CN114315924B

CN114315924B - 一种酚糖苷类化合物eyrein F、其制备方法及应用

Info

Publication number: CN114315924B
Application number: CN202111578330.5A
Authority: CN
Inventors: 王亚凤; 黄永林; 庞闹; 何瑞杰; 阳丙媛; 刘章彬
Original assignee: Guangxi Institute of Botany of CAS
Current assignee: Guangxi Institute of Botany of CAS
Priority date: 2021-12-22
Filing date: 2021-12-22
Publication date: 2023-10-03
Anticipated expiration: 2041-12-22
Also published as: CN114315924A

Abstract

本发明公开了一种酚糖苷类化合物eyrein F、其制备方法及应用，属于中药成分的提取、分离纯化技术领域。所述酚糖苷类化合物eyrein F，其化学结构式如式1所示：本发明还公开了上述酚糖苷类化合物eyrein F的制备方法及应用。本发明首次从甜槠叶子中提取得到一种全新结构的化合物，具有明显的减脂活性，可以用于制备减脂产品，既为甜槠资源的全面开发和深度利用提供新途径，也提供了减脂产品新的来源，具有积极的药学价值和广泛的社会意义。

Description

一种酚糖苷类化合物eyrein F、其制备方法及应用

技术领域

本发明涉及一种酚糖苷类化合物eyrein F、其制备方法及应用，属于中药成分的提取、分离纯化技术领域。

背景技术

脂质在生命过程的几乎所有方面都发挥着生物学作用，包括生长、发育、繁殖、衰老和寿命等，同时与脂质代谢性疾病也息息相关。人体内甘油三酯储存高、分解率低时会促进脂肪组织积累导致肥胖，甘油三酯储存和利用率同时降低时会减慢脂质在脂肪组织中的分流导致血脂异常。肥胖症、高脂血症和2型糖尿病等慢性代谢疾病的重要诱发因素之一为脂质代谢紊乱。因此，调节脂质代谢的稳态是有效防止脂质代谢疾病发生的关键所在。植物多酚以多种方式参与调控机体的胆固醇吸收、甘油三酯合成和分泌以及血浆低密度脂蛋白氧化等生理进程，在维持或改善机体脂质代谢平衡中发挥着重要作用。

天然产物是诞生治疗重大疾病药物或重要先导化合物的主要源泉，比如抗疟疾药物青蒿素、用于改善记忆力和抵御老年痴呆药物石杉碱甲、驱除蛔虫用的川楝素等药物，这些药物均具有疗效确切、副作用小，并广泛应用于临床。我国有着丰富的植物资源，这为创新药物的发现提供丰厚的物质基础。从成分复杂的植物提取物中制备功能成分，是发现有效天然药物的快捷途径，也是中药应用研究的难点。

甜槠，又称为茅丝栗、丝栗、甜锥、反刺槠、小黄橼、锥子、曹槠、槠柴、酸椽槠等，为壳斗科锥属植物。该植物在民间常作为药材使用，具有清热去火、消肿止痛，预防慢性疾病等功效，但其是否具备减脂功效尚未有研究报道。此外，也没有从甜槠叶子中发现高活性成分的研究报道。鉴于此，有必要针对甜槠叶子中的高活性目标成分建立一种简单快捷的分离纯化方法。

发明内容

本发明的目的之一，是提供一种酚糖苷类化合物eyrein F。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种酚糖苷类化合物eyrein F，其化学结构式如式1所示：

本发明的酚糖苷类化合物eyrein F的原理说明：

式1所示的化合物中，含有咖啡酰基、没食子酰基和三羟基苯甲醇等小分子活性基团。上述小分子活性基团具有丰富的生物活性，能够通过化学反应形成新功能活性物质。此外，又引入了糖苷基团，增加该化合物的极性，容易通过水解形成新的活性小分子基团，容易被人体吸收，又可快速代谢。通过线虫减脂模型试验也进一步验证了该化合物具有较好的减脂活性。

本发明的酚糖苷类化合物eyrein F的有益效果是：

本发明首次从甜槠叶子中提取得到一种全新结构的化合物，命名为eyrein F。经动物试验发现，该化合物具有明显的减脂活性，可以用于制备减脂产品，既为甜槠资源的全面开发和深度利用提供新途径，也提供了减脂产品新的来源，具有积极的药学价值和广泛的社会意义。

本发明的目的之二，是提供上述酚糖苷类化合物eyrein F的制备方法。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：上述酚糖苷类化合物eyrein F的制备方法，包括如下步骤：

