CN113321618B - 马齿苋中三种生物碱类化合物及其提取分离方法 - Google Patents

马齿苋中三种生物碱类化合物及其提取分离方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及中药提取、分离领域，尤其涉及从马齿苋中提取、分离和鉴别出的三种生物碱类化合物及其提取分离方法。所述的三种生物碱类化合物，分子式分别为C16H15NO5，C13H11NO3，C14H13NO3，分别命名为4,9,10‑trihydroxy‑2‑methoxy‑6,7‑dihydrodibenzo[b,e]azocin‑12(5H)‑one，9,10‑dihydroxy‑5,6‑dihydro‑11H‑benzo[d]pyrrolo[1,2‑a]azepin‑11‑one，8,9‑dihydroxy‑6,11‑dihydro‑5H‑benzo[d]pyrrolo[1,2‑a]azepine‑3‑carbaldehyde。还提供上述生物碱类化合物的提取分离方法，依次采用乙醇回流提取、硅胶柱层析、ODS中压柱及羟丙基葡聚糖柱层析纯化以及HPLC分离制备。其结构采用1H‑NMR、13C‑NMR及UHPLC‑ESI‑TOF‑MS的方法确定为三种新生物碱类化合物。该三种化合物具有潜在的抗炎和抗胆碱酯酶等活性，并提供制备方法，为开发新药和开发新成分提供先导物和理论依据。

Description

马齿苋中三种生物碱类化合物及其提取分离方法
技术领域
本发明涉及中药提取、分离领域，尤其涉及从马齿苋药材中提取、分离和鉴别出的三种生物碱类化合物及其提取分离方法。
背景技术
马齿苋（Portulaca oleracea L.），又名长命菜、马苋菜，为马齿苋科植物。马齿苋性喜肥沃土壤，耐旱亦耐涝，生命力强，分布广泛，资源丰富，而以我国东北部的更为常见。马齿苋既可入药，又可食用，是我国卫生部划定的药食同源的野生植物之一。2020版《中华人民共和国药典》中收载马齿苋的干燥地上部分入药，具有清热解毒、凉血止血、止痢等功效，用于热毒血痢、痈肿疔疮、湿疹、丹毒、蛇虫咬伤、便血、痔血和崩漏下血等。
现代药理学研究表明，马齿苋具有降血脂、降血糖、抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗动脉粥样硬化、松弛或兴奋平滑肌及增强免疫力等功效。研究表明马齿苋中所含多种化学成分与其多样的药理作用息息相关，其主要化学成分包括：黄酮类、生物碱类、萜类、香豆素类、有机酸类、挥发油、多糖、氨基酸、各种色素类和矿物质类等。其中生物碱是马齿苋中的一大类活性成分，而酰胺类生物碱又占绝大多数。目前已报道的生物碱类成分有去甲肾上腺素、多巴胺、少量多巴、腺苷、尿嘧啶、腺嘌呤、N，N-二环己基脲、尿囊素、N-反式-阿魏酰基酪胺；还有环二肽生物碱和酰胺类生物碱：马齿苋酰胺A-I、K、L、N-S。
目前从马齿苋中分离出的化学成分大多数是已知的，且结构新颖性较低，因此，对马齿苋中化合物的开发和分离是亟待需要的。
发明内容
针对上述问题，本发明提供从马齿苋中提取的三种生物碱类化合物，经研究发现本发明的三种生物碱类化合物具有抗炎、抗胆碱酯酶的作用，同时提供一种针对本发明三种生物碱类化合物的简便、快速、环保、纯度高的提取分离方法。
为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案。
本发明提供了一种从马齿苋药材中分离出的生物碱类化合物，其特征在于，所述生物碱类化合物包括如下三种：
分子式分别为：C16H15NO5（1），C13H11NO3（2），C14H13NO3（3），并且根据结构命名为4,9,10-trihydroxy-2-methoxy-6,7-dihydrodibenzo[b,e]azocin-12(5H)-one（1），9,10-dihydroxy-5,6-dihydro-11H-benzo[d]pyrrolo[1,2-a]azepin-11-one（2），8,9-dihydroxy-6,11-dihydro-5H-benzo[d]pyrrolo[1,2-a]azepine-3-carbaldehyde（3），其化学结构式如下：
Figure 966122DEST_PATH_IMAGE001
。
本发明还提供了一种从马齿苋药材中分离出三种生物碱类化合物的提取分离方法，其特征在于，所述提取分离方法的具体步骤包括：
步骤1、取马齿苋干燥药材，采用醇煎煮提取，醇提液滤过，合并滤液回流浓缩，放凉至室温，得药液备用；
