CN102297905A - 用手性柱分离鉴定及制备葫芦素混合物中单体物质的hplc方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用手性柱分离鉴定葫芦素混合物的HPLC方法，所述的HPLC方法的工艺条件为：色谱柱采用以直链淀粉类衍生物为固定相的手性柱，流动相为异丙醇、乙醇、甲醇、乙腈、正己烷、异己烷、正戊烷、三氟乙酸、冰醋酸中的两种以上的混合物，检测波长为220nm～270nm。本发明的方法具有操作简单、准确度高，专属性强的特点，可以很好地分离葫芦素混合物中胡芦素B、异葫芦素B、二氢葫芦素B、葫芦素E等物质，并可用于从胡芦素混合物中制备各种葫芦素单体，亦可用于准确测定葫芦素原料及其制剂中各种葫芦素的含量。

Description

用手性柱分离鉴定及制备葫芦素混合物中单体物质的HPLC方法

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种葫芦素混合物的分离、制备及鉴定，更具体的是涉及采用手性柱进行葫芦素混合物的分离、鉴定和制备。

背景技术

葫芦素(Cucurbitacins)是一类高度氧化三萜类成分，在植物中的分布很广，有二百余种之多。药理实验表明，葫芦素具有抗肿瘤、抗化学致癌、保肝、提高免疫力等多种生物活性，我国从甜瓜蒂中提取的葫芦素制剂已经用于临床，其片剂收载于卫生部药品标准《中药成方制剂》第十九册。临床试验证明其对原发性肝癌和肝炎的治疗有显著疗效。葫芦素片用于治疗慢性肝炎(药学通报1986，21(6)：357葫芦素片)，经上海、北京、重庆等地十三家医院临床使用，其有效率为75.2％，显效率为44.6％。临床上观察到葫芦素片能较全面地改善慢性肝炎常见症状和主要体征，并有明显的降酶、降浊和降胆红质作用，停药后不引起S-GPT反跳，对蛋白倒置和高球蛋白血症也有明显的纠正作用，还能提高慢性肝炎患者的非特异性细胞免疫能力，无明显毒副作用。此外，葫芦素片还能用于治疗原发性肝癌，经上海、北京、广西等地六家医院临床观察，统计169例，有效率69％，显效率39％。临床观察表明，该药与5-氟脲嘧啶比较，其改善症状、消除肝痛、缩小瘤体、延长生存期、恢复体力等，均优于对照组，且无一般化疗药物的毒副作用(中草药1987，18(10)：21治疗肝炎、肝癌新药葫芦素片；新药与临床1984，3(2)：21葫芦素治疗原发性肝癌50例临床观察；中草药1992，23(11)：605葫芦素的药理与临床应用)。还有作者将葫芦素片与化疗药联合，治疗中晚期肝癌，中位生存期由单一化疗药的6.1±7.12月，提高到12.5±7.54月(癌症1989，8(6)：434葫芦素片加化疗药治疗中晚期原发性肝癌的临床疗效观察)。葫芦素类物质多为水中难溶性化合物，其制剂的体外溶出与体内吸收均存在较大问题，从而影响药物疗效的发挥。解决难溶性药物水溶性的一个重要方法是采用纳米技术，我们在完成国家973课题(国家重点基础研究发展计划2009CB903302)时发现，纳米化过程中，药物的表面积大大增加，光解、水解等稳定性问题更易产生，建立合理的分析方法极为重要。

目前用于临床的葫芦素提取物以葫芦素B为主要成分，其中还包含葫芦素E等多种成分，而其法定质量标准中仅对葫芦素B进行了测定，规定葫芦素原料中含葫芦素B不低于60％，对于其他成分未进行控制，这对于药品的安全性、有效性和质量可控性都是极为不利的。在欧美国家上市销售的药品中，包括原料药和制剂均应有它的杂质列表，对生产制造和精制工艺中产生的，含量超过0.1％的杂质均需要进行结构确证，并进行相关的毒理学研究，目前国内对药品中杂质控制的要求已经达到甚至超过了国际标准，因此分离葫芦素原料中的杂质并对其进行结构确证是非常有必要的。文献报道葫芦素类化合物的分离多采用硅胶柱色谱法，但由于各种葫芦素的结构极为相似，此法分离效果较差，存在操作繁琐、重复性不好、并且使用到氯仿、苯等有毒试剂的缺点，导致各种葫芦素单体的制备较为困难。

