CN103360452B

CN103360452B - 甜瓜蒂四环三萜葫芦素类化合物的制备和应用

Info

Publication number: CN103360452B
Application number: CN201210097676.8A
Authority: CN
Inventors: 戚建华; 孙恺悦; 陈欢; 向兰; 高丽娟
Original assignee: Zhejiang Zuo Libaicao Prepared Slices Of Chinese Crude Drugs Co Ltd; Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang Zuo Libaicao Prepared Slices Of Chinese Crude Drugs Co Ltd; Zhejiang University ZJU
Priority date: 2012-04-04
Filing date: 2012-04-04
Publication date: 2016-02-24
Anticipated expiration: 2032-04-04
Also published as: CN103360452A

Abstract

本发明提供一种葫芦素类化合物的制备方法，将甜瓜蒂用有机溶剂提取，对提取物进行溶剂分配，浓缩后的样品经硅胶柱分离、高效液相色谱纯化得到葫芦素混合物和葫芦类化合物。本发明经抗衰老的酵母模型—K6001酵母细胞—证实了所述的其有效成分葫芦素类化合物可以显著延长酵母复制性寿命，因此，该葫芦素混合物和葫芦类化合物可在制备预防及治疗衰老以及预防或/且治疗衰老性疾病药物中的应用。同时也可在制备延缓衰老及预防衰老性疾病的营养组合物中应用。此类化合物还可作为先导物，优化结构，可在制备延缓衰老以及预防或/且治疗衰老性疾病的药物中应用；本发明的结构通式为。？

Description

甜瓜蒂四环三萜葫芦素类化合物的制备和应用

技术领域

本发明属化合物的医药食品领域，涉及甜瓜蒂四环三萜葫芦素类混合物和化合物及其衍生物的制备方法，以及在制备抗衰老性疾病药物及在制备营养组合物中的应用。

背景技术

随着医疗条件的改善，人类平均寿命在不断地延长，人口老龄化问题逐渐加深。截至2006年底，全国65岁以上人口1亿人，占全国总人口的7.9％。预计到2050年人口达到最高峰值时，老年人口总量将超过4亿，老龄化水平推进到30％以上，并且接近于1980年全世界老年人口之和。

人口的老龄化带来的就是衰老性疾病的发病率不断地增高，如老年痴呆症、心血管疾病、糖尿病等等。资料显示，老年痴呆症已成为导致成年人死亡的第四位主要原因，仅次于心脏病、癌症、中风。我国老年性痴呆患者估计超过500万，约占世界总病例数的1/4；而且，随着我国人口老龄化进程的加快，这个数字将更为庞大。据统计，中国老年性痴呆症的发病率65岁以上是5％，70岁以上是10％，80岁以上是30％，到了85岁以上则高达40％。再过20年，如今的中年人都将步入老年人的行列，痴呆症患者数量将急剧增加，老年人的健康也直接关系到整个社会的稳定与发展。由于该病发病后患者存活时间较长，给患者及亲属造成巨大的精神和经济压力。但是由于其发病的复杂性，到目前为止还没有疗效较好的药物。现代研究表明阿尔茨海默症与衰老之间关系密切。从延缓衰老的角度治疗老年痴呆症或许是可行的方法之一。因此抗衰老研究成为研究热点。天然产物作为药物已有悠久的历史，据统计，从1981年至2006年，新增加药物中来源于天然产物及天然产物衍生物的占28％。我国是世界上药用植物和生药种类最多、应用历史最久的国家。许多味中药材都是作为延缓衰老、延年益寿的传统用药。但由于整体用药成分复杂多变，质量难以控制，难以进入国际市场，因此对其活性的化学物质研究十分重要。

甜瓜蒂为葫芦科一年生草质藤本植物甜瓜的果蒂，最早载于《神农本草经》：主治大水，身面四肢浮肿，下水，杀蛊。《伤寒论》，《金匮要略》等对其均有记载。味苦，性寒，入胃经，可用于治疗痰涎宿食，胸中痞鞭，风痰癫痫，温热黄疸，四肢浮肿，鼻塞等。甜瓜蒂具有治疗顽固性黄疸的作用，甜瓜蒂中含有葫芦素B，葫芦素E等，具有抗肝炎，肝癌作用。此外，还有抗炎，提高机体免疫力，改善肠胃功能等多方面作用。但少有其关于延缓衰老作用的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种甜瓜蒂四环三萜葫芦素类化合物的制备方法，主要通过以下步骤实现：