步骤1：制备甜槠叶子粗提物

取新鲜的甜槠树叶，清洗，剪碎或干燥后粉碎，进行提取，过滤，取滤液，减压中低温浓缩，得到甜槠粗提物A；

步骤2：制备富含eyrein F的提取物B

将步骤1得到的甜槠粗提物A过凝胶柱层析，进行梯度洗脱，收集洗脱液，减压中低温浓缩，得到富含eyrein F的提取物B；

步骤3：制备提取物C

将步骤2得到的富含eyrein F的提取物B过树脂柱层析，进行梯度洗脱，收集洗脱液并经薄层色谱检测，再减压中低温浓缩，得到提取物C；

步骤4：制备酚糖苷类化合物eyrein F

将步骤3得到的提取物C过疏水柱层析，进行梯度洗脱，收集洗脱液并经薄层色谱检测，再减压中低温浓缩，干燥后，即得到如式1所示的目标化合物酚糖苷类化合物eyreinF。

本发明的酚糖苷类化合物eyrein F的制备方法的原理是：

本发明根据相似相溶原理通过极性溶剂提取甜槠叶子中的酚糖苷类化合物。先根据该类化合物分子量大小，进行相近分子量化合物的初步富集，然后根据小孔树脂离子作用力进行交换分离，进行目标化合物的初步富集，最后利用疏水层析材料除去与目标化合物等电点及分子量相近的少量杂质，进而得到高纯度的酚糖苷类化合物eyrein F。

本发明的酚糖苷类化合物eyrein F的制备方法的有益效果是：

1、本发明首次以甜槠叶子为原料，利用分子筛和离子交换可快速有效的富集到目标化合物，利用薄层色谱检测补充柱层析的不足，最后通过疏水层析柱可有效去除杂质得到纯度为90％以上的酚糖苷类化合物eyrein F。

2、本发明的制备方法，操作容易，原料易得，成本低廉，市场前景广阔，适合规模化推广应用。

在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。

进一步，步骤1中，所述剪碎的长度为1-2cm，所述干燥的温度为30℃，时间为2d；所述粉碎的粒径20-60目。

采用上述进一步的有益效果是：剪碎或者粉碎采用上述参数，更有利于后续酚糖苷类化合物eyrein F的提取。

进一步，步骤1中，所述提取采用常温浸提、加热提取和超声提取中的任意一种。

采用上述进一步的有益效果是：采用上述提取方式，能将甜槠叶子中的酚糖苷类化合物eyrein F成分提取出来。

更进一步，所述常温浸提的具体方法是：在剪碎或者粉碎后的原料中，加入剪碎或者粉碎后的原料7-15倍重量的体积浓度为80％-100％的甲醇水溶液或者体积浓度为80％-100％的乙醇水溶液，于室温提取，每次1d，共3-4次。

采用上述更进一步的有益效果是：采用上述提取方式，能将甜槠叶子中的酚糖苷类化合物eyrein F成分提取出来。

更进一步，所述加热提取的具体方法是：在剪碎或者粉碎后的原料中，加入剪碎或者粉碎后的原料5-15倍重量的体积浓度为80％-100％的甲醇水溶液或者体积浓度为80％-100％的乙醇水溶液，于25℃-40℃提取，每次3h-7h，共2-4次。

更进一步，所述超声提取的具体方法是：在剪碎或者粉碎后的原料中，加入剪碎或者粉碎后的原料5-10倍重量的体积浓度为80％-100％的甲醇水溶液或者体积浓度为80％-100％的乙醇水溶液，采用功率为100W，频率为40kHz-80kHz超声提取，每次30min-45min，共3次。

进一步，步骤1中，所述减压中低温浓缩的压力为45KPa-100KPa，温度≤50℃。

采用上述进一步的有益效果是：减压浓缩采用上述参数，避免温度过高使化合物结构发生变化。

进一步，步骤2中，所述凝胶柱层析采用羟丙基葡聚糖凝胶色谱柱Sephadex LH-20，规格为6cm×80cm，填料粒径为25μm-165μm。

采用上述进一步的有益效果是：采用羟丙基葡聚糖凝胶色谱柱Sephadex LH-20，可以使目标化合物得到初步富集，除去提取物中分子量较大或者较小的其它化合物。

上述羟丙基葡聚糖凝胶色谱柱Sephadex LH-20购自美国GE公司。

进一步，步骤2中，所述梯度洗脱具体为：采用1-2倍柱体积的体积浓度为0％-100％的甲醇水溶液作为洗脱剂，每20％体积浓度为一个梯度，每0.1L为一个流份，洗脱速度≤3mL/min。

采用上述进一步的有益效果是：不同的洗脱浓度使不同分子量的化合物得到富集，根据分子量大小初步富集目标化合物，该洗脱速度和流份比例可以提高目标化合物分离效率。

进一步，步骤2中，所述减压中低温浓缩的压力为45KPa-100KPa，温度≤50℃。

采用上述进一步的有益效果是：减压浓缩采用上述参数，可以使溶剂快速有效的除去，同时避免温度过高使化合物的结构发生变化。

进一步，步骤3中，所述树脂柱采用小孔树脂DiaionHP20ss，规格为4cm×60cm，填料粒径为75μm-150μm。

采用上述进一步的有益效果是：采用上述小孔树脂，可以提高目标化合物的纯度。

上述DiaionHP20SS购自日本三菱化学。

进一步，步骤3中，所述梯度洗脱具体为：采用2-3倍柱体积的体积浓度为0％-100％的甲醇水溶液作为洗脱剂，每10％体积浓度为一个梯度，每0.01L为一个流份，洗脱速度≤2mL/min，收集体积浓度为60％-70％的甲醇水溶液的洗脱液。