葫芦素含量测定的方法大多采用反相高效液相色谱法，部颁标准《中药成方制剂》第十九册中，对葫芦素原料及片剂中的葫芦素B进行了测定，亦有文献报道用高效液相色谱法测定葫芦素片的含量及均匀度(药物分析杂质1991，11(4)：245高效液相色谱法用于葫芦素片的含量及片剂均匀度测定)，还有人研究了用HPLC法测定滴丸剂中葫芦素B的含量(中草药2003，34(5)：421RP-HPLC法测定葫芦素滴丸中葫芦素B的含量)。最近，李晓峰等采用HPLC同时测定葫芦素原料中葫芦素B和葫芦素E的含量(李晓峰刘克非邓意辉HPLC法同时测定葫芦素原料中葫芦素B和葫芦素E的含量沈阳药科大学学报2010 27(02)：123-125)。我们在实验中发现，葫芦素(包括瓜蒂素)中除了葫芦素B、E外，尚有几种其他成分，而同时测定葫芦素原料药与制剂中葫芦素B及其共存物质含量的方法尚未见报道。在本发明的相关实验中，曾使用C18柱、C8柱、氨基柱、纯硅胶柱等常用色谱柱，均不能有效的分离以上化合物。

发明内容

为解决现有技术存在的上述问题，发明人旨在提供一种分离效果好、操作简单、准确度高和专属性强的高效液相色谱法(HPLC方法)，用于分离鉴定葫芦素混合物，测定出葫芦素混合物中各种葫芦素单体的含量，并可制备出各种葫芦素单体。

为实现本发明的目的，发明人提供如下技术方案：

一种用手性柱分离鉴定葫芦素混合物的HPLC方法，其色谱工艺条件为：

色谱柱：采用以表面涂布有直链淀粉类衍生物的硅胶作为固定相的手性柱.

流动相：来自异丙醇、乙醇、甲醇、乙腈、正己烷、异己烷、正戊烷、三氟乙酸、冰醋酸中的两种以上的混合物。

检测波长：220nm～270nm

流速：1.0～4.0mL/min

进样量：0.001mL至1.0mL

柱温：10～40℃

用于制备葫芦素化合物中各单体的条件为：

色谱柱：以表面涂布有直链淀粉类衍生物的硅胶作为固定相的手性柱。

流动相：异丙醇、乙醇、甲醇、乙腈、正己烷、异己烷、正戊烷、三氟乙酸、冰醋酸中的两种以上的混合物。

检测波长：220nm～270nm

流速：1.0～30.0mL/min

进样量：0.1mL至10.0mL

柱温：10～40℃

作为优选方案，根据本发明所述的用手性柱分离鉴定葫芦素混合物的HPLC方法，其中，所述的直链淀粉类衍生物是直链淀粉2-三(3，5-2二甲苯基氨基甲酸酯)或直链淀粉-三(S-a-苯乙基氨基甲酸酯)。

作为优选方案，根据本发明所述的用手性柱分离鉴定葫芦素混合物的HPLC方法，其中，所述的流动相混合物中正己烷、异己烷、正戊烷的体积比例为20％～90％，异丙醇、乙醇、甲醇、乙腈的体积比例为1％～50％，三氟乙酸、冰醋酸的体积比例为0％～2％。

作为优选方案，根据本发明所述的用手性柱分离鉴定葫芦素混合物的HPLC方法，其中，所述的葫芦素混合物配制为0.01～10mg/mL浓度的样品用于分离鉴定。

作为优选方案，根据本发明所述的用手性柱分离鉴定葫芦素混合物的HPLC方法，其中，所述的葫芦素混合物分离为葫芦素B、异葫芦素B、二氢葫芦素B、3-表-异葫芦素B和葫芦素E五种单体。

