CN107936070B - 具有sirt 1抑制活性的糖苷类化合物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种具有SIRT 1抑制活性的糖苷类化合物及其制备方法，本发明中所述的具有SIRT 1抑制活性的糖苷类化合物，其能够很好的抑制SIRT 1的活性，适宜作为标准品及药物开发用；其中所述的提取方法具有较高的收率，成本低、耗时短，操作简便，且所得产品纯度高。

Description

具有SIRT 1抑制活性的糖苷类化合物及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种具有SIRT 1 抑制活性的糖苷类化合物及其制备方法。
背景技术
组蛋白去乙酰化是一种重要的组蛋白共价修饰方式，在基因表达中起着非常重要的调控作用，组蛋白去乙酰化主要由组蛋白去乙酰化酶催化完成。SIRT 1（silentinformation regulator 1）相关蛋白（sirtuins）家族是一组高度保守的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）依赖的组蛋白去乙酰化酶，广泛存在于从低等生物到人类的各物种中。SIRT1主要定位于细胞核中，具有较高的NAD+ 依赖的组蛋白去乙酰化酶活性，通过对组蛋白及多种非组蛋白底物的去乙酰化修饰，调节底物的乙酰化水平和活性，从而参与基因表达调控、细胞凋亡、分化等诸多生理过程，进而影响肿瘤等疾病的发生发展。特异性的SIRT 1抑制剂作为潜在的药物来源已经引起愈来愈多科学家的关注。近年来，多种不同结构的小分子sirtuin抑制剂被发现或合成，并已有部分小分子抑制剂进入临床研究阶段。
花椒为芸香科（Rutaceae）花椒属（Zanthoxy lum L）植物花椒（Zanthoxylum bungeanum Maxim.）或青椒（Zanthoxylum schinifolium Sieb. et Zucc.）的干燥成熟果皮，是十三种调味料之首，既可食用，又可入药。秋季采收，晒干，除去种子和杂质。我国花椒种质资源十分丰富，花椒产量居世界第一，应用广泛。花椒的化学成分主要有挥发油、生物碱、酰胺、脂肪酸、木脂素和香豆素等，具有多种生理功能。花椒中含有糖苷类化合物，该类化合物具有潜在的SIRT 1抑制活性，故本发明以花椒为主要研究对象，进行糖苷类化合物的发现和SIRT 1抑制活性筛选。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有SIRT 1 抑制活性的糖苷类化合物及其制备方法。
为了满足上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种具有SIRT 1 抑制活性的糖苷类化合物，其特征在于具有结构通式如下：
Figure 200329DEST_PATH_IMAGE002
其中R选自以下基团：
Figure 304420DEST_PATH_IMAGE003
Figure 84157DEST_PATH_IMAGE004
Figure 479367DEST_PATH_IMAGE005
Figure 231422DEST_PATH_IMAGE006
Figure 53884DEST_PATH_IMAGE007
Figure 320918DEST_PATH_IMAGE008
Figure 208233DEST_PATH_IMAGE009
Figure 877112DEST_PATH_IMAGE010
Figure 870476DEST_PATH_IMAGE012
其中基团R1选自以下基团：
Figure 562488DEST_PATH_IMAGE014
其中基团R2和R3各自独立的为以下基团：H、OH、OCH3；
其中基团R4选自以下基团：H、甲基、乙基、丙基；
其中化合物(e)、(f)、(g)中，6位和9位的绝对构型各自独立的为：（6R, 9R）、（6R,9S）、（6S, 9R）、（6S, 9S）。
优选的，一种具有SIRT 1 抑制活性的糖苷类化合物的制备方法，其具体步骤如下：
1）将花椒用提取溶剂进行提取，所述花椒和提取溶剂的质量比为1:3-20，得提取液，再浓缩提取液至无有机溶剂，得到总浸膏A；
2）将总浸膏A溶于水，再利用D101大孔吸附树脂柱层析，或者利用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇分别萃取，得到不同的浸膏组分；利用D101大孔吸附树脂柱层析，得到的五个不同的浸膏组分B（水）、C（30%）、D（60%）、E（80%）、F（100%）；利用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇分别萃取，得到四个不同的浸膏组分G（石油醚相）、H（乙酸乙酯相）、I（正丁醇相）和J（水相）；
