CN115716830B

CN115716830B - 一种苦参碱型生物碱及其制备方法与在制备具有抗肺癌作用的药物中的应用

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Publication number: CN115716830B
Application number: CN202211064615.1A
Authority: CN
Inventors: 罗钉; 张玉波; 王国才; 王昊; 代小勇; 李药兰; 范春林; 邹加文; 黄粤豪
Original assignee: Jinan University; First Affiliated Hospital of Jinan University
Current assignee: Jinan University; First Affiliated Hospital of Jinan University
Priority date: 2022-09-01
Filing date: 2022-09-01
Publication date: 2024-03-19
Anticipated expiration: 2042-09-01
Also published as: CN115716830A

Abstract

本发明具体公开了一种苦参碱型生物碱及其制备方法和在制备具有抗肺癌作用的药物中的应用。所述的苦参碱型生物碱，具有式I、式II或式III所示的结构。所述的组合物和提取物，包含式I、式II或式III所示结构的任意一种或一种以上的苦参碱型生物碱。研究表明，本发明具有式I、式II或式III所示结构的苦参碱型生物碱其具有优异的抗肺癌作用，尤其是抗非小细胞肺癌作用。因此，将具有式I、式II或式III所示结构的苦参碱型生物碱，或将含有具有式I、式II或式III所示结构的苦参碱型生物碱的组合物或提取物作为活性成分用于制备具有抗肺癌作用的药物，尤其是制备具有抗非小细胞肺癌作用的药物具有重要的应用价值。

Description

一种苦参碱型生物碱及其制备方法与在制备具有抗肺癌作用的药物中的应用

技术领域

本发明涉及药物化学技术领域，具体涉及一种苦参碱型生物碱及其制备方法和在制备具有抗肺癌作用的药物中的应用。

背景技术

随着社会经济发展和人民生活水平提高，饮食结构改变，我国的疾病谱和死亡谱发生显著变化，恶性肿瘤是目前全世界的主要死亡原因之一，已经成为严重危害人类生命健康、制约社会经济发展的一大类疾病。在所有恶性肿瘤中，肺癌的发病率和死亡率位居前列，而非小细胞肺癌占到了所有临床肺癌病例的85％左右。近年来免疫疗法的兴起和酪氨酸激酶抑制剂的发现为非小细胞肺癌患者带来了一定的治疗收益，但免疫疗法高额的医疗费用给患者及其家庭带来巨大的经济压力，可用于放化疗的药物数量少且毒副作用大，临床上非小细胞肺癌的总体治愈率和生存率仍然很低。因此，现在迫切需要发现新型具有抗非小细胞肺癌作用的药物分子。

从中药中发现具有生物活性的化合物分子一直是药物发现的重要手段。苦豆子(拉丁名：Sophora alopecuroides L.)为豆科(Fabaceae)槐属(Sophora)下的一个变种，广泛分布于我国的西北部省份。作为我国的一味传统中药，其临床应用广泛，常见市售制剂如复方苦参素注射液、苦豆子油搽剂、克泻灵片、妇炎宁等，主要用于治疗癌肿疼痛、乙型肝炎、肠炎、妇科炎症等炎症和肿瘤相关疾病。现代药理学研究发现，苦参碱型生物碱为该植物产生药效的主要物质基础。但之前的研究对该植物种子中苦参碱类生物碱研究尚不充分，报道化合物类型较为单一，含量较大的单体化合物药理活性并不显著。所以苦豆子种子中苦参碱类生物碱值得进一步研究和开发，以期从中发现新颖结构并且具有较好生物活性的药物先导化合物分子。

发明内容

为了克服现有技术中存在的上述技术问题，本发明提供了一种全新的苦参碱型生物碱；研究表明，本发明全新结构的苦参碱型生物碱具有优异的抗肺癌作用，尤其是抗非小细胞肺癌作用。

本发明的技术方案如下：

本发明首先提供了一种苦参碱型生物碱，其具有式I、式II或式III所示的结构：

本发明在研究中发现，具有式I、式II或式III所示结构的苦参碱型生物碱其具有优异的抗非小细胞肺癌作用。

尤其是，发明人需要强调的是，在本发明以15,17-裂环苦参碱结构骨架为母核结构的苦参碱型生物碱化合物中，其中的羟基的位置，对于苦参碱型生物碱化合物的抗非小细胞肺癌作用的大小差别是巨大的。发明人在研究中惊奇的发现，具有式I所示结构的苦参碱型生物碱，具有十分优异的抗非小细胞肺癌作用；其抗非小细胞肺癌作用要远远高于具有式式II和式III所示结构的苦参碱型生物碱，同时也远远高于阳性对照药顺铂。