步骤2、将步骤1中药液蒸干后上硅胶柱，用乙酸乙酯洗脱，减压回收乙酸乙酯至浸膏，得到乙酸乙酯提取物；
步骤3、将步骤2中乙酸乙酯提取物经聚酰胺柱分离，采用乙醇洗脱，乙醇部分蒸干，备用；
步骤4、将步骤3中所得物经预处理的ODS柱层析分离，用甲醇-水梯度洗脱，得到若干洗脱部位，经薄层色谱进行检测，显色，将显色部位减压浓缩至干，得到浓缩物备用；
步骤5、将步骤4中所得浓缩物经预处理的羟丙基葡聚糖凝胶层析分离，以甲醇等度洗脱，得到若干部位，经薄层色谱进行检测，显色，合并显色的洗脱部位，将合并的洗脱部位经减压浓缩至干，得浓缩物备用；
步骤6、将步骤5中所得浓缩物通过HPLC分离制备，以乙腈-0.1%甲酸水作为流动相使用不同浓度进行等度洗脱，最终得到本发明所述的三种生物碱类化合物。
进一步地，所述步骤1中醇溶剂为50％乙醇，提取次数为两次，每次提取回流2小时，乙醇的用量为药材的8～16倍。
进一步地，所述步骤2中所用流动相洗脱程序为等度洗脱。
进一步地，所述步骤3中水和乙醇的体积比为5∶95等度洗脱。
进一步地，所述步骤4中甲醇和水的体积比为50∶50、65∶35、80∶20、90∶10、100∶0梯度洗脱。
进一步地，所述步骤4中所述ODS和步骤5中羟丙基葡聚糖凝胶的预处理过程为甲醇浸泡过24小时，上柱，以初始流动相平衡。
进一步地，所述步骤5中甲醇洗脱程序为等度洗脱。
进一步地，所述步骤6中乙腈-0.1%甲酸水的体积比为45∶55，得到本发明所述的生物碱类化合物4,9,10-trihydroxy-2-methoxy-6,7-dihydrodibenzo[b,e]azocin-12(5H)-one；乙腈-0.1%甲酸水的体积比为35∶65，得到本发明所述的生物碱类化合物9,10-dihydroxy-5,6-dihydro-11H-benzo[d]pyrrolo[1,2-a]azepin-11-one；乙腈-0.1%甲酸水的体积比为25∶75，得到本发明所述的生物碱类化合物8,9-dihydroxy-6,11-dihydro-5H-benzo[d]pyrrolo[1,2-a]azepine-3-carbaldehyde。
本发明还提供了一种如权利要求1所述的任意一种从马齿苋药材中分离出的生物碱类化合物的用途，其特征在于，所述用途可用于制备抗炎和抗胆碱酯酶的药物。
与现有技术相比本发明的有益效果。
本发明中所述马齿苋中三种生物碱类化合物的分离和药理活性研究中未发现论文期刊有所报道；本发明提供来源于马齿苋的三种生物碱类化合物及一种针对本发明化合物的提取分离方法，依次采用醇提取、硅胶柱层析、聚酰胺柱分离、ODS中压柱、羟丙基葡聚糖凝胶及HPLC进行分离纯化与制备，成功提取分离出三种的生物碱类化合物，该方法操作步骤仅为六步，操作方法简便及快速，提取分离过程主要采用醇提取，工艺方法环保，且经该方法分离得到的化合物纯度均大于98%，此外经研究表明以上化合物具有抗炎和抗胆碱酯酶作用，因此本发明三种生物碱化合物及其盐和衍生物可以作为其他化合物合成先导物，以及新药开发和药理活性研究的原料，亦可用于制备抗炎和胆碱酯酶的药物。
附图说明
图1为本发明生物碱类化合物4,9,10-trihydroxy-2-methoxy-6,7-dihydrodibenzo[b,e]azocin-12(5H)-one的1H-NMR光谱图。
图2为本发明生物碱类化合物4,9,10-trihydroxy-2-methoxy-6,7-dihydrodibenzo[b,e]azocin-12(5H)-one的13C-NMR光谱图。
图3为本发明生物碱类化合物4,9,10-trihydroxy-2-methoxy-6,7-dihydrodibenzo[b,e]azocin-12(5H)-one的DEPT光谱图。
图4为本发明生物碱类化合物4,9,10-trihydroxy-2-methoxy-6,7-dihydrodibenzo[b,e]azocin-12(5H)-one的核磁共振HMBC光谱图。
图5为本发明生物碱类化合物4,9,10-trihydroxy-2-methoxy-6,7-dihydrodibenzo[b,e]azocin-12(5H)-one的核磁共振1H-1HCOSY光谱图。
图6为本发明生物碱类化合物4,9,10-trihydroxy-2-methoxy-6,7-dihydrodibenzo[b,e]azocin-12(5H)-one的核磁共振HSQC光谱图。
