CN1709903A

CN1709903A - 皂苷类化合物及其苷元在制备治疗神经元损伤药物中的应用

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Publication number: CN1709903A
Application number: CN 200510026879
Authority: CN
Inventors: 张卫东; 何成; 李廷钊; 徐晓辉; 苏娟; 张川; 张薇
Original assignee: Second Military Medical University SMMU
Current assignee: Second Military Medical University SMMU
Priority date: 2005-06-17
Filing date: 2005-06-17
Publication date: 2005-12-21
Anticipated expiration: 2025-06-17
Also published as: CN100372865C

Abstract

本发明属医药技术领域，具体为一种瓜子金皂苷及其苷元的新的药物用途。研究证明：此类皂苷化合物及其苷元能逆转髓磷脂的抑制活性，显著地促进神经元细胞的分化和突起的生长。可用于制备治疗各种疾病引起的神经元损伤的药物。

Description

皂苷类化合物及其苷元在制备治疗神经元损伤药物中的应用

技术领域

本发明属医药技术领域，具体涉及一种瓜子金皂苷及其苷元在制备治疗各种疾病引起的神经元损伤的药物中的应用。

背景技术

脊髓损伤、脑损伤、癫痫、老年痴呆和帕金森氏症都能造成神经元损害，因此保护神经元并促进神经元的再生是治疗这些疾病的一个重要途径。但发育成熟的中枢神经系统中大多数神经元损伤后的再生能力很弱，这不仅与成熟神经元再生能力不足有关，而且与受损神经元所处的生长环境有关。大量的事实证明，中枢神经系统环境中抑制神经元细胞再生的原因与受损位点存在大量的髓磷脂有关。体外研究证实，固定的中枢神经系统髓磷脂蛋白能有效抑制多种神经元的再生，另外，髓磷脂的特异性抗体已经在体内用来对抗髓磷脂对神经元生长的抑制活性，特别是用来刺激脊髓皮层部位神经元的再生。因此，寻找能有效逆转髓磷脂抑制活性的物质可能是神经元损伤后促进神经元细胞生长的一个治疗途径。

瓜子金系远志科植物瓜子金(Polygala japonica HOUTT.)的全草，中医认为其具有祛痰止咳，散淤止血，宁心安神，解毒消肿等功效，主要用来治疗咳嗽痰多，跌打损伤，风湿痹痛，吐血，便血，心悸，失眠，咽喉肿痛等。

《中国药用植物图鉴》中认为瓜子金：“根：为镇静、祛痰剂，能益智安神，散郁化痰，消痈肿。治支气管炎，肺炎，咳嗽多痰，惊悸，健忘，痈疽疮肿，喉痹。”瓜子金含有的齐墩果烷型三萜皂苷是其主要的活性成分。现代研究证明，皂苷及皂苷元能通过多种途径保护神经元，某些皂苷类化合物还具有神经营养因子的作用能促进神经元细胞的生长。

迄今尚未发现瓜子金皂苷及其苷元促进神经元细胞生长及将其用于治疗脊髓损伤、脑损伤、癫痫、老年痴呆和帕金森氏症的报道。

本发明依据中医传统理论及用药经验，结合现代化学和药理手段，从瓜子金中提取分离高效低毒，具有促进神经元细胞生长的活性，可用以治疗各种疾病引起的神经损伤的瓜子金皂苷及皂苷元。

发明内容

本发明的目的是提出一种瓜子金皂苷及其皂苷元在制备治疗神经元损伤药物中的应用，包括以该类化合物为活性成分的药物组合物，以及它们在治疗各种疾病引起的神经元损伤中的应用。

本发明还提供一种瓜子金皂苷类化合物及其苷元的制备方法。

本发明进一步还提供一组以该类化合物为活性成分的，用于治疗脊髓损伤、脑损伤、癫痫、老年痴呆和帕金森氏症的药物组合物。

本发明提出的一类皂苷类化合物，以及分别由这些皂苷类化合物水解得到的苷元在制备治疗各种疾病引起的神经元损伤药物中的应用，该类化合物具有如下结构通式：

式中，R₁为氢；R₂，R₅为氢，或为1-5个单元的糖链；R₃为羧基、羟甲基或醛基；R₄为甲基或羟甲基；或R₂和R₅分别或同时为糖链所取代为瓜子金皂苷，瓜子金皂苷经水解后分别得到其皂苷元，此时R₂和R₅为氢。

