CN109942481B - 马齿苋中化合物Oleraisoindole A及其提取分离方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及中药提取、分离领域，尤其涉及从马齿苋中提取、分离和鉴别出的新生物碱类化合物及其提取分离方法。所述的新化合物，分子式为C₂₈H₂₃NO₇，命名为Oleraisoindole A。还提供上述新化合物的提取分离方法，依次采用水煎煮提取、硅胶柱层析、聚酰胺柱层析、ODS中压柱及Sephadex LH‑20分离制备，成功的提取分离出一种新的生物碱类化合物。其结构由质谱，碳谱，氢谱及二维核磁波谱解析的方法鉴定为一种新生物碱类化合物。新化合物具有抗肿瘤、神经保护作用，本发明新化合物及其盐或衍生物可以作为其他化合物合成先导物，以及新药开发和药理活性研究的原料，用于制备抗肿瘤、神经保护的药物。

Description

马齿苋中化合物Oleraisoindole A及其提取分离方法与应用

技术领域

本发明涉及中药提取、分离领域，尤其涉及从马齿苋药材中提取、分离和鉴别出的新化合物及其提取分离方法。

背景技术

马齿苋(Portulaca oleracea L.)，又名马苋菜、长命菜、蚂蚁菜，为马齿苋科一年生草本植物。马齿苋分布广泛，资源丰富，是我国卫生部规定的78种药食同源的野生植物之一。马齿苋收载于2015版《中华人民共和国药典》，具有清热解毒、凉血止血、止痢等功效，用于热毒血痢、痈肿疔疮、湿疹、丹毒、蛇虫咬伤、便血、痔血、崩漏下血等。

马齿苋现代药理学研究表明，其具有抗炎、抗菌、抗病毒、降血压、降血脂、抗氧化、抗癌、抗肿瘤、松弛骨骼肌和平滑肌、调节免疫功能等作用。马齿苋主要化学成分包括黄酮类、香豆素、萜类、甾类、生物碱、氨基酸、木脂素类、挥发油、多糖、各种色素类和矿物质类等为其多样的药理作用提供了物质基础。其中生物碱是马齿苋中一类主要的化学成分，目前已报道的生物碱类成分有去甲肾上腺素、多巴胺、少量多巴、腺苷、尿嘧啶、腺嘌呤、N，N-二环己基脲、尿囊素、N-反式-阿魏酰基酪胺；还有环二肽生物碱和生物碱：马齿苋酰胺A-I、K、L、N-S。

目前从马齿苋中分离出的化学成分大多数是已知的，且结构新颖性较低，因此，对马齿苋中新化合物的开发和分离是亟待需要的。

发明内容

针对上述问题，本发明提供从马齿苋中提取分离的新化合物，经研究发现本发明的新化合物具有抗肿瘤、神经保护作用，同时提供一种针对本发明新化合物的简便、快速、环保、纯度高的提取分离方法。

为实现本发明的上述目的，本发明提供马齿苋中化合物Oleraisoindole A，分子式为C₂₈H₂₃NO₇，化学结构式为：

为实现本发明的上述目的，本发明还提供一种马齿苋中化合物Oleraisoindole A的提取分离方法，包括以下步骤。

步骤1、取马齿苋干燥药材，采用水提取(水用量为药材的8～16倍)两次，水提液滤过，合并滤液直接加热浓缩，放凉至室温，得药液备用。

步骤2、将步骤1中药液蒸干后上硅胶柱，用乙酸乙酯洗脱，减压回收乙酸乙酯至浸膏，得到乙酸乙酯提取物。

步骤3、将步骤2中乙酸乙酯提取物经聚酰胺柱分离，采用乙醇-水梯度洗脱，50％乙醇蒸干后上硅胶柱，依次用乙酸乙酯-甲醇梯度洗脱得到若干洗脱部位，经薄层色谱进行检测，显色，合并显色的洗脱部位，将合并后的洗脱部位经减压浓缩至干，备用。