可以理解的是，根据高效液相色谱法的原理，就可以得到各种葫芦素单体在葫芦素混合物中的含量。

本发明还提供由上述的用手性柱分离鉴定葫芦素混合物的HPLC方法制备的各种葫芦素单体。根据各种葫芦素单体的出峰时间分别收集分离出的液体产物，得到含五种葫芦素的溶液，再经减压蒸发除去溶剂，即可得到葫芦素B及四种杂质的纯品。

作为优选方案，根据本发明所述的用手性柱分离鉴定葫芦素混合物的HPLC方法制备的各种葫芦素单体，其中，所述的葫芦素单体包括葫芦素B、异葫芦素B、二氢葫芦素B、3-表-异葫芦素B和葫芦素E五种单体。

发明人在实验中发现，以葫芦素原料中富集的杂质混合物(其中含葫芦素B约15％)为对象进行分离研究，使用直链淀粉类衍生物的手性色谱柱对葫芦素混合物具有很好的分离效果，得到了葫芦素B等五种葫芦素单体，所得四个杂质单体经紫外光谱(UV)、红外光谱(IR)、质谱(MS)、核磁共振谱(¹H NMR、¹³CNMR、¹H-¹H COSY、HSQC和HMBC)表征，分别确定其结构为葫芦素E、异葫芦素B、3-表-异葫芦素B和二氢葫芦素B。

本发明采用以直链淀粉类衍生物为固定相的手性柱，如分析型的

AD-H手性柱，即可建立一种可以同时测定葫芦素B及其相关的四种杂质的分析方法，能更好的控制葫芦素原料及其制剂的质量。所述的

AD-H手性柱是将直链淀粉2-三(3，5-2二甲苯基氨基甲酸酯)键合在硅胶载体上制成的，样品分子与固定相之间的相互作用主要是氢键、π-π相互作用和空间位置作用。

为更好说明本发明的优点，发明人对色谱柱的选择、流动相的选择及检测波长等方面一一做下述详述。

对照实验例1不同色谱柱对葫芦素混合物分离效果的比较

样品：精密称取葫芦素混合物约10mg，置10mL量瓶中，加适量乙醇超声使溶解，并定容至刻度，摇匀，过滤，取续滤液，得供试品溶液，即用无水乙醇配制1mg/mL的葫芦素混合物溶液。

本实验考察了C18柱、C8柱、氨基柱、纯硅胶柱对葫芦素混合物的分离效果，并与

AD-H手性柱进行比较。

液相色谱条件：

柱温：室温，检测波长220nm，流速：1.0mL·min^-1，进样量：20μL。

结果如下的表1：

表1不同色谱柱对葫芦素混合物分离效果的结果

色谱柱填料及规格	流动相组成	色谱峰个数
			CenturySIL C8(4.6×250mm，5μm)	乙腈/水(45/55)	3
DiamonsiL C18(4.6×200mm，5μm)	甲醇/水(68/32)	2
			Kromasil Si(4.6×200mm，5μm)	正己烷/异丙醇(88/12)	2
HYPERSIL NH2(4.6×250mm，5μm)	正己烷/乙醇(65/35)	1
			ChiralpakAD-H(4.6×200mm，5μm)	正己烷/异丙醇(80/20)	5

实验结果表明，C18柱(如图1所示)、C8柱、氨基柱、纯硅胶柱对葫芦素的分离效果较差，色谱峰存在重叠现象，并且通过改变流动相的比例及种类，均未能有明显的改善。这说明相对于其他色谱柱，

AD-H手性柱对各种葫芦素具备更好的分离效果。

大赛璐多糖衍生物正相手性柱(即

AD-H手性柱)的固定相为表面涂敷了手性多聚物(直链淀粉或纤维衍生物)的球形硅胶。由于是物理涂敷，必须注意流动相的选择。发明人经过大量研究筛选出了适宜本发明的流动相，所述的流动相可来自异丙醇、乙醇、甲醇、乙腈、正己烷、异己烷、正戊烷、三氟乙酸、冰醋酸中的两种以上的混合物。

