CN104945460A - 一种刺梨酸的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种刺梨酸的制备方法，具体涉及一种生物酶酶解辅助微波提取法提取刺梨酸的方法。具体的工艺步骤为：原材料的处理→酶解→微波提取→纯化→真空浓缩、冷冻干燥，即得刺梨酸。本发明利用了生物酶酶解，不仅可以充分破坏植物的细胞壁，使得有效成分充分流出，同时加入的酸水，不仅增强了生物酶的活性，也可以使刺梨酸游离，从而提高了刺梨酸的出率；利用陶瓷膜和大孔吸附树脂柱对刺梨酸的纯化，可以很好地提高所得产品的纯度。本发明具有工艺简单、反应条件温和、选择性高、所得刺梨酸纯度高等优点。采用本发明制备的刺梨酸尤其适合在制备抗肿瘤产品中的应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种天然药用植物中活性成分的提取技术，特别是涉及一种生物酶酶解辅助微波提取法提取刺梨酸的方法，以及所得刺梨酸在制备抗肿瘤产品中的应用。
背景技术
癌症是一大类恶性肿瘤的统称。癌细胞的特点是无限制、无止境地增生，使患者体内的营养物质被大量消耗；癌细胞释放出多种毒素，使人体产生一系列症状；癌细胞还可转移到全身各处生长繁殖，导致人体消瘦、无力、贫血、食欲不振、发热以及严重的脏器功能受损等等。与之相对的有良性肿瘤，良性肿瘤则容易清除干净，一般不转移、不复发，对器官、组织只有挤压和阻塞作用，但癌症（恶性肿瘤）还可破坏组织、器官的结构和功能，引起坏死出血合并感染，患者最终由于器官功能衰竭而死亡。到了科学高速发展的今天，我们有理由相信癌症并非不治之症。致力于自然医学研究的医学专家们研究发现：负离子对抑制癌细胞转移有令人鼓舞的效果，重要的是利用自然因子负离子对癌症患者治疗对机体无任何损害，没有任何毒副作用。
癌症严重威胁着人类的生命，是当今世界上大多数国家的主要死因之一。据世界卫生组织统计，全世界每年死于癌症的患者约500万，因此癌症的治疗和预防任务十分艰巨。
刺梨为蔷薇科植物刺梨的果实，别名茨梨，刺梨果实营养丰富，誉为“营养库”，含维生素（还含β-谷甾醇（β-sitosterol），委陵菜酸（tomentic acid），野雅春酸（euscaphic acid）， 原儿茶酸（procatechuic acid），以硬脂酸及二十一烷酸为主的脂肪酸，刺梨酸（roxburic acid）又叫2β，3a，7β，19a-四羟基-12-乌苏烯-28-羧酸（2β，3a，7β，19a-tetrahydroxyursolu-12-ene-28-car-boxylic acid）等成分，具有降血压、抗氧化及抗肿瘤等作用。
刺梨酸为五环三萜类化合物，分子是C30H48O6，分子量504.71，研究发现具有抗肿瘤作用。
通过文献检索，发现目前国内尚未见刺梨酸在制备抗肿瘤产品中的应用专利报道。
发明内容
本发明旨在扩大刺梨酸的应用范围，扩大抗肿瘤产品的应用品种，本发明特别提供一种刺梨酸的制备方法及其在抗肿瘤产品中的应用。
为了实现上述目的，刺梨酸的制备方法采用以下技术方案：
一种刺梨酸的制备的方法，其特征在于以下步骤：
（1）原材料的处理：取刺梨果经60~80℃干燥，粉碎，过40~80目筛；
（2）酶解：将上述粗粉放入pH值4~5、固液比为1：0.5~1的稀酸溶液中，并向其中加入粗粉重量0.1%~0.5%的生物酶，在温度为45~50℃的条件下酶解1~3h；
（3）微波提取：将步骤（2）中酶解混合物置于功率大小为1000~2000W的微波提取器中，加入料液比为1：3~5、70~80%的乙醇，进行醇提，得到刺梨酸粗提液；
（4）纯化：将上述刺梨酸粗提液首先在温度为20~40℃的条件下，用0.4微米的陶瓷膜分离出部分杂质；再将所得到的提取液上大孔吸附树脂柱，先用2~3倍柱体积的蒸馏水洗脱，再用2~4倍柱体积、40~50%的乙醇洗脱，最后用2~5倍柱体积、80~90%的乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液用0.1~0.5微米有机微孔滤膜过滤，通过HPLC外标法检测，收集富含刺梨酸的部分；
