CN109824685B - 马齿苋中化合物oleracone G及其提取分离方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及中药提取、分离领域，尤其涉及从马齿苋中提取、分离和鉴别出的一种化合物及其提取分离方法。所述的化合物，分子式为C₁₇H₁₂O₅，命名为oleracone G。还提供上述化合物的提取分离方法，依次采用水煎煮提取、硅胶柱层析、聚酰胺柱层析、ODS中压柱及Sephadex LH‑20纯化、液相分离制备。其结构采用紫外、红外、质谱、氢谱、碳谱及二维核磁波谱解析的方法确定为一种化合物。该化合物具有抗氧化、抗肿瘤作用，本发明化合物及其盐或衍生物可以作为其他化合物合成先导物，以及新药开发和药理活性研究的原料，用于制备抗氧化、抗肿瘤的药物。

Description

马齿苋中化合物oleracone G及其提取分离方法与应用

技术领域

本发明涉及中药提取、分离领域，尤其涉及从马齿苋药材中提取、分离和鉴别出的一种化合物及其提取分离方法。

背景技术

马齿苋(Portulaca oleracea L.)，又名长命菜、马苋菜，为马齿苋科植物。马齿苋性喜肥沃土壤，耐旱亦耐涝，生命力强，分布广泛，资源丰富。马齿苋既可入药，又可食用，是我国卫生部划定的药食同源的野生植物之一。2015版《中华人民共和国药典》中收载马齿苋的干燥地上部分入药，具有清热解毒、凉血止血、止痢等功效，用于热毒血痢、痈肿疔疮、湿疹、丹毒、蛇虫咬伤、便血、痔血、崩漏下血等。

现代药理学研究表明，马齿苋具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗动脉粥样硬化、降血脂、降血糖、松弛或兴奋平滑肌及增强免疫力等功效。研究表明马齿苋中所含多种化学成分与其多样的药理作用息息相关，其主要化学成分包括：生物碱类、黄酮类、萜类、香豆素类、有机酸类、挥发油、多糖、氨基酸、各种色素类和矿物质类等。其中生物碱是马齿苋中的一大类活性成分，目前已报道的生物碱类成分有去甲肾上腺素、多巴胺、少量多巴、腺苷、尿嘧啶、腺嘌呤、N，N-二环己基脲、尿囊素、N-反式-阿魏酰基酪胺；还有环二肽生物碱和酰胺类生物碱：马齿苋酰胺A-I、K、L、N-S。

目前从马齿苋中分离出的化学成分大多数是已知的，且结构新颖性较低，因此，对马齿苋中化合物的开发和分离是亟待需要的。

发明内容

针对上述问题，本发明提供从马齿苋中提取的一种化合物oleracone G，经研究发现本发明的化合物具有抗氧化、抗肿瘤的作用，同时提供一种针对本发明新化合物的简便、快速、环保、纯度高的提取分离方法。

为实现本发明的上述目的，本发明提供一种马齿苋中化合物oleracone G，分子式为C₁₇H₁₂O₅，化学结构式为：

为实现本发明的上述目的，本发明还提供一种马齿苋中化合物oleracone G提取分离方法，具体步骤为：

步骤1、取马齿苋干燥药材，采用水煎煮提取，水提液滤过，合并滤液直接加热浓缩，放凉至室温，得药液备用。

步骤2、将步骤1中浓缩液上硅胶柱，用乙酸乙酯洗脱，减压回收乙酸乙酯至浸膏，得到乙酸乙酯提取物。

步骤3、将步骤2中乙酸乙酯提取物经聚酰胺柱分离，采用乙醇-水梯度洗脱，将70％乙醇洗脱的显色部分合并蒸干后上硅胶柱，用乙酸乙酯，乙酸乙酯-甲醇梯度洗脱，经薄层色谱检测，显色，将纯乙酸乙酯部位的显色部分合并，减压浓缩至干，备用。