3）D101大孔吸附树脂柱层析所得浸膏组分B、C、D、E、F和石油醚、乙酸乙酯、正丁醇分别萃取所得浸膏组分G、H、I、J分别进行液质联用仪（HPLC-MS/MS或UPLC-MS/MS）分析，寻找糖苷类化合物所在部位，实验发现浸膏组分C和I为糖苷类化合物部位，且化合物类型相同，对浸膏组分C和I进行SIRT 1 抑制活性实验测试，实验证实C和I均具有SIRT 1 抑制活性；
4）对浸膏组分C或者I进行硅胶柱层析，用氯仿-甲醇为洗脱剂洗脱，等份收集洗脱液，每份洗脱液采用薄板层析色谱（TLC）定性检测，合并含相同成分的洗脱液，得到六个不同的浸膏组分C-1～C-6或者I-1～I-6；
5）对浸膏C-1～C-6或者I-1～I-6进行制备HPLC分离纯化，得到活性化合物，通过核磁共振谱（NMR谱），确定活性化合物的结构。
优选的，所述步骤1）中的提取溶剂为水、甲醇/ 水的混合溶液或者乙醇/ 水混合溶液，所述甲醇的体积百分数为0-100%，所述乙醇的体积百分数为0-100%。
优选的，所述步骤1）中的提取方法有室温冷浸提取、加热回流提取、渗漏提取或超声提取。
优选的，所述步骤2）中的利用D101大孔吸附树脂柱层析，所用实验条件为用乙醇/水混合溶液或甲醇/ 水混合溶液为洗脱溶剂梯度洗脱，梯度洗脱溶剂体积比为水、30%、60%、80%、100%，不同体积比的洗脱溶剂洗脱体积为3-6倍柱体积，分别将不同体积比的洗脱液浓缩，得到五个浸膏组分。
优选的，所述步骤2）中利用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇分别萃取，所用实验方法为总浸膏A溶于水后，用等体积的石油醚萃取三次，合并石油醚萃取液，浓缩，得到石油醚相，用同样的方法分别进行乙酸乙酯和正丁醇萃取，得到乙酸乙酯相和正丁醇相，水相浓缩得到水相。
优选的，所述提取方法室温冷浸提取每次需要将花椒在提取溶剂中浸泡5-9天，浸提次数为1-4次；所述提取方法加热回流提取的加热温度为30-100℃，每次提取10-300分钟，提取次数为1-4次，所述提取方法渗漏提取需要将花椒在提取溶剂中浸泡6-24h，再置于渗漏装备；所述提取方法超声提取的提取温度为30-100℃，频率为20-100Hz，功率为70-1000W，每次提取0.1-2.0小时，提取次数为1-4次。
优选的，所述步骤3）中UPLC-MS/MS分析所用色谱柱为Waters ACQUITY UPLC®HSS C18 column (2.1×50 mm, 1.8 μm)；HPLC-MS/MS分析所用色谱柱为Hanban Sci &Tech Megres C18 column (4.6 ×250 mm, 5μm)；流动相为乙腈:0.5%冰醋酸水=A:B；乙腈: 0.5%冰醋酸水的洗脱比例：1-20min，A 2-15%；20-24min，A 15-50%；24-28 min，A 50-70%；28-32 min，A70-92%；流速为0.3 mL/ min，进样体积：2μL，检测器：PDA，检测波长：275nm，离子源：电喷雾离子源。
优选的，所述步骤4）中硅胶柱层析所用洗脱剂氯仿-甲醇中氯仿与甲醇的体积比为30:1～1:3。
优选的，所述步骤5）中制备HPLC分离所用色谱柱为半制备Benetnach C18柱（Hanban Sci & Tech, 10.0×250 mm, 10μm），流动相为甲醇-水，甲醇与水的洗脱比例为1:20～1:1，流速为2～5 mL/ min，进样体积：1-100 μL，检测器：紫外检测器，检测波长：208nm和254 nm。
本发明的有益效果为：
1、在癌症的发生发展方面，SIRT 1主要通过调节p53基因（p53基因是人体抑癌基因）进而调节癌症的发生发展过程，SIRT 1抑制剂被应用于多种癌症研究，如乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、慢性骨髓性白血病、肺癌等。具有SIRT 1 抑制活性的糖苷类化合物组分的发现及其制备方法的研究，为癌症的治疗提供了一种研究思路，为抗癌药物的研制提供了物质基础。
2、本研究方法运用HPLC-MS/MS或UPLC-MS/MS指导研究工作，实现糖苷类化合物的快速发现，节省了时间和溶剂、试剂，提高了效率。运用TLC指导研究工作，合并相同组分，提供了分离效率。
3、半制备HPLC分离纯化样品，制备单体化合物，获得高纯度（99%以上）的化合物，确定了糖苷类化合物组分的化合物类型和结构，为新药研发提供了物质基础和标准物质。
附图说明
图1为化合物1的化学式；
图2为化合物2的化学式；
图3为化合物3的化学式；
图4为化合物4的化学式；
图5为化合物5的化学式；
图6为化合物6的化学式；
图7为化合物7的化学式；
图8为化合物8的化学式；
图9为化合物9的化学式；
图10为化合物10的化学式；
图11为化合物11的化学式；
图12为化合物12的化学式；
图13为化合物13的化学式；
图14为化合物14的化学式。
具体实施方式
实施例1：糖苷类化合物组分制备方法及组分中活性成分1、2和3的分离鉴定方法，化学式如图1、2和3所示。
1）将花椒用70%的乙醇/ 水混合溶液用室温冷浸提取3次，每次5天，合并提取液，减压浓缩至无乙醇味，得总浸膏A；