步骤4、将步骤3中所得物经预处理的ODS柱(Octadecylsilyl，十八烷基硅烷键合硅胶填料)层析分离，用甲醇-水梯度洗脱，得到若干洗脱部位，经薄层色谱进行检测，显色，将各显色的洗脱部位分别减压浓缩至干，得到浓缩物备用。

步骤5、将步骤4中所得物再经预处理的葡聚糖凝胶柱(Sephadex LH-20)层析分离，用甲醇洗脱，得到若干洗脱部位，经薄层色谱进行检测，显色，合并显色的洗脱部位，将合并后的洗脱部位经减压浓缩至干，备用。

步骤6、将步骤5中所得新化合物通过HPLC(高效液相)分离制备，以乙腈-0.1％甲酸为流动相进行等度洗脱，最终得到化合物oleraisoindole A。

所述ODS与葡聚糖凝胶的预处理过程为甲醇浸泡过24小时，上柱，用甲醇洗至滴入水中无混浊，再以初始流动相平衡。

与现有技术相比本发明的有益效果。

本发明中所述马齿苋新生物碱类化合物Oleraisoindole A的分离和药理活性研究未被现有论文期刊所报道；本发明提供来源于马齿苋的新生物碱类化合物及一种针对本发明新化合物的提取分离方法，依次采用水煎煮提取、硅胶柱层析、聚酰胺柱、ODS中压柱、Sephadex LH-20及高效液相色谱仪进行分离纯化与制备，成功提取分离出新化合物，该方法操作步骤仅为六步，操作方法简便及快速，提取分离过程主要采用水提取及乙酸乙酯洗脱，工艺方法环保，且经该方法分离得到的化合物纯度较高均大于90％，此外经研究表明此化合物具有抗肿瘤、神经保护作用，因此本发明新化合物及其盐和衍生物可以作为其他化合物合成先导物，以及新药开发和药理活性研究的原料，亦可用于制备抗肿瘤、抗氧化的药物。

