀将样品尽量剪碎，盛入无菌研钵中，越小越好，研磨至稀碎。将研磨好的样品用镊子取适量出来贴放在培养基上，每个平板放5～6块(也可铺满)，尽量分布均匀。剩余研磨好的样品用约1:1.5左右的无菌水置于50mL无菌离心管内震荡,取1mL浸出液注入9mL无菌水中稀释,则该稀释液为10～1梯度，以此类推稀释到10～2或10～3,取浸出液和各梯度稀释液0.2～0.25mL加入已倒好的平板中，每个浓度至少2板，涂布，用保鲜膜密封，28℃倒置培养。
样品通过分离得到共附生真菌菌株E23Y-1A，根据其菌落形态和分析其ITS序列鉴定为Penicillium sclerotiorum,编号为Penicillium sclerotiorum E23Y-1A。中国专利公开号：CN 114380782 A，名称为“化合物及制备方法、杀菌剂在防治橡胶炭疽病中的应用”披露了该菌的鉴定结果。期刊Phytochemistry Letters公开发表的文章《Two newazaphilones from the marine-derived fungus Penicillium sclerotiorum E23Y-1A》同样披露了该菌种。
用3.75g麦芽提取物，2.5g NaBr，250mL去离子水配制成麦芽种子液(pH＝7.4-7.8)，再用80g大米，120mL 3.3％的NaBr溶液配成大米固体培养基，都在121℃，20min条件下灭菌。之后将已培养好的真菌Penicillium sclerotiorum E23Y-1A接种到麦芽种子液，在28℃，180r/min的条件下，置于摇床3-5d做成菌株种子液。每份大米固体培养基中加入5mL菌株种子液，于室温下静置培养28d，共培养83瓶。发酵完成后，均加入乙酸乙酯进行浸提，超声30min后静置过夜，再过滤，取滤液。前后共提取4次。合并滤液后，旋转蒸发，得浸膏。
(2)将乙酸乙酯萃取部分过硅胶H柱色谱，干法上样，依次采用石油醚-乙酸乙酯系统，二氯甲烷-甲醇系统梯度洗脱，每个梯度冲洗量为三倍柱体积。具体梯度为石油醚-乙酸乙酯(1:0、20:1、10:1、8:2、7:3、6:4、5:5、3:7、0:1，v/v)；二氯甲烷-甲醇(9:1、8:2、0:1，v/v)，每个馏分收集500mL，各自旋转蒸发，再经过薄层色谱TLC检测，根据斑点情况合并馏分，各自旋转蒸干，得到馏分N10。干法拌样，萃取部分或待分离馏分用乙酸乙酯溶解，浓度为用滴管分多次加入到200-300目硅胶中，每次需等溶剂挥发干后，再加下一次。其中硅胶量为样品的2-3倍，拌样要均匀，溶剂挥发后，如果有较大颗粒，要将其碾碎。薄层色谱检测TLC，点板、展开后，先在254nm和365nm的紫外灯下检测，后在10％硫酸乙醇显色剂中蘸湿，烤干，再观察斑点情况。
(3)将馏分N10溶于石油醚-氯仿-甲醇的混合溶剂中，溶剂体积比为2:1:1(v/v)，使其浓度达到60mg/mL，过凝胶柱sephadex LH-20，每个馏分收集2mL，再经过薄层色谱TLC检测，根据斑点情况合并馏分，各自旋转蒸干，得到待分离的馏分N10D。
(4)将待分离的洗脱馏分N10D过300-400目硅胶柱色谱，石油醚-氯仿-甲醇系统梯度洗脱，体积比依次为10:2:0.2(v/v)、8:4:0.2(v/v)。收集洗脱液，每份收集15-20mL，再进行TLC检测，根据斑点情况合并馏分，各自旋转蒸干，得到待分离的馏分N10D4。在进行第二个梯度冲洗前，要进行TLC检测，确保目标点上方的点已全部洗脱完毕
(5)将待分离的洗脱馏分N10D4过300-400目硅胶柱色谱，纯氯仿作为洗脱剂，收集洗脱液，每份收集15-20mL，再进行TLC检测根据斑点情况合并馏分，各自旋转蒸干，得到待分离的馏分N10D4B。