步骤4、将步骤3中所得物再经预处理的ODS柱(Octadecylsilyl，十八烷基硅烷键合硅胶填料)层析分离，用甲醇-水梯度洗脱，得到若干洗脱部位，经薄层色谱进行检测，显色，将显色的洗脱部位减压浓缩至干，得浓缩物备用。

步骤5、将步骤4中所得浓缩物经预处理的Sephadex LH-20(羟丙基葡聚糖凝胶)层析分离，以甲醇洗脱，经薄层色谱进行检测，显色，将显色的洗脱部位分别减压浓缩至干，得浓缩物备用。

步骤6、将步骤5中所得浓缩物通过HPLC(高效液相)分离制备，以乙腈-0.1％甲酸(体积百分数)为流动相进行等度洗脱，最终得到本发明所述的一种化合物oleracone G。

所述ODS和Sephadex LH-20凝胶的预处理过程为甲醇浸泡过24小时，上柱，用甲醇洗至滴入水中无混浊，再以初始流动相平衡。

与现有技术相比本发明的有益效果。

本发明中所述马齿苋中化合物oleracone G的分离和药理活性研究未被现有技术所报道；本发明提供来源于马齿苋的一种化合物及一种针对本发明化合物的提取分离方法，依次采用水煎煮提取、硅胶柱层析、聚酰胺柱、ODS中压柱、Sephadex LH-20及高效液相色谱仪进行分离纯化与制备，成功提取分离出一种化合物，该方法操作步骤仅为六步，操作方法简便及快速，提取分离过程主要采用水提取及乙酸乙酯洗脱，工艺方法环保，且经该方法分离得到的化合物纯度较高均大于90％，此外经研究表明此化合物具有抗氧化、抗肿瘤作用，因此本发明化合物oleracone G及其盐和衍生物可以作为其他化合物合成先导物，以及新药开发和药理活性研究的原料，亦可用于制备抗氧化、抗肿瘤的药物。

附图说明

图1为本发明化合物oleracone G的紫外光谱图。

图2为本发明化合物oleracone G的红外光谱图。

图3为本发明化合物oleracone G的高分辨质谱图。

图4为本发明化合物oleracone G的¹H-NMR光谱图。

图5为本发明化合物oleracone G的¹³C-NMR光谱图。

图6为本发明化合物oleracone G的核磁共振碳谱(DEPT)光谱图。

图7为本发明化合物oleracone G的核磁共振¹H-¹HCOSY光谱图。

图8为本发明化合物oleracone G的核磁共振HMBC光谱图。

图9为本发明化合物oleracone G的核磁共振HSQC光谱图。

图10为本发明化合物oleracone G的核磁共振NOESY光谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做详细的说明。

实施例1。

本发明提供一种马齿苋中化合物oleracone G，分子式分别为C₁₇H₁₂O₅，化学结构式为：

所述化合物根据结构命名为oleracone G，表1为该化合物的核磁数据：¹H-NMR与¹³C-NMR在DMSO中。

表1：本发明化合物oleracone G的核磁数据。

编号	δ<sub>C</sub>	type	δH,mult(J in Hz)
				1	133.40	CH	7.44t(7.14)
2	122.95	CH	7.12d(7.68)
				3	130.40	CH	7.56d(7.50)
4	115.63	CH	7.08d(8.10)
				4a	151.26	C
5		O
				5a	97.28	CH	7.01s
6		O
				6a	157.35	C
7	94.73	CH	6.23s
				8	168.16	C
8-OCH<sub>3</sub>	56.15	CH<sub>3</sub>	3.84s
				9	95.77	CH	6.23s
10	164.08	C
				10-OH			12.33brs
10a	103.25	C
				11	183.19	C
11a	130.53	C
				12	130.63	CH	7.72s
12a	118.20	C

