CN113307817B

CN113307817B - 马齿苋中一种吡咯类生物碱化合物及其提取分离方法

Info

Publication number: CN113307817B
Application number: CN202110642164.4A
Authority: CN
Inventors: 英锡相; 崔馨予; 英哲铭
Original assignee: Liaoning University of Traditional Chinese Medicine
Current assignee: Liaoning University of Traditional Chinese Medicine
Priority date: 2021-06-09
Filing date: 2021-06-09
Publication date: 2022-05-06
Anticipated expiration: 2041-06-09
Also published as: CN113307817A

Abstract

发明涉及中药提取、分离领域，尤其涉及从马齿苋中提取、分离和鉴别出的吡咯类生物碱化合物及其提取分离方法。所述的吡咯类生物碱化合物，分子式为C₁₆H₉NO₄，并且根据其结构命名为10,11‑dihydroxybenzo[5',6']pentaleno[1',2':3,4]pyrrolo[2,1‑b]oxazol‑7(11bH)‑one。还提供上述吡咯类生物碱化合物的提取分离方法，依次采用乙醇回流提取、硅胶柱层析、ODS中压柱及羟丙基葡聚糖柱层析纯化、液相分离制备。其结构采用¹H‑NMR、¹³C‑NMR及UHPLC‑ESI‑TOF‑MS的方法确定为吡咯类生物碱化合物。该化合物具有潜在的抗炎和抗胆碱酯酶等活性，并提供制备方法，为开发新药和开发新成分提供先导物和理论依据。

Description

马齿苋中一种吡咯类生物碱化合物及其提取分离方法

技术领域

本发明涉及中药提取、分离领域，尤其涉及从马齿苋药材中提取、分离和鉴别出的吡咯类生物碱化合物及其提取分离方法。

背景技术

马齿苋（Portulaca oleracea L.），又名长命菜、马苋菜，为马齿苋科马齿苋属植物。马齿苋性喜肥沃土壤，耐旱亦耐涝，生命力强，分布广泛，资源丰富，而以我国东北部的更为常见。马齿苋既可入药，又可食用，是我国卫生部划定的药食同源的野生植物之一。2020版《中华人民共和国药典》中收载马齿苋的干燥地上部分入药，具有清热解毒、凉血止血、止痢等功效，用于热毒血痢、痈肿疔疮、湿疹、丹毒、蛇虫咬伤、便血、痔血和崩漏下血等。

现代药理学研究表明，马齿苋具有降血脂、降血糖、抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗动脉粥样硬化和松弛或兴奋平滑肌及增强免疫力等功效。研究表明马齿苋中所含多种化学成分与其多样的药理作用息息相关，其主要化学成分包括：黄酮类、生物碱类、萜类、香豆素类、有机酸类、挥发油、多糖、氨基酸、各种色素类和矿物质类等。其中生物碱是马齿苋中的一大类活性成分，而酰胺类生物碱又占绝大多数。目前已报道的生物碱类成分有去甲肾上腺素、多巴胺、少量多巴、腺苷、尿嘧啶、腺嘌呤、N，N-二环己基脲、尿囊素、N-反式-阿魏酰基酪胺；还有环二肽生物碱和酰胺类生物碱：马齿苋酰胺A-I、K、L、N-S。

目前从马齿苋中分离出的化学成分大多数是已知的，且结构新颖性较低，因此，对马齿苋中化合物的开发和分离是亟待需要的。

发明内容

针对上述问题，本发明提供一种从马齿苋中提取的吡咯类生物碱化合物，经研究发现本发明的吡咯类生物碱化合物具有抗炎、抗胆碱酯酶的作用，同时提供一种针对本发明吡咯类生物碱化合物的简便、快速、环保、纯度高的提取分离方法。

为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案。

本发明提供了一种从马齿苋药材中分离出的吡咯类生物碱化合物，其特征在于，分子式分别为：C₁₆H₉NO₄，并且根据结构命名为10,11-dihydroxybenzo[5',6']pentaleno[1',2':3,4]pyrrolo[2,1-b]oxazol-7(11bH)-one，其化学结构式如下：