此类皂苷及苷元可以从瓜子金中分离得到，也可以从其它植物中分离得到，或用合成方式获得。

上述皂苷类化合物中，R₂即C-3位糖链可由1-3个β-D-葡萄糖构成，β-D-葡萄糖与β-D-葡萄糖之间为任意连接方式。

上述皂苷类化合物中，R₅即C-28位糖链可由1-5个单糖构成，单糖的种类包括β-D-葡萄糖，α-L-鼠李糖，β-D-木糖，β-D-芹菜糖，β-D-半乳糖，β-D-岩藻糖，单糖之间的连接方式为任意连接方式。

上述皂苷类化合物中，构成糖链的单糖上任意位点可有羟烷基、可被任意取代的芳香酰基或C_1-18脂肪酰基取代。

所述的皂苷元由上述皂苷水解得到，其结构式中R₁，R₂，R₅为氢。R₃为羧基，羟甲基或醛基；R₄为甲基，羟甲基。

瓜子金在临床上用来治疗咽喉炎、骨髓炎，并具有精神调节等中枢神经系统作用，可用以改善人的学习记忆功能。本发明采用活性跟踪分离的方法，分离得到一类具有显著促进神经元细胞生长活性的皂苷类化合物，并根据其光谱数据(¹H-NMR、¹³C-NMR、DEPT、MS、UV)及理化性质鉴定其化学结构。将上述皂苷进行水解，得到相应的皂苷元。经深入的药理活性研究，上述皂苷类化合物及其苷元能显著促进神经元细胞的生长，可用于制备治疗各种疾病引起的神经元损伤的药物，例如制备治疗脊髓损伤、脑损伤、癫痫、老年痴呆和帕金森氏症等疾病的药物。

本发明的药物组合物含有治疗有效量的瓜子金皂苷类化合物和苷元组合物及其单体为活性成分，以及含有一种或多种药学上可接受的载体。

本发明的化合物和药物组合物可用于制备治疗各种疾病引起的神经损伤的药物。

上文所述药学上可接受的载体是指药学领域常规的药物载体，例如：稀释剂、赋形剂如水等，填充剂如淀粉、蔗糖等；粘合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；湿润剂如甘油；崩解剂如琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂如季铵化合物；表面活性剂如十六烷醇；吸附载体如高岭土和皂粘土；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙和镁、和聚乙二醇等。另外还可以在组合物中加入其它辅剂如香味剂、甜味剂等。

本发明化合物可以组合物的形式通过口服、鼻吸入、直肠或肠胃外给药的方式施用于需要这种治疗的患者。用于口服时，可将其制成常规的固体制剂如片剂、粉剂、粒剂、胶囊等，制成液体制剂如水或油悬浮剂或其它液体制剂如糖浆、酏剂等；用于肠胃外给药时，可将其制成注射用的溶液、水或油性悬浮剂等。优选的形式是片剂、包衣片剂、胶囊、栓剂、鼻喷雾剂和注射剂。

本发明药物组合物的各种剂型可以按照药学领域的常规生产方法制备。例如使活性成分与一种或多种载体混合，然后将其制成所需的剂型。

本发明的药物组合物优选含有重量比为0.1％-99.5％的活性成分，最优选含有重量比为0.5％-95％的活性成分。

具体实施方式

下面的实施例可以使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1：制备2β，27-bihydroxy-23-carboxyoleanolic acid 3-O-β-glucopyranoside

瓜子金全草10kg粉粹后，以70％乙醇回流提取3次，每次1小时，合并提取液，减压回收溶剂，得乙醇提取物，该提取物以水分散后，经AB-8大孔吸附树脂吸附，以水洗脱后，50％乙醇洗脱，收集50％乙醇洗脱液，溶剂回收至干后，将所得固体物行硅胶柱层析，氯仿-甲醇-水梯度洗脱，用薄层层析检查洗脱流分，具有相同单一斑点的流分合并，浓缩，得流分1、2、3、4、5、6、7、8、9，其中流分2经进一步硅胶层析和葡聚糖凝胶层析分离纯化，得2β，27-bihydroxy-23-carboxyoleanolic acid 3-O-β-glucopyranoside。

