CN108084060A - 马齿苋中生物碱oleraurea及其提取分离方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及中药提取、分离领域，尤其涉及从马齿苋中提取、分离和鉴别出的一种生物碱化合物及其提取分离方法。所述的生物碱化合物，分子式为C19H34N2O3，命名为oleraurea。还提供上述新化合物的提取分离方法，依次采用50％乙醇回流提取、聚酰胺柱层析、硅胶柱层析、ODS中压柱、及Sephadex LH‑20，成功的提取分离出一种新的生物碱化合物，这个新化合物具有抗胆碱酯酶和抗炎作用，本发明新化合物及其盐或衍生物可以作为其他化合物合成先导物，以及新药开发和药理活性研究的原料，用于制备抗胆碱酯酶和抗炎药物或保健品。
Description
技术领域
本发明涉及中药提取、分离领域，尤其涉及从马齿苋药材中提取、分离和鉴别出的生物碱类化合物及其提取分离方法。
背景技术
马齿苋(Portulaca oleracea L.)，又名长命菜、马苋菜、五行草，为马齿苋科一年生肉质草本植物。马齿苋耐旱耐涝，且耐光耐阴，分布广泛，资源丰富。大多为野生，很少有人种植，是我国卫生部规定的78种药食同源的野生植物之一，被列入2008年北京奥运会的菜谱。2015版《中华人民共和国药典》中收载马齿苋的干燥地上部分入药，具有清热解毒、凉血止血、止痢等功效，用于热毒血痢、痈肿疔疮、湿疹、丹毒、蛇虫咬伤、便血、痔血、崩漏下血等。
马齿苋现代药理学研究表明，其具有抗炎止痛、抗菌、抗病毒、降血压、降血脂、抗氧化、抗癌、松弛骨骼肌和平滑肌、调节免疫功能等作用。研究表明马齿苋众多化学成分为其多样的药理作用提供了物质基础，马齿苋主要化学成分包括黄酮类、香豆素、萜类、甾类、生物碱、氨基酸、生物碱类、挥发油、多糖、各种色素类和矿物质类等。其中生物碱是马齿苋中一类主要的化学成分，目前已报道的生物碱类成分有去甲肾上腺素、多巴胺、少量多巴、腺苷、尿嘧啶、腺嘌呤、N，N-二环己基脲、尿囊素、N-反式-阿魏酰基酪胺；还有环二肽生物碱和生物碱：马齿苋酰胺A-I、K、L、N-S。
目前从马齿苋中分离出的化学成分大多数是已知的，且结构新颖性较低，因此，对马齿苋中新化合物的开发和分离是亟待需要的。
发明内容
针对上述问题，本发明提供一种从马齿苋中提取生物碱化合物，经研究发现本发明的生物碱具有抗胆碱酯酶、抗炎的作用，同时提供一种针对本发明新生物碱化合物的简便、快速、环保、纯度高的提取分离方法。
为实现本发明的上述目的，本发明提供的生物碱化合物，分子式为C19H34N2O3，化学名为(10E,12E)-9-ureidooctadeca-10,12-dienoic acid，命名为oleraurea，化学结构式为：
为实现本发明的上述目的，本发明还提供一种马齿苋中生物碱化合物的提取分离方法，具体步骤为。
步骤1、取马齿苋干燥药材，采用50％乙醇回流提取，50％乙醇体积用量为药材的8～16倍，减压回收乙醇，放凉至室温，得药液备用。
步骤2、将步骤1中药液经柱层析硅胶柱分离，依次采用乙酸乙酯-乙醇梯度洗脱，将洗脱部位减压浓缩至干，备用。
步骤3、将步骤2中所得的浓缩物经聚酰胺柱分离，采用乙醇-水梯度洗脱，30％乙醇部分蒸干后上硅胶柱，依次用乙酸乙酯-甲醇梯度洗脱得到若干洗脱部位，经薄层色谱进行检测，显色，合并显色的洗脱部位，将合并后的洗脱部位经减压浓缩至干，备用。
步骤4、将步骤3中所得浓缩物经预处理的ODS柱(Octadecylsilyl，十八烷基硅烷键合硅胶填料)层析分离，用甲醇-水洗脱，得到若干洗脱部位，经薄层色谱进行检测，显色，合并显色的洗脱部位，经减压浓缩至干，备用。
步骤5、将步骤4中所得物再经Sephadex LH-20(羟丙基葡聚糖凝胶)处理，以甲醇等度洗脱，得到若干洗脱部位，经薄层色谱进行检测，显色，合并显色的洗脱部位，将合并后的洗脱部位经减压浓缩至干，备用。
步骤6、对步骤5中所得浓缩物进行HPLC(高效液相)分离制备，以乙腈-0.1％甲酸水溶液作为流动相，制备得到本发明生物碱类化合物，其纯度经高效液相色谱检测高于98％。