本发明一种化合物oleracone G的结构鉴定与推导。

Oleracone G：淡黄色粉末状物，易溶于甲醇，不溶、微溶于水。点样于硅胶薄层板后，喷三氯化铁试液斑点呈青色。UV(MeOH)λ_max:208nm，241nm，307nm，IR(KBr)ν_max 2921，2853，1653,1600，1371,1296，1193，1165cm^-1。HRESI(+)TOFMS给出m/z:297.0587[M+H]⁺的准分子离子峰，分子量为296.0685。结合¹H-NMR，¹³C-NMR以及DEPT数据，推测该化合物可能的分子式为C₁₇H₁₂O₅，不饱和度为12。¹³C-NMR谱和DEPT谱显示17个碳信号，分别为8个CH(7个烯烃碳，δ：94.73,95.77,115.63,122.95,130.40,130.63,133.40；1个脂肪烃碳，97.28)、8个季碳(一个羰基，δ：183.19；四个连O的烯烃碳，δ：151.26,157.35,164.08,168.16；三个烯烃碳，δ：103.25,118.20,130.53)。

¹H-NMR谱信号δ3.84(s,3H)，对应¹³C-NMR谱信号δ_C 56.15，显示结构存在一个-OCH₃基团。同时，¹H-NMR谱活泼氢信号δ12.33(brs,1H)，表明结构存在一个羟基基团。¹H-NMR谱信号δ6.23(s,2H)，分别对应¹³C-NMR谱信号δ_C 94.73和δ_C 95.77，具有黄酮类化合物四取代芳香A环结构的特征。由于HMBC谱上存在δ_H 6.23同时与δ_C 94.73(C-7)和δ_C 95.77(C-9)的相关信号，判定苯环上两质子属于间位关系。依据HMBC谱信号，δ_H 6.23(H-7)与δ_C 103.25，δ_C157.35，δ_C 168.16相关，以及δ_H 6.23(H-9)与δ_C 103.25，δ_C 164.08，δ_C 168.16相关，可知103.25，δ_C 157.35，δ_C 164.08，δ_C 168.16分别为苯环上的其余四个碳原子，且δ_C 157.35，δ_C164.08，δ_C 168.16均位于低场，可能与O相连。基于HMBC谱，δ_H 3.84与δ_C 168.16相关，以及NOESY谱，δ_H 3.84同时与δ_H 6.23(H-7/9)相关信号，可确定-OCH₃与δ_C 168.16(C-8)位相连。由于H-7与δ_C 157.3相关，H-9与δ_C 164.08相关，且二者又与δ_C 103.25相关，故推测δ_C157.35，δ_C 164.08和δ_C 103.25分别为C-6a，C-10和C-10a。考虑到烯碳δ_C 164.08处于低场，可能与O相连，故推测-OH位于δ_C 164.08(C-10)位。

依据H-H COSY谱信号及各质子的耦合常数，得知δ_H 7.56(H-3,1H,d,J＝7.50)，δ_H7.12(H-2,1H,d,J＝7.68)，δ_H 7.44(H-1,1H,t,J＝7.14)，δ_H 7.08(H-4,1H,d,J＝8.10)四个芳香质子相互耦合。结合HMBC谱信号δ_H 7.44(H-1，δ_C133.40)与δ_C 130.40(C-3)，δ_C 151.26(C-4a)相关,δ_H 7.12(H-2，δ_C122.95)与δ_C 115.63(C-4)，δ_C 118.20(C-12a)相关，δ_H 7.56(H-3，δ_C130.40)与δ_C 133.40(C-1)，δ_C 151.26(C-4a)相关，δ_H 7.08(H-4,δ_C 115.63)与δ_C118.20(C-12a)，δ_C 122.95(C-2),δ_C 151.26(C-4a)相关，表明化合物具有一个邻位二取代的苯环结构。