(6)将待分离的洗脱馏分N10D4B溶于色谱甲醇中，经过半制备高效液相色谱纯化，得到馏分N10D4B。半制备HPLC的色谱柱为反相C18柱，流动相为85％色谱甲醇-酸水，配制酸水时三氟乙酸的量为0.5‰，紫外检测器的检测波长为220nm和425nm，每次进样收集12.5min出现的吸收峰。
(7)将待分离的馏分N10D4B过300-400目硅胶柱色谱，石油醚-乙酸乙酯系统作为洗脱剂，溶剂体积比为15:1(v/v)，收集洗脱液，每份收集15-20mL，再进行TLC检测根据斑点情况合并馏分，各自旋转蒸干，得到待分离的馏分N10D4B1。
(8)将待分离的馏分N10D4B1过300-400目硅胶柱色谱，石油醚-乙酸乙酯系统作为洗脱剂，溶剂体积比为15:1(v/v)，洗脱剂中加入三氟乙酸，比例为500:1(v/v)，收集洗脱液，每份收集15-20mL，再进行TLC检测，根据斑点情况合并馏分，各自旋转蒸干，得到馏分N10D4B1B。此馏分即为5-bromoisorotiorin。
实施例3
5-bromoisorotiorin的结构鉴定，附图1-10为本发明制得的5-bromoisorotiorin的各种相关谱图。
化合物5-bromoisorotiorin(II)为红色固体，[α]2D5+267.96(c 0.1，MeOH)；HR-ESI-MS给出[M+Na]+峰481.0566(C23H23BrNaO5，计算值为481.0621)，确定其分子式为C23H23BrO5；UV(MeOH)λmax(logε)245(3.1),370(3.4)nm。
化合物5-bromoisorotiorin(II)的1H-NMR和HSQC谱表明该化合物有5个烯烃质子(δH 8.83,7.14,6.66,6.10,5.74)，5个甲基质子(δH 2.61,1.86,1.71,1.02,0.87)，两个化学不等价的亚甲基质子(δH 1.44；1.33)，1个次甲基质子(δH 5.74)。13C-NMR和DEPT135表明该化合物有3个羰基碳(δC 194.5,183.5,168.0)，1个含氧季碳(δC 87.6)，1个次甲基碳(δC35.4)，1个亚甲基碳(δC 30.2)，12个烯烃碳原子(δC 164.0,158.5,152.1,149.6,143.9,141.9,132.2,123.9,115.8,111.2,108.4,100.8)，5个甲基碳(δC 30.3,26.5,20.3,12.5,12.1)。根据以上数据可以得出5-bromoisorotiorin的不饱和度为9，再结合分子式可知它是一个三环化合物。此外，从1H-NMR和13C-NMR可以看出，分离得到的5-bromoisorotiorin中所含杂质较少，纯度较高。
根据HMBC谱图，H-1(δH 8.83)与C-3(δC 158.5),C-4a(δC 141.9)and C-8a(δC164.0)相关，H-4(δH 6.66)与C-3,C-5(δC 111.2),C-8a相关，H-16(δH1.71)与C-6(δC183.5)，C-7(δC 87.6)，C-8(δC 164.0)相关，可以确定一个C-7位置是甲基取代的azaphilone骨架，再结合化学位移和分子式可知，C-5位置有溴原子取代。
1H-1H COSY谱中显示H-9与H-10相关，H-12与H-13相关，H-13与H-14相关，H-14与H-15相关，H-18与H-13相关，再结合HMBC谱中H-10(δH 7.14)与C-11(δC 132.2)、C-17(δC12.5)相关；H-12(δH 5.74)与C-10(δC 143.9)、C-13(δC 35.4)、C-14(δC 30.2)、C-17相关；H-14(δH 1.44；1.33)与C-12(δC 149.6)、C-13、C-15(δC 12.1)、C-18(δC 20.3)相关，可以确定一条3,5-二甲基-1,3-庚二烯的烷基链。再根据3J9,10＝15.6Hz和H-4与H-9、H-9与H-17、H-10与H-12的NOE效应，推出链中双键的构型为9E和11E。