（5）真空浓缩、冷冻干燥：将上述富含刺梨酸的液体部分经70~80℃真空浓缩至固体含量为20～25％时，冷冻干燥得到刺梨酸产品。
步骤（2）所述生物酶为纤维素酶、果胶酶、半纤维素酶中的一种。
步骤（3）中所述微波提取在温度为60~80℃的条件下提取600~900s。
步骤（4）中所述大孔吸附树脂为X-5、LSA-21、WLD中的一种。
本发明的目的在于提供一种刺梨酸活性成分在抗肿瘤方面的应用。
本发明制备的提取物在抗肿瘤作用上的药理活性通过以下药理实验证明。
1、实验目的
通过体外实验研究刺梨酸的抗肿瘤作用。
2、实验方法
采用MTT法观察刺梨酸体外对人结肠癌细胞（HT-29）或人食管癌细胞（Eca-109）的生长抑制率。
3、实验步骤
（1）选用人结肠癌细胞（HT-29）或人食管癌细胞（Eca-109）对数期细胞，用0.5%的胰蛋白酶分解细胞后，用含10%胎牛血清的1640培养液中配成单个细胞悬浮液，接种到96孔培养板中，每孔300μL，置37℃，5%CO2的条件下培养72小时，倒置显微镜下观察。（2）设置实验组和对照组，实验组换新的含不同浓度刺梨酸培养基（刺梨酸的浓度为1.90、0.84、0.42mg/ml），对照组则换含等体积溶剂的培养基，每组设3组平行孔，置37℃，5%CO2的条件下培养2~5天，离心（1000转，6min），弃去上清液。（3）每孔加入100μL新鲜配置的含0.20mg/ml MTT的无血清培养基。37℃继续培养3h。小心弃去上清液，并加入200μLDMSO，用微型超声振荡器混匀后，在酶标仪上以实验波长为570nm测定光密度值。并计算不同药剂量对肿瘤细胞的抑制率。结果见下表1。
肿瘤细胞抑制率=（1-OD实验/OD对照）*100%
4、实验结果
表1 刺梨酸对人癌细胞的抑制率
| 刺梨酸的浓度（mg/ml） | 人结肠癌细胞（HT-29）抑制率（%） | 人食管癌细胞（Eca-109）抑制率（%） |
| 1.90 | 63.23 | 71.43 |
| 0.84 | 76.84 | 79.20 |
| 0.42 | 68.41 | 67.23 |
5、实验结论
由上表可知：刺梨酸对人结肠癌细胞（HT-29）或人食管癌细胞（Eca-109）系有明显的生长抑制作用。其可在抗肿瘤产品中得到应用。
本发明所制备的刺梨酸活性成分与一种或多种药学上可接受的固体或液体赋形剂或辅剂结合，制成适合人或动物适合的剂型。
下面将结合具体实施方式进一步说明本发明，但本发明要求保护的范围并不局限于下列实施方式。
具体实施方式
实施例1：
取刺梨果经60℃干燥，粉碎，过40目筛；将上述粗粉放入pH值为4、固液比为1：0.5的稀酸溶液中，并向其中加入粗粉重量0.1%的纤维素酶，在温度为45℃的条件下酶解1h；将所得酶解混合物置于功率大小为1000W的微波提取器中，加入料液比为1：3、70%的乙醇，在温度为60℃的条件下提取600s，得到刺梨酸粗提液；将刺梨酸粗提液首先在温度为20℃的条件下，用0.4微米的陶瓷膜分离出部分杂质；再将所得到的提取液上X-5型大孔吸附树脂柱，先用2倍柱体积的蒸馏水洗脱，再用2倍柱体积、40%的乙醇洗脱，最后用2倍柱体积、80%的乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液用0.1微米有机微孔滤膜过滤，通过HPLC外标法检测，收集富含刺梨酸的部分；将富含刺梨酸的液体部分经70℃真空浓缩至固体含量为20％时，冷冻干燥得到刺梨酸产品。
实施例2：