依HMBC谱信号，δ_H 7.72(H-12)与δ_C 151.26(C-4a)，δ_C 118.20(C-12a)相关，δ_H7.44(H-1)与δ_C 130.63(C-12)相关，表明烯碳δ_C 130.63(C-12)与邻位二取代苯环的季碳δ_C118.20(C-12a)位相连。结合¹H-NMR谱烯烃质子H-12(δ_C 130.63)表现为单峰，且HMBC谱H-12与δ_C 97.28(C-5a)，δ_C 130.53(C-11a)，及δ_C 183.19(C-11，羰基)相关，确立一个由C-12，C-11(羰基碳)，C-11a,C-5a构成的三取代烯烃结构的存在，其中烯烃季碳为δ_C 130.53(C-11a)。

上述解析过程确定了一个黄酮类四取代芳香A环结构，一个邻位二取代苯环结构，一个三取代烯烃双键结构和一个羰基基团的存在。考虑到化合物分子式为C₁₇H₁₂O₅，不饱和度为12，且δ_C 151.26(C-4a)和δ_C 157.35(C-6a)位于低场区，提示与O相连，推测化合物可能存在两个含氧环结构，则羰基与δ_C 103.25(C-10a)位相连，δ_C 97.28(C-5a)分别与连接C-6a的O(O-6)和与连接C-4a的O(O-5)相连，构成两个含氧环结构。¹H-NMR谱H-5a(δ_H 7.01,1H,s)为单峰，¹³C-NMR谱上脂肪碳C-5a(δ_C 97.28)较大的化学位移以及NOESY谱C-8位上甲氧基与H-5a的相关信号，进一步验证了由C-5a构成的两含氧环结构存在的合理性。

根据以上信息，可确定此化合物为上述结构。

本发明还提供上述新化合物的提取分离方法，具体步骤为：

步骤1：称取马齿苋干燥药材150kg，采用水煎煮提取，水用量为药材的10倍，煎煮提取两次，每次煎煮2h，水提液滤过，合并滤液，加热浓缩，放凉至室温，得药液备用。

步骤2：将步骤1中所得药液蒸干后经硅胶柱层析分离，用乙酸乙酯(115L)等度洗脱，其中硅胶为100-200目，室温以上，40℃以下减压回收乙酸乙酯至浸膏，得到乙酸乙酯提取物。

步骤3：将步骤2中乙酸乙酯提取物经聚酰胺柱分离，采用乙醇-水(0：100，30：70，50：50，70：30，100：0，v：v)梯度洗脱，将70％(体积百分数)乙醇部位的显色部分合并蒸干后经硅胶柱层析分离，其中硅胶为200-300目，依次用乙酸乙酯，乙酸乙酯-甲醇(5:1、2:1、1:2，v:v)梯度洗脱，将乙酸乙酯洗脱得到的15个部位(即得到15个瓶，每瓶300mL)，经薄层色谱进行检测，显色，合并显色的3～12洗脱部位，并于室温以上，40℃以下减压浓缩至干，备用。

步骤4：将步骤3中所得物再经预处理的ODS中压柱层析分离，其中填料粒度为40～70μm，用甲醇-水(70：30，80：20，85：15，90：10和100：0，v/v)梯度洗脱(加压，使流速为1mL/min，温度为室温)，得到12个部位(即梯度洗脱得12个瓶，每瓶100mL)，经薄层色谱进行检测，显色，将显色的3～10部位合并，50℃以下减压浓缩至干，备用。所述ODS的预处理过程为甲醇浸泡过24h，上柱，用甲醇洗至滴入水中无混浊，再以初始流动相平衡。

步骤5：将步骤4中所得显色部位经预处理的Sephadex LH-20柱层析，以甲醇等度洗脱，得到25个部位(即梯度洗脱得25个瓶，每瓶50mL)，经薄层色谱进行检测，显色，将显色的14～20部位合并，50℃以下减压浓缩至干，备用。所述Sephadex LH-20凝胶的预处理过程为甲醇浸泡过24h，上柱，用甲醇洗至滴入水中无混浊，再以初始流动相平衡。

步骤6：将步骤5中所得显色部位经HPLC分离制备，以乙腈和0.1％甲酸体积比为70:30作为流动相，检测波长为210，280nm，分离制备得到本发明一种化合物oleracone G，归一法测定纯度均为90～99％。