2）将总浸膏A溶于水后，进行D101大孔吸附树脂柱层析，用乙醇/ 水混合溶液为洗脱溶剂梯度洗脱，洗脱溶剂体积比为水、30%、60%、80%、100%，不同体积比的洗脱溶剂洗脱体积均为3倍柱体积，分别将不同体积比的洗脱液浓缩，得到五个不同的浸膏组分B（水）、C（30%）、D（60%）、E（80%）、F（100%）；
3）浸膏组分B、C、D、E、F分别进行UPLC-MS/MS分析，寻找糖苷类化合物所在部位。实验发现，浸膏组分C为糖苷类化合物部位。
4）对浸膏组分B、C、D、E和F进行SIRT 1 抑制活性实验测试，实验证实C具有较好的SIRT 1 抑制活性。
5）对浸膏组分C进行硅胶柱层析，用氯仿-甲醇为洗脱剂梯度洗脱，氯仿与甲醇的体积比为20:1、10:1、5:1、2:1、1:1、0:1，等份收集洗脱液，每份洗脱液采用TLC定性检测，合并含相同成分的洗脱液，得到六个不同的浸膏组分C-1～C-6；
6）对浸膏C-2进行制备HPLC分离纯化，C-2（75 mg）经半制备HPLC分离（12%甲醇-水，Benetnach C18柱）分离，得到三个组份：C-2-1—C-2-3，C-2-1经半制备HPLC（8%甲醇-水，Benetnach C18柱）纯化，得到化合物1；C-2-2经半制备HPLC（12%甲醇-水，BenetnachC18柱）纯化，得到化合物2；C-2-3经半制备HPLC（12%甲醇-水，Benetnach C18柱）纯化，得到化合物3。经核磁共振波谱解析确定化合物1、2和3的结构，数据如下：
化合物1：分子式：C12H16O7；分子量272；1H NMR (MeOD, 400 MHz) δ ppm: 4.73(d, J = 7.2 Hz, H-1′), 6.69 (2H, dd, J = 6.8, 2.4 Hz, H-3, H-5), 6.96 (2H,dd, J = 6.8, 2.4 Hz, H-2, H-6), 4.73 (d, J = 7.2 Hz, H-1'), 3.41 (d, J = 7.2Hz, H-2'), 3.36 (m, H-3'), 3.41 (m, H-4'), 3.36 (m, H-5'), 3.88 (d, J = 12.0Hz, H-6'a), 3.70 (dd, J = 12.0, 4.8 Hz, H-6'b)；13C NMR (MeOD, 100 MHz) δ ppm:152.4 (C-1), 116.6 (C-2, C-6), 119.4 (C-3, C-5) , 153.8 (C-4), 103.0 (C-1′),75.0 (C-2′), 78.0 (C-3′, C-5′), 71.4 (C-4′), 62.5 (C-6′)。
化合物2：分子式：C14H20O8；分子量316；1H NMR (MeOD, 400 MHz) δ ppm: 7.10(d, J = 8.0 Hz, H-6), 6.72 (d, J = 2.0 Hz, H-3), 6.64 (dd, J = 8.0, 2.0 Hz,H-5), 4. 69 (d, J = 7.2 Hz, H-1'), 3. 88 (dd, J = 12.8, 1.6 Hz, H-6'a), 3. 70(dd, J = 12.8, 4.8 Hz, H-6'b), 3.45 (2H, dd, J = 7.2, 6.0 Hz, H-2', 3'), 3.39(2H, m, H-4', 5'), 2.70 (2H, t, J = 7.2 Hz, H-7), 3.69 (2H, t, J = 7.2 Hz, H-8)；13C NMR (MeOD, 100 MHz) δ ppm: 62.5 (C-6′), 71.4 (C-4′), 75.0 (C-2′), 78.0(C-3′, C-5′), 103.0 (C-1′), 145.3 (C-1), 148.4 (C-2), 117.7 (C-3), 136.2 (C-4), 121.4 (C-5), 119.1 (C-6), 39.7 (C-7), 64.3 (C-8)。
化合物3：分子式：C13H18O7；分子量286；1H NMR (MeOD, 400 MHz) δ ppm: 6.41(s, H-2), 6.35 (s, H-4), 6.28 (s, H-6), 6.28 (s, H-6), 2.21 (3H, s, H3-7),4.84 (d, J = 7.2 Hz, H-1'), 3.33 (m, H-2'), 3.65 (m, H-3'), 3.25 (m, H-4'),3.33 (m, H-5'), 3.90 (dd, J = 12.0, 1.2 Hz, H-6'a), 3.70 (dd, J = 12.0, 5.2Hz, H-6'b); 13C NMR (MeOD, 100 MHz) δ ppm: 160.1 (C-1), 102.2 (C-2), 159.2 (C-3), 109.7 (C-4), 141.2 (C-5), 111.2 (C-6), 21.6 (C-7), 102.2 (C-1'), 74.9 (C-2') , 78.1 (C-3') , 71.4 (C-4') , 78.0 (C-5') , 62.5 (C-6')。