附图说明

图1为本发明新化合物oleraisoindole A的紫外光谱图。

图2为本发明新化合物oleraisoindole A的红外光谱图。

图3为本发明新化合物oleraisoindole A的高分辨质谱图。

图4为本发明新化合物oleraisoindole A¹H-NMR光谱图。

图5为本发明新化合物oleraisoindole A¹³C-NMR光谱图。

图6为本发明新化合物oleraisoindole A的核磁共振碳谱(DEPT)光谱图。

图7为本发明新化合物oleraisoindole A的核磁共振¹H-¹H COSY光谱图。

图8为本发明新化合物oleraisoindole A的核磁共振HMBC光谱图。

图9为本发明新化合物oleraisoindole A的核磁共振HSQC光谱图。

图10为本发明新化合物oleraisoindole A的核磁共振ROESY光谱图。

具体实施方式

本发明提供新化合物，分子式为C₂₈H₂₃NO₇，命名为oleraisoindole A化学结式为：

所述新化合物根据结构命名为oleraisoindole A，下表1为该新化合物的核磁数据：¹H-NMR与¹³C-NMR在氘代DMSO中。

本发明化合物结构鉴定参阅图1-10。

oleraisoindole A：黄色粉末，易溶于甲醇。点样于硅胶薄层板后，喷稀碘化铋钾试液斑点呈橙色，喷三氯化铁试液斑点呈青色。UV(MeOH)λ_max:284nm。IR(KBr)v_max 1700,1390cm^-1。HRESI(+)TOFMS给出m/z:484.1404[M-H]^-的准分子离子峰，分子量为484.1401。结合¹H-NMR，¹³C-NMR以及DEPT数据，推测该化合物可能的分子式为C₂₈H₂₃NO₇，不饱和度为18。¹³C-NMR谱和DEPT谱显示26个碳信号，分别为2个OCH₃(δ：55.69；55.75)、2个CH₂(δ：32.9；39.0)，8个烯碳(δ：109.5；110.4；114.2；115.1；115.2；121.8；122.5；129.5)、12个季碳(6个连O的双键碳，δ：146.5；147.1；150.0；155.8；166.9；167.4；6个双键碳，δ：121.6；124.9；125.6；128.3；131.1；137.0)。¹H-NMR谱显示2个CH₃信号分别为δ3.74(3H，s),3.94(3H，s)；2个亚甲基信号，分别为δ2.74(2H，brt，J＝7.6)，δ3.66(2H，dd，J＝6.9,9.2)；8个次甲基信号分别为δ2.79(1H，m)，δ6.05(2H，dd，J＝2.28,4.38)。根据1H-1H COSY谱可知，次甲基中的Hδ6.86、δ6.91分别和δ6.73相耦合，Hδ6.95和δ6.63相耦合；亚甲基中的Hδ3.66和δ2.74相耦合；而Hδ7.12、δ7.66和δ8.20相对于其他次甲基化学位移较大，可能与双键相连。从核磁数据中可以看出，该化合物存在两个苯环。第一个苯环：氢谱中δ6.73、δ6.86和δ6.91的三个氢是1,3,4位三取代的苯环中的一部分；HMBC谱显示H-2'与C-4，H-6'与C-4相耦合，说明与C-4(δ137.0)相关联。HMBC谱中H-5'与C-3'相耦合，且ROE中甲基与H-2'相耦合，说明甲氧基与苯环上的C-3'相连；另外，H-2’与C-4’，H-6’与C-4’相耦合，且C-4’(δ146.5)处于低场，推测苯环上还存在一个与C-4'相连的羟基。第二个苯环：是一个典型的对位取代苯环，一个羟基与C-4”'(δ155.8)相连；HMBC谱中H-2”'、H-6”'与C-2”相耦合，说明C-2”与C-1”'相连。HMBC谱中H-1”分别与C-2”、羰基C-1(δ167.4)和C-3(δ166.9)相耦合，根据1H-NMR谱和13C-NMR谱中C-1”(δH 3.66，δC 39.0)的化学位移，可以推算出这是一个典型的CH₂与N相连的结构。在1H-NMR谱中，可以看到有四个单峰信号，分别是一个甲氧基(δH 3.94,δC 55.75)和三个次甲基C-9(δH 8.20，δC 121.8)、C-8(δH 7.66，δC 109.5)、C-5(δH 7.12，δC 110.4)。在这部分结构中存在9个季碳，其中一个双键碳C-4(δ137.0)、两个羰基碳C-1和C-3作为外围碳。在碳谱中C-4未被检测到，但是在HMBC谱中有相关；氢谱中H-8与H-9化学位移不同，而在ROE中显示两者空间相关，说明两者相关，但不在同一个苯环上；总之，上述表明两个环绕质子在同一萘基上。在ROE中甲氧基与H-8有强的相关信号，说明甲氧基与C-7相连。在HMBC中，H-9与C-1和C-3a也相耦合。因此，可以推断出C-1与C-9a相连。另外，虽然C-3与C-3a相连的键不能被测定，但基于C-3a(δ121.6)的化学位移，两者相连是合理的。在ROE中H-5与H-6'相耦合，最终确定这是一个四取代的苯环。在碳谱中C-9a未被检测到，但是在HMBC谱中有相关。根据以上信息，可确定此新化合物为上述结构。

本发明还提供上述化合物的提取分离方法，具体步骤为。

步骤1：称取马齿苋干燥药材150kg，采用水回流提取，水用量(v/v)为药材的10倍，回流提取两次，每次2h，加热浓缩，放凉至室温，得药液备用。

步骤2：将步骤1中所得药液蒸干后经硅胶柱层析分离，用乙酸乙酯(115L)等度洗脱，其中硅胶为100-200目，40℃以下减压回收乙酸乙酯至浸膏，得到乙酸乙酯提取物。