2β，27-bihydroxy-23-carboxyoleanolic acid 3-O-β-glucopyranoside，白色无定形粉末或白色针晶，mp182-184℃，分子式：C₃₆H₅₆O₁₂。结构式如下：

实施例2：制备polygalasaponin E

瓜子金全草10kg粉粹后，以70％乙醇回流提取3次，每次1小时，合并提取液，减压回收溶剂，得乙醇提取物，该提取物以水分散后，经AB-8大孔吸附树脂吸附，以水洗脱后，50％乙醇洗脱，收集50％乙醇洗脱液，溶剂回收至干后，将所得固体物行硅胶柱层析，氯仿-甲醇-水梯度洗脱，用薄层层析检查洗脱流分，具有相同单一斑点的流分合并，浓缩，得流分1、2、3、4、5、6、7、8、9，其中流分5经进一步硅胶层析和葡聚糖凝胶层析分离纯化，得polygalasaponin E。

Polygalasaponin E，白色无定形粉末或白色针晶，mp145-147℃，[α]_D ²⁰-45.3°(c＝0.38，MeOH)，HR-ESIMS：965.4720[M+Na]⁺，计算值C₄₇H₇₄O₁₉Na为965.44722。结合核磁共振¹H谱和¹³C谱，推断分子式为C₄₇H₇₄O₁₉。利用多种二维核磁共振相关谱(化学位移相关谱、无畸变极化转移增益谱、异核多量子相干谱、异核多键相干谱、二维核欧沃豪斯效应谱、全相关谱)对其结构进行解析，鉴定polygalasaponin E为medicagenic acid28-O-[β-D-xylopyranosyl(1→4)-α-L-rhamnopyranosyl(1→2)-β-D-glucopyranosyl]ester，为一新化合物，对碳氢信号归属如下：

编号	C	H	编号	C	H
编号	C	H	编号	C	H	12345678910111213141516171819202122	44.971.375.653.652.021.432.040.148.536.723.7122.5143.842.128.123.246.841.846.030.433.632.8	2.40(1H，d，J＝13Hz)1.41(1H，m)4.57(1H，m)4.53(1H，m)2.17(1H，m)1.92(1H，m)1.77(1H)^a1.94(1H)^a1.71(1H)^a1.81(1H)^a2.20(1H，m)2.05(1H，m)5.48(1H，t-like)2.08(1H)^a1.44(1H，m)2.10(1H，m)1.95(1H)^a3.13(1H，dd，J＝13.0，3.0Hz)1.94(1H)^a1.20(1H，m)1.30(1H，m)^a1.11(1H，d，J＝12.0Hz)1.81(1H)^a1.681H，(m)	252627282930Glc+123456Rah-123456Xy1-1234	16.817.125.7176.132.823.594.576.279.071.078.461.8101.071.472.284.968.118.3107.275.978.570.6	1.61(3H，s)1.17(3H，s)1.23(3H，s)0.84(3H，s)0.84(3H，s)6.21(1H，d，J＝8.0Hz)4.37(1H，d，J＝8.0Hz)4.30(1H)^a4.28(1H)^a4.06(1H)^a4.40(1H，dd，J＝12.0，2.0Hz)4.34(1H)^a6.41(1H，s)4.83(1H，br)4.71(1H，dd，J＝8.0，3.0Hz)4.35(1H)^a4.52(1H，dd，J＝6.0，9.0Hz)1.79(3H，d，J＝6.0Hz)5.05(1H，m)4.05(1H)^a3.97(1H，m)4.18(1H，m)

2324

180.813.4

1.98(3H，s)

5

67.2

4.24(1H，dd，J＝11.0，5.0Hz)3.52(1H，t，J＝10.0Hz)

实施例3：制备polygalasaponin G

瓜子金全草10kg粉粹后，以70％乙醇回流提取3次，每次1小时，合并提取液，减压回收溶剂，得乙醇提取物，该提取物以水分散后，经AB-8大孔吸附树脂吸附，以水洗脱后，50％乙醇洗脱，收集50％乙醇洗脱液，溶剂回收至干后，将所得固体物行硅胶柱层析，氯仿-甲醇-水梯度洗脱，用薄层层析检查洗脱流分，具有相同单一斑点的流分合并，浓缩，得流分1、2、3、4、5、6、7、8、9，其中流分5经进一步硅胶层析和葡聚糖凝胶层析分离纯化，得polygalasaponin G。