对照实验例2检测波长的确定

用无水乙醇配制1mg/mL的葫芦素混合物溶液，以正己烷/异丙醇(82∶18)为流动相，经

AD-H手性柱(4.6×200mm，5μm)进行分离，用二极管阵列检测器(DAD)测定各成分的紫外光谱，结果表明各葫芦素的最大吸收波长分别为葫芦素E(234nm、270nm)、异葫芦素B(232nm)、3-表-异葫芦素B(232nm)、二氢葫芦素B(220nm)、葫芦素B(230nm)，所以可以根据不同的需要选择220nm～270nm作为检测波长。

具体的，本发明优选实施例中制备五种葫芦素单体及测定葫芦素混合物中各种单体含量可按如下方法操作：

一、用

AD-H手性柱制备五种葫芦素

用

AD-H手性柱(制备型，

10μm)，流动相为异丙醇、乙醇、甲醇、乙腈、正己烷、异己烷、正戊烷、三氟乙酸、冰醋酸中的两种或两种以上的混合物，流速根据实际情况可选择1.0～4.0mL/min，进样量的选择范围为0.1mL至1.0mL，检测波长为220nm。

将葫芦素混合物用乙醇溶解至适当的浓度，按照以上色谱条件进样，分段收集流出液，减压蒸发除去溶剂，得到各葫芦素纯品。

二、测定葫芦素原料中各成分的含量

使用分析型的AD-H手性柱(

5μm)，流动相可在用

AD-H手性柱制备五种葫芦素的基础上适当调整各溶剂的比例，流速为1.0mL/min，进样量为20μL，检测波长为220nm。

将葫芦素原料用流动相溶解，制成合适的浓度，并配制各葫芦素纯品的混合对照溶液，分别进样，测定各成分的含量。

另外，本发明所建立的方法可以用于任意一种及一种以上的葫芦素化合物含量测定，也可用于采用葫芦素单体或者混合物制备的各种制剂(如纳米粒、片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液、注射液、软膏、凝胶剂、脂质体、乳剂、栓剂等固体制剂、半固体制剂、液体制剂及气雾剂、粉雾剂等)的含量测定与质量控制。

本发明的优点是：

本发明所建立的方法具有操作简单、准确度高，专属性强的优点。采用此方法可以很好地分离葫芦素E、异葫芦素B、3-表-异葫芦素B、二氢葫芦素B和葫芦素B，极大地降低了制备各葫芦素单体的难度，并能够准确测定葫芦素原料及其制剂中各成分的含量，可以更好的控制葫芦素原料及其制剂的质量。

附图说明

图1为本发明对照实验例1中C18色谱柱对葫芦素混合物分离效果。

图2为本发明对照实施例1用

AD-H手性柱制备五种葫芦素的色谱图，图中(1)是葫芦素E；(2)是异葫芦素B；(3)是3-表-异葫芦素B；(4)是二氢葫芦素B；(5)是葫芦素B。

图3为葫芦素B及其四种杂质化合物的结构式。

图4为本发明实施例2用不同流动相经

AD-H手性柱分析葫芦素原料(葫芦素混合物)的色谱图。

图4-A是流动相为正己烷∶乙醇∶异丙醇∶冰醋酸＝70∶20∶10∶0.1的色谱图；

图4-B是流动相为正己烷∶乙醇∶三氟乙酸＝70∶30∶0.1的色谱图；

图4-C是流动相为正己烷∶异丙醇＝80∶20的色谱图。

图5为葫芦素B及四种杂质对照品混合液的色谱图。

图中(1)是葫芦素E；(2)是异葫芦素B；(3)是3-表-异葫芦素B；(4)是二氢葫芦素B；(5)是葫芦素B。

图6为本发明实施例4葫芦素原料含量测定的色谱图。

图中(1)是葫芦素E；(2)是异葫芦素B；(3)是3-表-异葫芦素B；(4)是二氢葫芦素B；(5)是葫芦素B。

图7-A、图7-B分别是本发明实施例1制备的杂质化合物(2)的¹H-NMR和¹³C-NMR图谱。

图8-A、图8-B分别是本发明实施例1制备的杂质化合物(3)的¹H-NMR和¹³C-NMR图谱。

图9-A、图9-B分别是本发明实施例1制备的杂质化合物(4)的¹H-NMR和¹³C-NMR图谱。

图10-A、图10-B分别是本发明实施例1制备的杂质化合物(5)的¹H-NMR和¹³C-NMR图谱。

具体实施方式

下面结合说明书附图对本发明做详细的阐述，应当理解下述的优选实施例只用于对本发明技术方案的揭示，本发明的技术方案并不限于下述的优选实施例。

一仪器和试药

1仪器

Bruker Esquire 2000质谱仪(沈阳药科大学测试中心)