(1)粉碎和浸提：

中药甜瓜蒂经粉碎后，用工业级乙醇室温下浸提3天，抽滤浓缩，得甜瓜蒂乙醇浸提物粗样；

(2)萃取、分离和纯化：

将甜瓜蒂乙醇浸提物粗样用80％的甲醇水溶液和正己烷(体积比＝1∶1)进行溶剂分配，得到80％的甲醇水溶液层样品。所得层样品进行旋转蒸发，得到浓缩物。浓缩物经正相硅胶色谱(silicagel)开口柱分离(溶剂系统为正己烷∶乙酸乙酯，100％甲醇)，得到甜瓜蒂四环三萜葫芦素类化合物，将其中一部分直接进行高效液相色谱纯化，得到一些纯化的甜瓜蒂四环三萜葫芦素类化合物(化合物I-a～e)；将另一部分通过二次正相硅胶开口柱分离(溶剂系统为氯仿∶甲醇)，再进行高效液相色谱纯化，得到另一些纯化的葫芦素类化合物(化合物I-f～g)。

本发明制备的甜瓜蒂四环三萜葫芦素类化合物的结构通式如下：

其中：表示单键或双键；

R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆、R₇、R₈、R₉分别独立的选自氢、羟基、酰基、＝O、酯基、酰胺或卤素；

R₁₀、R₁₁、R₁₂分别独立的选自甲基、氢、酰基、羟基、葡萄糖氧基、甲氧基、丁氧基、羧基、酯基、酰胺或卤素；

R₁₃、R₁₄、R₁₅、R₁₆、R₁₇分别独立的选自氢、甲基、羟基、羟甲基、甲氧基、酯基、酰胺或卤素。

化合物I-a～g的结构式如下：

化合物I-a(1)r₁＝OH，r₂＝Ac

化合物I-b(2)r₁＝OH，r₂＝Ac，23，24dihydro

化合物I-e(5)r₁＝OH，r₂＝H

化合物I-f(6)r₁＝OGlu，r₂＝Ac

化合物I-c(3)

化合物I-d(4)t₁＝Ac

化合物I-g(7)t₁＝H

本发明的另一个目的是提供甜瓜蒂四环三萜葫芦素类化合物在制备抗衰老药物中的应用。本发明研究发现该类四环三萜葫芦素类化合物及化合物I-a在抗衰老化合物的体外筛选模型中，可以显著延长酵母细胞的复制性寿命(见图1～2)。

本发明的还有一个目的在于四环三萜葫芦素类化合物的药物组合物，其特征在于包含四环三萜葫芦素类化合物作为其活性成份。该药物组合物的用途是延缓衰老，预防或治疗衰老性疾病。

该药物组合物可根据任何常规过程制备药学上可接受的载体或稀释剂。这里所述的药学上可接受的载体是指药学领域常规的药物载体，例如稀释剂、赋形剂如是等，填充剂如淀粉、蔗糖、微晶纤维素等；粘合剂如淀粉浆、羟丙纤维素、明胶、聚乙二醇等；湿润剂如硬脂酸镁、微粉硅胶、聚乙二醇类等；吸收促进剂聚山梨脂、卵磷脂等，表面活性剂伯洛沙姆、脂肪酸山梨坦、聚山梨脂等等，另外还可以在组合物中加入其它辅剂如香味剂、甜味剂等。

给药的剂型可以是片剂，丸剂，粉剂，分散片，小药囊剂，酏剂，混悬剂，乳剂，溶液剂，糖浆剂，气雾剂，软胶囊，硬胶囊，无菌注射液，搽剂或栓剂。可制成常规，速释，缓释或延迟释放。