Polygalasaponin G，白色无定形粉末或白色针晶，mp：214-216℃，[α]_D ²⁰-47.6°(c＝0.075，MeOH)，HR-ESIMS：1083.5361[M+Na]⁺，计算值C₅₂H₈₄O₂₂Na为1083.5352。结合核磁共振¹H谱和¹³C谱，推断分子式为C₅₂H₈₄O₂₂。利用多种二维核磁共振相关谱(化学位移相关谱、无畸变极化转移增益谱、异核多量子相干谱、异核多键相干谱、二维核欧沃豪斯效应谱、全相关谱)对其结构进行解析，鉴定polygalasaponin G为bayogenin 28-O-{β-D-xylo-pyranosyl(1→4)-[β-D-apiofuranosyl(1→3)]-α-L-rhamnopyranosyl(1→2)-β-D-gluco-pyranosyl}ester，为一新化合物，对碳氢信号归属如下：

编号	C	H	编号	C	H
编号	C	H	编号	C	H	12345	44.771.372.942.148.0	2.33(1H，dd，J＝14.0，2.0Hz)1.26(1H，m)4.50(1H，m)4.23(1H，d，J＝5.0Hz)1.73(1H)^a	27282930Glc-1	25.7176.132.723.494.4	1.20(3H，s)0.82(3H，s)0.84(3H，s)6.22(1H，d，J＝8.0Hz)

67891011121314151617181920212223242526

18.132.039.848.336.923.7122.6143.842.027.923.246.741.646.130.433.632.967.514.217.017.3

1.98(1H，m)1.73(1H，)^a1.96(1H，m)1.75(1H)^a1.75(1H)^a2.17(1H，m)2.02(1H，m)5.45(1H，t-like)2.11(1H，m)1.40(1H，m)2.10(1H，m)1.93(1H，m)3.11(1H，dd，J＝13.0，4.0Hz)1.73(1H，)^a1.20(1H)^a1.30(1H，m)1.11(1H，br d，J＝13.0Hz)1.78(1H)^a1.68(1H，m)4.13(1H，d，J＝11.0Hz)3.76(1H，d，J＝11.0Hz)1.35(3H，s)1.60(3H，s)1.18(3H，s)

2346Rah-12456Xyl-1345Api-12345

77.978.471.078.462.0101.571.081.878.668.218.7105.075.478.470.966.8111.277.279.274.264.2

4.29(1H，m)4.23(1H)^a4.27(1H，t，J＝9.0Hz)3.97(1H，m)4.40(1H，dd，J＝14.0，2.0Hz)4.32(1H，dd，J＝14.0，4.0Hz)6.24(1H，d，J＝1.0Hz)5.04(1H，t-like)4.64(1H，dd，J＝8.0，4.0Hz)4.52(1H，t，J＝8.0Hz)4.51(1H，m)1.79(3H，d，J＝5.0Hz)5.34(1H，d，J＝8.0Hz)4.00(1H，m)4.10(1H，t，J＝8.0Hz)4.16(1H，m)4.21(1H)^a3.48(1H，t，J＝10.0Hz)6.09(1H，d，J＝5.0Hz)4.79(1H，d，J＝4.0Hz)4.59(1H，d，J＝9.0Hz)4.19(1H，d，J＝9.0Hz)4.07(1H，d，J＝11.0Hz)4.01(1H，d，J＝11.0Hz)

实施例4：制备polygalasaponin XVIII

瓜子金全草10kg粉粹后，以70％乙醇回流提取3次，每次1小时，合并提取液，减压回收溶剂，得乙醇提取物，该提取物以水分散后，经AB-8大孔吸附树脂吸附，以水洗脱后，50％乙醇洗脱，收集50％乙醇洗脱液，溶剂回收至干后，将所得固体物行硅胶柱层析，氯仿-甲醇-水梯度洗脱，用薄层层析检查洗脱流分，具有相同单一斑点的流分合并，浓缩，得流分1、2、3、4、5、6、7、8、9，其中流分6经进一步硅胶层析和葡聚糖凝胶层析分离纯化，得polygalasaponin XVIII。