由HMBC谱中H-9与C-3、C-4；H-10与C-3的远程相关，可以得出链3,5-二甲基-1,3-庚二烯在C-3的位置与azaphilone骨架相连。至此，化合物5-bromoisorotiorin(II)的平面结构确定。
化合物5-bromoisorotiorin的绝对构型是根据实验ECD谱图与计算ECD谱图的对比确定的，如图9。所以化合物5-bromoisorotiorin的绝对构型为7R，13S。最终确定了化合物5-bromoisorotiorin的结构式为
Figure BDA0003672673680000121
实施例4
制备Penicilazaphilone H的方法如下：
(1)将活化后的真菌Penicillium sclerotiorum E23Y-1A在大米固体培养基中进行培养，完成后用乙酸乙酯浸提，超声辅助，过滤后取滤液，减压浓缩至浸膏，加水混悬后依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，取乙酸乙酯萃取部分。
(2)将乙酸乙酯萃取部分过硅胶H柱色谱，干法上样，依次采用石油醚-乙酸乙酯系统，二氯甲烷-甲醇系统梯度洗脱。具体梯度为石油醚-乙酸乙酯(10:1、8:2、7:3、6:4、5:5、3:7、0:1，v/v)；二氯甲烷-甲醇(9:1、8:2、0:1，v/v)，每个馏分收集500mL，各自旋转蒸发，再经过薄层色谱TLC检测，根据斑点情况合并馏分，各自旋转蒸干，得到馏分N18。
(3)将馏分N18过硅胶300-400目柱色谱，干法上样，依次采用石油醚-乙酸乙酯系统，二氯甲烷-甲醇系统梯度洗脱。具体梯度为石油醚-乙酸乙酯(10:1、8:1、6:1、8:2、7:3、6:4、5:5、3:7、0:1，v/v)；二氯甲烷-甲醇(9:1、8:2、0:1，v/v)，每个馏分收集250mL，各自旋转蒸发，再经过薄层色谱TLC检测，根据斑点情况合并馏分，各自旋转蒸干，得到馏分N18-10。
(4)将馏分N18-10溶于甲醇中，使其浓度达到60mg/mL，过凝胶柱sephadex LH-20，每个馏分收集2mL，再经过薄层色谱TLC检测，根据斑点情况合并馏分，各自旋转蒸干，得到待分离的馏分N18-10E。
(5)将待分离的馏分N18-10E过300-400目硅胶柱色谱，二氯甲烷-甲醇系统作为洗脱剂，溶剂体积比依次为70:1、50:1(v/v)，收集洗脱液，每份收集15-20mL，再进行TLC检测，根据斑点情况合并馏分，各自旋转蒸干，得到馏分N18-10E4。
(6)将待分离的洗脱馏分N18-10E4溶于色谱甲醇中，经过半制备高效液相色谱纯化，得到馏分N18-10E4B。半制备HPLC的色谱柱为反相C18柱，流动相为50％色谱甲醇-超纯水，紫外检测器的检测波长为220nm和370nm，每次进样收集27min出现的吸收峰。此馏分即为Penicilazaphilone H。
实施例5
Penicilazaphilone H的结构鉴定，附图11-20为本发明制得的Penicilazaphilone H的各种相关谱图。
Figure BDA0003672673680000131
+198.97(c 0.1,MeOH)；HR-ESI-MS给出[M+H]+峰431.1067(C19H28BrO6，计算值为431.1064)，确定其分子式为C19H27BrO6。UV(MeOH)λmax(logε)241(3.1),368(3.7)nm。