实施例2：糖苷类化合物组分制备方法及组分中活性成分4、5、6和7的分离鉴定方法，化学式如图4、5、6和7所示。
1）将花椒用70%的甲醇/ 水混合溶液室温加热回流提取3次，每次加热温度为80℃，提取2.0小时，合并提取液，减压浓缩至无甲醇味，得总浸膏A；
2）将总浸膏A溶于水后，进行D101大孔吸附树脂柱层析，用甲醇/ 水混合溶液为洗脱溶剂梯度洗脱，洗脱溶剂体积比为水、30%、60%、80%、100%，不同体积比的洗脱溶剂洗脱体积均为3倍柱体积，分别将不同体积比的洗脱液浓缩，得到五个不同的浸膏组分B（水）、C（30%）、D（60%）、E（80%）、F（100%）；
3）浸膏组分B、C、D、E、F分别进行HPLC-MS/MS分析，寻找糖苷类化合物所在部位。实验发现，浸膏组分C为糖苷类化合物部位。
4）对浸膏组分B、C、D、E和F进行SIRT 1 抑制活性实验测试，实验证实C具有较好的SIRT 1 抑制活性。
5）对浸膏组分C进行硅胶柱层析，用氯仿-甲醇为洗脱剂梯度洗脱，氯仿与甲醇的体积比为10:1、5:1、3:1、2:1、1:1、0:1，等份收集洗脱液，每份洗脱液采用TLC定性检测，合并含相同成分的洗脱液，得到六个不同的浸膏组分C-1～C-6；
6）对浸膏C-3进行制备HPLC分离纯化，C-3（100 mg）经半制备HPLC分离（45%甲醇-水，Benetnach C18柱）分离，得到三个组份：C-3-1—C-3-3，C-3-1经半制备HPLC（40%甲醇-水，Benetnach C18柱）纯化，得到化合物4；C-3-2经半制备HPLC（40%甲醇-水，BenetnachC18柱）纯化，得到化合物5和6；C-3-3经半制备HPLC（40%甲醇-水，Benetnach C18柱）纯化，得到化合物7。经核磁共振波谱解析确定化合物4、5、6和7的结构，数据如下：
化合物4：分子式：C18H26O7；分子量354；1H NMR (MeOD, 400 MHz) δ ppm: 6.52(2H, s, H-3, 5), 5.94 (m, H-8), 4.90 (d, J = 17.2 Hz, H-9a),4.80 (d, J = 7.6Hz, H-1'), 3.81 (6H, s, 2,4-OMe), 3.33 (2H, d, J =7.2 Hz, H=7), 3.39 (m, H-2'), 3.47 (m, H-3'), 3.20 (m, H-4'), 3.39 (m, H-5'), 3.78 (dd, J =12.4, 1.6Hz, H-6'a), 3.66 (dd, J = 12.0, 4.8 Hz, H-6'b)；13C NMR (MeOD, 100 MHz) δ ppm:154.2 (C-2, 6), 138.7 (C-1), 138.4 (C-4), 134.7 (C-8), 116.2 (C-9), 107.5 (C-3, 5), 105.6 (C-1'), 78.3 (C-3'), 77.8 (C-5'), 75.7 (C-2'), 71.3 (C-4'), 62.6(C-6'), 57.0 (1,3-OMe), 41.4 (C-7)。
化合物5：分子式：C17H24O6；分子量324；1H NMR (MeOD, 400 MHz) δ ppm: 3.29–3.49 (6H, m, H2-7, 2', 3', 4', 5'), 3.66 (dd, J = 12.2, 4.0 Hz, H-6a'), 3.84(3H, s, H3-10), 3.85 (d, J = 12.0 Hz, H-6b'), 4.80 (m Hz, H-1'), 5.02 (br d,J = 9.2 Hz, H-9a), 5.06 (dd, J = 15.6, 1.2 Hz, H-9b), 5.94 (m, H-8), 6.71(dd, J = 8.0, 1.6 Hz, H-5), 6.81 (d, J = 1.6 Hz, H-3), 7.06 (d, J = 8.0 Hz,H-6)；13C NMR (MeOD, 100 MHz) δ ppm: 150.8 (C-2), 146.3 (C-1), 139.0 (C-4),136.4 (C-8), 122.10 (C-5), 118.3 (C-6), 115.9 (C-9), 114.1 (C-3), 103.1 (C-1'), 78.2 (C-3'), 77.8 (C-5'), 74.9 (C-2'), 71.3 (C-4'), 62.5 (C-6'), 56.7(2-OMe), 40.7 (C-7)。