采用上述进一步的有益效果是：不同的洗脱浓度使不同极性不同类型的化合物有效富集，同时除去少量杂质，该洗脱速度和流份比例可以提高目标化合物分离效率。

进一步，步骤3中，所述薄层色谱检测具体为：硅胶GF₂₅₄板，展开剂为V_甲苯：V_甲酸乙酯：V_甲酸＝1:7:1，直立上行展开，显色剂为质量浓度为1％的FeCl₃-乙醇溶液，显蓝紫色且比移值Rf为0.58的洗脱部位，即为提取物C流份。

采用上述进一步的有益效果是：采用上述参数，可以收集得到提取物C流份。

比移值Rf，是指薄层色谱法中原点到斑点中心的距离与原点到溶剂前沿的距离的比值。

进一步，步骤3中，所述减压中低温浓缩的压力为45KPa-100KPa，温度≤50℃。

进一步，步骤4中，所述疏水柱采用Butyl-650C吸附柱，规格为1.5cm×30cm，填料粒径为65μm或者100μm。

采用上述进一步的有益效果是：采用上述疏水柱，可以除去微量杂质，进一步提高目标化合物的纯度，化合物结构稳定。

上述Butyl-650C吸附柱购自日本TOSOH公司。

进一步，步骤4中，所述梯度洗脱具体为：采用2-3倍柱体积的体积浓度为20％-80％的甲醇水溶液作为洗脱剂，每10％体积浓度为一个梯度，每0.006L为一个流份，洗脱速度为≤2mL/min，收集体积浓度为20％-30％的甲醇水溶液的洗脱液。

采用上述进一步的有益效果是：疏水层析柱Butyl-650C能有效分离与目标化合物等电点且分子量相近的化合物，该洗脱速度和流份比例可以提高杂质与目标化合物分离率。

进一步，步骤4中，所述薄层色谱检测具体为：硅胶GF₂₅₄板，展开剂为V_甲苯：V_甲酸乙酯：V_甲酸＝1:7:1，直立上行展开，显色剂为质量浓度为1％的FeCl₃-乙醇溶液，显蓝紫色且比移值Rf为0.8的洗脱部位，即为目标化合物流份。

采用上述进一步的有益效果是：采用上述参数，可以收集得到目标化合物流份。

进一步，步骤4中，所述减压中低温浓缩的压力为45KPa-100KPa，温度≤50℃。

进一步，步骤4中，所述干燥是指在50℃干燥至含水率≤5wt％。

采用上述进一步的有益效果是：采用上述参数，可以得到符合要求的产品。

本发明的目的之三，是提供上述酚糖苷类化合物eyrein F或其可药用盐在制备减脂产品中的应用。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：上述酚糖苷类化合物eyrein F或其可药用盐在制备减脂产品中的应用。

本申请的发明人进行了药理学研究，结果显示，采用本发明的酚糖苷类化合物eyrein F处理L1期的秀丽隐杆线虫48h达到L4晚期，用10×镜头记录各重复实验组每一条线虫完整的脂滴所激发的总荧光，Image J计算平均荧光强度，综合评价eyrein F对其脂滴生成的影响。经过多次重复实验，结果均显示总荧光强度极显著低于未处理组线虫，总荧光强度下降最大可达37.6％，平均荧光强度下降最大可达26.7％。验证实验中，mCherry线虫重复上述实验，结果显示总荧光强度下降18.2％，平均荧光强度下降6.7％，线虫长度显著小于未处理组，100×发现脂滴面积显著变小，低荧光探针的表达提示该化合物可能增加脂肪的消耗；该实验结果显示本发明的酚糖苷类化合物eyrein F具有明显的减脂活性，可应用于制备减脂产品。

本发明的酚糖苷类化合物eyrein F在制备减脂产品中的应用的有益效果是：

经动物试验研究发现，本发明的酚糖苷类化合物eyrein F具有明显的减脂活性，可以用于制备减脂产品，能显著降低减脂产品的副作用，同时也有较高的减肥效率，市场前景广阔，适合规模化推广应用。

在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。

进一步，所述减脂产品为药物制剂。

采用上述进一步的有益效果是：本发明的酚糖苷类化合物eyrein F或其可药用盐可用于制备减脂产品，这些减脂产品是药物制剂。

更进一步，所述药物制剂包括上述酚糖苷类化合物eyrein F或其可药用盐和药学上可接受的载体。

采用上述更进一步的有益效果是：酚糖苷类化合物eyrein F或其可药用盐作为有效成分，具有明显的减脂活性，可以和药学上可接受的载体一起，制成减脂药物，用于治疗肥胖症。

更进一步，所述载体为缓释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂和润滑剂中的任意一种或两种以上的混合物。