所述ODS和Sephadex LH-20凝胶的预处理过程为甲醇浸泡过24小时，上柱，用甲醇洗至滴入水中无混浊，再以初始流动相平衡。
所述新生物碱化合物可以用于制备抗胆碱酯酶和抗炎药物。
与现有技术相比，本发明的有益效果。
本发明中所述马齿苋生物碱化合物的分离和药理活性研究未被现有论文期刊所报道；本发明提供来源于马齿苋的生物碱类化合物及一种针对本发明新化合物的提取分离方法，依次采用50％乙醇回流提取、聚酰胺柱层析、硅胶柱层析、ODS中压柱、Sephadex LH-20、HPLC进行分离纯化与制备成功提取分离出一种生物碱类化合物，该方法操作步骤仅为六步，操作方法简便及快速，提取分离过程主要采用50％乙醇提取，工艺方法环保，且经该方法分离得到的化合物纯度较高均大于90％，此外经研究表明该化合物具有抗胆碱酯酶和抗炎作用，因此本发明的一种生物碱类化合物及其盐和衍生物可以作为其他化合物合成先导物，以及新药开发和药理活性研究的原料，亦可用于制备抗胆碱酯酶和抗炎的药物。
附图说明
图1为本发明生物碱化合物oleraurea的紫外光谱图。
图2为本发明生物碱化合物oleraurea的红外光谱图。
图3为本发明生物碱化合物oleraurea的高分辨质谱图。
图4为本发明生物碱化合物oleraurea 1H-NMR光谱图。
图5为本发明生物碱化合物oleraurea的13C-NMR光谱图。
图6为本发明生物碱化合物oleraurea的核磁共振碳谱(DEPT)光谱图。
图7为本发明生物碱化合物oleraurea的核磁共振1H-1HCOSY光谱图。
图8为本发明生物碱化合物oleraurea的核磁共振HMBC光谱图。
图9为本发明生物碱化合物oleraurea的核磁共振HSQC光谱图。
图10为本发明生物碱化合物oleraurea的核磁共振NOESY光谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做详细的说明。
实施例1。
本发明提供一种生物碱类化合物，分子式为C19H34N2O3，命名为oleraurea。化学结构式为：
所述生物碱类化合物根据结构命名为oleraurea，表1为该生物碱化合物的核磁数据：1H-NMR与13C-NMR在氘代DMSO中。
表1：本发明生物碱化合物的核磁数据
参阅图1-10，本发明生物碱化合物的结构鉴定与推导。
Oleraurea：白色粉末，易溶于甲醇，不溶、微溶于水。点样于硅胶薄层板后，喷溴甲酚蓝试液斑点显蓝色，提示该化合物含有羧基。UV(MeOH)λmax:226，290nm，IRνN-H3442cm-1，νCH2932cm-1，2861cm-1νC＝O1650，1606cm-1，δCH 1355cm-1。HRESI(+)TOFMS给出m/z：339.2611[M+H]+的准分子离子峰，分子量为338.2569。结合1H-NMR，13C-NMR以及DEPT数据，推测该化合物可能的分子式C19H34N2O3，不饱和度为4。13C-NMR谱、HMBC谱和DEPT谱显示19个碳信号，分别为1个甲基(δ：13.85)；11个亚甲基(δ：21.88，24.61，25.27，28.40，28.57，28.68，28.74，30.76，31.89，34.10，35.21)；1个次甲基(δ：50.16)；4个烯碳(δ：128.63，129.89，133.26，134.0)；2个羰基碳(δ：158.19，175.32)。δC 175.32在碳谱中较弱，但是在HMBC谱中有强相关，339.2611[M+H]+的准分子离子峰和红外图谱也可以证明它的存在。在1H NMR谱中，δH0.84(t，3H，J＝6.65Hz)证明1个甲基的存在；δH 1.22(m，10H，重叠)，1.23(m，2H)，1.33(m，2H)，1.36(m，2H)，1.46(m，2H)，2.01(q，2H，J＝14.4Hz)，2.14(m，2H)证明11个亚甲基的存在；δH 4.02(m，1H)证明1个次甲基的存在；δH 5.32(1H，s)和5.90(d，1H，J＝8.45Hz)证明脲基的存在；δH 5.47(m，1H)，5.60(m，1H)，5.99(d，2H，J＝14.1Hz，重叠)证明4个烯氢的存在。