化合物6：分子式：C19H32O7；分子量372；1H NMR (MeOD, 400 MHz) δ ppm: 1.97(d, J = 17.2 Hz,H-2a), 2.47 (d, J = 17.2 Hz, H-2b),5.79 (s, H-4), 1.96 (m, H-6), 1.64 (m, H-7a), 1.79 (m, H-7b), 1.62 (m, H-8a), 1.65 (m, H-8b), 3.80 (m,H-9), 1.24 (3H, d, J = 6.0 Hz, H-10), 1.00 (3H, s, H3-11), 1.08 (3H, s, H3-12), 2.03 (3H, s, H3-13), 4.31 (d, J = 7.6 Hz, H-1'), 3.10–3.49 (4H, m, 2',3', 4', 5'), 3.66 (dd, J = 12.0, 4.0 Hz, H-6a'), 3.85 (d, J = 12.0 Hz, H-6b')；13C NMR (MeOD, 100 MHz) δ ppm: 37.4 (C-1), 48.1 (C-2), 202.4 (C-3), 125.4(C-4), 169.9 (C-5), 52.5 (C-6), 26.6 (C-7), 37.4 (C-8), 77.8 (C-9), 21.9 (C-10), 29.0 (C-11), 27.5 (C-12), 25.0 (C-13), 104.0 (C-1'), 75.3 (C-2'), 78.2(C-3'), 71.7 (C-4'), 77.6 (C-5'), 62.8 (C-6')。
化合物7：分子式：C19H30O7；分子量370；1H NMR (MeOD, 400 MHz) δ ppm: 2.05(d, J = 16.8 Hz, H-2a), 2.48 (d, J = 16.8 Hz, H-2b), 5.88 (s, H-4), 2.69 (d,J = 9.2 Hz, H-6), 5.75 (dd, J = 15.2, 9.2 Hz, H-7b), 5.58 (dd, J = 15.2, 7.2Hz, H-8), 4.47 (br t, J = 6.4 Hz, H-9), 1.28 (3H, d, J = 6.4 Hz, H-10), 0.98(3H, s, H3-11), 1.02 (3H, s, H3-12), 1.98 (3H, s, H3-13), 4.28 (d, J = 7.6 Hz,H-1'), 3.10–3.49 (4H, m, 2', 3', 4', 5'), 3.62 (dd, J = 11.6, 6.4 Hz, H-6a'),3.84 (dd, J = 11.6, 2.0 Hz, H-6b')；13C NMR (MeOD, 100 MHz) δ ppm: 37.2 (C-1),48.5 (C-2), 202.0 (C-3), 126.2 (C-4), 165.7 (C-5), 56.9 (C-6), 131.2 (C-7),137.0 (C-8), 74.8 (C-9), 22.2 (C-10), 27.4 (C-11), 28.0 (C-12), 23.9 (C-13),101.2 (C-1'), 75.0 (C-2'), 78.4 (C-3'), 71.7 (C-4'), 78.2 (C-5'), 62.9 (C-6')。
实施例3：糖苷类化合物组分制备方法及组分中活性成分8、9和10的分离鉴定方法，化学式如图8、9和10所示。
1）将花椒用甲醇超声提取，提取温度为50℃，频率为40Hz，功率为500W，提1.0小时，花椒与提取溶剂的质量比为1:8，提取3次，合并提取液，再进行浓缩，干燥，得到提取物A；
2）将总浸膏A溶于水后，利用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇分别萃取。首先，将总浸膏A溶于水后，用等体积的石油醚萃取三次，合并石油醚萃取液，浓缩，得到石油醚相（G）；水相用等体积的乙酸乙酯萃取三次，合并乙酸乙酯萃取液，浓缩，得到乙酸乙酯相（H）；萃取后的水相继续用等体积的正丁醇萃取三次，合并正丁醇萃取液，浓缩，得到正丁醇相（I），水相浓缩得到水相（J）。
3）浸膏组分G、H、I、J分别进行UPLC-MS/MS分析，寻找糖苷类化合物所在部位。实验发现，浸膏组分I为糖苷类化合物部位。
4）对浸膏组分G、H、I和J进行SIRT 1 抑制活性实验测试，实验证实I具有较好的SIRT 1 抑制活性。
5）对浸膏组分I进行硅胶柱层析，用氯仿-甲醇为洗脱剂梯度洗脱，氯仿与甲醇的体积比为15:1、8:1、4:1、2:1、1:1、0:1，等份收集洗脱液，每份洗脱液采用TLC定性检测，合并含相同成分的洗脱液，得到六个不同的浸膏组分I-1～I-6；
6）对浸膏I-4进行制备HPLC分离纯化，I-4（720 mg）经半制备HPLC分离（50%甲醇-水，Benetnach C18柱）分离，得到三个组份：I-4-1—I-4-3，I-4-1经半制备HPLC（25%甲醇-水，Benetnach C18柱）纯化，得到化合物8；I-4-2经半制备HPLC（20%甲醇-水，BenetnachC18柱）纯化，得到化合物9和10。经核磁共振波谱解析确定化合物8、9和10的结构，数据如下：