分析化合物Penicilazaphilone H的1H-NMR和HSQC谱图得知，Ⅱ有4个甲基(δH1.37,1.33,0.97,0.92)，两个亚甲基(δH 4.47,4.25；1.42,1.34)，5个次亚甲基(δH 6.09,4.11,3.51,3.04,1.70)，两个烯烃质子(δH 6.57,6.30,J＝15.5Hz)。Penicilazaphilone H的13C-NMR和DEPT135谱图表明它有19碳原子，包括6个季碳：1个酮羰基碳(δC 193.3)，2个含氧季碳(δC 77.7,75.9)，3个three烯烃碳(δC 161.7,148.1,109.4)；7个叔碳：2个次甲基(δC38.1,35.5)，2个含氧叔碳(δC 78.4,73.8)，3个烯烃碳(δC 144.4,122.8,105.5)；2个亚甲基(δC 68.5,28.8)；4个甲基(δC 23.7,23.5,13.5,12.5)。根据以上数据可以得出Penicilazaphilone H的不饱和度为4，再结合分子式可知它是一个双环化合物。此外，从1H-NMR和13C-NMR可以看出，分离得到的Penicilazaphilone H中所含杂质较少，纯度较高。
1H-1H COSY谱表明H2-1与H-8a，H-8a与H-8相关，再结合HMBC谱中H-1(δH 4,47,4.25)与C-3(δC 161.7)、C-4a(δC 148.1)、C-8(δC 73.8)、C-8a(δC 38.1)相关；H-4(δH 6.09)与C-5(δC 109.4)、C-8a(δC 38.1)相关；H-8(δH 4.11)与C-4a(δC 148.1)、C-6(δC 193.3)、C-7(δC 77.7)相关；H-8a(δH 3.04)与C-4a(δC 148.1)、C-5(δC 109.4)相关；H-16(δH 1.37)与C-6(δC 193.3)、C-8(δC 73.8)相关，充分说明Penicilazaphilone H拥有一个C-7处被甲基取代的azaphilone骨架，且C-5处有溴原子取代。
1H-1H COSY谱显示H-9(δH 6.30)与H-10(δH 6.57)相关，H-12(δH 3.51)与H-13(δH1.70)相关，H-13与H2-14(δH 1.34)相关，H2-14与H-15(δH 0.92)相关，H-18(δH 0.97)与H-13(δH 1.70)相关，再加上HMBC谱中的H-9(δH6.30)与C-3、C-4(δC 105.5)、C-11(δC 75.9)相关；H-10(δH 6.57)与C-3、C-17(δC 23.5)相关；H-12(δH 3.51)与C-10(δC 144.4)、C-14(δC28.8)、C-17(δC23.5)、C-18(δC 13.5)相关；H-15(δH 0.92)与C-13(δC 35.5)、C-14(δC 28.8)相关；H-17(δH 1.33)与C-10(δC 144.4)、C-11(δC 75.9)、C-12(δC 78.4)、C-13(δC 35.5)相关；H-18(δH 0.97)与C-12(δC 78.4)、C-14(δC 28.8)相关，可以确定一条3,5-二甲基-3,4-二醇-1-庚烯的烷基链，且它连接在C-3位置。
NOESY谱显示，H-8与H-8a相关，H-8与H-16相关，H-8a与H-16相关，表明这些质子在空间是共面的，而偶合常数3J8/8a＝3.0则进一步证实了H-8与H-8a在平面环的同侧。H-12与H-13相关，表明C-11处的甲基、C-12处的羟基、C-13处的甲基在空间的同侧，所以化合物Penicilazaphilone H的相对构型为7R*，8R*，8aS*，11S*，12R*，13S*。另外，仔细对比化合物与文献中Eupenicilazaphilone B的核磁数据，发现除C-5处的取代不同外，其余平面结构完全相同，将二者的ECD谱图进行对比后，发现两者在241nm、319nm和374nm处的Cotton效应完全一致。再根据文献可知Azaphilones化合物中C-5处的取代对构型没有影响，所以Penicilazaphilone H的绝对构型为7R，8R，8aS，11S，12R，13S。至此，最终确定了化合物Penicilazaphilone H的结构式为