本发明的药物组合物的给药途径包括口服，鼻腔，肌肉，皮下，静注等。

本发明提供了一类四环三萜葫芦素类化合物，研究发现可以显著延长酵母细胞的复制性寿命。可在制备抗衰老方面药物中应用。本发明为此类化合物开发成为预防或治疗抗衰老药物及保健品提供了依据。

附图说明

图1是葫芦素混合物延长酵母细胞的复制性寿命。

图2是化合物I-a延长酵母细胞的复制性寿命。

具体实施方式

本发明结合附图和实施例作进一步的说明。

实施例1葫芦素混合物和葫芦素类化合物的制备

1)粉碎和浸提：

中药甜瓜蒂500g粉碎后，用12.5L乙醇(工业级)室温下震荡浸提3天。抽滤、浓缩后，得到乙醇浸提物粗样93.4g。

2)萃取、分离和纯化：

将甜瓜蒂乙醇浸提物粗样(90g)用80％的甲醇水溶液和正己烷(体积比＝1∶1)进行溶剂分配2次，所得的80％的甲醇水溶液层样品进行旋转蒸发，得到浓缩物(72.5g)。浓缩物经正相硅胶色谱(silicagel，200-300目)开口柱分离(溶剂系统为正己烷∶乙酸乙酯＝90∶10，80∶20，70∶30，40∶60，0∶100，100％甲醇)，得到四环三萜葫芦素类化合物(22.5g)，将其中一部分直接处理后，进行高效液相色谱纯化，得到一些纯化的葫芦素类化合物(化合物I-a～e)；将另一部分通过二次正相硅胶开口柱分离(溶剂系统为氯仿∶甲醇＝99∶1，97∶3，95∶5，93∶7，91∶9，80∶20，70∶30，50∶50，100％甲醇)，再进行高效液相色谱纯化，得到另一些纯化的葫芦素类化合物(化合物I-f～g)。

本发明制备了7种葫芦素类化合物。经结构鉴定，这7种葫芦素类化合物包括：化合物I-a(1)为葫芦素B(CucurbitacinB)；化合物I-b(2)为23，24-dihydro-CucurbitacinB；化合物I-c(3)为23，24-dihydro-IsocucurbitacinB；化合物I-d(4)为CucurbitacinE；化合物I-e(5)为CucurbitacinD；化合物I-f(6)为CucurbitacinBglucoside；化合物I-g(7)CucurbitacinI。

实施例2对实施例1所得化合物I-a-g(1-7)的理化特征及化学结构的定性鉴定

化合物1-7的化学结构经¹HNMR、¹³CNMR、MS测试，并与文献数据对比后确定。

化合物(1)的理化性质：白色固体，(c0.9，inEtOH)；¹³CNMR(125MHz，inCD₃OD)：215.8(C-11)，214.0(C-3)，205.3(C-22)，171.9(C-31)，151.6(C-24)，142.1(C-5)，122.7(C-23)，121.3(C-6)，81.1(C-25)，80.3(C-20)，72.9(C-2)，72.8(C-16)，60.0(C-17)，51.8(C-13)，51.7(C-4)，50.0(C-9)，49.4(C-12)，49.4(C-14)，46.5(C-15)，44.2(C-8)，37.1(C-1)，34.9(C-10)，29.9(C-28)，26.9(C-27)，26.4(C-26)，25.3(C-21)，24.9(C-7)，21.9(C-29)，21.6(C-32)，20.7(C-18)，20.1(C-19)，19.5(C-30)；ESI-MSm/z：499[M+H-AcOH]⁺。

化合物(2)的理化性质：白色粉末，(c1.0，CHCl₃)；¹³CNMR(125MHz，inCDCl₃)：214.0(C-22)，212.9(C-3)，212.8(C-11)，170.2(C-31)，140.5(C-5)，121.0(C-6)，81.3(C-25)，79.0(C-20)，71.7(C-2)，71.0(C-16)，57.0(C-17)，50.9(C-13)，50.8(C-4)，48.8(C-9)，48.4(C-14)，48.0(C-12)，45.0(C-15)，42.4(C-8)，36.0(C-1)，34.8(C-24)，33.1(C-10)，30.8(C-23)，29.4(C-28)，26.2(C-27)，25.9(C-26)，24.9(C-21)，23.9(C-7)，22.3(C-32)，21.8(C-29)，20.0(C-18)，19.8(C-19)，18.7(C-30)；ESI-MSm/z：561[M+H]⁺。