优选地，式I所示结构第5位羟基的绝对构型为5R或5S。

优选地，式II所示结构中第7位羟基和第11氢的绝对构型为7S,11R或7R,11S。

优选地，式III所示结构的中第12位羟基的绝对构型为12R或12S。

优选地，所述的苦参碱型生物碱为具有式I、式II或式III所示结构的外消旋体。

进一步优选地，式I所示结构的外消旋体中光学对映体的第5位羟基的绝对构型为5R和5S。

进一步优选地，式II所示结构的外消旋体中光学对映体的第7位羟基和第11氢的绝对构型为7S,11R和7R,11S。

进一步优选地，式III所示结构的外消旋体中光学对映体的第12位羟基的绝对构型为12R和12S。

本发明还提供了一种组合物，其包含式I、式II或式III所示结构的任意一种或一种以上的苦参碱型生物碱。

本发明还提供了一种提取物，其包含式I、式II或式III所示结构的任意一种或一种以上的苦参碱型生物碱。

优选地，所述的提取物包含式I、式II和式III所示结构的苦参碱型生物碱。

优选地，式I、式II和式III所示结构的苦参碱型生物碱的总重量占提取物总重量的10％以上。

进一步优选地，式I、式II和式III所示结构的苦参碱型生物碱的总重量占提取物总重量的20％～80％。

优选地，所述的提取物为苦豆子种子提取物。

本发明还提供了一种上述苦参碱型生物碱、组合物或提取物在制备具有抗肺癌作用的药物中的应用。

优选地，所述的肺癌为非小细胞肺癌。

优选地，所述的药物以苦参碱型生物碱、组合物或提取物作为活性成分，还包含药学上可接受的辅料。

优选地，所述的药物制成散剂、丸剂、片剂、胶囊剂、口服液、气雾剂或注射剂。

有益效果：本发明提供了一种全新结构的苦参碱型生物碱；研究表明，本发明具有式I、式II或式III所示结构的苦参碱型生物碱其具有优异的抗肺癌作用，尤其是抗非小细胞肺癌作用。因此，将具有式I、式II或式III所示结构的苦参碱型生物碱，或将含有具有式I、式II或式III所示结构的苦参碱型生物碱的组合物或提取物作为活性成分用于制备具有抗肺癌作用的药物，尤其是制备具有抗非小细胞肺癌作用的药物具有重要的应用价值。

附图说明

图1为化合物sophaloseedline I的单晶结构图。

图2为化合物sophaloseedline J的单晶结构图。

图3为化合物sophaloseedline K的单晶结构图。

图4为化合物sophaloseedline I的高分辨质谱图。

图5为化合物sophaloseedline I的氢谱(600M,CD₃OD)。

图6为化合物sophaloseedline I的碳谱(150M,CD₃OD)。

图7为化合物sophaloseedline I的¹H-¹H COSY谱。

图8为化合物sophaloseedline I的HSQC谱。

图9为化合物sophaloseedline I的HMBC谱。

图10为化合物sophaloseedline J的高分辨质谱图。

图11为化合物sophaloseedline J的氢谱(600M,CD₃OD)。

图12为化合物sophaloseedline J的碳谱(150M,CD₃OD)。

图13为化合物sophaloseedline J的¹H-¹H COSY谱。

图14为化合物sophaloseedline J的HSQC谱。

图15为化合物sophaloseedline J的HMBC谱。

图16为化合物sophaloseedline K的高分辨质谱图。

图17为化合物sophaloseedline K的氢谱(600M,CD₃OD)。

图18为化合物sophaloseedline K的碳谱(150M,CD₃OD)。

图19为化合物sophaloseedline K的¹H-¹H COSY谱。

图20为化合物sophaloseedline K的HSQC谱。

图21为化合物sophaloseedline K的HMBC谱。

图22为化合物sophaloseedline I的结构编号图。

图23为化合物sophaloseedline J的结构编号图。

图24为化合物sophaloseedline K的结构编号图。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步解释本发明，但实施例对本发明不做任何形式的限定。

实施例1苦参碱型生物碱的制备

(1)将干燥的苦豆子种子(约30kg)，粉碎后使用95％乙醇浸泡提取三遍，减压浓缩提取液，得总浸膏约1.9kg；再将总浸膏分散在水中，使用2％的盐酸酸化至pH为5，加入氯仿萃取，除去酸化部分的有机层；剩余的水相部分使用饱和的氨水重新调至弱碱性(PH为8.5)，加入氯仿重新萃取，即得苦豆子总碱部位(897g)；

(2)将苦豆子总碱部位上D101大孔树脂柱，依次使用纯水，乙醇-水(40:60,65:35,95:5,v:v)进行梯度洗脱，基于各个梯度比例分别得到四个馏分，命名大孔树脂柱馏分一至馏分四；