采用上述进一步的有益效果是：上述种类的载体，有利于药物释放、提高用药量准确性，增加药用的稳定性。

更进一步，所述药物制剂的剂型为口服剂、膏剂、糊剂、涂剂、凝胶剂、胶囊剂和喷雾剂中的任意一种。

采用上述进一步的有益效果是：本发明的减脂药物可以制成多种剂型，适用于多种给药途径，更方便不同的病患者使用。

附图说明

图1为本发明实施例1制备得到的酚糖苷类化合物eyrein F的¹H NMR谱；

图2为本发明实施例1制备得到的酚糖苷类化合物eyrein F的¹³C NMR谱；

图3为本发明的实验例中，10×油红O脂滴染色图；

图4为本发明的实验例中，10×GFP荧光图像；

图5为本发明的实验例中，100×油红O脂滴染色图；

图6为本发明的实验例中，100×GFP荧光图像。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

实施例1

本实施例的酚糖苷类化合物eyrein F的制备方法，包括如下步骤：

步骤1：制备甜槠叶子粗提物

取2kg新鲜的甜槠树叶，清洗，剪至长度为1-2cm的碎片，加入14kg体积浓度为80％的甲醇水溶液，于室温提取，每次1d，共3次；合并3次提取滤液，过滤去掉残渣，滤液在100KPa，45℃条件下浓缩，得到甜槠粗提物A。

步骤2：制备富含eyrein F的提取物B

将步骤1得到的甜槠粗提物A过羟丙基葡聚糖凝胶色谱柱Sephadex LH-20层析，规格为6cm×80cm，填料粒径为25μm-165μm。采用1-2倍柱体积的体积浓度为0％-100％的甲醇水溶液作为洗脱剂，进行梯度洗脱，以纯水开始，每20％体积浓度为一个梯度，每0.1L为一个流份，洗脱速度≤3mL/min，收集洗脱液。在100KPa，45℃条件下浓缩，得到富含eyrein F的提取物B。

步骤3：制备提取物C

将步骤2得到的富含eyrein F的提取物B过小孔树脂Diaion HP 20ss层析，规格为4cm×60cm，填料粒径为75μm-150μm。采用2-3倍柱体积的体积浓度为0％-100％的甲醇水溶液作为洗脱剂，进行梯度洗脱，每10％体积浓度为一个梯度，每0.01L为一个流份，洗脱速度≤2mL/min，收集体积浓度为60％-70％的甲醇水溶液的洗脱液，并经薄层色谱检测，具体为：硅胶GF₂₅₄板，展开剂为V_甲苯：V_甲酸乙酯：V_甲酸＝1:7:1，直立上行展开，显色剂为质量浓度为1％的FeCl₃-乙醇溶液，显蓝紫色且比移值Rf为0.58的洗脱部位，即为提取物C流份。再在100KPa，45℃条件下浓缩，得到提取物C。

步骤4：制备酚糖苷类化合物eyrein F

将步骤3得到的提取物C过Butyl-650C吸附柱层析，规格为1.5cm×30cm，填料粒径为65μm或者100μm。采用2-3倍柱体积的体积浓度为20％-80％的甲醇水溶液作为洗脱剂，进行梯度洗脱，每10％体积浓度为一个梯度，每0.006L为一个流份，洗脱速度为≤2mL/min，收集体积浓度为20％-30％的甲醇水溶液的洗脱液，并经薄层色谱检测，具体为：硅胶GF₂₅₄板，展开剂为V_甲苯：V_甲酸乙酯：V_甲酸＝1:7:1，直立上行展开，显色剂为质量浓度为1％的FeCl₃-乙醇溶液，显蓝紫色且比移值Rf为0.8的洗脱部位，即为目标化合物流份。再在100KPa，45℃条件下浓缩，在50℃干燥至含水率≤5wt％，即得到目标化合物。

目标化合物的结构鉴定：

化合物的¹H NMR和¹³C NMR数据，如表1所示。¹H NMR谱，如图1所示，¹³C NMR谱，如图2所示。

表1实施例1化合物的¹H NMR和¹³C NMR数据(测试溶剂：氘代丙酮)

在254nm波长紫外灯下有吸收，与1％三氯化铁-乙醇溶液反应呈现蓝紫色，提示有苯酚基团。高分辨质谱HR-ESI-MS给出m/z：631.1452[M-H]^-的准分子离子峰，提示其相对分子质量为632。