化合物(3)的理化性质：无色针晶，(c1.0，CHCl₃)；¹³CNMR(125MHz，inCDCl₃)：212.6(C-11)，211.1(C-2)，202.5(C-22)，170.3(C-31)，140.0(C-9)，138.4(C-5)，122.1(C-6)，79.5(C-3)，79.4(C-25)，78.2(C-20)，71.7(C-16)，58.2(C-17)，50.5(C-13)，48.7(C-12)，48.3(C-14)，45.5(C-15)，42.4(C-8)，40.9(C-4)，36.5(C-1)，36.1(C-24)，32.3(C-10)，30.5(C-23)，27.7(C-29)，26.4(C-27)，25.9(C-26)，24.4(C-28)，23.9(C-21)，23.7(C-7)，21.2(C-32)，20.0(C-19)，19.2(C-18)，18.5(C-30)；ESI-MSm/z：501[M+H-AcOH]⁺。

化合物(4)的理化性质：白色粉末，(c1.0，CHCl₃)；¹³CNMR(125MHz，inCDCl₃)：212.7(C-11)，202.5(C-22)，198.6(C-3)，170.2(C-31)，152.0(C-24)，144.5(C-2)，136.7(C-5)，120.8(C-6)，120.4(C-23)，114.8(C-1)，79.3(C-25)，78.2(C-20)，71.3(C-16)，58.2(C-17)，50.7(C-13)，48.8(C-9)，48.8(C-12)，48.1(C-14)，47.5(C-4)，45.6(C-15)，41.6(C-8)，34.7(C-10)，27.9(C-29)，26.4(C-27)，25.8(C-26)，24.0(C-21)，23.6(C-7)，21.9(C-32)，20.2(C-28)，20.2(C-19)，19.8(C-18)，18.3(C-30)；ESI-MSm/z：579[M+Na]⁺。

化合物(5)的理化性质：白色晶体，(c1.0，MeOH)；¹³CNMR(125MHz，inCDCl₃)：213.1(C-11)，212.9(C-3)，202.3(C-22)，154.6(C-24)，141.2(C-5)，120.4(C-6)，119.8(C-23)，78.3(C-20)，72.8(C-25)，71.3(C-2)，70.8(C-16)，58.4(C-17)，50.8(C-4)，50.4(C-13)，48.6(C-9)，48.6(C-12)，48.5(C-14)，45.9(C-15)，41.6(C-8)，36.7(C-1)，34.9(C-10)，30.6(C-26)，28.8(C-27)，28.5(C-28)，24.4(C-7)，23.9(C-21)，20.6(C-19)，20.2(C-18)，20.1(C-29)，19.4(C-30)；ESI-MSm/z：499[M-H₂O+H]⁺。

化合物(6)的理化性质：白色固体，(c2.0，MeOH)；¹³CNMR(125MHz，inCD₃OD)：215.0(C-11)，213.5(C-3)，205.1(C-22)，171.7(C-31)，151.2(C-24)，141.1(C-5)，122.4(C-23)，121.2(C-6)，104.1(C-1’)，81.4(C-25)，80.5(C-20)，79.8(C-2)，78.4(C-5’)，77.5(C-3’)，75.1(C-2’)，71.5(C-16)，71.3(C-4’)，62.7(C-6’)，60.1(C-17)，52.2(C-4)，51.2(C-13)，49.3(C-9)，49.2(C-12)，49.1(C-14)，46.4(C-15)，44.0(C-8)，35.6(C-1)，35.2(C-10)，29.2(C-29)，26.5(C-27)，26.2(C-26)，25.3(C-21)，24.5(C-7)，21.5(C-32)，21.4(C-30)，20.3(C-18)，20.1(C-19)，18.8(C-28)；ESI-MSm/z：721[M-H]^-。