polygalasaponin XVIII，白色无定形粉末或白色针晶，mp182-184℃，分子式：C₅₉H₉₄O₂₈。

其结构式如下：

实施例5：制备polygalasaponin H

瓜子金全草10kg粉粹后，以70％乙醇回流提取3次，每次1小时，合并提取液，减压回收溶剂，得乙醇提取物，该提取物以水分散后，经AB-8大孔吸附树脂吸附，以水洗脱后，50％乙醇洗脱，收集50％乙醇洗脱液，溶剂回收至干后，将所得固体物行硅胶柱层析，氯仿-甲醇-水梯度洗脱，用薄层层析检查洗脱流分，具有相同单一斑点的流分合并，浓缩，得流分1、2、3、4、5、6、7、8、9，其中流分6经进一步硅胶层析和葡聚糖凝胶层析分离纯化，得polygalasaponin H。

Polygalasaponin H，白色无定形粉末或白色针晶，mp：218-221℃，[α]_D ²⁰-2.4°(c＝0.16，MeOH)，HR-ESIMS：1097.5142[M+Na]⁺，计算值C₅₂H₈₂O₂₃Na为1097.5145。结合核磁共振¹H谱和¹³C谱，推断分子式为C₅₂H₈₂O₂₃。利用多种二维核磁共振相关谱(化学位移相关谱、无畸变极化转移增益谱、异核多量子相干谱、异核多键相干谱、二维核欧沃豪斯效应谱、全相关谱)对其结构进行解析，鉴定polygalasaponin H为medicagenic acid28-O-{β-D-xylopyranosyl(1→4)-[β-D-apiofuranosyl(1→3)]-α-L-rhamnopyranosyl(1→2)-β-D-glucopyranosyl)ester，为一新化合物，对碳氢信号归属如下：

编号	C	H	编号	C	H
编号	C	H	编号	C	H	12345678910111213141516171819202122	44.971.375.653.652.021.332.040.148.536.623.7122.5143.742.027.723.246.741.746.030.433.632.9	2.40(1H，dd，J＝12.0，2.0Hz)1.42(1H，m)4.58(1H，m)4.75(1H，d，J＝4.0Hz)2.17(1H，d，J＝12.0Hz)2.02(1H)1.82(1H)2.00(1H)1.75(1H)1.80(1H)2.21(1H，m)2.05(1H)5.50(1H，t-like)2.12(1H，m)1.34(1H，m)2.11(1H，m)1.91(1H，m)3.14(1H，dd，J＝13.0，4.0Hz)1.75(1H)1.18(1H)1.32(1H，m)1.16(1H)1.80(1H)1.61(1H，m)	27282930Glc-123456Rah-123456Xyl-12345Api-1	25.7176.132.123.594.578.078.371.078.362.1101.471.081.978.468.318.7105.075.478.470.966.8111.3	1.22(3H，s)0.83(3H，s)0.89(3H，s)6.26(1H，d，J＝7.0Hz)4.30(1H，dd，J＝7.0，2.0Hz)4.23(1H，m)4.29(1H，m)4.00(1H)4.41(1H，dd，J＝11.0，2.0Hz)4.35(1H，dd，J＝11.0，5，0Hz)6.19(1H，s)5.04(1H，br.s)4.67(1H，dd，J＝8.0，3.0Hz)4.55(1H，t，J＝9.0Hz)4.52(1H，m)1.78(3H，d，J＝6.0Hz)5.34(1H，d，J＝8.0Hz)4.00(1H)4.10(1H，t，J＝8.0Hz)4.19(1H)4.20(1H)3.48(1H，t，J＝10.0Hz)6.09(1H，d，J＝5.0Hz)

23242526

180.813.416.817.2

2.03(3H，s)1.64(3H，s)1.18(3H，s)

2345

77.279.274.264.2

4.78(1H，d，J＝4.0Hz)4.59(1H，d，J＝9.0Hz)4.19(1H，d，J＝9.0Hz)4.05(1H，d，J＝12.0Hz)4.02(1H，d，J＝12.0Hz)