同时，HMBC谱可观察到相关峰：H-2/C-1，3，4；H-3/C-4；H-4/C-5，6；H-5/C-4，6，7；H-6/C-4，5，7；H-7/C-5，C-6；H-8/C-6；H-9/C-10，11；H-10/C-12；H-13/C-11；H-14/C-12，13，15，16；H-15/C-13，14，16，17；H-16/C-17；H-17/C-16，18；H-18/C-16，17，以及在1H-1H COSY谱中观察到的强相关峰H-2/H-3/H-4/H-5/H-6/H-7/H-8/H-9/H-10/H-11/H-12/H-13/H-14/H-15/H-16/H-17/H-18，提示一条长碳链的存在，NOESY谱也证明了长碳链的存在。4个烯氢属于两个双键，使相连的亚甲基(δ：31.89)和次甲基(δ：50.16)位于低场，其耦合常数为14.4Hz，判定为反式构型。羧基碳(δ：173.8)使其相连的次甲基C-2向低场移动。在1H-1H COSY谱中H-9/NH，NOESY谱中NH/NH2，H-8，9，10；NH2/NH，H-9，确定了脲基的存在。根据以上信息，可确定此新生物碱为上述结构。
本发明还提供上述该生物碱化合物的提取分离方法，具体步骤为。
步骤1：称取马齿苋干燥药材80kg，采用50％乙醇回流提取，50％乙醇体积用量为药材的10倍，回流提取两次，每次2h，减压回收乙醇，放凉至室温，得药液备用。
步骤2：将步骤1中药液经柱层析硅胶柱分离，其中硅胶为100目，依次采用乙酸乙酯-乙醇梯度洗脱(1/0，4/1，2/1，v/v)，每个梯度冲5个柱体积；将2/1洗脱部位减压浓缩至干，备用。
步骤3：将步骤2中浓缩液经聚酰胺柱分离，采用乙醇-水(0/100，30/70，70/30，90/10，v/v)梯度洗脱，30％乙醇部分蒸干后经硅胶柱层析分离，其中硅胶为200～300目，依次用乙酸乙酯-甲醇(5/1，2/1，1/2，1/3，v/v)梯度洗脱，经薄层色谱进行检测，显色，合并显色的洗脱部位，共得到4个部位(即共得到4个瓶，每瓶500mL)，将第一个部分在40℃以下减压浓缩至干，备用。
步骤4：将步骤3中所得部分经预处理的ODS中压柱层析分离，其中十八烷基硅烷键合硅胶填料粒度为20～40μm，用甲醇-水(20/80，40/60，60/40，80/20，100/0，v/v)等度洗脱(加压，使流速为1mL/min，温度为室温)，经薄层色谱进行检测，显色，合并显色的洗脱部位，将第四个部分在40℃以下减压浓缩至干，备用。所述ODS的预处理过程为甲醇浸泡过24h，上柱，用甲醇洗至滴入水中无混浊，再以初始流动相平衡。
步骤5：将步骤4中所得物再经预处理的Sephadex LH-20(羟丙基葡聚糖凝胶)处理，以2000ml纯甲醇等度洗脱，得到10个部位(即洗脱得10个瓶，每瓶200mL)，经薄层色谱进行检测，将3、4部位合并，50℃以下减压浓缩至干，备用。所述Sephadex LH-20凝胶的预处理过程为甲醇浸泡过24h，上柱，用甲醇洗至滴入水中无混浊，再以初始流动相平衡。
步骤6：将步骤5中所得物经HPLC分离制备，以乙腈-0.1％甲酸水溶液(49/51，v/v)作为流动相，检测波长为210，230nm，制备得到本发明生物碱类化合物，归一法测定纯度高于98％。
本发明生物碱化合物的抗胆碱酯酶作用。
1、主要材料。
1.1、药品和试剂：实验所用生物碱化合物由上述方法制备，纯度高于98％，磷酸二氢钠、磷酸氢二钠(国药集团化学试剂有限公司)，毒扁豆碱(瀚香生物科技)，磷5，5’－二硫代双(2－硝基苯甲酸)(Dithiobisnitrobenzoic acid，DTNB，上海金穗生物科技有限公司)，乙酰胆碱酯酶(AChE)和碘化硫代乙酰胆碱(Acetylthiocholine iodide，ATCI，大连美仑生物技术有限公司)。
1.分组：分为阴性对照组、阳性对照组和实验组，各一组。