图7为本发明生物碱类化合物4,9,10-trihydroxy-2-methoxy-6,7-dihydrodibenzo[b,e]azocin-12(5H)-one的核磁共振ROESY光谱图。
图8为本发明生物碱类化合物4,9,10-trihydroxy-2-methoxy-6,7-dihydrodibenzo[b,e]azocin-12(5H)-one的高分辨质谱图。
图9为本发明生物碱类化合物4,9,10-trihydroxy-2-methoxy-6,7-dihydrodibenzo[b,e]azocin-12(5H)-one的紫外光谱图。
图10为本发明生物碱类化合物4,9,10-trihydroxy-2-methoxy-6,7-dihydrodibenzo[b,e]azocin-12(5H)-one的红外光谱图。
图11为本发明生物碱类化合物9,10-dihydroxy-5,6-dihydro-11H-benzo[d]pyrrolo[1,2-a]azepin-11-one的1H-NMR光谱图。
图12为本发明生物碱类化合物9,10-dihydroxy-5,6-dihydro-11H-benzo[d]pyrrolo[1,2-a]azepin-11-one的13C-NMR光谱图。
图13为本发明生物碱类化合物9,10-dihydroxy-5,6-dihydro-11H-benzo[d]pyrrolo[1,2-a]azepin-11-one的DEPT光谱图。
图14为本发明生物碱类化合物9,10-dihydroxy-5,6-dihydro-11H-benzo[d]pyrrolo[1,2-a]azepin-11-one的核磁共振HMBC光谱图。
图15为本发明生物碱类化合物9,10-dihydroxy-5,6-dihydro-11H-benzo[d]pyrrolo[1,2-a]azepin-11-one的核磁共振1H-1HCOSY光谱图。
图16为本发明生物碱类化合物9,10-dihydroxy-5,6-dihydro-11H-benzo[d]pyrrolo[1,2-a]azepin-11-one的核磁共振HSQC光谱图。
图17为本发明生物碱类化合物9,10-dihydroxy-5,6-dihydro-11H-benzo[d]pyrrolo[1,2-a]azepin-11-one的核磁共振ROESY光谱图。
图18为本发明生物碱类化合物9,10-dihydroxy-5,6-dihydro-11H-benzo[d]pyrrolo[1,2-a]azepin-11-one的高分辨质谱图。
图19为本发明生物碱类化合物9,10-dihydroxy-5,6-dihydro-11H-benzo[d]pyrrolo[1,2-a]azepin-11-one的紫外光谱图。
图20为本发明生物碱类化合物9,10-dihydroxy-5,6-dihydro-11H-benzo[d]pyrrolo[1,2-a]azepin-11-one的红外光谱图。
图21为本发明生物碱类化合物8,9-dihydroxy-6,11-dihydro-5H-benzo[d]pyrrolo[1,2-a]azepine-3-carbaldehyde的1H-NMR光谱图。
图22为本发明生物碱类化合物8,9-dihydroxy-6,11-dihydro-5H-benzo[d]pyrrolo[1,2-a]azepine-3-carbaldehyde的13C-NMR光谱图。
图23为本发明生物碱类化合物8,9-dihydroxy-6,11-dihydro-5H-benzo[d]pyrrolo[1,2-a]azepine-3-carbaldehyde的DEPT光谱图。
图24为本发明生物碱类化合物8,9-dihydroxy-6,11-dihydro-5H-benzo[d]pyrrolo[1,2-a]azepine-3-carbaldehyde的核磁共振HMBC光谱图。
图25为本发明生物碱类化合物8,9-dihydroxy-6,11-dihydro-5H-benzo[d]pyrrolo[1,2-a]azepine-3-carbaldehyde的核磁共振1H-1HCOSY光谱图。
图26为本发明生物碱类化合物8,9-dihydroxy-6,11-dihydro-5H-benzo[d]pyrrolo[1,2-a]azepine-3-carbaldehyde的核磁共振HSQC光谱图。
图27为本发明生物碱类化合物8,9-dihydroxy-6,11-dihydro-5H-benzo[d]pyrrolo[1,2-a]azepine-3-carbaldehyde的核磁共振ROESY光谱图。