实施例6：制备polygalasaponin XXI

瓜子金全草10kg粉粹后，以70％乙醇回流提取3次，每次1小时，合并提取液，减压回收溶剂，得乙醇提取物，该提取物以水分散后，经AB-8大孔吸附树脂吸附，以水洗脱后，50％乙醇洗脱，收集50％乙醇洗脱液，溶剂回收至干后，将所得固体物行硅胶柱层析，氯仿-甲醇-水梯度洗脱，用薄层层析检查洗脱流分，具有相同单一斑点的流分合并，浓缩，得流分1、2、3、4、5、6、7、8、9，其中流分7经进一步硅胶层析和葡聚糖凝胶层析分离纯化，得polygalasaponin XXI。

polygalasaponin XXI，白色无定形粉末或白色针晶，mp220-223℃，分子式：C₅₃H₈₄O₂₄。其结构式如下：

实施例7：制备polygalasaponin V

瓜子金全草10kg粉粹后，以70％乙醇回流提取3次，每次1小时，合并提取液，减压回收溶剂，得乙醇提取物，该提取物以水分散后，经AB-8大孔吸附树脂吸附，以水洗脱后，50％乙醇洗脱，收集50％乙醇洗脱液，溶剂回收至干后，将所得固体物行硅胶柱层析，氯仿-甲醇-水梯度洗脱，用薄层层析检查洗脱流分，具有相同单一斑点的流分合并，浓缩，得流分1、2、3、4、5、6、7、8、9，其中流分8经进一步硅胶层析和葡聚糖凝胶层析分离纯化，得polygalasaponin V。

polygalasaponin V，白色无定形粉末或白色针晶，mp218-221℃，分子式：C₅₈H₉₄O₂₇。其结构式如下：

实施例8：制备2β-hydroxy-23-hydroxyoleanolic acid(bayogenin)

瓜子金全草10kg粉粹后，以70％乙醇回流提取3次，每次1小时，合并提取液，减压回收溶剂，得乙醇提取物，该提取物以水分散后，经AB-8大孔吸附树脂吸附，以水洗脱后，50％乙醇洗脱，收集50％乙醇洗脱液，溶剂回收至干后，将所得固体物行硅胶柱层析，氯仿-甲醇-水梯度洗脱，用薄层层析检查洗脱流分，具有相同单一斑点的流分合并，浓缩，得流分1、2、3、4、5、6、7、8、9，其中流分8经进一步硅胶层析和葡聚糖凝胶层析分离纯化，得polygalasaponin V，取polygalasaponin V 10g，以一定比例盐酸甲醇溶液加热水解，水解完全后蒸去溶剂，剩余物加水混悬，用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯部分回收溶剂至小体积，放置结晶即得2β-hydroxy-23-hydroxyoleanolic acid。

2β-hydroxy-23-hydroxyoleanolic acid，无色针晶或片状结晶，分子式C₃₀H₄₈O₅。经光谱其结构式如下：

实施例9：制备2β-hydroxy-23-carboxyoleanolic acid(medicagenic acid)

瓜子金全草10kg粉粹后，以70％乙醇回流提取3次，每次1小时，合并提取液，减压回收溶剂，得乙醇提取物，该提取物以水分散后，经AB-8大孔吸附树脂吸附，以水洗脱后，50％乙醇洗脱，收集50％乙醇洗脱液，溶剂回收至干后，将所得固体物行硅胶柱层析，氯仿-甲醇-水梯度洗脱，用薄层层析检查洗脱流分，具有相同单一斑点的流分合并，浓缩，得流分1、2、3、4、5、6、7、8、9，其中流分5、7经进一步硅胶层析和葡聚糖凝胶层析分离纯化，分别得到polygalasaponin E和polygalasaponin H，取polygalasaponin E或polygalasaponin H 10g，以一定比例盐酸甲醇溶液加热水解，水解完全后蒸去溶剂，剩余物加水混悬，用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯部分回收溶剂至小体积，放置结晶即得2β-hydroxy-23-carboxyoleanolic acid。