步骤3：将步骤2中乙酸乙酯提取物经聚酰胺柱分离，采用乙醇-水(0/100，30/70，50/50，70/30，100/0，v/v)梯度洗脱，50％乙醇蒸干后经硅胶柱层析分离，其中硅胶为200～300目，依次用乙酸乙酯-甲醇(5:1、2:1、1:2，v:v)梯度洗脱，共得到19个部位(即共得到19个瓶，每瓶300mL)，经薄层色谱进行检测，显色，合并显色的1～14洗脱部位，将合并后的1～14部位经40℃以下减压浓缩至干，备用。

步骤4：将步骤3中所得物再经预处理的ODS中压柱层析分离(Octadecylsilyl，十八烷基硅烷键合硅胶填料)，其中填料粒度为20～40μm，用甲醇-水(50/50，60/40，70/30，80/20，100/0，v/v)梯度洗脱(加压，使流速为1mL/min，温度为室温)，得到16个部位(即梯度洗脱得16个瓶，每瓶100mL)，经薄层色谱进行检测，显色，将显色的7～9部位保留，50℃以下减压浓缩至干，备用。

步骤5：将步骤4中所得物再经预处理的葡聚糖凝胶柱层析分离(Sephadex LH-20)，用甲醇洗脱，得到26洗脱部位(即共得到26个瓶，每瓶50mL)，经薄层色谱进行检测，显色，将显色的18-26部位保留，50℃以下减压浓缩至干，备用，得到新化合物。所述ODS与葡聚糖凝胶的预处理过程为甲醇浸泡过24h，上柱，用甲醇洗至滴入水中无混浊，再以初始流动相平衡。

步骤6：将步骤5中所得新化合物经HPLC分离制备，以乙腈：0.1％甲酸(43：57，v/v)作为流动相，检测波长为210nm，280nm，分离制备得到本发明新化合物，归一法测定纯度均为90～99％。

本发明化合物的抗肿瘤作用。

1主要材料。

1.1药品和试剂：实验所用新生物碱化合物由上述方法制备，纯度为90～99％，精密称取，用DMSO稀释至下述各剂量组所需溶液。DMEM高糖培养基、胎牛血清(美国Hyclone公司)；青霉素、链霉素(杭州四季青公司)。

1.2细胞株：人结肠癌细胞Caco-2、人乳腺癌细胞MCF-7、人胃癌细胞BGC-823、人肺腺癌细胞SPC-A1、人肝癌细胞BEL-7402、人宫颈癌细胞Hela-229、卵巢癌细胞Ho-8910、人类口腔表皮样癌细胞KB(中科院上海细胞库)。

1.3分组：分为对照组、实验组和调零组(含DMSO溶媒的培养液)。

2实验方法。

2.1细胞培养，DMEM高糖培养基，加入l0％的胎牛血清，l％抗菌素(100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素)，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养。

2.2MTI法检测细胞增殖，取对数生长期细胞接种于96孔培养板中，细胞密度为1×104个/mL，每孔100μL，温度37℃，5％的CO₂条件下培养过夜后，实验组加入不同浓度的本发明新生物碱化合物，每组设3个复孔，加药后置于37℃，5％CO₂培养箱中培养48h。将含药培养液吸去，加入体积比为4：1的无血清培养液和MTT(终质量浓度为5mg/mL)共100mL，继续孵育4h，小心吸去上清液后，每孔加入DMSO150μL，放于震荡器上震荡以使结晶完全溶解(5min)，酶标仪在570nm波长下检测各孔的吸光度(A)值。然后，计算各浓度化合物对细胞生长的抑制率，抑制率公式：细胞生长抑制率＝(1-A_加药孔/A_对照孔)×100％，再应用SPSS软件处理数据，将抑制率对药物浓度作曲线，计算IC₅₀值。