BrukerAVANCE 400超导核磁共振波谱仪(沈阳药科大学测试中心)

高效液相色谱仪：P230高压恒流泵(分析型及制备型)

UV228紫外-可见检测器，DAD二极管阵列检测器(大连依利特科学仪器有限公司)

色谱柱：Dimansil C₁₈色谱柱(200mm×4.6mm，5μm，迪马公司)

AD-H色谱柱(大赛璐化学工业有限公司)半制备型ODS(

10μm)色谱柱(大连依利特科学仪器有限公司)三用紫外线分析仪(温州永嘉上塘教学仪器厂)RE-52型旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)DZF-250干燥箱(郑州长城科工贸有限公司)TN型托盘式扭力天平(上海第二天平仪器厂)

2试药

葫芦素BE原料(天津药物研究院药业有限责任公司，含葫芦素B 68.7％)葫芦素B(纯度98.7％，由葫芦素BE原料制得)葫芦素混合物(本实验室自制)

实施例1用AD-H手性柱制备五种葫芦素

1实验仪器及色谱条件

P230高压恒流泵(制备型)，UV228紫外-可见检测器(大连依利特科学仪器有限公司)；Chiralpak AD-H手性柱(制备型，

10μm大赛璐化学工业有限公司)

流动相：正己烷∶异丙醇∶乙醇∶三氟乙酸(75∶15∶10∶0.1)(v/v)

流速：3.0mL/min

柱温：室温

检测波长：220nm

进样量：200μL

2样品的制备

取葫芦素混合物(含15％葫芦素B)200mg，加乙醇5mL使其溶解，经0.45μm微孔滤膜过滤，进样(分离效果如图2所示)，分段收集流出液，得到含五种葫芦素的溶液，减压蒸发除去溶剂，得到葫芦素B及四种杂质的纯品。

3四种杂质化合物的结构确证

四个杂质化合物经紫外光谱(UV)、红外光谱(IR)、质谱(MS)、核磁共振谱(¹H NMR、¹³C NMR、¹H-¹H COSY、HSQC和HMBC)表征，其波谱数据与文献1～3报道的葫芦素E、异葫芦素B、3-表-异葫芦素B和二氢葫芦素B的波谱数据一致分别确定其结构为葫芦素E、异葫芦素B、3-表-异葫芦素B和二氢葫芦素B(如图3所示)。

4四种杂质化合物的结构鉴定

1、化合物(2)

化合物(2)：白色固体粉末，m/z：579.3[M+Na]，1135.6[2M+Na]，结合¹H-NMR及¹³C-NMR数据，确定分子式为C₃₂H₄₄O₈，¹H-NMR(600MHz，in CDCl3)(如图7-A)共显示44个氢：高场区可以明显观察到9条甲基谱线分别为δH0.99(3H，s)，1.03(3H，s)，1.25(3H，s)，1.36(3H，s)，1.39(3H，s)，1.44(3H，s)，1.54(3H，s)，1.57(3H，s)，2.01(3H，s)，其中2.01(3H，s)为乙酰基上的甲基信号。此外，分子中含有三个双键，δH5.95(1H，d，J＝2.4Hz)，δH5.77(1H，m)，δH7.05(1H，d J＝15.6Hz)，δH6.46(1H，d J＝15.6Hz)其中δH7.05(1H，d J＝15.6Hz)和δH6.46(1H，d J＝15.6Hz)为反式双键信号；该化合物还含有1个O-CH，δH4.37(1H，m)和1个与不饱和碳相连的羟基，δH5.90(1H，s)。

¹³C-NMR(600MHz，in CDCl₃)(如图7-B)共显示32条谱线：δ_C 213.1、202.7、198.9和170.5为4个羰基碳信号，4个烯碳信号(δ_C 152.2、121.0、120.6和115.1)；高场方向可以观察到3个连氧碳信号(δ_C 79.6、78.9和71.6)，该化合物的碳氢数据与文献报道的葫芦素E的碳氢数据基本一致，鉴定结构为葫芦素E(cucurbitacin E，CuE)。