。

本发明还提供给了一种从马齿苋药材中分离出的吡咯类生物碱化合物的提取分离方法，其特征在于，所述提取分离方法的具体步骤为：

步骤1、取马齿苋干燥药材，采用乙醇回流提取，醇提液滤过，合并滤液回流浓缩，放凉至室温，得药液备用；

步骤2、将步骤1中药液蒸干后上硅胶柱，用乙酸乙酯洗脱，减压回收乙酸乙酯至浸膏，得到乙酸乙酯提取物；

步骤3、将步骤2中乙酸乙酯提取物经聚酰胺柱分离，采用乙醇洗脱，乙醇部分蒸干，备用；

步骤4、将步骤3中所得物经预处理的ODS柱层析分离，用甲醇-水梯度洗脱，得到若干洗脱部位，经薄层色谱进行检测，显色，将显色部位减压浓缩至干，得到浓缩物备用；

步骤5、将步骤4中所得浓缩物经预处理的羟丙基葡聚糖凝胶层析分离，以甲醇等度洗脱，得到若干部位，经薄层色谱进行检测，显色，合并显色的洗脱部位，将合并的洗脱部位经减压浓缩至干，得浓缩物备用；

步骤6、将步骤5中所得浓缩物通过HPLC分离制备，以乙腈-0.1%甲酸水作为流动相使用不同浓度进行等度洗脱，最终得到本发明所述的吡咯类生物碱化合物。

进一步地，所述步骤1中醇溶剂为50％乙醇，提取次数为两次，每次提取回流2小时，乙醇的用量为药材的8～16倍。

进一步地，所述步骤2中所用流动相洗脱程序为等度洗脱。

进一步地，所述步骤3中水和乙醇的体积比为5∶95等度洗脱。

进一步地，所述步骤4中甲醇和水的体积比为50∶50、65∶35、80∶20、90∶10和100∶0梯度洗脱。

进一步地，所述步骤4中所述ODS和羟丙基葡聚糖凝胶的预处理过程为甲醇浸泡过24小时，上柱，以初始流动相平衡。

进一步地，所述步骤5中甲醇洗脱程序为等度洗脱。

进一步地，所述步骤6中乙腈-0.1%甲酸水的体积比为40∶60，得到本发明所述的吡咯类生物碱化合物5,6-dihydroxybenzo[5',6']pentaleno[1',2':4,5]pyrrolo[1,2-b]isoxazol-9(4bH)-one。

本发明还提供了一种如权利要求1所述的从马齿苋药材中分离出吡咯类生物碱化合物的用途，其特征在于，所述用途可用于制备抗炎和抗胆碱酯酶的药物。

与现有技术相比本发明的有益效果。

本发明中所述马齿苋中吡咯类生物碱化合物的分离和药理活性研究中未发现论文期刊有所报道；本发明提供来源于马齿苋的吡咯类生物碱化合物及一种针对本发明化合物的提取分离方法，依次采用乙醇回流提取、硅胶柱层析、聚酰胺柱分离、ODS中压柱、羟丙基葡聚糖柱层析及HPLC进行分离纯化与制备，成功提取分离出的吡咯类生物碱化合物，该方法操作步骤仅为六步，操作方法简便及快速，提取分离过程主要采用乙醇提取，工艺方法环保，且经该方法分离得到的化合物纯度均大于98%，此外经研究表明以上化合物具有抗炎和抗胆碱酯酶作用，因此本发明吡咯类生物碱化合物及其盐和衍生物可以作为其他化合物合成先导物，以及新药开发和药理活性研究的原料，亦可用于制备抗炎和抗胆碱酯酶的药物。

附图说明

图1为本发明吡咯类生物碱化合物10,11-dihydroxybenzo[5',6']pentaleno[1',2':3,4]pyrrolo[2,1-b]oxazol-7(11bH)-one的¹H-NMR光谱图。