本发明化合物的抗氧化作用。

1主要材料。

1.1药品和试剂：实验所用化合物由上述方法制备，纯度为90～99％，精密称取，用甲醇稀释至下述各剂量组所需溶液。DPPH(1，1-二苯基-2-苦基肼自由基)(Sigma-Fluka公司)；BHA(叔丁基羟茴香醚)(上海祥瑞科技有限公司)；甲醇，色谱纯(昌泰兴业有限公司)。

1.2分组：对照组，实验组，空白组。

2.实验方法。

比色法测定消除DPPH自由基的能力，样品组取1mL DPPH溶液(100μM)加入到4mL比色皿中，再加入1mL不同浓度的样品溶液(5，10，20，30，50μM)；对照组取1mL甲醇溶液加入到4mL比色皿中，再加入1mL不同浓度的样品溶液；空白组取1mLDPPH溶液加入到4mL比色皿中，再加入1mL甲醇溶液。三组均充分混匀，室温避光静置10min，517nm下测定吸光值,静置30min后，按同样方法操作。每个样品平均测定三次取平均值，阳性对照为不同浓度的BHA溶液。根据以下公式计算样品对DPPH自由基的清除率，并进一步计算其自由基清除率IC₅₀值。

DPPH清除率(％)＝1－(A₁－A₂)/A₀×100％，

其中，A₀为空白组的吸光度值；A₁为样品组的吸光度值；A₂为对照组的吸光度值。

3.实验结果。

实验结果表明本发明化合物对DPPH自由基具有清除作用，且随药物浓度增大，清除率也明显升高。本发明化合物对DPPH自由基IC₅₀值见下表2。

表2.本发明新化合物对DPPH自由基的清除作用。

组别	IC<sub>50</sub>(μM)
		BHA	53.21
Oleracone G	40.14

本发明生物碱化合物的抗肿瘤作用。

1主要材料。

1.1药品和试剂：实验所用化合物由上述方法制备，纯度为90～99％，精密称取，用DMSO稀释至下述各剂量组所需溶液。DMEM高糖培养基、胎牛血清(美国Hyclone公司)；青霉素、链霉素(杭州四季青公司)。

1.2细胞株：人结肠癌细胞Caco-2、人乳腺癌细胞MCF-7、人胃癌细胞BGC-823、人肺腺癌细胞SPC-A1、人肝癌细胞BEL-7402、人宫颈癌细胞Hela-229、卵巢癌细胞Ho-8910、人类口腔表皮样癌细胞KB(中科院上海细胞库)。

1.3分组：分为对照组、实验组和调零组(含DMSO溶媒的培养液)。

2实验方法。

2.1细胞培养，DMEM高糖培养基，加入l0％的胎牛血清，l％抗菌素(100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素)，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养。

2.2MTI法检测细胞增殖，取对数生长期细胞接种于96孔培养板中，细胞密度为1×10⁴个/mL，每孔100μL，温度37℃，5％CO₂条件下培养过夜后，实验组加入不同浓度的本发明化合物，每组设3个复孔，加药后置于37℃，5％CO₂培养箱中培养48h。将含药培养液吸去，加入体积比为4：1的无血清培养液和MTT(终质量浓度为5mg/mL)共100mL，继续孵育4h，小心吸去上清液后，每孔加入DMSO 150μL，放于震荡器上震荡以使结晶完全溶解(5min)，酶标仪在570nm波长下检测各孔的吸光度(A)值。然后，计算各浓度化合物对细胞生长的抑制率,抑制率公式：细胞生长抑制率＝(1-A_加药孔/A_对照孔)×100％，再应用SPSS软件处理数据，将抑制率对药物浓度作曲线，计算IC₅₀值。