2、化合物(3)

化合物(3)：白色固体粉末，m/z：581.3[M+Na]，1139.6[2M+Na]结合¹H-NMR及¹³C-NMR数据，确定分子式为C₃₂H₄₆O₈，¹H-NMR(600MHz，in CDCl₃)(如图8-A)共显示46个氢：1个反式双键，δ_H7.04(1H，d J＝15.6Hz)和δ_H6.43(1H，d J＝15.6Hz)；1个烯丙位单烯氢，δ_H5.94(1H，d，J＝6.0Hz)和2个连氧叔碳的氢信号(8_H4.34(1H，t J＝7.8Hz)和δ_H3.90(1H，s))。高场区可以明显观察到9个甲基信号分别为δ_H0.81(3H，s)，δ_H0.97(3H，s)，1.18(3H，s)，1.26(6H，s)，1.35(3H，s)，1.42(3H，s)，1.53(3H，s)，1.56(3H，s)，2.00(3H，s)，其中2.00(3H，s)为乙酰基上的甲基信号。

¹³C-NMR(600MHz，in CDCl₃)(如图8-B)共显示32条谱线：4个羰基碳信号(δ_C 211.8、210.6、202.4和170.2)，四个双键碳信号(δ_C 138.2、152.0、121.9和120.3)；高场方向可以观察到4个连氧碳信号(δ_C 80.2、79.3、78.1和71.3)；该化合物氢谱中3.90单峰的存在，是区别异葫芦素B结构(3-OH)与其它葫芦素的主要证据，鉴定其结构为异葫芦素B(Isocucurbitacin B，Iso-B)。

3、化合物(4)

化合物(4)：白色固体粉末，m/z：581.3[M+Na]，1139.6[2M+Na]，结合¹H-NMR及¹³C-NMR数据，确定分子式为C₃₂H₄₆O₈，¹H NMR(600MHz，in CDCl₃)(如图9-A)谱中，δ6.45(1H，d，J＝15.6)和δ7.04(1H，d，J＝15.6)为一对反式双键氢质子信号，δ4.37(1H，t，J＝7.8)和δ4.13(1H，s)为2个连氧次甲基质子信号，δ2.01(3H，s)为1个连在羰基上的甲基质子信号，δ0.85(3H，s)、0.97(3H，s)、1.08(3H，s)、1.32(3H，s)、1.39(3H，s)、1.42(3H，s)、1.54(3H，s)和δ1.57(3H，s)为8个连在季碳上的甲基质子信号；

¹³C NMR(600MHz，in CDCl₃)(如图9-B)谱中给出32个碳信号，其中δ212.5、211.0和δ202.4为3个羰基碳信号，δ170.3为1个酯羰基碳信号，δ151.4、139.9、122.0和δ120.3为4个双键碳信号，δ79.4、79.3、78.1和δ71.3为4个连氧碳信号；以上信息，与化合物3(异葫芦素B)极为相似，其¹H-NMR数据与文献中3-epi-isocucurbitacin B数据基本一致，推断化合物4为3-epi-isocucurbitacin B(3-表-异葫芦素B)。根据以上文献及化合物4的一维和二维NMR(HMQC、HMBC和¹H-¹H COSY)光谱数据，对其进行了碳氢信号全归属(如表2所示)。

表2化合物(4)的¹H-NMR，¹³C-NMR数据

4化合物(5)

化合物(5)：白色固体粉末，m/z：583.3[M+Na]，1143.7[2M+Na]结合¹H-NMR及¹³C-NMR数据，确定分子式为C₃₂H₄₈O₈，¹H-NMR(300MHz，in CDCl₃)(如图10-A)共显示48个氢：低场区有4个氢，其中有1个是烯氢，高场区有44个氢。从低场区可以推知化合物含有以下结构单元：1个烯丙位单烯氢(δ_H5.79，1H，d，J＝5.4Hz)和2个连氧叔碳的氢信号(δ_H4.43，1H，m)和δ_H4.36(1H，s)。高场区可以明显观察到9个甲基信号分别为δ_H0.97(3H，s)，1.07(3H，s)，1.27(3H，s)，1.34(3H，s)，1.36(3H，s)，1.42(3H，s)，1.43(3H，s)，1.45(3H，s)，1.96(3H，s)，其中1.96(3H，s)为乙酰基上的甲基信号。