2实验方法。
2.1样品准备，样品以甲醇为溶剂稀释。用1mol/L的磷酸二氢钠和磷酸氢二钠，配制成PBS(0.1M pH＝8.0)。
2.2改进的Ellman方法测定抗胆碱酯酶活性，在96孔酶标板中依次加入140uL PBS(0.1M pH＝8.0)，10uLDTNB(15mmol/L)，15uL AChE(0.2u/mL)，20μL样品溶液。阴性对照组实验用甲醇代替样品，阳性对照组实验用毒扁豆碱代替样品。37℃孵育10min后，加10uLATCI(15mmol/L)。20℃孵育10min后，用酶标仪在405nm下测定其吸光度值。根据下式计算抑制率:抑制率(％)＝[(空白组－样品)/空白组]×100％。
3实验结果。
实验结果表明本发明生物碱化合物有抗胆碱酯酶作用。实验结果，如表2所示。
表2：本发明抗胆碱酯酶抑制活性。
| 组别 | IC50(μM) |
| 毒扁豆碱 | 29.74 |
| oleraurea | 65.69 |
本发明生物碱化合物的抗炎作用。
1、主要材料。
1.1、药品和试剂：实验所用生物碱化合物由上述方法制备，纯度为90～99％，精密称取，用DMSO稀释至下述各剂量组所需溶液。DMEM高糖培养基、胎牛血清(美国Hyclone公司)；青霉素、链霉素(杭州四季青公司)；L-6、TNF-α、PGE2的ELISA试剂盒(美国Cayman公司)；LPS(美国Sigma公司)；I细胞裂解液、Griess试剂(碧云天生物技术有限公司)。
1.2细胞株：RAW264.7巨噬细胞(美国ATCC细胞库)。
1.3分组：分为对照组、LPS组和实验组，各一组。
2实验方法。
2.1细胞培养，DMEM高糖培养基，加入l0％的胎牛血清，l％抗菌素(100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素)，置于37.5℃，CO2培养箱中培养。
2.2MTT比色法测定细胞活力，上述三组分别取对数生长期RAW264.7巨噬细胞接种于96孔培养板中，细胞密度为1×104个/mL，每孔100μL，温度37℃，5％CO2条件下培养过夜后，实验组加入不同浓度的本发明新生物碱化合物oleraurea(1-50μM)，孵育1h后向LPS组和实验组分别加入终浓度为1μg/mL的LPS，另设调零组(含DMSO溶媒的培养液)，每组设3个复孔，考察加入药物后对细胞的影响。上述各组细胞培养24h后，在各孔细胞中加入5mg/mLMTT 20μL，温度37℃，5％CO2条件下继续孵育4h后，终止培养，吸弃孔内液体，每孔加入100μL二甲基亚砜(DMSO)，振荡10min，使细胞内结晶充分溶解，酶标仪570nm波长处测定各孔吸光值。
2.3利用格里斯(Griess)法测定NO的含量，考察本发明新生物碱化合物对LPS诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7的NO产生量的抑制作用。小鼠巨噬细胞RAW264.7传代后在含10％胎牛血清的高糖细胞培养基DMEM中培养，实验组加入不同浓度的本发明新生物碱化合物oleraurea(1-20μM)，在37℃，5％CO2条件下孵育1h后用LPS(终浓度为1μg/mL)诱导炎症反应，24h后收集上清液，每组处理重复3孔。Griess法测定细胞上清液中NO的含量，根据不同浓度本发明新生物碱化合物对LPS诱导的RAW264.7细胞释放NO的影响，用以反映NO水平。
2.4ELISA法测定炎症因子IL-6、TNF-α和炎症介质PGE2：将对数生长期RAW264.7巨噬细胞接种于24孔培养板中，细胞密度为1×105个/mL，每孔1mL，温度37℃，5％CO2条件下培养过夜，实验组加入本发明新生物碱化合物oleraurea(1-20μM)，培育1h后，在每孔加入LPS(终浓度为1μg/mL)，共孵育24h，每组处理重复3孔。ELISA法测定马齿苋来源新生物碱处理后的RAW264.7巨噬细胞分泌的IL-6、TNF-α和PGE2的含量。
3实验结果。