结合¹HNMR和¹³CNMR波谱数据，确定其分子式为C₂₉H₂₈O₁₆，不饱和度Ω＝16。根据¹HNMR数据δ:7.54ppm(1H，d，J＝15.9Hz)，7.13ppm(1H，d，J＝2.0Hz)，6.98ppm(1H，dd，J＝2.0,8.2Hz)，6.83ppm(1H，d，J＝8.2Hz)，6.29ppm(1H，d，J＝15.9Hz)推断化合物含有1，3，4取代的苯环结构，同时偶合常数15.9Hz为反式双键，因此推测反式咖啡酸的存在。δH:7.15ppm(2H，s)代表没食子酰基质子信号，6.48ppm代表苯环间位氢，由于苯环无给电子基团影响，化学位移略偏高场。3.54-4.69ppm为葡萄糖对应质子的信号，偶合常数7.6Hz证实葡萄糖为β构型。碳谱中δC:126.9(C-1”')，114.8(C-2”')，146.2(C-3”')，148.9(C-4”')，116.2(C-5”')，122.6(C-6”')，146.4(C-7”')，114.6(C-8”')，167.7(C-9”')则对应反式咖啡酸基团，没食子酰基的碳原子信号分别为δ:120.9(C-1”)，109.9(C-2”，6”)，139.0(C-4”)，145.9(C-3”，5”)和167.2(C-7”)，苯环的碳原子信号则为δ:135.2(C-1)，108.1(C-2，6)，133.6(C-4)，150.7(C-3，5)。根据HSQC波谱可知，δH:7.15ppm(H-2”，6”)对应δC:109.9ppm(C-2”,6”)，δH:6.48ppm对应δC:108.1ppm(C-2,6)，δH:5.01ppm(2H，s)对应δC:66.0ppm，推测5.01ppm为亚甲基质子信号峰。通过HMBC波谱可得知，葡萄糖6位质子信号：4.69ppm(1H，dd，J＝1.9，12.1Hz，H-6'a)和4.34ppm(1H，dd，J＝5.8，12.1Hz，H-6'b)同时与167.2ppm(C-7”)相关，证明没食子酰基与葡萄糖6位相连，葡萄糖1位氢δH:4.64ppm(H-1')与苯环4位碳δC:133.6ppm(C-4)相关，证明葡萄糖1位连在苯环的4位上。亚甲基上的氢δH:5.01ppm(H-7)同时与δC:108.1ppm(C-2,6)、135.2ppm(C-1)、167.7ppm(C-9”)相关，证实亚甲基与咖啡酸的羧基、苯环1位同时相连。通过以上分析，确定化合物结构如式1所示。

本发明命名上述化合物为酚糖苷类化合物eyrein F。

实施例2

步骤1：制备甜槠叶子粗提物

取1.5kg新鲜的甜槠树叶，清洗，在30℃干燥2d，粉碎至粒径20目，加入8kg体积浓度为90％的甲醇水溶液，于25℃提取，每次7h，共2次；合并2次提取滤液，过滤去掉残渣，滤液在45KPa，50℃条件下浓缩，得到甜槠粗提物A。

步骤2：制备富含eyrein F的提取物B

将步骤1得到的甜槠粗提物A过羟丙基葡聚糖凝胶色谱柱Sephadex LH-20层析，规格为6cm×80cm，填料粒径为25μm-165μm。采用1-2倍柱体积的体积浓度为0％-100％的甲醇水溶液作为洗脱剂，进行梯度洗脱，以纯水开始，每20％体积浓度为一个梯度，每0.1L为一个流份，洗脱速度≤3mL/min，收集洗脱液。在60KPa，40℃条件下浓缩，得到富含eyrein F的提取物B。

步骤3：制备提取物C

将步骤2得到的富含eyrein F的提取物B过小孔树脂Diaion HP 20ss层析，规格为4cm×60cm，填料粒径为75μm-150μm。采用2-3倍柱体积的体积浓度为0％-100％的甲醇水溶液作为洗脱剂，进行梯度洗脱，每10％体积浓度为一个梯度，每0.01L为一个流份，洗脱速度≤2mL/min，收集体积浓度为60％-70％的甲醇水溶液的洗脱液，并经薄层色谱检测，具体为：硅胶GF₂₅₄板，展开剂为V_甲苯：V_甲酸乙酯：V_甲酸＝1:7:1，直立上行展开，显色剂为质量浓度为1％的FeCl₃-乙醇溶液，显蓝紫色且比移值Rf为0.58的洗脱部位，即为提取物C流份。再在60KPa，40℃条件下浓缩，得到提取物C。

步骤4：制备酚糖苷类化合物eyrein F

将步骤3得到的提取物C过Butyl-650C吸附柱层析，规格为1.5cm×30cm，填料粒径为65μm或者100μm。采用2-3倍柱体积的体积浓度为20％-80％的甲醇水溶液作为洗脱剂，进行梯度洗脱，每10％体积浓度为一个梯度，每0.006L为一个流份，洗脱速度为≤2mL/min，收集体积浓度为20％-30％的甲醇水溶液的洗脱液，并经薄层色谱检测，具体为：硅胶GF₂₅₄板，展开剂为V_甲苯：V_甲酸乙酯：V_甲酸＝1:7:1，直立上行展开，显色剂为质量浓度为1％的FeCl₃-乙醇溶液，显蓝紫色且比移值Rf为0.8的洗脱部位，即为目标化合物流份。再在60KPa，40℃条件下浓缩，在50℃干燥至含水率≤5wt％，即得到目标化合物。