图28为本发明生物碱类化合物8,9-dihydroxy-6,11-dihydro-5H-benzo[d]pyrrolo[1,2-a]azepine-3-carbaldehyde的高分辨质谱图。
图29为本发明生物碱类化合物8,9-dihydroxy-6,11-dihydro-5H-benzo[d]pyrrolo[1,2-a]azepine-3-carbaldehyde的紫外光谱图。
图30为本发明生物碱类化合物8,9-dihydroxy-6,11-dihydro-5H-benzo[d]pyrrolo[1,2-a]azepine-3-carbaldehyde的红外光谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做详细的说明。
实施例1。
本发明提供三种生物碱类化合物，分子式为C16H15NO5（1），C13H11NO3（2），C14H13NO3（3），并且根据其结构命名为4,9,10-trihydroxy-2-methoxy-6,7-dihydrodibenzo[b,e]azocin-12(5H)-one（1），9,10-dihydroxy-5,6-dihydro-11H-benzo[d]pyrrolo[1,2-a]azepin-11-one（2），8,9-dihydroxy-6,11-dihydro-5H-benzo[d]pyrrolo[1,2-a]azepine-3-carbaldehyde（3），化学结构式为：
Figure 680000DEST_PATH_IMAGE001
。
所述三种生物碱类化合物的核磁数据如表1：1H-NMR与13C-NMR在MeOD中。
表1：本发明三种生物碱化合物的核磁数据
Figure 990896DEST_PATH_IMAGE002
。
本发明生物碱类化合物1根据结构命名为4,9,10-trihydroxy-2-methoxy-6,7-dihydrodibenzo[b,e]azocin-12(5H)-one的结构鉴定与推导，表1为该生物碱类化合物的核磁数据。
4,9,10-trihydroxy-2-methoxy-6,7-dihydrodibenzo[b,e]azocin-12(5H)-one：化合物1为黄褐色粉末，易溶于甲醇，紫外下最大吸收为348nm，313nm，243nm，在IR光谱中观察到NH基团（3340cm-1和1567cm-1）和羰基基团（1706cm-1）的吸收。UHPLC-ESI-Q-TOF-MS给出m/z:300.0878 [M-H]-（C16H14NO5 -计算值为300.0872）的准分子离子峰。结合1H-NMR，13C-NMR以及DEPT数据，推测该化合物可能的分子式为C16H15NO5，不饱和度为10。13C-NMR谱和DEPT谱显示了16个C原子的信号，包括一个甲氧基，一个羰基碳，两个CH2基团，四个芳香族次甲基，四个与O相连的碳原子和其他四个季碳原子。在化合物1的1H-NMR光谱中，δH7.54（H-11，1H，s）和δH6.67（H-8，1H，s）处的信号表明存在1,2,4,5-取代的苯环。在δH7.14（H-1，1H，d，J=4.26Hz）和δH6.93（H-2，1H，d，J=4.26Hz）的信号表明存在1,3,5,6-取代的苯环。除不饱和氢原子外，在δH3.83（3H，s）处的化学位移是典型的甲氧基信号。并且在δH4.87（H-6，2H）和δH3.17（H-7，2H，dd，J＝4.44Hz，6.00Hz）处观察到与N原子连接的部分的信号。从HBMC光谱可以推断出H-6与水峰信号重合。表1列出了1H-NMR（600MHz，MeOD）和13C-NMR（150MHz，MeOD）的数据。HMBC中H-8与C-9（δC145.90），C-10（δC152.45），C-11a（δC129.16）及H-11与C-7a（δC136.43），C-9，C-10，C-11a的相关性证明两个羟基位于苯环的C-9和C-10处。此外，HMBC中H-8与C-7（δC36.12）的相关性和H-11与C-12（δC182.94）的相关性可以将CH2基团连接在C-7a，并将羰基连接在C-11a处。基于位置6的氢和碳的化学位移（δH4.87/δC48.61）以及HMBC谱中H-6与C-4a（δC140.54），C-7，C-7a，C-11a和C-12a（δC127.50）的相关性建立N-CH2CH2键。在分子的另一侧，HBMC谱图中H-1与C-3（δC118.11），C-4a，C-12a和H-3与C-1，C-4a，C-12a的相关性证明一个连有甲氧基和羟基的苯环。ROESY图谱中甲氧基与H-1，H-3的相关性表明甲氧基位于2位（δC146.98），羟基位于4位（δC163.05）。由于在HMBC光谱中，H-6与C-4a，C-7，C-7a，C-12a的相关，可以建立一个由苯环上的C-4a，7a，11a和12a，羰基碳原子，CH2CH2片段和NH组成的八元环。其他相关图谱COSY和ROESY进一步佐证了此结构。