3实验结果。

实验结果表明本发明新生物碱化合物对人结肠癌细胞Caco-2、人乳腺癌细胞MCF-7、人胃癌细胞BGC-823、人肺腺癌细胞SPC-A1、人肝癌细胞BEL-7402、人宫颈癌细胞Hela-229、卵巢癌细胞Ho-8910、人类口腔表皮样癌细胞KB的增殖具有抑制作用，且随药物浓度增大，抑制率也明显升高，即呈浓度依赖。本发明新化合物对上述八种肿瘤细胞IC₅₀值见表2。

表2本发明新化合物对肿瘤细胞的抑制作用。

细胞株	IC<sub>50</sub>(μM/L)
		结肠癌细胞Caco-2	23.76
乳腺癌细胞MCF-7	21.42
		胃癌细胞BGC-823	17.22
肺腺癌细胞SPC-A1	25.94
		肝癌细胞BEL-7402	19.85
宫颈癌细胞Hela-229	20.59
		卵巢癌细胞Ho-8910	20.16
口腔表皮样癌细胞KB	10.03

本发明新化合物的神经保护作用。

1主要材料。

1.1药品和试剂：实验所用新生物碱化合物由上述方法制备，纯度为90～99％，精密称取，用DMSO稀释至下述各剂量组所需溶液。DMEM高糖培养基、胎牛血清(美国Hyclone公司)；青霉素、链霉素(杭州四季青公司)，磷酸盐缓冲液(PBS)，(武汉博士德有限公司)，ROS检测试剂盒(海门碧云天试剂公司)

1.2细胞株：人神经母细胞瘤细胞株(SH-SY5Y、IMR-32)(中科院上海细胞

1.3分组：分为对照组、H₂O₂损伤模型组和实验组。

2实验方法。

2.1细胞培养，DMEM高糖培养基，加入l0％的胎牛血清，l％抗菌素(100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素)，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养。

2.2MTT比色法测定细胞活力，上述三组分别取对数生长期SH-SY5Y细胞和IMR-32细胞接种于96孔培养板中，细胞密度为1×10⁴个/mL，每孔100μL，温度37℃，5％CO₂条件下培养过夜后，实验组加入不同浓度的本发明新生物碱化合物oleraisoindole A(5-40μM)，孵育1h后向H₂O₂组和实验组分别加入终浓度为800μM/L的H₂O₂，另设调零组(含DMSO溶媒的培养液)，每组设3个复孔，考察加入药物后对细胞的影响。上述各组细胞培养24h后，在各孔细胞中加入5mg/mL MTT 20μL，温度37℃，5％CO₂条件下继续孵育4h后，终止培养，吸弃孔内液体，每孔加入100μL二甲基亚砜(DMSO)，振荡10min，使细胞内结晶充分溶解，酶标仪450nm波长处测定各孔吸光值(A)值，计算细胞存活率，细胞存活率＝(AH₂O₂损伤－A空白)/(A对照－A空白)。

2.3DCFH-DA法检测SH-SY5Y细胞和IMR-32细胞内ROS，各组细胞给予相应物质后孵育24h，孵育结束前30min，各孔加入DCFH-DA，使终浓度为10μmol/L，于37℃继续孵育30min，收集细胞，PBS洗2次，细胞计数，将各组细胞制成相同浓度的细胞悬液。取100μL细胞悬液检测荧光强度，激发波长485nm，发射波长538nm。以对照组荧光强度为100％，其余各组与对照组荧光强度相比较，计算胞内ROS变化。

2.4INT显色反应法测定LDH的释放量，除上述对照组、H₂O₂损伤模型组和实验组外，另设立空白对照组(空白对照组不接种细胞)，各组细胞加入相应物质培养24h，取各孔上清120μL至新的96孔板中，加60μL配好的LDH检测工作液，避光室温孵育30min，在490nm处用多功能酶标仪测定A值，计算相对于对照管的LDH释放量百分率。LDH释放率＝(A给药－A空白)/(A对照－A空白)