化合物8：分子式：C20H24O9；分子量408；1H NMR (DMSO, 400 MHz) δ ppm: 6.23(d，J =9.2 Hz, H-3), 7.95 (d, J = 9.2 Hz, H-4), 7.49 (s, H-5), 6.83 (s, H-8),4.84 (t, J = 4.8 Hz, H-2'), 3.17 (2H, dd, J = 15.6, 4.8 Hz, H2-3'), 1.24 (3H,s, H3-5'), 1.27 (3H, s, H3-6'), 4.41 (d, J = 7.6 Hz, H-1"); 13C NMR (DMSO, 100MHz) δ ppm: 161.0 (C-2), 112.7 (C-3), 145.2 (C-4), 124.4 (C-5), 126.1 (C-6),163.6 (C-7), 97.3 (C-8), 155.5 (C-9), 111.8 (C-10), 90.6 (C-2'), 29.3 (C-3'),77.4 (C-4'), 23.0 (C-5'), 23.6 (C-6'), 97.8 (C-1"), 74.0 (C-2"), 77.0 (C-3"),70.6 (C-4"), 77.4 (C-5"), 61.4 (C-6")。
化合物9：分子式：C13H18O6；分子量270；1H NMR (MeOD, 400 MHz) δ ppm: 4.89(d, J = 12.0 Hz, H-1a), 4.62 (d, J = 12.0 Hz, H-1b), 7.37 (2H, d, J = 7.2 Hz,H-3, 7), 7.28 (2H, t, J = 7.2 Hz, H-4, 6), 7.23 (d, J = 7.2 Hz, H-5), 4.31(d, J = 7.6 Hz, H-1'), 3.18–3.30 (4H, m, 2', 3', 4', 5'), 3.86 (dd, J = 12.0,2.0 Hz, H-6'a), 3.65 (dd, J = 12.0, 5.6 Hz, H-6'a); 13C NMR (MeOD, 100 MHz) δ ppm: 71.8 (C-1), 139.1 (C-2), 129.2 (C-3), 129.3 (C-4), 128.7 (C-5), 129.3(C-6), 129.2 (C-7), 103.3 (C-1'), 75.1 (C-2'), 78.1 (C-3'), 71.7 (C-4'), 78.0(C-5'), 62.8 (C-6')。
化合物10：分子式：C11H20O6；分子量248；1H NMR (MeOD, 400 MHz) δ ppm: 5.36(td, J = 6.4, 1.2 Hz, H-2a), 4.32 (dd, J = 11.6, 6.4 Hz, H-1a), 4.27 (d, J =7.6 Hz, H-1'), 4.21 (dd, J = 11.6, 7.6 Hz, H-1b), 3.86 (dd, J = 12.0, 2.0 Hz,H-6'a), 3.66 (dd, J = 12.0, 5.6 Hz, H-6'b), 3.23 (m, H-5'), 3.30 (2H, m, H-3', H-4'), 3.16 (t, J = 8.4 Hz, H-2'), 1.75 (3H, s, H3-4), 1.69 (3H, s, H3-5)。
实施例4：糖苷类化合物组分制备方法及组分中活性成分11和12的分离鉴定方法，化学式如图11和12所示。
1）花椒用50%的乙醇/ 水为提取溶剂进行渗漏提取，将花椒在提取溶剂中浸泡20h，花椒与提取溶剂的质量比为1:15，合并提取液，再进行浓缩，干燥，得到提取物A；
2）将总浸膏A溶于水后，利用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇分别萃取。首先，将总浸膏A溶于水后，用等体积的石油醚萃取三次，合并石油醚萃取液，浓缩，得到石油醚相（G）；水相用等体积的乙酸乙酯萃取三次，合并乙酸乙酯萃取液，浓缩，得到乙酸乙酯相（H）；萃取后的水相继续用等体积的正丁醇萃取三次，合并正丁醇萃取液，浓缩，得到正丁醇相（I），水相浓缩得到水相（J）。
3）浸膏组分G、H、I、J分别进行HPLC-MS/MS分析，寻找糖苷类化合物所在部位。实验发现，浸膏组分I为糖苷类化合物部位。
4）对浸膏组分G、H、I和J进行SIRT 1 抑制活性实验测试，实验证实I具有较好的SIRT 1 抑制活性。
5）对浸膏组分I进行硅胶柱层析，用氯仿-甲醇为洗脱剂梯度洗脱，氯仿与甲醇的体积比为15:1、8:1、4:1、2:1、1:1、0:1，等份收集洗脱液，每份洗脱液采用TLC定性检测，合并含相同成分的洗脱液，得到六个不同的浸膏组分I-1～I-6；
6）对浸膏I-5进行制备HPLC分离纯化，I-5（450 mg）经半制备HPLC分离（20%甲醇-水，Benetnach C18柱）分离，得到两个组份：I-5-1—I-5-2，I-5-1经半制备HPLC（20%甲醇-水，Benetnach C18柱）纯化，得到化合物11；I-5-2经半制备HPLC（20%甲醇-水，BenetnachC18柱）纯化，得到化合物12。经核磁共振波谱解析确定化合物11和12的结构，数据如下：