图2为本发明吡咯类生物碱化合物10,11-dihydroxybenzo[5',6']pentaleno[1',2':3,4]pyrrolo[2,1-b]oxazol-7(11bH)-one的¹³C-NMR光谱图。

图3为本发明吡咯类生物碱化合物10,11-dihydroxybenzo[5',6']pentaleno[1',2':3,4]pyrrolo[2,1-b]oxazol-7(11bH)-one的DEPT光谱图。

图4为本发明吡咯类生物碱化合物10,11-dihydroxybenzo[5',6']pentaleno[1',2':3,4]pyrrolo[2,1-b]oxazol-7(11bH)-one的核磁共振HMBC光谱图。

图5为本发明吡咯类生物碱化合物10,11-dihydroxybenzo[5',6']pentaleno[1',2':3,4]pyrrolo[2,1-b]oxazol-7(11bH)-one的核磁共振¹H-¹HCOSY光谱图。

图6为本发明吡咯类生物碱化合物10,11-dihydroxybenzo[5',6']pentaleno[1',2':3,4]pyrrolo[2,1-b]oxazol-7(11bH)-one的核磁共振HSQC光谱图。

图7为本发明吡咯类生物碱化合物10,11-dihydroxybenzo[5',6']pentaleno[1',2':3,4]pyrrolo[2,1-b]oxazol-7(11bH)-one的核磁共振ROESY光谱图。

图8为本发明吡咯类生物碱化合物10,11-dihydroxybenzo[5',6']pentaleno[1',2':3,4]pyrrolo[2,1-b]oxazol-7(11bH)-one的高分辨质谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做详细的说明。

实施例1。

本发明提供吡咯类生物碱化合物，分子式为C₁₆H₉NO₄命名为10,11-dihydroxybenzo[5',6']pentaleno[1',2':3,4]pyrrolo[2,1-b]oxazol-7(11bH)-one，化学结构式为：

。

所述吡咯类生物碱化合物根据结构命名为10,11-dihydroxybenzo[5',6']pentaleno[1',2':3,4]pyrrolo[2,1-b]oxazol-7(11bH)-one，表1为该吡咯类生物碱类化合物的核磁数据：¹H-NMR与¹³C-NMR在MeOD-d ₄中。

表1：本发明化合物10,11-dihydroxybenzo[5',6']pentaleno[1',2':3,4]pyrrolo[2,1-b]oxazol-7(11bH)-one的核磁数据

。

本发明吡咯类生物碱类化合物10,11-dihydroxybenzo[5',6']pentaleno[1',2':3,4]pyrrolo[2,1-b]oxazol-7(11bH)-one的结构鉴定与推导。