3实验结果。

细胞相对存活率实验结果如表3所示。

表3：本发明对人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y和IMR-32细胞相对存活率的影响。

注：^*P<0.05与H₂O₂损伤模型组比较。

SH-SY5Y细胞和IMR-32细胞内ROS量检测结果如表4所示。

表4：本发明对人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y和IMR-32细胞内ROS量的影响。

注：^*P<0.05与对照组比较，^#P<0.05与H₂O₂损伤模型组比较

SH-SY5Y细胞和IMR-32细胞内LDH释放的影响结果如表5所示。

表5：本发明对人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y和IMR-32细胞内LDH释放的影响。

注：^*P<0.05与对照组比较，^#P<0.05与H₂O₂损伤模型组比较。

综上所述，本发明提供特殊化合物及其提取分离方法，依次采用水回流提取、硅胶柱层析、聚酰胺柱层析、ODS中压柱、葡聚糖凝胶柱层析分离纯化，成功的分离得到一种新化合物，该方法简便，快速，环保，且经该方法分离得到的化合物纯度较高，由于所得化合物化学结构独特，从常用中药马齿苋中提取出来，其具有抗肿瘤及神经保护作用，因此本发明特殊化合物及其盐和衍生物可以作为天然产物开发中药新药，具有广阔的前景。

Claims (5)

1.一种马齿苋中化合物Oleraisoindole A的提取分离方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、取马齿苋干燥药材，采用水煎煮提取2次，每次煎煮2小时，水量为药材的8～16倍，放凉至室温，得药液备用；

步骤2、将步骤1中药液蒸干后上硅胶柱，用乙酸乙酯洗脱，减压回收乙酸乙酯至浸膏，得到乙酸乙酯提取物；

步骤3、将步骤2中乙酸乙酯提取物经聚酰胺柱分离，采用水和乙醇的体积比为100：0，70：30，50：50，30：70和0：100梯度洗脱，50％乙醇部分蒸干后上硅胶柱，依次用乙酸乙酯-甲醇梯度洗脱得到若干洗脱部位，所用乙酸乙酯，及乙酸乙酯和甲醇的体积比为5：1，2：1和1：2；经薄层色谱进行检测，显色，合并显色的洗脱部位，将合并后的洗脱部位经减压浓缩至干，备用；

步骤4、将步骤3中所得物经预处理的ODS柱层析分离，用甲醇和水的体积比为50：50，60：40，70：30和80：20梯度洗脱，得到若干洗脱部位，经薄层色谱进行检测，显色，将各显色的洗脱部位分别减压浓缩至干，得到浓缩物备用；

步骤5、将步骤4中所得物再经预处理的葡聚糖凝胶柱层析分离，用甲醇洗脱，得到若干洗脱部位，经薄层色谱进行检测，显色，合并显色的洗脱部位，将合并后的洗脱部位经减压浓缩至干，备用；

步骤6、对步骤5中所得浓缩物进行HPLC分离制备，以乙腈和0.1％甲酸的体积比为43：57作为流动相，制备得到一种生物碱类化合物；

所述马齿苋中化合物Oleraisoindole A的分子式为：C₂₈H₂₃NO₇，其化学结构式如下：

2.如权利要求1所述的提取分离方法，其特征在于，所述ODS与葡聚糖凝胶的预处理过程为甲醇浸泡过24小时，上柱，用甲醇洗至滴入水中无混浊，再以初始流动相平衡。

3.如权利要求1所述的提取分离方法，其特征在于，所述步骤2中所用流动相洗脱程序为等度洗脱。

4.如权利要求1所述的提取分离方法，其特征在于，所述步骤5中用甲醇洗脱程序为等度洗脱。

5.如权利要求1所述的化合物Oleraisoindole A在制备神经保护的药物中的应用。

Images