Figure BDA0003672673680000151
实施例6
抗乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase，AchE)活性测试实验。
(1)配制磷缓冲盐溶液(PBS)：称取磷酸氢二钠(Na2HPO4)3.5814g于150mL三角瓶中，加100mL双蒸水溶解；称取磷酸二氢钠(NaH2PO4)0.156g于25mL三角瓶中，加10mL双蒸水溶解。取94.7mL磷酸氢二钠溶液与5.3mL磷酸二氢钠溶液混合成100mL PBS溶液(pH＝8.0)。(2)配制显色剂DTNB(5,5-二硫二硝基苹果酸)：称取5.78mg于三角瓶中，加10mL PBS溶液溶解。(3)配制底物溶液AICI(硫代乙酰胆碱)：称取39.6mg于15mL三角瓶中，加10mL PBS溶液溶解。(4)AchE溶液为0.2U/mL。步骤(2)-(4)中配制完成的溶液置于冰盒中备用。(5)将待测样品5-bromoisorotiorin和Penicilazaphilone H以及阳性对照他克林均用DMSO溶解，其终浓度均为200μM。(6)配制待测样品溶液：实验组取975μL(150×7)配制好的PBS溶液于EP管中，再取65μL(10×6.5)化合物溶液加至EP管中，最后取130μL(20×6.5)AchE溶液，摇匀，分别取6次180μL混合均匀的溶液加入96孔板中；阴性与空白组取675μL(150×4.5)配制好的PBS溶液于EP管中，再取45μL(10×4.5)的化合物溶液加至EP管中，最后取90μL(20×4.5)的AchE溶液，摇匀，分别取4次180μL混合均匀的待测溶液加入到96孔板中。将96孔板于37℃放置15min后，实验组和阴性对照组均加入20μL底物(10μL AICI+10μLDTNB)；空白对照组和本底组加入10μL PBS+10μL DTNB。将96孔板于37℃放置30min后,于412nm波长的酶标仪下测量各孔的OD值吸光度。
计算化合物AchE抑制活性，公式如下：
抑制率＝(ODDMSO-(OD样-OD本底))/(ODDMSO-ODPBS)×100％
通过公式计算得出5-bromoisorotiorin和Penicilazaphilone H对AchE的抑制率分别为9.96±0.11％、1.57±0.02％。
实施例7
运用分子对接的方法分析了5-bromoisorotiorin和Penicilazaphilone H对乙酰胆碱酯酶的抑制原理。
AchE的结构从Protein Data Bank中下载(序列号1U65)，分辨率为
Figure BDA0003672673680000161
运用软件Discovery Studio 2016进行分子对接。从图21的分子对接的结果图可以看出5-bromoisorotiorin C-6的氧原子与AchE的残基LYS413形成氢键，同时它C-3处的烷基链中的11-CH3与VAL522、13-CH3与ARG515和VAL518、15-CH3与VAL518、MET405和CYS521均存在着疏水作用力，另外化合物还与THR497、GLN500、ARG517、LEU516、ASN407、ASN525和GLN526以范德华力相互作用；从图22的分子对接结果图可以看出Penicilazaphilone H与VAL518、VAL522、ASN525、GLN526、ASN409、THR497、LYS413和GLN500以范德华力相互作用。分析结果可知，产生相互作用的结构部位不包括R1、R2、R3、R4处的取代，而主要是C-3处的烷基链，所以通式里的其他化合物也会对AchE产生类似的抑制活性。