化合物(7)的理化性质：白色粉末，(c1.56，CHCl₃)；¹³CNMR(125MHz，inCDCl₃)：212.6(C-11)，202.5(C-22)，198.1(C-3)，155.2(C-24)，144.3(C-2)，136.7(C-5)，120.3(C-6)，119.1(C-23)，114.8(C-1)，78.3(C-20)，71.7(C-16)，71.2(C-25)，57.6(C-17)，50.9(C-13)，48.9(C-9)，48.8(C-12)，48.3(C-14)，47.6(C-4)，45.2(C-15)，41.3(C-8)，34.7(C-10)，29.6(C-26)，29.2(C-27)，27.7(C-28)，23.7(C-21)，23.4(C-7)，20.1(C-29)，20.1(C-19)，20.0(C-18)，18.4(C-30)；ESI-MSm/z：532[M+H₂O]⁺。

实施例3四环三萜葫芦素类化合物及化合物I-a延长酵母细胞的复制性寿命

四环三萜葫芦素类化合物和化合物I-a在抗衰老体外筛选模型中，显著延长酵母细胞的复制性寿命。

酿酒酵母是单细胞的真核生物，很长时间以来用于真核细胞程序的研究。由于与动物水平具有高度同源性，例如：在酵母中发现的显著延长其寿命的基因Sir2，在小鼠水平上也发现了具有相同功能的同源性基因SIRT1，这些研究成果对于衰老过程的认识以及寻找延缓衰老措施都起到作用重要；因而近年来酿酒酵母被广泛用于衰老过程的研究。酵母用抗衰老研究有很多优势，它是第一个拥有完整基因组数据的真核细胞生物，寿命较短，因而研究周期较短。酿酒酵母用于抗衰老研究的生命周期有两种：复制性寿命和时间寿命。复制性寿命是指一个酵母细胞在死亡之前所能分裂增殖的最大次数，也就是所能产生的子细胞最多个数。由于传统的复制性寿命研究操作复杂，Stefanie，Jarolim等人发现了一种特殊的本酵母--K6001--此菌株的子细胞在葡萄糖培养基中不会产生后代，只有母细胞可以产生后代，因而可以在显微镜下数出子细胞的个数从而确定酵母的复制性寿命，适合于天然产物初筛，因此本实验中采用了此酵母菌株。大量研究表明白藜芦醇(Resveratrol，缩写为Res.)可以显著延长多种生物的寿命，像酵母，线虫，果蝇，小鼠，恒河猴等，因此本实验中采用白藜芦醇作为阳性对照。本发明发现的四环三萜葫芦素类混合物和化合物可以显著得延长酵母细胞的复制性寿命，且其活性与阳性对照白藜芦醇相当。

1、实验方法：

(1)将-30度保存的K6001酵母菌株用5ml无菌水洗涤三次，除去其中的甘油。加入1ml无菌水，吹打使其悬浮，取出300μl加入到10ml半乳糖液体培养基(1％的酵母粉，2％的蛋白胨，3％的半乳糖)中。将其放入摇床，28度振摇培养48小时，使其恢复生长能力。

(2)从摇床中取出培养好的酵母，取出1ml用5ml无菌水洗涤三次，除去其中的液体培养基，用血球计数板计数。

(3)在培养皿中加入5ml的葡萄糖固体培养基(1％的酵母粉，2％的蛋白胨，2％的葡萄糖，2％的琼脂粉)，待培养基凝固后，向其表面加入不同浓度的样品，待乙醇挥干后，再加入4000个酵母，在28度恒温下培养48小时。

(4)显微镜下随机数出40个母细胞产生的子细胞个数，作图分析。其中的阳性对照为白藜芦醇。

2、实验结果：

与阴性对照比较，四环三萜葫芦素类化合物在500ng/ml浓度下及化合物I-a在10nM，100nM浓度下显著延长酵母细胞的复制性寿命(p＜0.05)。其活性与阳性对照10μM白藜芦醇(Res.)相当(见图1～2)。

Claims

1.一种葫芦素类化合物在制备预防或治疗衰老性疾病的药物中的应用，所述化合物为I-a~g，结构式如下：

。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物含有药学上可接受的赋形剂。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型为固体制剂或液体制剂，给药途径为肠道、非肠道给药。