化合物11：分子式：C17H24O9；分子量372；1H NMR (MeOD, 400 MHz) δ ppm: 6.74(2H, s, H-3, 5), 6.54 (d, J =15.6 Hz, H-7), 6.32 (dt, J =15.6, 5.2 Hz, H-8),4.86 (m, H-1′), 4.22 (2H, br d, J =5.2 Hz, H-9), 3.82 (6H, 2,6-OCH3×2); 13CNMR (MeOD, 100 MHz) δ ppm: 154.3 (C-2, 6), 135.9 (C-1), 135.2 (C-4), 131.3(C-8), 130.0 (C-7), 105.4(C-3, 5), 105.3 (C-1′), 78.3 (C-3′), 77.8 (C-5′),75.7 (C-2′), 71.3 (C-4′), 63.6 (C-9), 62.6 (C-6′), 57.1 (2,6-OCH3×2)。
化合物12：分子式：C18H27O8；分子量371；1H NMR (MeOD, 400 MHz) δ ppm: 2.16(d, J = 17.2 Hz, H-2a), 2.61 (d, J = 17.2 Hz, H-2b),5.86 (s, H-4), 5.85 (d, J = 15.6, Hz, H-7), 5.72 (dd, J = 15.2, 7.2 Hz, H-8), 4.53 (dd, J = 7.2, 6.4Hz, H-9), 1.27 (3H, d, J = 6.4 Hz, H-10), 1.01 (3H, s, H3-11), 1.03 (3H, s,H3-12), 1.94 (3H, s, H3-13), 4.26 (d, J = 7.6 Hz, H-1'), 3.16 (dd, 7.6, 8.8,H-2'), 3.18 (dd, 8.8, 7.6, H-3'), 3.25 (t, 7.6 Hz, H-4'), 3.24 (m, H-5'),3.62 (dd, J = 12.0, 6.4 Hz, H-6a'), 3.84 (dd, J = 11.6, 1.6 Hz, H-6b'); 13CNMR (MeOD, 100 MHz) δ ppm: 42.4 (C-1), 50.8 (C-2), 101.3 (C-3), 127.1 (C-4),167.1 (C-5), 80.0 (C-6), 133.7 (C-7), 133.8 (C-8), 74.6 (C-9), 22.2 (C-10),23.5 (C-11), 24.7 (C-12), 19.6 (C-13), 101.3 (C-1'), 75.0 (C-2'), 78.4 (C-3'), 71.7 (C-4'), 78.2 (C-5'), 62.8 (C-6')。
实施例5：糖苷类化合物组分制备方法及组分中活性成分13和14的分离鉴定方法，化学式如图13和14所示。
1）将花椒用70%的甲醇/ 水室温加热回流提取3次，每次加热温度为80℃，提取2.0小时，合并提取液，减压浓缩至无甲醇味，得总浸膏A；
2）将总浸膏A溶于水后，进行D101大孔吸附树脂柱层析，用甲醇/ 水为洗脱溶剂梯度洗脱，洗脱溶剂体积比为水、30%、60%、80%、100%，不同体积比的洗脱溶剂洗脱体积均为3倍柱体积，分别将不同体积比的洗脱液浓缩，得到五个不同的浸膏组分B（水）、C（30%）、D（60%）、E（80%）、F（100%）；
3）浸膏组分B、C、D、E、F分别进行UPLC-MS/MS分析，寻找糖苷类化合物所在部位。实验发现，浸膏组分C为糖苷类化合物部位。
4）对浸膏组分B、C、D、E和F进行SIRT 1 抑制活性实验测试，实验证实C具有较好的SIRT 1 抑制活性。
5）对浸膏组分C进行硅胶柱层析，用氯仿-甲醇为洗脱剂梯度洗脱，氯仿与甲醇的体积比为10:1、5:1、3:1、2:1、1:1、0:1，等份收集洗脱液，每份洗脱液采用TLC定性检测，合并含相同成分的洗脱液，得到六个不同的浸膏组分C-1～C-6；
6）对浸膏C-6进行制备HPLC分离纯化，C-6经半制备HPLC分离（45%甲醇-水，Benetnach C18柱）分离，得到三个组份：C-6-1—C-6-3，C-6-1经半制备HPLC（45%甲醇-水，Benetnach C18柱）纯化，得到化合物13；C-6-2经半制备HPLC（40%甲醇-水，Benetnach C18柱）纯化，得到化合物14。经核磁共振波谱解析确定化合物13和14的结构，数据如下：