(3)将大孔树脂柱馏分二进一步上硅胶柱层析，依次用石油醚-乙酸乙酯体系(95:5,85:15,75:25,50:50,v:v)进行梯度洗脱，基于各个梯度比例分别得到四个馏分，命名硅胶柱馏分一至馏分四；

(4)将硅胶柱馏分二进一步上ODS反向柱层析，依次用甲醇-水体系(10:90,20:80,30:70,50:50,v:v)进行梯度洗脱，基于各个梯度比例分别得到四个馏分，命名ODS柱馏分一至馏分四；

(5)将ODS柱馏分四采用制备型高效液相色谱(采用C18反相柱)进行分离得式I和式II所示结构的苦参碱型生物碱；其中，制备型高效液相色谱的条件为：以体积比为50:50的甲醇-水为流动相，检测波长254nm，流速为6mL/min进行洗脱，收集保留时间60.3min、70.1min的色谱峰，分离得到式I和式II所示结构的苦参碱型生物碱；式I所示结构的苦参碱型生物碱命名为：sophaloseedline I；式II所示结构的苦参碱型生物碱命名为：sophaloseedline J；

将ODS柱馏分三采用制备型高效液相色谱(采用C18反相柱)进行分离得式III所示结构的苦参碱型生物碱；其中，制备型高效液相色谱的条件为：以体积比为30:70的乙腈-水为流动相，检测波长254nm，流速为6mL/min进行洗脱，收集保留时间75.6min的色谱峰，分离得到式III所示结构的苦参碱型生物碱；式III所示结构的苦参碱型生物碱命名为：sophaloseedline K。

sophaloseedline I、J、K的结构鉴定：

化合物sophaloseedline I-K均为晶体状形态，各化合物的实测比旋光值均接近于零，说明均为外消旋体。其UV谱显示这类结构的最大吸收位于300和355nm处，提示它们均具有共轭体系；其高分辨质谱(HR-ESI-MS)给出它们的分子式分别为C₁₅H₂₂N₂O₃(sophaloseedline I)、C₁₅H₂₂N₂O₃(sophaloseedline J)、C₁₅H₂₀N₂O₃(sophaloseedline K)，不饱和度为6或7。

化合物sophaloseedline I-K的¹H NMR谱和¹³C NMR谱均可观察到苦参碱型生物碱C-2位或C-10位的特征性信号，为连在氮原子上的亚甲基的信号，其化学位移分别在δ_C52.1/52.4,δ_H a,b 3.45(m)/a,b 3.45(m)；δ_C 52.2/52.9,δ_H a 3.57(m),b 3.49(m)/a3.57(m),b 3.49(m)；δ_C 50.5/51.3,δ_H a,b 3.45(m)/a,b 3.45(m)。推测化合物sophaloseedline I-K分别为苦参碱类化合物flavesine I/flavesine H/flavesine G的单羟基衍生物[Journal of Natural Products,2018,81(10):2259-2265]，其C环为芳香性的吡啶环或具有含亚胺的共轭体系，D环的C-15-N-16的酰胺键打开后成侧链形式。

通过二维谱图解析可以确定化合物sophaloseedline I-K的平面结构。

化合物sophaloseedline I中能观察到H₂-17→C-4/C-5/C-6/C-11和H₂-4→C-2/C-5/C-17的HMBC相关，以及在¹H-¹H COSY谱中的连续自旋偶合体系，但没有与flavesine I一样的/>的相关，说明sophaloseedline I的羟基连在季碳C-5上。

化合物sophaloseedline J中H-11→C-6/C-7/C-8/C-12/C-13/C-17的远程相关，以及¹H-¹H COSY谱中的自旋相关，可以推出sophaloseedlineJ为flavesine H的C-7位羟基取代衍生物。

化合物sophaloseedline K的¹H-¹H COSY谱中均有三个独立的自旋偶合体系，分别为此外HMBC谱中H-13/H-14→C-12相关峰可以验证化合物sophaloseedline K的取代位点分别在C-12。

最后，通过X-Ray单晶衍射数据分析(结构数据见附图1～3)，鉴定了sophaloseedline I-K的构型如式I、式II和式III所示结构的苦参碱型生物碱，式I、式II和式III所示结构的苦参碱型生物碱的外消旋体中三对光学对映体的苦参碱型生物碱的绝对构型依次为5R和5S、7S,11R和7R,11S、12R和12S。