根据以上信息，可确定此生物碱类化合物为上述结构。
本发明生物碱类化合物2根据结构命名为9,10-dihydroxy-5,6-dihydro-11H-benzo[d]pyrrolo[1,2-a]azepin-11-one的结构鉴定与推导，表1为该生物碱类化合物的核磁数据。
9,10-dihydroxy-5,6-dihydro-11H-benzo[d]pyrrolo[1,2-a]azepin-11-one：化合物2为黄色粉末，易溶于甲醇，紫外下最大吸收为346nm和280nm，在IR光谱中观察到羰基基团（1610cm-1）和羟基基团（3438cm-1）的吸收。UHPLC-ESI-TOF-MS给出m/z:230.0812[M+H]+（C13H12NO3 +，计算值为230.0812）的准分子离子峰。结合1H-NMR，13C-NMR以及DEPT数据，推测该化合物可能的分子式为C13H11NO3，不饱和度为9。13C-NMR谱和DEPT谱显示13个碳信号，分别为一个羰基碳，两个CH2，两个芳香次甲基，三个烯烃次甲基，两个连氧碳原子和三个季碳。在氢谱中在δH7.42（H-7，d，J=8.0Hz）和δH7.73（H-8，d，J=8.0Hz）的信号证明了1,2,3,4-取代苯环的存在，另外三个氢信号δH8.03（H-1，m），δH7.06（H-2，dd，J=4.0Hz，2.4Hz）和δH8.13（H-3，m）为顺式耦合烯烃氢原子。除了不饱和氢原子外，在δH5.12（H-5，m）和δH3.95（H-6，m）处观察到与N原子相连的部分的信号。表2列出了1H-NMR（600MHz，MeOD）和13C-NMR（150MHz，MeOD）的数据。HMBC中H-7与C-8（δC129.57），C-9（δC155.16），C-10a（δC128.14）和H-8与C-6a（δC141.1），C-9，C-10（δC163.22）的相关性表明两个羟基位于苯环的C-9和C-10。此外，HMBC中H-7与C-6（δC45.04）的相关性和H-7与C-11（δC194.16）的相关性可以将CH2基团连接至C-6a，并将羰基连接至C-10a。此外，可以基于位置5的质子和碳化学位移（δH5.12/δC59.17）以及H-5与C-3（δC140.96），C-6，C-6a和C-11a建立N-CH2CH2键。根据HMBC光谱，H-1与C-2（δC119.72），C-3，C-11，C-11a（δC141.90）之间的相关性，H-2与C-1（δC132.38），C-3，C-11a和H-3与C-1，C-2，C-5，C-11表明三个烯烃次甲基依次连接形成具有N原子和季碳的吡咯环。因此，建立了一个七元环，该环包含苯环的C-6a和C-10a，羰基碳原子，吡咯环的C-11a和N以及CH2CH2片段。其他相关图谱COSY和ROESY进一步佐证了此结构。
本发明生物碱类化合物3根据结构命名为8,9-dihydroxy-6,11-dihydro-5H-benzo[d]pyrrolo[1,2-a]azepine-3-carbaldehyde的结构鉴定与推导，表1为该生物碱类化合物的核磁数据。
8,9-dihydroxy-6,11-dihydro-5H-benzo[d]pyrrolo[1,2-a]azepine-3-carbaldehyde：化合物3为红棕色粉末，易溶于甲醇，紫外下最大吸收为452nm和297nm，在IR光谱中观察到醛基基团（2921cm-1，2850cm-1）和羟基基团（3349cm-1）的吸收。UHPLC-ESI-TOF-MS给出m/z:244.0969 [M+H]+（C14H14NO3 +，计算值为244.0969）的准分子离子峰，分子量为243.0895。结合合1H-NMR，13C-NMR以及DEPT数据，推测该化合物可能的分子式为C14H13NO3，不饱和度为9。根据13C-NMR谱和DEPT谱显示了14个C原子的信号，包括一个醛基碳，三个脂族亚甲基，两个芳香次甲基，两个烯基次甲基，两个连O原子的C原子以及其他四个季碳。