CN102659549B - 热淋清颗粒原料提取短叶苏木酚的方法和制剂质控方法 - Google Patents
热淋清颗粒原料提取短叶苏木酚的方法和制剂质控方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102659549B CN102659549B CN 201210092489 CN201210092489A CN102659549B CN 102659549 B CN102659549 B CN 102659549B CN 201210092489 CN201210092489 CN 201210092489 CN 201210092489 A CN201210092489 A CN 201210092489A CN 102659549 B CN102659549 B CN 102659549B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- flow point
- ethyl acetate
- brevifolin
- phase
- herba polygoni
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- FBUBVLUPUDBFME-UHFFFAOYSA-N Xanthoxylin Chemical compound COC1=CC(O)=C(C(C)=O)C(OC)=C1 FBUBVLUPUDBFME-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 60
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 59
- FXVRSKPFWVYCPN-UHFFFAOYSA-N brevifolin Natural products OC1=C(O)C(O)=CC(C(O2)=O)=C1C1=C2C(=O)CC1 FXVRSKPFWVYCPN-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 30
- 239000002994 raw material Substances 0.000 title claims abstract description 25
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title abstract description 17
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 title abstract description 4
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 90
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 48
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims abstract description 26
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims abstract description 25
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 16
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 14
- OXGUCUVFOIWWQJ-HQBVPOQASA-N quercitrin Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](C)O[C@H]1OC1=C(C=2C=C(O)C(O)=CC=2)OC2=CC(O)=CC(O)=C2C1=O OXGUCUVFOIWWQJ-HQBVPOQASA-N 0.000 claims abstract description 12
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 11
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 15
- 239000006286 aqueous extract Substances 0.000 claims description 13
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 12
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 10
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 claims description 9
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 claims description 9
- 239000002024 ethyl acetate extract Substances 0.000 claims description 8
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 6
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 6
- 238000007654 immersion Methods 0.000 claims description 5
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 claims description 4
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 claims description 4
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 claims description 3
- 238000005070 sampling Methods 0.000 claims description 3
- 238000013517 stratification Methods 0.000 claims description 3
- 238000007670 refining Methods 0.000 claims description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 abstract description 11
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 abstract description 4
- 241000764065 Persicaria capitata Species 0.000 abstract description 3
- LUJAXSNNYBCFEE-UHFFFAOYSA-N Quercetin 3,7-dimethyl ether Natural products C=1C(OC)=CC(O)=C(C(C=2OC)=O)C=1OC=2C1=CC=C(O)C(O)=C1 LUJAXSNNYBCFEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 3
- PUTDIROJWHRSJW-UHFFFAOYSA-N Quercitrin Natural products CC1OC(Oc2cc(cc(O)c2O)C3=CC(=O)c4c(O)cc(O)cc4O3)C(O)C(O)C1O PUTDIROJWHRSJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 3
- OXGUCUVFOIWWQJ-XIMSSLRFSA-N acanthophorin B Natural products O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@H](C)O[C@H]1OC1=C(C=2C=C(O)C(O)=CC=2)OC2=CC(O)=CC(O)=C2C1=O OXGUCUVFOIWWQJ-XIMSSLRFSA-N 0.000 abstract description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 abstract description 3
- 239000008187 granular material Substances 0.000 abstract description 3