目标化合物的结构鉴定同实施例1。

实施例3

步骤1：制备甜槠叶子粗提物

取1.5kg新鲜的甜槠树叶，清洗，在30℃干燥2d，粉碎至粒径40目，加入12kg体积浓度为80％的甲醇水溶液，采用功率为100W，频率为60kHz超声提取，每次45min，共3次；合并3次提取滤液，过滤去掉残渣，滤液在80KPa，45℃条件下浓缩，得到甜槠粗提物A。

步骤2：制备富含eyrein F的提取物B

将步骤1得到的甜槠粗提物A过羟丙基葡聚糖凝胶色谱柱Sephadex LH-20层析，规格为6cm×80cm，填料粒径为25μm-165μm。采用1-2倍柱体积的体积浓度为0％-100％的甲醇水溶液作为洗脱剂，进行梯度洗脱，以纯水开始，每20％体积浓度为一个梯度，每0.1L为一个流份，洗脱速度≤3mL/min，收集洗脱液。在80KPa，45℃条件下浓缩，得到富含eyrein F的提取物B。

步骤3：制备提取物C

将步骤2得到的富含eyrein F的提取物B过小孔树脂DiaionHP20ss层析，规格为4cm×60cm，填料粒径为75μm-150μm。采用2-3倍柱体积的体积浓度为0％-100％的甲醇水溶液作为洗脱剂，进行梯度洗脱，每10％体积浓度为一个梯度，每0.01L为一个流份，洗脱速度≤2mL/min，收集体积浓度为60％-70％的甲醇水溶液的洗脱液，并经薄层色谱检测，具体为：硅胶GF₂₅₄板，展开剂为V_甲苯：V_甲酸乙酯：V_甲酸＝1:7:1，直立上行展开，显色剂为质量浓度为1％的FeCl₃-乙醇溶液，显蓝紫色且比移值Rf为0.58的洗脱部位，即为提取物C流份。再在80KPa，45℃条件下浓缩，得到提取物C。

步骤4：制备酚糖苷类化合物eyrein F

将步骤3得到的提取物C过Butyl-650C吸附柱层析，规格为1.5cm×30cm，填料粒径为65μm或者100μm。采用2-3倍柱体积的体积浓度为20％-80％的甲醇水溶液作为洗脱剂，进行梯度洗脱，每10％体积浓度为一个梯度，每0.006L为一个流份，洗脱速度为≤2mL/min，收集体积浓度为20％-30％的甲醇水溶液的洗脱液，并经薄层色谱检测，具体为：硅胶GF₂₅₄板，展开剂为V_甲苯：V_甲酸乙酯：V_甲酸＝1:7:1，直立上行展开，显色剂为质量浓度为1％的FeCl₃-乙醇溶液，显蓝紫色且比移值Rf为0.8的洗脱部位，即为目标化合物流份。再在80KPa，45℃条件下浓缩，在50℃干燥至含水率≤5wt％，即得到目标化合物。

目标化合物的结构鉴定同实施例1。

实验例：酚糖苷类化合物eyrein F对隐杆秀丽线虫减脂实验

人体内脂肪代谢的调节涉及大脑中枢与体内脂肪储存和分解部位之间的信号传递，代谢过程非常复杂。因此，较低等且较不复杂的生物体在提供有关脂质代谢的基本调控时会显得更简单和清晰。线虫的脂肪调节基因与哺乳动物基因同源，在整个动物水平上遗传易操纵且脂滴可视化。因此，缺乏部分脂质调控信号因子的秀丽隐杆线虫相比于肥胖表型的突变小鼠是更好的研究减脂模型。