取刺梨果经70℃干燥，粉碎，过60目筛；将粗粉放入pH值为4、固液比为1：1的稀酸溶液中，并向其中加入粗粉重量0.3%的果胶酶，在温度为45℃的条件下酶解1.5h；将所得酶解混合物置于功率大小为2000W的微波提取器中，加入料液比为1：4、75%的乙醇，在温度为80℃的条件下提取800s，得到刺梨酸粗提液；将刺梨酸粗提液首先在温度为30℃的条件下，用0.4微米的陶瓷膜分离出部分杂质；再将所得到的提取液上LSA-21型大孔吸附树脂柱，先用3倍柱体积的蒸馏水洗脱，再用3倍柱体积、45%的乙醇洗脱，最后用4倍柱体积、85%的乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液用0.3微米有机微孔滤膜过滤，通过HPLC外标法检测，收集富含刺梨酸的部分；将上述富含刺梨酸的液体部分经75℃真空浓缩至固体含量为20%时，冷冻干燥得到刺梨酸产品。
实施例3：
取刺梨果经80℃干燥，粉碎，过80目筛；将上述粗粉放入pH值为5、固液比为1：1的稀酸溶液中，并向其中加入粗粉重量0.5%的半纤维素酶，在温度为50℃的条件下酶解3h；将所得酶解混合物置于功率大小为2000W的微波提取器中，加入料液比为1：5、80%的乙醇，在温度为90℃的条件下提取900s，得到刺梨酸粗提液；将刺梨酸粗提液首先在温度为40℃的条件下，用0.4微米的陶瓷膜分离出部分杂质；再将所得到的提取液上WLD型大孔吸附树脂柱，先用3倍柱体积的蒸馏水洗脱，再用4倍柱体积、50%的乙醇洗脱，最后用5倍柱体积、90%的乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液用0.5微米有机微孔滤膜过滤，通过HPLC外标法检测，收集富含刺梨酸的部分；将上述富含刺梨酸的液体部分经80℃真空浓缩至固体含量为25％时，冷冻干燥得到刺梨酸产品。
实施例4：
刺梨酸制成注射剂
在实施例1、2、3中制得的刺梨酸活性成分中加入乙醇或它们的混合物作为溶剂，并加入泊洛沙姆作为增溶剂，醋酸盐作为pH调节剂，氯化钠作为渗透压调节剂即可制成注射剂。
实施例5：
刺梨酸制成片剂
在实施例1、2、3中制得的刺梨酸中加入淀粉、蜂蜜、乙醇、干淀粉、滑石粉、聚乙二醇即可制成片剂。
Claims (6)
1.一种刺梨酸的制备方法，其特征在于，它主要是采用以下步骤：
（1）原材料的处理：取刺梨果经60~80℃干燥，粉碎，过40~80目筛；
（2）酶解：将上述粗粉放入pH值4~5、固液比为1：0.5~1的稀酸溶液中，并向其中加入粗粉重量0.1%~0.5%的生物酶，在温度为45~50℃的条件下酶解1~3h；
（3）微波提取：将步骤（2）中酶解混合物置于功率大小为1000~2000W的微波提取器中，加入料液比为1：3~5、70~80%的乙醇，进行醇提，得到刺梨酸粗提液；
（4）纯化：将上述刺梨酸粗提液首先在温度为20~40℃的条件下，用0.4微米的陶瓷膜分离出部分杂质；再将所得到的提取液上大孔吸附树脂柱，先用2~3倍柱体积的蒸馏水洗脱，再用2~4倍柱体积、40~50%的乙醇洗脱，最后用2~5倍柱体积、80~90%的乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液用0.1~0.5微米有机微孔滤膜过滤，通过HPLC外标法检测，收集富含刺梨酸的部分；
（5）真空浓缩、冷冻干燥：将上述富含刺梨酸的液体部分经70~80℃真空浓缩至固体含量为20～25％时，冷冻干燥得到刺梨酸产品。
2.根据权利要求1所述的一种刺梨酸的制备方法，其特征在于：步骤（2）所述生物酶为纤维素酶、果胶酶、半纤维素酶中的一种。
3.根据权利要求1所述的一种刺梨酸的制备方法，其特征在于：步骤（3）中所述微波提取在温度为60~80℃的条件下提取600~900s。
4.根据权利要求1所述的一种刺梨酸的制备方法，其特征在于：步骤（4）中所述大孔吸附树脂为X-5、LSA-21、WLD中的一种。
5.根据权利要求1~4所述方法制备的刺梨酸尤其适合在制备抗肿瘤产品中的应用。
6.根据权利要求5所述的抗肿瘤产品包括药品，保健品。
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