¹³C-NMR(300MHz，in CDCl₃)(如图10-B)共显示32条谱线：低场区有4个羰基碳信号(δ_C 213.9、213.0、212.1和170.3)、两个双键碳信号(δ_C 140.4和δ_C 120.4)；高场方向可以观察到4个连氧碳信号(δ_C 81.3、78.9、71.6和71.0)，该化合物与葫芦素B的主体结构相同，氢谱中比葫芦素B少了一个反式双键的信号，该化合物的碳氢数据与文献报道的二氢葫芦素B的碳氢数据基本一致，鉴定结构为二氢葫芦素B(dihydrocucurbitacin B，Dihydro-B)，并结合文献归属了全部碳氢信号(如表3所示)。

表3化合物(5)的¹H-NMR，¹³C-NMR数据

实施例2不同流动相下分析型

AD-H手性柱对葫芦素原料的分离

其他操作同实施例1，不同之处在于：

以体积比正己烷∶乙醇∶异丙醇∶冰醋酸＝70∶20∶10∶0.1为流动相对葫芦素混合物进行分离鉴定，其分离效果如图4-A所述。

或体积比正己烷∶乙醇∶三氟乙酸＝70∶30∶0.1为流动相对葫芦素混合物进行分离鉴定，其分离效果如图4-B所述。

或以体积比正己烷∶异丙醇＝80∶20为流动相对原料进行分离，其分离效果如图4-C所示。

实施例3葫芦素混合物中的各种葫芦素单体含量测定方法学考察

标准曲线精密称取葫芦素E、异葫芦素B、3-表-异葫芦素B、二氢葫芦素B和葫芦素B对照品适量，用流动相溶解并稀释成浓度约为40μg·mL^-1(葫芦素E、异葫芦素B、3-表-异葫芦素B)、0.1mg·mL^-1(二氢葫芦素B)和0.7mg·mL^-1(葫芦素B)的混合溶液作为对照储备液。精密量取对照品储备液1.0、3.0、5.0、7.0、9.0mL置10mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，制得系列对照品溶液。精密吸取系列对照溶液各20μL，注入液相色谱仪，同时记录5种成分色谱峰的峰面积。分别以浓度C(μg·mL^-1)为横坐标，以峰面积A为纵坐标，进行线性回归计算，葫芦素E、异葫芦素B、3-表-异葫芦素B、二氢葫芦素B和葫芦素B的回归方程分别为A＝9734.9C+1806.1，r＝0.9997；A＝13310.1C+2265.7，r＝0.9997；A＝7639.4C+880.5，r＝0.9998；A＝3190.4C+2298.5，r＝0.9999；A＝12902.4C+4869.3，r＝0.9997，结果表明，葫芦素E浓度在4.06～36.49μg·mL^-1范围内，异葫芦素B浓度在4.11～36.99μg·mL^-1范围内，3-表-异葫芦素B浓度在4.09～36.81μg·mL^-1范围内，二氢葫芦素B浓度在10.16～91.44μg·mL^-1范围内，葫芦素B浓度在70.5～634.5μg·mL^-1范围内均与峰面积呈良好的线性关系。

回收率精密称取已知含量的葫芦素原料9份，用流动相配制成浓度均为1.0mg·mL^-1的溶液，精密量取5.0mL置10mL量瓶中，分别加入1.5、2.5、3.5mL对照储备液，用流动相稀释至刻度，摇匀，制备低、中、高3种质量浓度的供试溶液，每个浓度制备3份样品。按设定的色谱条件进行测定，结果表明葫芦素E、异葫芦素B、3-表-异葫芦素、二氢葫芦素B和葫芦素B的平均回收率分别为100.1％(RSD＝0.95％，n＝9)，99.2％(RSD＝0.83％，n＝9)，101.0％(RSD＝1.5％，n＝9)，98.8％(RSD＝1.6％，n＝9)，101.1％(RSD＝1.7％，n＝9)。