10,11-dihydroxybenzo[5',6']pentaleno[1',2':3,4]pyrrolo[2,1-b]oxazol-7(11bH)-one：化合物为黄褐色粉末，易溶于甲醇。UHPLC-ESI-Q-TOF-MS给出m/z:278.0457[M-H]^-（C₁₆H₁₀NO₄ ^-，计算值为278.0453）的准分子离子峰。结合¹H-NMR，¹³C-NMR以及DEPT数据，推测该化合物可能的分子式为C₁₆H₉NO₄，不饱和度为13。¹³C-NMR谱和DEPT谱显示了16个碳原子信号，包括一个羰基碳，7个CH基团，两个与O相连的碳原子和其他六个季碳。在HMBC光谱中，δ_H6.88（H-7，d，J=8.10Hz）和δ_H7.28（H-8，d，J＝8.16Hz）处的信号表明存在1,2,3,4-取代的苯环。δ_H7.77（H-2，br）和δ_H6.63（H-3，br）处的信号是两个典型的顺式偶联烯烃氢原子。两个不饱和的氢信号在δ_H6.89（H-5，d，J=3.24）和δ_H7.32（H-6，br）。除不饱和氢原子外，在δ_H3.91（H-11b，s）处观察到CH的信号。表1列出了¹H-NMR（600MHz，MeOD-d ₄）和¹³C-NMR（150MHz，MeOD-d ₄）的数据。在HMBC光谱中，H-8与C-9（δ_H117.23），C-10（δ_C154.21）和C-11a（δ_C138.70）的相关性以及H-9与C-7a（δ_C132.04）和C-11（δ_C143.00）的相关性表明两个羟基位于苯环的C-10（δ_C154.21）和C-11。根据氢与碳化学位移以及H-2与C-3（δ_C113.93），C-11d（153.77）的相关，H-3与C-2（δ_C147.13），C-5（δ_C117.59）和C-11d的相关；H-5与C-3和C-11d的相关证明了吡咯并恶唑的存在。根据H-6与C-5a（δ_C135.08），C-6a（δ_C135.09），C-7（δ_C195.24），C-11c（δ_C117.23）和C-11b（δ_C30.23）；H-11b与C-5a，C-6（δ_C120.38），C-6a，C-7，C-7a和C-11a的相关性表明两个五元环共享相同的两个碳原子（C-6a和C-11b）。此外，H-6与C-5a，C-11c之间的相关性；H-8与C-7；H-11b与C-11和C-11d的相关性可以确认改化合物具有6/5/5/5/5环系统。其他相关图谱COSY和ROESY进一步佐证了此结构。

根据以上信息，可确定此吡咯类生物碱类化合物为上述结构。

本发明还提供上述吡咯类生物碱类化合物的提取分离方法，具体步骤为：

步骤1：马齿苋干燥药材250kg，采用50％乙醇回流提取，50％乙醇用量为药材的8～16倍，回流提取两次，每次2h，减压回收乙醇，放凉至室温，得药液备用；

步骤2：将步骤1中所得药液蒸干后经硅胶柱层析分离，用乙酸乙酯（115L）等度洗脱，其中硅胶为100～200目，40℃以下减压回收乙酸乙酯至浸膏，得到乙酸乙酯提取物；

步骤3：将步骤2中乙酸乙酯提取物经聚酰胺柱分离，采用体积比为5:95的水和乙醇等度洗脱，乙醇部分蒸干备用；

步骤4：将步骤3中所得物再经预处理的ODS中压柱层析分离，其中填料粒度为20～40μm，用甲醇∶水（50∶50，65∶35，80∶20，90∶10，100∶0，v∶v）梯度洗脱（加压，使流速为1mL/min，温度为室温），得到25个部位（即梯度洗脱得25个瓶，每瓶100mL），经薄层色谱进行检测，显色，将显色的20～25部位保留，50℃以下减压浓缩至干，备用；

步骤5：将步骤4中所得物再经预处理的羟丙基葡聚糖凝胶柱层析分离，用甲醇洗脱，得到20洗脱部位（即共得到20瓶，每瓶50mL），经薄层色谱进行检测，显色，将显色的8～11部位保留，50℃以下减压浓缩至干，备用，得到化合物。所述ODS与羟丙基葡聚糖凝胶的预处理过程为甲醇浸泡过24h，上柱，用甲醇洗至滴入水中无混浊，再以初始流动相平衡；

步骤6：将步骤5中所得化合物经HPLC分离制备，以乙腈∶0.1％甲酸作为流动相分别用体积比为40∶60等度洗脱，检测波长为210nm和280nm，分离制备得到本发明的吡咯类生物碱类化合物，归一法测定纯度均为≥98%。

实施例2本发明吡咯类生物碱类化合物的抗炎作用。

1主要材料。

1.1、药品和试剂：实验所用化合物由上述方法制备，纯度为≥98%，精密称取，用DMSO稀释至下述各剂量组所需溶液。胎牛血清（美国Hyclone公司）；青霉素、链霉素（杭州四季青公司）；DMSO（美国Sigma公司）；cck-8试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）；DMEM高糖培养基、LPS、IL-1β、TNF-α的ELISA试剂盒（索莱宝科技有限公司）；细胞裂解液。