步骤1：线虫同步化

(1)取含大量产卵期成虫的N2(秀丽隐杆线虫)线虫1-2板，加入2mL M9缓冲液冲洗，吸取到15mL离心管中，重复3次；

(2)2000rpm离心2min(当板上大肠杆菌含量偏多或染杂菌时，静置2min，缓慢取上层浑浊液体，去除大量菌液)；

(3)弃上清(用枪头缓慢吸)，加入3mL次氯酸盐裂解液混匀；

(4)持续涡旋震荡，显微镜下观察直至无虫清液(含大量虫卵、少许线虫残骸)，加入3倍体积缓冲液稀释；

(5)6000rpm离心5min，弃上清(尽可能吸出液体)，加入5mL缓冲液，震荡混匀，6000rpm离心5min；重复2次；

(6)弃上清，留100-500μl，震荡摇匀(悬浮虫卵)，吸出至不含OP50的NGM平板边缘，吹干放置20℃培养。

步骤2：药物溶液配制

称取实施例1制备得到的酚糖苷类化合物eyrein F 10mg，加入DMSO(Dimethylsulfoxid)500μl溶解，震荡摇匀，过夜充分溶解。

步骤3：减脂实验方法

(1)取过夜培养的E.coliOP50(尿嘧啶缺陷大肠杆菌)菌液，8000prm离心10min，吸弃上清液；

(2)将OP50沉淀重新悬浮在M9缓冲液中，8000prm离心5min，弃上清取沉淀，重复洗涤两次；

(3)最后一次洗涤后，吸出剩余的水，确定沉淀的重量；

(4)将沉淀完全重悬于M9，配制成浓度为100mg/mL的溶液，储存于4℃备用；

(5)取20℃孵化12h的L1期秀丽隐杆线虫，使用M9缓冲液冲洗平板，用Millipore11μm滤膜过滤得到L1期线虫；

(6)使用体式镜计数10μl液滴中的线虫数量，确定溶液中的线虫浓度并用M9调节至10条/10μl。每个样品至少重复计数3次；

(7)取制备的OP50溶液5μl、线虫溶液30μl和M9溶液164μl混匀199μl；

(8)将199μl线虫/OP50溶液转移到96孔板的每个孔中(使用底部透明易观察的96孔板，移液时确保线虫处于悬浮状态)；

(9)添加已制备确定浓度的药物：吸取前将药物在微板摇床上摇匀，每孔添加1μl药物，记录好编号，每个样品3个平行；

(10)加药后用胶带封口膜封板，在微板摇床上摇2-3分钟，避免污染和蒸发。将板放回20℃的培养箱孵育2天，直到线虫达到L4(不能超过年轻成虫)阶段。

步骤4：指标测量

(1)培养48h后，观察发现对照组线虫处于L4晚期，准备制片显微镜拍照；

(2)制片：使用1mL枪头吸取溶解后的2％琼脂糖溶液，滴一滴至载玻片，立即覆盖另一块载玻片压片，琼脂糖冷却凝固后，取下盖玻片，形成一块表面含均匀透明琼脂平面的载玻片；

(3)使用巴氏吸管将经药物处理的线虫从96孔板中吸出，滴在干净的平板上。吸取解冻后的左旋咪唑溶液10μl滴在载玻片的琼脂糖薄层上，使用pick挑针挑取线虫30条至左旋咪唑溶液中，加上盖玻片；

(4)用10×的镜头拍下完整的线虫荧光图片。部分线虫使用100×镜头拍下清晰脂滴荧光图片。如图3-图6所示。

(5)ImageJ软件处理：将原始图片转换成8bit的灰度图，校正光密度，选择测量单位象素，测量荧光数值，记录数据并计算。同时采取ImageJ手工测量线虫长度和宽度，长度和宽度分别以头部至尾部、阴户处为标准测量距离。每次测量3组数据取平均值。

(6)采用Execl处理数据，GraphPadPrism8进行统计学分析。荧光图片主要分析线虫总荧光强度，辅助对比平均荧光强度，计算增长或下降幅度，对脂滴的积累进行显著性分析；线虫长度与宽度数据结合实际图片，对线虫脂滴量的多少进行显著性分析。

步骤5：结果分析

初步实验结果显示，酚糖苷类化合物eyrein F处理线虫48h后，总荧光强度下降20％，且平均荧光强度呈下降趋势，幅度低于总荧光强度，线虫脂滴面积减小。

经同样的方案处理线虫48h达到L4晚期至年轻成虫状态时，在拍摄10×GFP荧光图片的同时拍摄对应的DIC图片，计算平均荧光强度，观察并分析酚糖苷类化合物eyrein F是否具备减脂的潜力。

重复实验结果显示酚糖苷类化合物eyrein F处理线虫48h后总荧光强度下降37.6％，平均荧光强度下降26.7％。

步骤6：减脂实验结果验证

mCherry线虫重复上述实验，在拍摄10×GFP荧光和DIC图片时，记录100×线虫脂滴荧光图片，观察脂滴数量与大小。分别手动测量线虫的长度与宽度，进一步分析酚糖苷类化合物eyrein F是否具有减脂功效。实验结果显示总荧光强度下降18.2％，平均荧光强度下降6.7％，线虫长度显著小于未处理组，100×发现脂滴面积显著变小，低荧光探针的表达提示酚糖苷类化合物eyrein F能增加脂肪的消耗。该实验结果显示本发明的酚糖苷类化合物eyrein F具有明显的减脂活性，可应用于制备减脂产品。

所述减脂产品为药物制剂。本发明的酚糖苷类化合物eyrein F或其可药用盐可用于制备减脂产品，这些减脂产品是药物制剂。

所述药物制剂包括酚糖苷类化合物eyrein F或其可药用盐和药学上可接受的载体。酚糖苷类化合物eyrein F或其可药用盐作为有效成分，具有明显的减脂活性，可以和药学上可接受的载体一起，制成减脂药物，用于治疗肥胖症。

所述载体为缓释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂和润滑剂中的任意一种或两种以上的混合物。上述种类的载体，有利于药物释放、提高用药量准确性，增加药用的稳定性。

所述药物制剂的剂型为口服剂、膏剂、糊剂、涂剂、凝胶剂、胶囊剂和喷雾剂中的任意一种。本发明的减脂药物可以制成多种剂型，适用于多种给药途径，更方便不同的病患者使用。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种酚糖苷类化合物eyrein F，其特征在于，其化学结构式如式1所示：