实验结果表明本发明生物碱化合物对LPS诱导的巨噬细胞RAW264.7的增殖无影响，安全无毒；并可有效抑制LPS诱导的巨噬细胞RAW264.7所产生过量炎症细胞因子IL-6、TNF-α和炎症介质NO、PGE2，且呈浓度依赖。细胞相对存活率实验结果，如表3所示。
表3：本发明对RAW264.7巨噬细胞相对存活率的影响。
注：*P<0.05与对照组比较(高浓度组有显著性差异)。
利用格里斯(Griess)法测定NO的含量实验结果，见表4。
表4：本发明对LPS诱导的RAW264.7细胞释放NO的影响(均数±标准差，n＝3)。
注：*P<0.05与对照组比较，#P<0.05与LPS组比较。
ELISA法测定炎症因子IL-6、TNF-α和炎症介质PGE2结果，如表5所示。
表5：本发明对LPS诱导的RAW264.7细胞分泌的IL-6、TNF-α和PGE2含量的影响(均数±标准差，n＝3)。
注：*P<0.05与对照组比较，#P<0.05与LPS组比较。
综上所述，本发明提供特殊化合物及其提取分离方法，依次采用50％乙醇回流提取、硅胶柱层析、聚酰胺柱层析、ODS中压柱、Sephadex LH-20处理，成功的分离得到一种新化合物，该方法简便，快速，环保，且经该方法分离得到的化合物纯度较高，由于所得化合物化学结构独特，从常用中药马齿苋中提取出来，其具有抗炎及抗胆碱酯酶作用，因此本发明特殊化合物及其盐和衍生物可以作为天然产物开发中药新药，具有广阔的前景。
Claims (9)
1.一种马齿苋中生物碱oleraurea，其特征在于，分子式为C19H34N2O3，命名为oleraurea，化学结构式为。
2.如权利要求1所述的马齿苋中生物碱oleraurea，其特征在于，具体步骤为：
步骤1、取马齿苋干燥药材，采用50％乙醇回流提取，减压回收乙醇，放凉至室温，得药液备用；
步骤2、将步骤1中药液经柱层析硅胶柱分离，依次采用乙酸乙酯-乙醇梯度洗脱，将得到的洗脱部位减压浓缩至干，备用；
步骤3、将步骤2中所得的浓缩物经聚酰胺柱分离，采用乙醇-水梯度洗脱，30％乙醇部分蒸干后上硅胶柱，依次用乙酸乙酯-甲醇梯度洗脱得到若干洗脱部位，经薄层色谱进行检测，显色，合并显色的洗脱部位，将合并后的洗脱部位经减压浓缩至干，备用；
步骤4、将步骤3中所得浓缩物经预处理的ODS柱(Octadecylsilyl，十八烷基硅烷键合硅胶填料)层析分离，用甲醇-水洗脱，得到若干洗脱部位，经薄层色谱进行检测，显色，合并显色的洗脱部位，经减压浓缩至干，备用；
步骤5、将步骤4中所得物再经Sephadex LH-20(羟丙基葡聚糖凝胶)处理，以甲醇等度洗脱，得到若干洗脱部位，经薄层色谱进行检测，显色，合并显色的洗脱部位，将合并后的洗脱部位经减压浓缩至干，备用；
步骤6、对步骤5中所得浓缩物进行HPLC(高效液相)分离制备，以乙腈-0.1％甲酸水溶液作为流动相，制备得到本发明生物碱类化合物。
3.如权利要求2所述提取分离方法，其特征在于，所述步骤1中50％乙醇回流每次提取，每次回流2小时，乙醇体积用量为药材的8～16倍。
4.如权利要求2所述的提取分离方法，其特征在于，所述ODS和Sephadex LH-20凝胶的预处理过程为甲醇浸泡过24小时，上柱，用甲醇洗至滴入水中无混浊，再以初始流动相平衡。
5.如权利要求2所述的提取分离方法，其特征在于，所述步骤2中乙酸乙酯-乙醇的体积比为1/0、4/1、2/1。
6.如权利要求2所述的提取分离方法，其特征在于，所述步骤3中乙醇-水体积比为0/100、30/70、70/30或90/10。
7.如权利要求2所述的提取分离方法，其特征在于，所述步骤3中乙酸乙酯-甲醇体积比为5/1、2/1、1/2和1/3。
8.如权利要求2所述的提取分离方法，其特征在于，所述步骤4中甲醇-水比为20/80、40/60、60/40、80/20和100/0。
9.如权利要求1所述的马齿苋中生物碱oleraurea用于制备抗胆碱酯酶或抗炎的药物或保健品。
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