化合物13：分子式：C15H20O6；分子量296；1H NMR (MeOD, 400 MHz) δ ppm: 3.31(2H, m, H2-7), 3.35-3.46 (4H, m, H-2', H-3', H-4', H-5'), 3.69 (dd, J = 11.6,5.2 Hz, H-6'a), 3.88 (dd, J = 11.6, 1.2 Hz, H-6'b), 4.84 (d, J = 7.2 Hz, H-1'), 5.00 (dd, J = 8.8, 4.4 Hz, H-9a), 5.02 (dd, J = 12.0, 1.6 Hz, H-9b),5.92 (m, H-8), 7.02 (2H, d, J = 8.8 Hz, H-2,6), 7.09 (2H, d, J = 8.8 Hz, H-3,5)；13C NMR (MeOD, 100 MHz) δ ppm: 157.6 (C-1), 139.2 (C-2,6), 130.5 (C-3,5),135.3 (C-4), 40.4 (t, C-7), 117.8 (C-8), 115.7 (C-9), 102.5 (C-1'), 75.0 (C-2'), 78.1 (C-3'), 71.4 (C-4'), 78.0 (C-5'), 62.5 (C-6')。
化合物14：分子式：C28H36O13；分子量580；1H NMR (MeOD, 400 MHz) δ ppm: 6.71(2H, s, H-2,6), 4.76 (1H, d, J = 3.2 Hz, H-7), 3.14 (m, H-8), 3.91 (d, J =6.0 Hz, H-9a), 4.28 (d, J = 8.4 Hz, H-9b), 6.65 (2H, s, H-2',6'), 4.71 (1H,d, J = 3.6 Hz, H-7'), 3.14 (m, H-8'), (d, J = 6.0 Hz, H-9'a), 4.28 (d, J =8.4 Hz, H-9'b), 3.85 (6H, s, 3,5-OCH3), 3.84 (6H, s, 3',5'-OCH3), 4.85 (m, H-1"), 3.46 (m, H-2"), 3.40 (2H, m, H-3",H-4"), 3.19 (1H, m, H-5"), 3.77 (d, J= 12.0 Hz, H-6"a), 3.65 (dd, 12.0, 5.2 Hz, H-6"b)；13C NMR (MeOD, 100 MHz) δ ppm: 139.6 (C-1), 104.9 (C-2), 154.4 (C-3), 135.6 (C-4), 154.4 (C-5), 104.9(C-6), 87.2 (C-7), 55.5 (C-8), 72.9 (C-9), 56.8 (2 X-OCH3), 133.1 (C-1'),104.6 (C-2'),149.4 (C-3'), 135.6 (C-4'), 149.4 (C-5'), 104.6 (C-6'), 87.6 (C-7'), 55.7 (C-8'), 72.9 (C-9'), 57.1 (2 x-OCH3), 105.4 (C-1"), 75.7 (C-2"),77.8 (C-3"), 71.4 (C-4"), 78.4 (C-5"), 62.6 (C-6")。

Claims (1)

1.一种具有SIRT 1 抑制活性的糖苷类化合物的制备方法，其特征在于具体步骤如下：
1）将花椒用70%的乙醇/ 水混合溶液在室温冷浸提取3次，每次5天，合并提取液，减压浓缩至无乙醇味，得总浸膏A；
2）将总浸膏A溶于水后，进行D101大孔吸附树脂柱层析，用乙醇/ 水混合溶液为洗脱溶剂梯度洗脱，洗脱溶剂体积比为0:100、30:70、60:40、80:20、100:0，不同体积比的洗脱溶剂洗脱体积均为3倍柱体积，分别将不同体积比的洗脱液浓缩，得到五个不同的浸膏组分，所述浸膏组分为洗脱溶剂体积比为0:100的B、洗脱溶剂体积比为30:70的C、洗脱溶剂体积比为60:40的D、洗脱溶剂体积比为80:20的E、洗脱溶剂体积比为100:0的F；
3）浸膏组分B、C、D、E、F分别进行UPLC-MS/MS分析，寻找糖苷类化合物所在部位，实验发现，浸膏组分C为糖苷类化合物部位；
4）对浸膏组分C进行硅胶柱层析，用氯仿-甲醇为洗脱剂梯度洗脱，氯仿与甲醇的体积比为20:1、10:1、5:1、2:1、1:1、0:1，等份收集洗脱液，每份洗脱液采用TLC定性检测，合并含相同成分的洗脱液，得到六个不同的浸膏组分C-1～C-6；
5）对浸膏C-2进行制备HPLC分离纯化，75 mg 的C-2经半制备HPLC分离，HPLC中的流动相为12%甲醇-水，分离所用的色谱柱为Benetnach C18柱，得到三个组份：C-2-1、C-2-2、C-2-3，C-2-1经半制备HPLC分离纯化，HPLC中的流动相为8%甲醇-水，分离所用的色谱柱为Benetnach C18柱纯化，得到化合物1；C-2-2经半制备HPLC分离纯化，所用流动相为12%甲醇-水、所用色谱柱为Benetnach C18柱，得到化合物2；C-2-3经半制备HPLC分离纯化，HPLC中的流动相为12%甲醇-水，分离所用的色谱柱为Benetnach C18柱，得到化合物3，经核磁共振波谱解析确定化合物1、2和3的结构为：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
、
Figure DEST_PATH_IMAGE004
和
Figure DEST_PATH_IMAGE006
。
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