- OEKUVLQNKPXSOY-UHFFFAOYSA-N quercetin 3-O-beta-D-glucopyranosyl(1->3)-alpha-L-rhamnopyranosyl(1->6)-beta-d-galactopyranoside Natural products OC1C(O)C(C(O)C)OC1OC1=C(C=2C=C(O)C(O)=CC=2)OC2=CC(O)=CC(O)=C2C1=O OEKUVLQNKPXSOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 3
- QPHXPNUXTNHJOF-UHFFFAOYSA-N quercetin-7-O-beta-L-rhamnopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(C)OC1OC1=CC(O)=C2C(=O)C(O)=C(C=3C=C(O)C(O)=CC=3)OC2=C1 QPHXPNUXTNHJOF-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 3
- 239000013558 reference substance Substances 0.000 abstract 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 24
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 22
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 15
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 15
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 15
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 14
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 8
- 238000011160 research Methods 0.000 description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 7
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- 238000003809 water extraction Methods 0.000 description 6
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 5
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 5
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 4
- 238000010262 high-speed countercurrent chromatography Methods 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 3
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 3
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 3
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 3
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 241001251200 Agelas Species 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000004880 Polyuria Diseases 0.000 description 2
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000035619 diuresis Effects 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- LNTHITQWFMADLM-UHFFFAOYSA-N gallic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC(O)=C(O)C(O)=C1 LNTHITQWFMADLM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000411851 herbal medicine Species 0.000 description 2
- 238000005192 partition Methods 0.000 description 2
- 238000011155 quantitative monitoring Methods 0.000 description 2
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 2
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 2
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 2
- 101000623895 Bos taurus Mucin-15 Proteins 0.000 description 1
- 241000463291 Elga Species 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 241001529246 Platymiscium Species 0.000 description 1
- 241000219050 Polygonaceae Species 0.000 description 1
- 241000205407 Polygonum Species 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003260 anti-sepsis Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000002451 electron ionisation mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 229930003935 flavonoid Natural products 0.000 description 1
- 150000002215 flavonoids Chemical class 0.000 description 1
- 235000017173 flavonoids Nutrition 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 235000004515 gallic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229940074391 gallic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- GBMDVOWEEQVZKZ-UHFFFAOYSA-N methanol;hydrate Chemical compound O.OC GBMDVOWEEQVZKZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 1
- 239000011236 particulate material Substances 0.000 description 1
- 150000007965 phenolic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000009048 phenolic acids Nutrition 0.000 description 1
- 239000004810 polytetrafluoroethylene Substances 0.000 description 1
- 229920001343 polytetrafluoroethylene Polymers 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000013094 purity test Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 239000012925 reference material Substances 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000010421 standard material Substances 0.000 description 1