在1H-NMR光谱中，δH6.62（H-7，1H，s）和δH6.63（H-10，1H，s）处的信号表明存在邻位取代的苯环。在δH6.08（H-1，d，J=4.02Hz）和δH6.90（H-2，d，J=4.02Hz）处的氢原子为顺式耦合烯烃H原子。除了不饱和氢原子外，在δH3.99（H-11，s，）处观察到CH2的信号，在δH4.63（H-5，m）和δH3.10（H-6，m）处观察到与N原子相连的部分的信号。表3列出了1H-NMR（600MHz，MeOD）和13C-NMR（150MHz，MeOD）的数据。HMBC中H-7与C-9（δC145.43），C-10a（δC128.98）和H-10与C-6a（δC130.47）和C-8（δC144.97）的相关性表明两个羟基位于苯环的C-8和C-9位。此外，HMBC相关性H-7与C-6（δC33.60）和H-10与C-11（δC32.60）相互关联，从而可以将CH2CH2基团与C-6a相连，并将另一个CH2基团与C-10a关联。此外，可以基于位置5的氢和碳的化学位移（δH4.63/δC48.43）以及H-5与6a和11a的HMBC相关建立N-CH2CH2键。根据HMBC光谱，H-1与C-3（δC133.64）和C-11a（δC145.15）之间的相关性，H-2与C-3和C-11a；醛氢与C-3的相关性表明，两个烯基次甲基与一个N原子和两个季碳相连，形成一个在3位（δC133.64）带有醛基的吡咯环。因此，建立了一个包含苯环上的C-6a和C-10a、3个CH2基团、吡咯环上的C-11a、N原子以及CH2CH2部分的七元环。其他相关图谱COSY和ROESY进一步佐证了此结构。
根据以上信息，可确定此生物碱类化合物为上述结构。
本发明还提供上述三种生物碱类化合物的提取分离方法，具体步骤为：
步骤1：步骤1、称取马齿苋干燥药材250kg，采用50％乙醇回流提取，用量为药材的8～16倍，回流提取两次，每次2h，减压回收乙醇，放凉至室温，得药液备用；
步骤2：将步骤1中所得药液蒸干后经硅胶柱层析分离，用乙酸乙酯（115L）等度洗脱，其中硅胶为100～200目，40℃以下减压回收乙酸乙酯至浸膏，得到乙酸乙酯提取物；
步骤3：将步骤2中乙酸乙酯提取物经聚酰胺柱分离，采用乙醇梯度洗脱，乙醇蒸干，备用；
步骤4：将步骤3中所得物再经预处理的ODS中压柱层析分离，其中填料粒度为20～40μm，用甲醇-水（50∶50，65∶35，80∶20，90∶10，100∶0，v/v）梯度洗脱（加压，使流速为1mL/min，温度为室温），得到25个部位（即梯度洗脱得25个瓶，每瓶100mL），经薄层色谱进行检测，显色，将显色的20～25部位保留，50℃以下减压浓缩至干，备用；
步骤5：将步骤4中所得物再经预处理的羟丙基葡聚糖凝胶柱层析分离，用甲醇洗脱，得到20洗脱部位（即共得到20个瓶，每瓶50mL），经薄层色谱进行检测，显色，将显色的8～11部位保留，50℃以下减压浓缩至干，得浸膏，备用。所述ODS与羟丙基葡聚糖凝胶的预处理过程为甲醇浸泡过24h，上柱，用甲醇洗至滴入水中无混浊，再以初始流动相平衡；
步骤6：将步骤5中所得浸膏经HPLC分离制备，以乙腈∶0.1%甲酸作为流动相分别用体积比为45∶55、35∶65、25∶75等度洗脱，检测波长为210nm和280nm，分离制备得到本发明的三种生物碱类化合物，归一法测定纯度均为≥98%。
实施例2本发明三种生物碱类化合物的抗炎作用。
1、主要材料。
1.1、药品和试剂：实验所用化合物由上述方法制备，纯度为≥98%，精密称取，用DMSO稀释至下述各剂量组所需溶液。胎牛血清（美国Hyclone公司）；青霉素、链霉素（杭州四季青公司）；DMSO（美国Sigma公司）；CCK-8试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）；DMEM高糖培养基、LPS、IL-1β、TNF-α的ELISA试剂盒（索莱宝科技有限公司）；细胞裂解液。
1.2 细胞株：RAW264.7巨噬细胞（美国ATCC细胞库）。
1.3 分组：对照组、LPS组和实验组，各一组。
2 实验方法。
2.1 细胞培养，DMEM高糖培养基，加入10%的胎牛血清，l%抗菌素(100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素)，置于37℃，5%CO2培养箱中培养。