以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种嗜氮酮类化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，具有化学式(I)的化合物，
Figure FDA0003672673670000011
其中，
Figure FDA0003672673670000012
或R1＝R2＝OH或R1＝OH,R2＝OAc或R1＝OAc，R2为羰基；R3与R4形成双键，或R3＝R4＝H；R5与R6形成双键，或R5＝R6＝OH。
2.根据权利要求1所述的嗜氮酮类化合物，其特征在于，当R1+R2＝
Figure FDA0003672673670000013
R3与R4形成双键，R5与R6形成双键，化合物为5-bromoisorotiorin。
3.根据权利要求1所述的嗜氮酮类化合物，其特征在于，当R1＝R2＝OH，R3＝R4＝H，R5＝R6＝OH，化合物为Penicilazaphilone H。
4.根据权利要求1-3任意一项所述的嗜氮酮类化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，在制备乙酰胆碱酯酶的抑制剂类治疗阿兹海默症药物中的应用。
5.一种药物组合物，其特征在于，包含根据权利要求1-3任一项或多项所述嗜氮酮类化合物，和药学上可接受的载体或赋形剂。
6.一种具有治疗阿兹海默症的药物，其特征在于：含有权利要求1-3任意一项或多项所述的嗜氮酮类化合物，或其溶剂化物、立体异构体、互变异构体及前药。
7.一种制备权利要求1-3所述嗜氮酮类化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1将活化后的真菌Penicillium sclerotiorum E23Y-1A在大米固体培养基中进行培养，完成后用乙酸乙酯浸提，超声辅助，过滤后取滤液，减压浓缩至浸膏，加水混悬后依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，取乙酸乙酯萃取部分；
步骤2对乙酸乙酯萃取部分进行硅胶柱色谱分离，采用石油醚-乙酸乙酯系统和二氯甲烷-甲醇系统梯度。洗脱梯度为石油醚-乙酸乙酯(1:0、20:1、10:1、8:2、7:3、6:4、5:5、3:7、0:1，v/v)；二氯甲烷-甲醇(9:1、8:2、0:1，v/v)，收集洗脱剂为石油醚-乙酸乙酯(8:2、5:5，v/v)时的馏分，得到馏分N10、N18；
步骤3将馏分N10、N18反复经硅胶柱色谱、葡聚糖凝胶柱色谱、半制备液相色谱进行纯化分离，最终得到所述嗜氮酮类化合物。
8.一种制备权利要求2所述的嗜氮酮类化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将活化后的真菌Penicillium sclerotiorum E23Y-1A在大米固体培养基中进行培养，完成后用乙酸乙酯浸提，超声辅助，过滤后取滤液，减压浓缩至浸膏，加水混悬后依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，取乙酸乙酯萃取部分；
(2)将乙酸乙酯萃取部分过硅胶H柱色谱，干法上样，依次采用石油醚-乙酸乙酯系统，二氯甲烷-甲醇系统梯度洗脱，梯度为石油醚-乙酸乙酯(1:0、20:1、10:1、8:2、7:3、6:4、5:5、3:7、0:1，v/v)；二氯甲烷-甲醇(9:1、8:2、0:1，v/v)，收集每个馏分，再经过薄层色谱TLC检测，根据斑点情况合并馏分，各自旋转蒸干，得到馏分N10；
(3)将馏分N10溶于石油醚-氯仿-甲醇的混合溶剂中，溶剂体积比为2:1:1(v/v)，使其浓度达到60mg/mL，过凝胶柱sephadex LH-20，收集每个馏分，再经过薄层色谱TLC检测，根据斑点情况合并馏分，各自旋转蒸干，得到待分离的馏分N10D；