3实验结果。

实验结果表明本发明化合物对人结肠癌细胞Caco-2、人乳腺癌细胞MCF-7、人胃癌细胞BGC-823、人肺腺癌细胞SPC-A1、人肝癌细胞BEL-7402、人宫颈癌细胞Hela-229、卵巢癌细胞Ho-8910、人类口腔表皮样癌细胞KB、的增殖具有抑制作用，且随药物浓度增大，抑制率也明显升高，即呈浓度依赖。本发明新化合物对上述八种肿瘤细胞IC₅₀值见下表。

综上所述，本发明提供新化合物及其提取分离方法，依次采用水煎煮提取、硅胶柱层析、聚酰胺柱层析、ODS中压柱及Sephadex LH-20纯化、液相分离制备，成功的分离得到一种新化合物，该方法简便，快速，环保，且经该方法分离得到的化合物纯度较高，由于所得新化合物化学结构独特，从常用中药马齿苋中提取出来，其具有抗氧化、抗肿瘤作用，因此本发明新化合物及其盐和衍生物可以作为天然产物开发中药新药，具有广阔的前景。

Claims (10)

1.一种马齿苋中化合物oleracone G，其特征在于，分子式为：C₁₇H₁₂O₅，化学结构式如下：

。

2.如权利要求1所述化合物oleracone G的提取分离方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、取马齿苋干燥药材，采用水煎煮提取，水提液过滤，合并滤液直接加热浓缩，放凉至室温，得药液备用；

步骤2、将步骤1中浓缩液上硅胶柱，用乙酸乙酯洗脱，减压回收乙酸乙酯至浸膏，得到乙酸乙酯提取物；

步骤3、将步骤2中乙酸乙酯提取物经聚酰胺柱分离，采用乙醇-水梯度洗脱，将70%乙醇洗脱的显色部分合并蒸干后上硅胶柱，用乙酸乙酯，乙酸乙酯-甲醇梯度洗脱，经薄层色谱检测，显色，将纯乙酸乙酯部位的显色部分合并，减压浓缩至干，备用；

步骤4、将步骤3中所得物再经预处理的ODS柱层析分离，用甲醇-水梯度洗脱，得到若干洗脱部位，经薄层色谱进行检测，显色，将显色的洗脱部位减压浓缩至干，得浓缩物备用；

步骤5、将步骤4中所得浓缩物经预处理的Sephadex LH-20，以甲醇洗脱，经薄层色谱进行检测，显色，将显色的洗脱部位分别减压浓缩至干，得浓缩物备用；

步骤6、对步骤5中所得浓缩物进行HPLC分离制备，以乙腈-0.1%甲酸作为流动相进行等度洗脱，制备得到化合物oleracone G。

3.如权利要求2所述提取分离方法，其特征在于，所述步骤1中水煎煮提取两次，每次煎煮2小时，水用量为药材的8～16倍。

4.如权利要求2所述提取分离方法，其特征在于，所述步骤2中所用乙酸乙酯流动相洗脱程序为等度洗脱；硅胶目数100-200目。

5.如权利要求2所述提取分离方法，其特征在于，所述步骤3中所用乙醇和水的体积比，0：100，30：70，50：50，70：30和100：0；乙酸乙酯和甲醇的体积比为5：1，2：1和1：2；硅胶目数200-300目。

6.如权利要求2所述的提取分离方法，其特征在于，所述步骤4和步骤5中ODS和Sephadex LH-20凝胶的预处理过程为甲醇浸泡过24小时，上柱，用甲醇洗至滴入水中无混浊，再以初始流动相平衡。

7.如权利要求2所述的提取分离方法，其特征在于，所述步骤4中所用甲醇和水的体积比为70：30，80：20，85：15，90：10和100：0；填料粒度为40～70μm。

8.如权利要求2所述的提取分离方法，其特征在于，所述步骤5中所用甲醇洗脱程序为等度洗脱。

9.如权利要求2所述的提取分离方法，其特征在于，所述步骤6中所用乙腈-0.1%甲酸体积比为70：30，该化合物保留时间为5.62min。

10.如权利要求1所述的化合物oleracone G在制备抗氧化、抗肿瘤药物中的应用。

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