2.权利要求1所述的酚糖苷类化合物eyrein F的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1：制备甜槠叶子粗提物

步骤2：制备富含eyrein F的提取物B

步骤3：制备提取物C

步骤4：制备酚糖苷类化合物eyrein F

将步骤3得到的提取物C过疏水柱层析，进行梯度洗脱，收集洗脱液并经薄层色谱检测，再减压中低温浓缩，干燥后，即得到如式1所示的目标化合物酚糖苷类化合物eyrein F。

3.根据权利要求2所述的酚糖苷类化合物eyrein F的制备方法，其特征在于，步骤1中，所述剪碎的长度为1-2cm，所述干燥的温度为30℃，时间为2d；所述粉碎的粒径20-60目；所述提取采用常温浸提、加热提取和超声提取中的任意一种；所述减压中低温浓缩的压力为45KPa-100KPa，温度≤50℃。

4.根据权利要求3所述的酚糖苷类化合物eyrein F的制备方法，其特征在于，所述常温浸提的具体方法是：在剪碎或者粉碎后的原料中，加入剪碎或者粉碎后的原料7-15倍重量的体积浓度为80％-100％的甲醇水溶液或者体积浓度为80％-100％的乙醇水溶液，于室温提取，每次1d，共3-4次；

所述加热提取的具体方法是：在剪碎或者粉碎后的原料中，加入剪碎或者粉碎后的原料5-15倍重量的体积浓度为80％-100％的甲醇水溶液或者体积浓度为80％-100％的乙醇水溶液，于25℃-40℃提取，每次3h-7h，共2-4次；

所述超声提取的具体方法是：在剪碎或者粉碎后的原料中，加入剪碎或者粉碎后的原料5-10倍重量的体积浓度为80％-100％的甲醇水溶液或者体积浓度为80％-100％的乙醇水溶液，采用功率为100W，频率为40kHz-80kHz超声提取，每次30min-45min，共3次。

5.根据权利要求2所述的酚糖苷类化合物eyrein F的制备方法，其特征在于，步骤2中，所述凝胶柱层析采用羟丙基葡聚糖凝胶色谱柱Sephadex LH-20，规格为6cm×80cm，填料粒径为25μm-165μm；

所述梯度洗脱具体为：采用1-2倍柱体积的体积浓度为0％-100％的甲醇水溶液作为洗脱剂，每20％体积浓度为一个梯度，每0.1L为一个流份，洗脱速度≤3mL/min；

所述减压中低温浓缩的压力为45KPa-100KPa，温度≤50℃。

6.根据权利要求2所述的酚糖苷类化合物eyrein F的制备方法，其特征在于，步骤3中，所述树脂柱采用小孔树脂Diaion HP 20ss，规格为4cm×60cm，填料粒径为75μm-150μm；

所述梯度洗脱具体为：采用2-3倍柱体积的体积浓度为0％-100％的甲醇水溶液作为洗脱剂，每10％体积浓度为一个梯度，每0.01L为一个流份，洗脱速度≤2mL/min，收集体积浓度为60％-70％的甲醇水溶液的洗脱液；

所述薄层色谱检测具体为：硅胶GF₂₅₄板，展开剂为V_甲苯：V_甲酸乙酯：V_甲酸＝1:7:1，直立上行展开，显色剂为质量浓度为1％的FeCl₃-乙醇溶液，显蓝紫色且比移值Rf为0.58的洗脱部位，即为提取物C流份；

所述减压中低温浓缩的压力为45KPa-100KPa，温度≤50℃。

7.根据权利要求2所述的酚糖苷类化合物eyrein F的制备方法，其特征在于，步骤4中，所述疏水柱采用Butyl-650C吸附柱，规格为1.5cm×30cm，填料粒径为65μm或者100μm；

所述梯度洗脱具体为：采用2-3倍柱体积的体积浓度为20％-80％的甲醇水溶液作为洗脱剂，每10％体积浓度为一个梯度，每0.006L为一个流份，洗脱速度为≤2mL/min，收集体积浓度为20％-30％的甲醇水溶液的洗脱液；

所述薄层色谱检测具体为：硅胶GF₂₅₄板，展开剂为V_甲苯：V_甲酸乙酯：V_甲酸＝1:7:1，直立上行展开，显色剂为质量浓度为1％的FeCl₃-乙醇溶液，显蓝紫色且比移值Rf为0.8的洗脱部位，即为目标化合物流份；

所述减压中低温浓缩的压力为45KPa-100KPa，温度≤50℃；

所述干燥是指在50℃干燥至含水率≤5wt％。

8.权利要求1所述的酚糖苷类化合物eyrein F或其可药用盐在制备减脂产品中的应用，所述减脂产品为药物制剂。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述药物制剂包括权利要求1所述的酚糖苷类化合物eyrein F或其可药用盐和药学上可接受的载体。