(4)将待分离的洗脱馏分N10D过300-400目硅胶柱色谱，石油醚-氯仿-甲醇系统梯度洗脱，体积比依次为10:2:0.2(v/v)、8:4:0.2(v/v)。收集洗脱液，分别收集，再进行TLC检测，根据斑点情况合并馏分，各自旋转蒸干，得到待分离的馏分N10D4；
(5)将待分离的洗脱馏分N10D4过300-400目硅胶柱色谱，纯氯仿作为洗脱剂，收集洗脱液，再进行TLC检测根据斑点情况合并馏分，各自旋转蒸干，得到待分离的馏分N10D4B；
(6)将待分离的洗脱馏分N10D4B溶于色谱甲醇中，经过半制备高效液相色谱纯化，得到馏分N10D4B；
(7)将待分离的馏分N10D4B过300-400目硅胶柱色谱，石油醚-乙酸乙酯系统作为洗脱剂，溶剂体积比为15:1(v/v)，收集洗脱液再进行TLC检测根据斑点情况合并馏分，各自旋转蒸干，得到待分离的馏分N10D4B1；
(8)将待分离的馏分N10D4B1过300-400目硅胶柱色谱，石油醚-乙酸乙酯系统作为洗脱剂，溶剂体积比为15:1(v/v)，洗脱剂中加入三氟乙酸，比例为500:1(v/v)，收集洗脱液，再进行TLC检测，根据斑点情况合并馏分，各自旋转蒸干，得到馏分N10D4B1B，此馏分为权利要求2所述的化合物5-bromoisorotiorin。
9.一种制备权利要求3所述的嗜氮酮类化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将活化后的真菌Penicillium sclerotiorum E23Y-1A在大米固体培养基中进行培养，完成后用乙酸乙酯浸提，超声辅助，过滤后取滤液，减压浓缩至浸膏，加水混悬后依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，取乙酸乙酯萃取部分；
(2)将乙酸乙酯萃取部分过硅胶H柱色谱，干法上样，依次采用石油醚-乙酸乙酯系统，二氯甲烷-甲醇系统梯度洗脱，洗脱梯度为石油醚-乙酸乙酯(10:1、8:2、7:3、6:4、5:5、3:7、0:1，v/v)；二氯甲烷-甲醇(9:1、8:2、0:1，v/v)，收集每个馏分，各自旋转蒸发，再经过薄层色谱TLC检测，根据斑点情况合并馏分，各自旋转蒸干，得到馏分N18；
(3)将馏分N18过硅胶300-400目柱色谱，干法上样，依次采用石油醚-乙酸乙酯系统，二氯甲烷-甲醇系统梯度洗脱，洗脱梯度为石油醚-乙酸乙酯(10:1、8:1、6:1、8:2、7:3、6:4、5:5、3:7、0:1，v/v)；二氯甲烷-甲醇(9:1、8:2、0:1，v/v)，收集每个馏分，各自旋转蒸发，再经过薄层色谱TLC检测，根据斑点情况合并馏分，各自旋转蒸干，得到馏分N18-10；
(4)将馏分N18-10溶于甲醇中，使其浓度达到60mg/mL，过凝胶柱sephadex LH-20，收集每个馏分，再经过薄层色谱TLC检测，根据斑点情况合并馏分，各自旋转蒸干，得到待分离的馏分N18-10E；
(5)将待分离的馏分N18-10E过300-400目硅胶柱色谱，二氯甲烷-甲醇系统作为洗脱剂，溶剂体积比依次为70:1、50:1(v/v)，收集每份洗脱液，再进行TLC检测，根据斑点情况合并馏分，各自旋转蒸干，得到馏分N18-10E4；
(6)将待分离的洗脱馏分N18-10E4溶于色谱甲醇中，经过半制备高效液相色谱纯化，得到馏分N18-10E4B。此馏分为权利要求3中所述的化合物Penicilazaphilone H。
10.根据权利要求7所述的嗜氮酮类化合物的制备方法，其特征在于，在步骤1中用3.75g麦芽提取物，2.5g NaBr，250mL去离子水配制成麦芽种子液，pH值为7.4-7.8，再用80g大米，120mL 3.3％的NaBr溶液配成大米固体培养基，温度121℃，20min条件下灭菌。
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