实施例4葫芦素原料的各单体成分的含量测定

色谱柱：

AD-H色谱柱(4.6mm×200mm，5μm)；流动相：正己烷-异丙醇-乙醇-三氟乙酸(v/v，70∶15∶15∶0.1)；柱温：35℃；检测波长220nm；流速：1.0mL·min^-1；进样量：20μL。

精密称取葫芦素原料约25mg，置50mL量瓶中，加流动相超声使溶解，并稀释至刻度，摇匀，过滤，取续滤液，得供试品溶液。按上述色谱条件注入液相色谱仪进行测定，记录峰面积，用外标法计算五种成分的含量，原料中葫芦素E、异葫芦素B、3-表-异葫芦素B、二氢葫芦素B和葫芦素B的含量分别为4.1％、4.8％、3.0％、11.2％、68.9％。

实施例5葫芦素制剂中各成分的含量测定

采用球磨机制备葫芦素纳米混悬剂，其平均粒径为236nm，药物浓度约为2.5mg/ml。

精密移取纳米混悬剂1.0ml，于离心干燥机中除去溶剂，加入适量流动相溶解并定量转移至置5mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，过滤，取续滤液，得供试品溶液。按“实施例4”的色谱条件进行测定，记录峰面积，用外标法计算五种成分的含量。纳米混悬剂中葫芦素E、异葫芦素B、3-表-异葫芦素B、二氢葫芦素B和葫芦素B的含量分别为4.6％、4.3％、3.8％、10.6％、68.1％。

实施例6葫芦素片剂中各成分的含量测定

色谱柱：直链淀粉-三(S-a-苯乙基氨基甲酸酯)色谱柱(4.6mm×200mm，5μm)；流动相：正戊烷-异丙醇-甲醇-冰醋酸(v/v，65∶10∶25∶0.1)；柱温：40℃；检测波长220nm；流速：1.0mL·min^-1；进样量：100μL。

流动相也可采用异戊烷-异丙醇-乙腈-三氟乙酸(v/v，65∶10∶25∶0.1)，其他不变。

测定：取葫芦素片剂10片，称重，置于乳钵中研细，乙醇提取3遍，挥除乙醇，所得提取物以流动相转移至2.0mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，过滤，取续滤液进行测定。结果片剂中各成分的含量分别为：葫芦素E 5.1％、异葫芦素B 3.8％、3-表-异葫芦素B 2.9％、二氢葫芦素B 15.1％和葫芦素B 62.8％。

Claims (8)

1.一种用手性柱分离鉴定及制备葫芦素混合物制剂中单体物质的HPLC方法，其特征在于，所述方法的工艺条件为：

色谱柱：以表面涂布有直链淀粉类衍生物的硅胶作为固定相的手性柱

流动相：异丙醇、乙醇、甲醇、乙腈、正己烷、异己烷、正戊烷、三氟乙酸、冰醋酸中的两种以上的混合物

检测波长：220nm～270nm

流速：1.0～30.0mL/min

进样量：0.001mL至10.0mL

柱温：10～40℃。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，当流速为1.0～4.0mL/min，进样量为0.001mL至0.1mL时用于分离鉴定葫芦素混合物中单体物质。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，当流速为1.0～30.0mL/min，进样量为0.1mL至10.0mL时用于制备葫芦素混合物中单体物质。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的直链淀粉类衍生物是直链淀粉2-三(3，5-2二甲苯基氨基甲酸酯)或直链淀粉-三(S-a-苯乙基氨基甲酸酯)。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的流动相混合物中正己烷、异己烷、正戊烷的体积比例为20％～90％，异丙醇、乙醇、甲醇、乙腈的体积比例为1％～50％，三氟乙酸、冰醋酸的体积比例为0％～2％。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的葫芦素混合物配制为0.01～10mg/mL浓度的样品用于分离鉴定。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的葫芦素混合物中单体物质为葫芦素B、异葫芦素B、二氢葫芦素B、3-表-异葫芦素B和葫芦素E五种单体。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的制剂包括固体制剂、半固体制剂、液体制剂、气雾剂、粉雾剂。

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