表1.化合物sophaloseedline I-K的氢谱和碳谱归属(CD₃OD,δin ppm,J in Hz)^a

^a注解：重叠峰未进行多重峰分析归属

化合物sophaloseedline I-K的理化性质数据如下：

sophaloseedline I：无色块状晶体；熔点mp 135～136℃；比旋光值紫外UV(CH₃OH)λ_max:202和359nm；¹H NMR(600MHz,CD₃OD)和¹³C NMR(150MHz,CD₃OD),见表1；高分辨质谱HR-ESI-MS m/z:279.1694[M+H]⁺(计算值C₁₅H₂₃N₂O₃,279.1703)。

sophaloseedline J：无色块状晶体；熔点138～139℃；比旋光值紫外UV(CH₃OH)λ_max:20和355nm；¹H NMR(600MHz,CD₃OD)和¹³C NMR(150MHz,CD₃OD),见表1；高分辨质谱HR-ESI-MS m/z:279.1694[M+H]⁺(计算值C₁₅H₂₃N₂O₃,279.1703)。

sophaloseedline K：无色块状晶体；熔点133～134℃；比旋光值紫外UV(CH₃OH)λ_max:205，228,和296nm；¹H NMR(600MHz,CD₃OD)和¹³C NMR(150MHz,CD₃OD),见表1；高分辨质谱HR-ESI-MS m/z:277.1520[M+H]⁺(计算值C₁₅H₂₁N₂O₃,277.1547)。

实验例

药理实验方法，MTT法

(1)主要试剂的配制

磷酸盐缓冲液(PBS)：取KH2PO4 0.2g，NaHPO4 2.8g，NaCl 8.0g，KCl 0.2g于烧杯中，混合均匀调节pH至7.2，于1000mL容量瓶中定容，高压灭菌，置于4℃冰箱中保存；MTT：取50mg MTT粉末溶于10mL PBS中，待完全溶解后过滤膜除菌，避光于4℃冰箱保存；DMEM培养液：将DMEM粉末用去离子水溶解，加入一定量NaHCO3，加酸调节pH至7.2，过滤膜除菌后于4℃冰箱避光保存；细胞生长液：取适量DMEM培养液，加入1％的双抗和10％胎牛血清，混匀后放置于4℃冰箱保存；细胞维持液：取适量DMEM培养液，加入1％的双抗和2％胎牛血清，混匀后放置于4℃冰箱保存；0.25％胰蛋白酶：取胰蛋白酶2.5g，溶解于1000ml D-Hanks中，加酸将pH值调节至7.6到7.8范围内，过0.22μm滤膜除菌，置于-20℃下保存。

(2)样品的配制

精确称取按实施例1方法制备得到的sophaloseedline I、sophaloseedline J、sophaloseedline K用DMSO配制成50mM的溶液。最终稀释至100,50,25,12.5,6.25,3.125μΜ。

(3)细胞的培养与增殖

使用DMEM细胞培养液，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养，所有后续实验均在细胞对数生长期进行。

(4)化合物抑制两种非小细胞肺癌细胞(A549和H1299)增殖活性试验

a.将对数生长期的A549和H1299细胞分别接种于各自的96孔板中，细胞密度为4×10⁵/mL，100μL/孔，置于细胞培养箱中培养；

b.培养过夜后，移除培养液，将6个不同浓度的样品溶液分别加入100μL到各个培养板的孔中，每个浓度设3个复孔，同时设置细胞对照组，继续培养；

c.48h后吸走培养液，每孔加入30μL MTT(5mg/mL)，培养箱中避光培养5h。吸走MTT，加入200μL DMSO溶解反应产物，震荡后通过酶标仪570nm波长处测吸光度OD值，计算细胞生长抑制率。药理实验结果见表2。

表2.化合物抑制两种非小细胞肺癌细胞(A549和H1299)增殖的半数抑制浓度

^a重复实验3次，IC₅₀值为(平均值±标准偏差)；^b阳性对照

从表1实验数据可以看出sophaloseedline I、sophaloseedline J、sophaloseedline K均具有优异的抗非小细胞肺癌作用；尤其是sophaloseedline I，其抗非小细胞肺癌作用十分显著，远远高于sophaloseedline J以及sophaloseedline K；同时也远远高于阳性对照药顺铂。

上述实验结果也说明，在本发明以15,17-裂环苦参碱结构骨架为母核结构的苦参碱型生物碱化合物中，其中的羟基的位置，对于苦参碱型生物碱化合物的抗非小细胞肺癌作用的大小差别是巨大的；其中，第5位发生羟基化后得到的式I所示结构的苦参碱型生物碱，其具有十分优异的抗非小细胞肺癌作用，其抗非小细胞肺癌作用要远远高于其它位置发生羟基化后得到的苦参碱型生物碱。

Claims

1.一种苦参碱型生物碱，其特征在于，具有式I、式II或式III所示的结构：

式I；

式II；

式III。

2.一种组合物，其特征在于，包含式I、式II或式III所示结构的任意一种或两种以上的苦参碱型生物碱。

3.权利要求1所述的一种苦参碱型生物碱或权利要求2所述的组合物在制备具有抗肺癌作用的药物中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的肺癌为非小细胞肺癌。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，还包含药学上可接受的辅料。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的药物制成散剂、丸剂、片剂、胶囊剂、口服液、气雾剂或注射剂。