2β-hydroxy-23-carboxyoleanolic acid，无色针晶或片状结晶，分子式C₃₀H₄₆O₆。其结构式如下：

实施例10：制备2β，27-bihydroxy-23-carboxyoleanolic acid

瓜子金全草10kg粉粹后，以70％乙醇回流提取3次，每次1小时，合并提取液，减压回收溶剂，得乙醇提取物，该提取物以水分散后，经AB-8大孔吸附树脂吸附，以水洗脱后，50％乙醇洗脱，收集50％乙醇洗脱液，溶剂回收至干后，将所得固体物行硅胶柱层析，氯仿-甲醇-水梯度洗脱，用薄层层析检查洗脱流分，具有相同单一斑点的流分合并，浓缩，得流分1、2、3、4、5、6、7、8、9，其中流分2经进一步硅胶层析和葡聚糖凝胶层析分离纯化，分别得到2β，27-bihydroxy-23-carboxyoleanolic acid 3-O-β-glucopyranoside，取2β，27-bihydroxy-23-carboxyoleanolic acid 3-O-β-glucopyranoside 10g，以一定比例盐酸甲醇溶液加热水解，水解完全后蒸去溶剂，剩余物加水混悬，用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯部分回收溶剂至小体积，放置结晶即得2β，27-bihydroxy-23-carboxyoleanolic acid。

2β，27-bihydroxy-23-carboxyoleanolic acid，无色针晶或片状结晶，分子式C₃₀H₄₆O₇。其结构式如下：

实施例11：制备polygalasapogenin

瓜子金全草10kg粉粹后，以70％乙醇回流提取3次，每次1小时，合并提取液，减压回收溶剂，得乙醇提取物，该提取物以水分散后，经AB-8大孔吸附树脂吸附，以水洗脱后，50％乙醇洗脱，收集50％乙醇洗脱液，溶剂回收至干后，将所得固体物行硅胶柱层析，氯仿-甲醇-水梯度洗脱，用薄层层析检查洗脱流分，具有相同单一斑点的流分合并，浓缩，得流分1、2、3、4、5、6、7、8、9，其中流分6经进一步硅胶层析和葡聚糖凝胶层析分离纯化，得polygalasaponin XVIII。取polygalasaponin XVIII 10g，以一定比例盐酸甲醇溶液加热水解，水解完全后蒸去溶剂，剩余物加水混悬，用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯部分回收溶剂至小体积，放置结晶即得polygalasapogenin。

polygalasapogenin，无色针晶或片状结晶，分子式C₃₀H₄₆O₅。其结构式如下：

实施例12：制备瓜子金皂苷及其苷元的制剂

片剂：活性成分 20mg

乳糖 177mg

玉米淀粉 50mg

硬脂酸镁 3mg

制备方法：将活性成分、乳糖和淀粉混合，用水均匀湿润，把湿润后的混合物过筛并干燥，再过筛，加入硬脂酸镁，然后将混合物压片，每片重250mg，活性成分含量为20mg。

实施例13：瓜子金皂苷类化合物及其苷元促进神经元细胞生长实验

1.实验方法

1.1髓磷脂的制备

按文献方法从P8大鼠中枢神经系统白质中制备髓磷脂，经低渗处理，细胞膜经蔗糖梯度离心并悬浮于10mM HEPES(羟乙基哌嗪乙磺酸)。八孔培养板以16.6mg/mL多聚-L-赖氨酸被覆，室温放置1h，0.1mol/L NaHCO₃洗涤，前述髓磷脂按0.5～1mg总蛋白/孔加入培养板，过夜吹干备用。

1.2神经元分离

取两只大鼠的小脑，放入5mL 0.025％的胰蛋白酶中，剪碎，37℃消化10min，加入10％FCS(胎牛血清)DMEM(Dulbecco改良Eagle’s培养基)5mL，经800rpm离心6min，细胞移入2mL Sato培养液(黄体酮20nM；硒30nM；腐胺100mM；胰岛素5mg/mL；牛血清蛋白4mg/mL；L-甲状腺素0.1mg/mL；三碘甲腺原氨酸0.08mg/mL)中，制成单细胞悬液，800rpm离心6min，将细胞再次悬浮于Sato培养液中。然后将制备好的神经细胞接种到16.6mg/mL多聚-L-赖氨酸和髓磷脂处理过的培养板上，每个培养板含1×10⁶个细胞[2]。