2.2 cck-8法测定细胞活力，上述三组分别取对数生长期RAW264.7巨噬细胞接种于96孔培养板中，细胞密度为1×104个/mL，每孔100μL，温度37℃，5%CO2条件下培养过夜后，实验组加入不同浓度的本发明的三种化合物4,9,10-trihydroxy-2-methoxy-6,7-dihydrodibenzo[b,e]azocin-12(5H)-one（1）（1～20μM），9,10-dihydroxy-5,6-dihydro-11H-benzo[d]pyrrolo[1,2-a]azepin-11-one（2）（1～20μM），8,9-dihydroxy-6,11-dihydro-5H-benzo[d]pyrrolo[1,2-a]azepine-3-carbaldehyde（3）（1～20μM），孵育1h后向LPS组和实验组分别加入终浓度为1μg/mL的LPS，另设调零组（含DMSO溶媒的培养液），每组设3个复孔，考察加入药物后对细胞的影响。上述各组细胞培养24h后，在各孔细胞中加入cck-8溶液10μL，温度37℃，5%CO2条件下继续孵育4h后，酶标仪450nm波长处测定各孔吸光值。
2.3 ELISA法测定炎症因子IL-1β、TNF-α：将对数生长期RAW264.7巨噬细胞接种于24孔培养板中，细胞密度为1×105个/mL，每孔500μL，温度37℃，5%CO2条件下培养过夜，实验组加入本发明的三种化合物4,9,10-trihydroxy-2-methoxy-6,7-dihydrodibenzo[b,e]azocin-12(5H)-one（1）（1～20μM），9,10-dihydroxy-5,6-dihydro-11H-benzo[d]pyrrolo[1,2-a]azepin-11-one（2）（1～20μM），8,9-dihydroxy-6,11-dihydro-5H-benzo[d]pyrrolo[1,2-a]azepine-3-carbaldehyde（3）（1～20μM），培育1h后，在每孔加入LPS（终浓度为1μg/mL），共孵育24h，每组处理重复3孔。ELISA法测定马齿苋来源化合物处理后的RAW264.7巨噬细胞分泌的IL-1β、TNF-α的含量。
3实验结果。
实验结果表明本发明三种生物碱化合物在20μM以下对LPS诱导的巨噬细胞RAW264.7的增殖无影响，安全无毒；并可有效抑制LPS诱导的巨噬细胞RAW264.7所产生过量炎症细胞因子IL-1β、TNF-α，且呈浓度依赖。
细胞相对存活率实验结果如表2所示。
表2：本发明对RAW264.7巨噬细胞相对存活率的影响
Figure 418728DEST_PATH_IMAGE003
注：* P<0.05与LPS组比较（高浓度组有显著性差异）
ELISA法测定炎症因子IL-1β、TNF-α结果如表3所示。
表3：本发明对LPS诱导的RAW264.7细胞分泌的IL-1β、TNF-α含量的影响（均数±标准差，n=3）
Figure 764259DEST_PATH_IMAGE004
注：* P<0.05与对照组比较，# P<0.05与LPS组比较。
实施例3本发明的三种化合物的抗胆碱酯酶作用。
1、主要材料。
药品和试剂：实验所用生物碱化合物由上述方法制备，纯度为≥98%，磷酸二氢钠、磷酸氢二钠（国药集团化学试剂有限公司），毒扁豆碱（瀚香生物科技），磷5，5’-二硫代双（2－硝基苯甲酸）（Dithiobisnitrobenzoic acid，DTNB，上海金穗生物科技有限公司），乙酰胆碱酯酶（AChE）和碘化硫代乙酰胆碱（Acetylthiocholine iodide，ATCI，大连美仑生物技术有限公司）。
2. 分组：分为空白组、对照组和样品组。
3 实验方法。
3.1 样品准备
分别精密称取样品和毒扁豆碱0.11mg，分别以甲醇为溶剂，配置成2.5μM、5.0μM、10.0μM、20.0μM和40.0μM的五个梯度浓度。分别精密称取7.8005g的磷酸二氢钠和17.9070g的磷酸氢二钠，用蒸馏水定容至500ml，取26.5ml的磷酸二氢钠和473.5ml的磷酸氢二钠，配制成500ml PBS（0.1M pH=8.0）；精密称取0.0594g DTNB，加入10ml的PBS，配制成DTNB溶液（15mmol/L）；精密称取0.01g AChE，加入10ml PBS，配制成AChE溶液（0.2U/mL）；精密称取0.044g ATCI，用蒸馏水定容至10ml，配制成ATCI溶液（15mmol/L）。
3.2 改进的Ellman方法测定抗胆碱酯酶活性。