1.2 细胞株：RAW264.7巨噬细胞（美国ATCC细胞库）。

1.3 分组：对照组、LPS组和实验组，各一组。

2 实验方法。

2.1 细胞培养，DMEM高糖培养基，加入10%的胎牛血清，l%抗菌素（100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素），置于37℃，5%CO₂培养箱中培养。

2.2 cck-8法测定细胞活力，上述三组分别取对数生长期RAW264.7巨噬细胞接种于96孔培养板中，细胞密度为1×10⁴个/mL，每孔100μL，温度37℃，5%CO₂条件下培养过夜后，实验组加入不同浓度的本发明的化合物10,11-dihydroxybenzo[5',6']pentaleno[1',2':3,4]pyrrolo[2,1-b]oxazol-7（11bH)-one（1～20μM），孵育1h后向LPS组和实验组分别加入终浓度为1μg/mL的LPS，另设调零组（含DMSO溶媒的培养液），每组设3个复孔，考察加入药物后对细胞的影响。上述各组细胞培养24h后，在各孔细胞中加入cck-8溶液10μL，温度37℃，5%CO₂条件下继续孵育4h后，酶标仪450nm波长处测定各孔吸光值。

2.3 ELISA法测定炎症因子IL-1β、TNF-α：将对数生长期RAW264.7巨噬细胞接种于24孔培养板中，细胞密度为1×10⁵个/mL，每孔500μL，温度37℃，5%CO₂条件下培养过夜，实验组加入本发明的化合物10,11-dihydroxybenzo[5',6']pentaleno[1',2':3,4]pyrrolo[2,1-b]oxazol-7(11bH)-one（1～20μM），培育1h后，在每孔加入LPS（终浓度为1μg/mL），共孵育24h，每组处理重复3孔。ELISA法测定马齿苋来源化合物处理后的RAW264.7巨噬细胞分泌的IL-1β、TNF-α的含量。

3实验结果。

实验结果表明本发明吡咯类生物碱化合物在20μM以下对LPS诱导的巨噬细胞RAW264.7的增殖无影响，安全无毒；并可有效抑制LPS诱导的巨噬细胞RAW264.7所产生过量炎症细胞因子IL-1β、TNF-α，且呈浓度依赖。

细胞相对存活率实验结果如表2所示。

表2：本发明对RAW264.7巨噬细胞相对存活率的影响

注：^* P<0.05与LPS组比较（高浓度组有显著性差异）。

ELISA法测定炎症因子IL-1β、TNF-α的结果如表3所示。

表3：本发明对LPS诱导的RAW264.7细胞分泌的IL-1β、TNF-α含量的影响（平均值±标准差，n=3）

注：^* P<0.05与对照组比较，^# P<0.05与LPS组比较。

实施例3本发明的化合物的抗胆碱酯酶作用。

1、主要材料。

1.1、药品和试剂：实验所用吡咯类生物碱化合物由上述方法制备，纯度为90～99%，磷酸二氢钠、磷酸氢二钠（国药集团化学试剂有限公司），毒扁豆碱（瀚香生物科技），磷5，5’-二硫代双（2－硝基苯甲酸）（Dithiobisnitrobenzoic acid，DTNB，上海金穗生物科技有限公司），乙酰胆碱酯酶（AChE）和碘化硫代乙酰胆碱（Acetylthiocholine iodide，ATCI，大连美仑生物技术有限公司）。