1.3生长分析

神经元细胞接种于培养板4h后贴壁，换为无血清培养基(含10％B27的Neurobasl及受试样品)，经培养24h后以4％多聚甲醛固定30min，并用冰甲醇处理2min，以10％FCS DMEM培养液中止培养30min后，加入鼠单克隆抗体(单克隆抗体：β₃-微管蛋白1：2000，Progema)继续孵育4h。PBS-BSA(2％)洗涤细胞3次，加入罗丹明二抗(1∶400，Sigma)孵育45min，洗涤三次后，培养板倒置荧光显微镜下观察神经元细胞生长情况，随机采集100个神经元细胞图像，手动测量突起长度。

实验平行操作3次。

2.实验结果

样品	神经元突起总长度(μm)	P
样品	神经元突起总长度(μm)	P	空白	28.9720±29.2912	＜0.0001

G6976	71.6122±42.3346	＜0.0001
G6976	71.6122±42.3346	＜0.0001	A^*	55.5394±40.1168	＜0.0001
polygalasaponin E	60.3249±30.1825	＜0.0001	A^*	55.5394±40.1168	＜0.0001
polygalasaponin E	60.3249±30.1825	＜0.0001	polygalasaponin G	58.8914±34.2749	＜0.0001
polygalasaponin XVIII	69.3766±35.2239	＜0.0001	polygalasaponin G	58.8914±34.2749	＜0.0001
polygalasaponin XVIII	69.3766±35.2239	＜0.0001	polygalasaponin H	67.9982±32.2769	＜0.0001
polygalasaponin XXI	68.6720±31.4611	＜0.0001	polygalasaponin H	67.9982±32.2769	＜0.0001
polygalasaponin XXI	68.6720±31.4611	＜0.0001	po1ygalasaponin V	66.9696±37.0828	＜0.0001
bayogenin	62.1726±38.2519	＜0.0001	po1ygalasaponin V	66.9696±37.0828	＜0.0001
bayogenin	62.1726±38.2519	＜0.0001	medicagenic acid	65.7472±37.2268	＜0.0001
B*	64.2648±29.3705	＜0.0001	medicagenic acid	65.7472±37.2268	＜0.0001
B*	64.2648±29.3705	＜0.0001	polygalasapogenin	66.1006±33.0916	＜0.0001

^*A：2β，27-bihydroxy-23-carboxyoleanolic acid 3-O-β-glucopyranoside

B：2β，27-bihydroxy-23-carboxyoleanolic acid

结论：受试样品能够对抗髓磷脂的抑制活性，显著的促进神经元细胞的生长，其作用强度与蛋白激酶PKC抑制剂G6976相当。

Claims

1.一种具有促进神经元细胞生长的皂苷类化合物以及由这些皂苷类化合物水解得到的苷元，其特征在于具有如下结构通式：

式中，R₁为氢；R₂，R₅为氢，或为1-5个单元的糖链；R₃为羧基、羟甲基或醛基；R₄为甲基或羟甲基；当R₂和R₅分别或同时为糖链所取代时为瓜子金皂苷，皂苷经水解后分别得到其皂苷元，此时R₂和R₅为氢。

2、根据权利要求1所述的皂苷类化合物，其特征在于R₂由1-3个β-D-葡萄糖构成，β-D-葡萄糖与β-D-葡萄糖之间为任意连接方式。

3、根据权利要求2所述的皂苷类化合物，其特征在于R₅由1-5个单糖构成，单糖的种类包括β-D-葡萄糖，α-L-鼠李糖，β-D-木糖，β-D-芹菜糖，β-D-半乳糖，β-D-岩藻糖，单糖之间的连接方式为任意连接方式。

4、根据权利要求3所述的皂苷类化合物，其特征在于构成糖链的单糖上任意位点有羟烷基、可被任意取代的芳香酰基或C_1-18脂肪酰基取代。

5、一种如权利要求1所述的皂苷类化合物及其苷元在制备治疗各种疾病引起的神经元损伤药物中的应用。

6、根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述的疾病包括髓损伤、脑损伤、癫痫、老年痴呆、帕金森氏症、外周神经炎、外周神经损伤和视神经萎缩。

7、用于治疗各种疾病引起的神经元损伤的药物组合物，其特征在于其中含有权利要求1所述的化合物为活性成分和药学上可接受的载体。

8、根据权利要求7所述的药物组合物，其特征在于活性成份的重量含量为0.1-99.5％。