在96孔酶标板中依次加入140μL PBS（0.1M pH=8.0），10μL DTNB（15mmol/L），15μLAChE（0.2U/mL），20μL样品溶液。空白组实验用甲醇代替样品，对照组实验用毒扁豆碱代替样品。37℃孵育10min后，加10μL的ATCI（15mmol/L）。20℃孵育10min后，用酶标仪在410nm下测定其吸光度值。根据下式计算抑制率：抑制率（%）=（空白组-样品组）/空白组×100%。
4实验结果。
实验结果表明本发明生物碱化合物有抗胆碱酯酶作用。
实验结果如表4所示。
表4：本发明抗胆碱酯酶抑制活性
Figure 383459DEST_PATH_IMAGE005
。
综上所述，本发明提供特殊化合物及其提取分离方法，依次采用乙醇回流提取、硅胶柱层析、聚酰胺柱层析、ODS中压柱、羟丙基葡聚糖凝胶柱层析以及HPLC分离纯化，成功的分离得到三种化合物，该方法简便，快速，环保，且经该方法分离得到的化合物纯度较高，由于所得化合物化学结构独特，从常用中药马齿苋中提取出来，其具有抗炎和抗胆碱酯酶作用，因此本发明特殊化合物及其盐和衍生物可以作为天然产物开发中药新药，具有广阔的前景。

Claims (7)

1.一种从马齿苋药材中分离出的生物碱类化合物，其特征在于，所述生物碱类化合物包括如下三种：
分子式分别为：C16H15NO5（1），C13H11NO3（2），C14H13NO3（3），并且根据结构命名为4,9,10-trihydroxy-2-methoxy-6,7-dihydrodibenzo[b,e]azocin-12(5H)-one（1），9,10-dihydroxy-5,6-dihydro-11H-benzo[d]pyrrolo[1,2-a]azepin-11-one（2），8,9-dihydroxy-6,11-dihydro-5H-benzo[d]pyrrolo[1,2-a]azepine-3-carbaldehyde（3），其化学结构式如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
。
2.一种如权利要求1所述的三种生物碱类化合物的提取分离方法，其特征在于，所述提取分离方法的具体步骤包括：
步骤1、取马齿苋干燥药材，采用醇煎煮提取，醇提液滤过，合并滤液回流浓缩，放凉至室温，得药液备用；
步骤2、将步骤1中药液蒸干后上硅胶柱，用乙酸乙酯洗脱，减压回收乙酸乙酯至浸膏，得到乙酸乙酯提取物；
步骤3、将步骤2中乙酸乙酯提取物经聚酰胺柱分离，采用体积比为5∶95的水和乙醇等度洗脱，乙醇部分蒸干，备用；
步骤4、将步骤3中所得物经预处理的ODS柱层析分离，用甲醇-水梯度洗脱，得到若干洗脱部位，经薄层色谱进行检测，显色，将显色部位减压浓缩至干，得到浓缩物备用；
步骤5、将步骤4中所得浓缩物经预处理的羟丙基葡聚糖凝胶层析分离，以甲醇等度洗脱，得到若干部位，经薄层色谱进行检测，显色，合并显色的洗脱部位，将合并的洗脱部位经减压浓缩至干，得浓缩物备用；
步骤6、将步骤5中所得浓缩物通过HPLC分离制备，以体积比为45∶55的乙腈-0.1%甲酸水作为流动相使用不同浓度进行等度洗脱，得到生物碱类化合物4,9,10-trihydroxy-2-methoxy-6,7-dihydrodibenzo[b,e]azocin-12(5H)-one；乙腈-0.1%甲酸水的体积比为35∶65，得到生物碱类化合物9,10-dihydroxy-5,6-dihydro-11H-benzo[d]pyrrolo[1,2-a]azepin-11-one；乙腈-0.1%甲酸水的体积比为25∶75，得到生物碱类化合物8,9-dihydroxy-6,11-dihydro-5H-benzo[d]pyrrolo[1,2-a]azepine-3-carbaldehyde。
3.如权利要求2所述的提取分离方法，其特征在于，所述步骤1中醇溶剂为50％乙醇，提取次数为两次，每次提取回流2小时，乙醇的用量为药材的8～16倍。
4.如权利要求2所述的提取分离方法，其特征在于，所述步骤2中所用流动相洗脱程序为等度洗脱。
5.如权利要求2所述的提取分离方法，其特征在于，所述步骤4中甲醇和水的体积比为50∶50、65∶35、80∶20、90∶10、100∶0梯度洗脱。
6.如权利要求2所述的提取分离方法，其特征在于，所述步骤4中所述ODS和步骤5中羟丙基葡聚糖凝胶的预处理过程为甲醇浸泡过24小时，上柱，以初始流动相平衡。
7.一种如权利要求1所述的任意一种生物碱类化合物的用途，其特征在于，所述用途可用于制备抗炎和抗胆碱酯酶的药物。
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