1.2、分组：分为空白组、对照组和样品组。

2 实验方法。

2.1 样品准备。

分别精密称取样品和毒扁豆碱0.11mg，分别以甲醇为溶剂，配置成2.5μM、5.0μM、10.0μM、20.0μM和40.0μM的五个梯度浓度。分别精密称取7.8005g的磷酸二氢钠和17.9070g的磷酸氢二钠，用蒸馏水定容至500ml，取26.5ml的磷酸二氢钠和473.5ml的磷酸氢二钠，配制成500ml的PBS（0.1M，pH=8.0）；精密称取0.0594g的DTNB，加入10ml的PBS，配制成DTNB溶液（15mmol/L）；精密称取0.01g的AChE，加入10ml的PBS，配制成AChE溶液（0.2U/mL）；精密称取0.044g的ATCI，用蒸馏水定容至10ml，配制成ATCI溶液（15mmol/L）。

2.2改进的Ellman方法测定抗胆碱酯酶活性。

在96孔酶标板中依次加入140μL的PBS（0.1M，pH=8.0），10μL的DTNB（15mmol/L），15μL的AChE（0.2U/mL），20μL样品溶液。空白组实验用甲醇代替样品，阳性对照组实验用毒扁豆碱代替样品。37℃孵育10min后，加10μL的ATCI（15mmol/L）。20℃孵育10min后，用酶标仪在410nm下测定其吸光度值。根据下式计算抑制率：

抑制率（%）=（空白组-样品组）/空白组×100%。

3实验结果。

实验结果表明本发明吡咯类生物碱化合物有抗胆碱酯酶作用。

实验结果如表4所示。

表4：本发明抗胆碱酯酶抑制活性

。

综上所述，本发明提供特殊化合物及其提取分离方法，依次采用乙醇回流提取、硅胶柱层析、聚酰胺柱层析、ODS中压柱及羟丙基葡聚糖凝胶柱层析分离纯化，成功的分离得到化合物，该方法简便，快速，环保，且经该方法分离得到的化合物纯度较高，由于所得化合物化学结构独特，从常用中药马齿苋中提取出来，其具有抗炎和抗胆碱酯酶作用，因此本发明特殊化合物及其盐和衍生物可以作为天然产物开发中药新药，具有广阔的前景。

Claims

1.一种从马齿苋药材中分离出的吡咯类生物碱化合物，其特征在于，分子式为：C₁₆H₉NO₄结构式如下：

。

2.一种从马齿苋药材中分离出的吡咯类生物碱化合物的提取分离方法，其特征在于，所述提取分离方法的具体步骤为：

步骤2：将步骤1中所得药液蒸干后经硅胶柱层析分离，用115L乙酸乙酯等度洗脱，其中硅胶为100～200目，40℃以下减压回收乙酸乙酯至浸膏，得到乙酸乙酯提取物；

步骤4：将步骤3中所得物再经预处理的ODS中压柱层析分离，其中填料粒度为20～40μm，在室温、加压使流速为1mL/min的条件下用体积比为50∶50，65∶35，80∶20，90∶10，100∶0的甲醇∶水梯度洗脱，得到25个部位，即梯度洗脱得25个瓶，每瓶100mL，经薄层色谱进行检测，显色，将显色的20～25部位保留，50℃以下减压浓缩至干，备用；

步骤5：将步骤4中所得物再经预处理的羟丙基葡聚糖凝胶柱层析分离，用甲醇洗脱，得到20洗脱部位，即共得到20瓶，每瓶50mL；经薄层色谱进行检测，显色，将显色的8～11部位保留，50℃以下减压浓缩至干，备用；

步骤6：将步骤5中所得化合物经HPLC分离制备，用体积比为40∶60的乙腈∶0.1％甲酸作为流动相等度洗脱，检测波长为210nm和280nm，分离制备得到权利要求1所述的吡咯类生物碱类化合物，归一法测定纯度均为≥98%。

3.如权利要求2所述的提取分离方法，其特征在于，所述步骤4和步骤5中所述ODS和羟丙基葡聚糖凝胶的预处理过程为甲醇浸泡过24小时，上柱，以初始流动相平衡。

4.一种如权利要求1所述的从马齿苋药材中分离出吡咯类生物碱化合物的用途，其特征在于，所述用途可用于制备抗炎和抗胆碱酯酶的药物。