- 238000012916 structural analysis Methods 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 229940126680 traditional chinese medicines Drugs 0.000 description 1
- 238000002137 ultrasound extraction Methods 0.000 description 1
- 230000002485 urinary effect Effects 0.000 description 1
- 238000001291 vacuum drying Methods 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Extraction Or Liquid Replacement (AREA)
Abstract
本发明涉及从热淋清颗粒的原料例如头花蓼水提物中提取短叶苏木酚和/或槲皮苷的方法，还涉及使用短叶苏木酚对热淋清颗粒制剂进行质量监控的方法。本发明提取短叶苏木酚和/或槲皮苷的方法中使用高速逆流色谱仪(HSCCC)并且使用正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水(1∶4～6∶0.8～1.2∶4～6)的混合物作为HSCCC溶剂系统进行分离。本发明以高纯度和高收率从热淋清颗粒的原料中获得短叶苏木酚，并且该成分可作为监控头花蓼制剂例如热淋清颗粒质量的方法中使用的对照品。
Description
技术领域
本发明属中药技术领域，涉及从热淋清颗粒的原料中提取短叶苏木酚的方法，例如从头花蓼水提物中提取短叶苏木酚的方法，还涉及从热淋清颗粒的原料或头花蓼水提物中提取短叶苏木酚和槲皮苷的方法。本发明还进一步涉及使用短叶苏木酚对热淋清颗粒制剂进行质量监控的方法。
背景技术
头花蓼为蓼科植物头花蓼Polygonum capitatum Buch.-Ham.ex D.Don的干燥全草或地上部分，收载于《贵州省中药材民族药材质量标准》2003年版，具清热利湿、抗菌消炎、利尿通淋等功效(贵州省食品药品监督管理局.贵州省中药材民族药材质量标准[M].贵阳：贵州科技出版社，2003：147)。头花蓼是贵州常用苗药，是贵州省中药现代化重点发展的“六大苗药”和重点培育发展的“七大中药产业链”的品种之一。
以头花蓼为主要原料的热淋清颗粒在临床上用于治疗泌尿系统感染，被《中国药典》2010年版一部收载，但国内外至今对头花蓼的研究报道较少，已有的文献初步认为黄酮类、酚酸类为头花蓼的有效成分[1-4]。目前《中国药典》2010年版仅以没食子酸作为热淋清颗粒的定量监控指标，仍然期待有更有效的可靠的评价指标。
本发明人致力于对热淋清颗粒的原料药(即头花蓼水提物，为粉末状物)进行系统的全成分分析，期待寻找可用于定量监控热淋清制剂例如热淋清颗粒制剂的新方法。众所周知，监控成分复杂的物质例如中药提取物 需要有明确的监控指标，例如需要有该中药中含有的、可得到、易得到的标准物质，并且对于某一中药提取物，如果能够以多种化学物质同时监控其质量，则对于药品的质量把控将会比单一组分控制更加合理。
因此，从热淋清颗粒的原料药(即头花蓼水提物，为粉末状物)中发现新的化学物质仍是本领域技术人员期待的，以便为药品质量控制提供新的途径。
发明内容
本发明的目的在于为头花蓼制剂例如热淋清颗粒提供药品质量控制的新途径。本发明人发现，采用独特的方法处理热淋清颗粒制剂的原料药即头花蓼水提物，寻找到一种未曾在头花蓼药材中报道的新物质即短叶苏木酚(brevifolin)，该方法在获得该新物质以及其它化学单体方面的收率具有有益的工业价值的优点。本发明基于此发现而得以完成。
为此，本发明第一方面提供了从热淋清颗粒的原料(例如头花蓼水提物)中提取短叶苏木酚(和/或槲皮苷)的方法，该方法包括以下步骤：
(1)取头花蓼水提物，用60～95％乙醇浸泡5～24小时，超声处理10～120min，过滤，滤液蒸发干燥，残余物用水溶解，过滤，滤液用乙酸乙酯萃取至上层无色，将乙酸乙酯层合并，蒸发干燥，得到乙酸乙酯粗提物；
(2)将步骤(1)所得乙酸乙酯粗提物加载到高速逆流色谱仪(HSCCC)中，用正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水(1∶4～6∶0.8～1.2∶4～6)的混合物作为HSCCC溶剂系统进行分离，收集40～90min的流分；必要时重复此分离和收集的操作；将所述流分蒸除溶剂，得到头花蓼二次分离原料物；
(3)在分液漏斗中，按乙酸乙酯∶正丁醇∶0.008～0.012mol/L的磷酸氢二钾溶液＝3.36～5.04∶0.64～0.96∶5的比例(体积比)配置约1500mL的两相溶剂系统，静置分层成上相(固定相)和下相(流动相)，超声脱气；
(4)采用单线圈、头接尾的洗脱方式，首先使管路充满固定相(上相)，主机正转，然后泵入流动相，待流动相流出，两相溶剂在柱中达到平衡状态时，取步骤(2)所得头花蓼二次分离原料物，溶于等体积的上下相中，用注射器进样；
(5)用紫外检测器对流分进行检测，检测波长为250～290nm，同时记录色谱图，根据色谱图用流分收集器自动收集流分，每3min收集一管；分离时间在270min以上；
(6)收集30～40min之间出峰的流分作为流分I，200～260min之间出峰的流分作为流分II；
(7)分别除去流分I和流分II的溶剂，流分I和流分II分别相应地得到组分I和组分II，任选地分别对组分I和组分I进一步精制，组分I为短叶苏木酚，组分II为槲皮苷。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(1)中，所用乙醇是70～90％乙醇，优选80％乙醇。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(1)中，乙醇浸泡的时间是8-15小时，例如10-12小时。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(1)中，超声处理的时间是15-60min，优选20-45min，例如约30min。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(2)中，所述HSCCC溶剂系统是正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水(1∶4.5～5.5∶0.9～1.1∶4.5～5.5)的混合物，在一个实施方案中，所述HSCCC溶剂系统是正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水(1∶5∶1∶5)的混合物。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(2)中，收集45～80min的流分，优选收集53～74min的流分。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(2)中，所述分离和收集的操作重复2～6次，优选重复3～5次，优选重复4次；并合并所收集的流分。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(3)中，所述两相溶剂系统的比例为3.78～4.62∶0.72～0.88∶5，优选所述两相溶剂系统的比例为4.2∶0.8∶5。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(3)中，所述磷酸氢二钾溶液的浓度为0.009～0.011mol/L，优选为0.01mol/L。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(4)中，主机正转的转速为700～1000rpm，优选800～900rpm，优选860rpm。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(4)中，向管路泵入流动相的流速为1～3mL/min，优选1.5～2.5mL/min，优选约2mL/min。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(5)中，所述检测波长为260～280nm，优选270～275nm，优选272nm。
本发明第二方面提供了一种监测头花蓼制剂(例如热淋清颗粒制剂)质量的方法，该方法包括使用短叶苏木酚作为对照品，使用高效液相色谱法进行检测，测定该制剂中短叶苏木酚的含量、或者不同批次制剂中短叶苏木酚含量的变异、或者每批产品的测定值与均值之间差异。
根据本发明第二方面的方法，其中所述的高效液相色谱法的色谱条件是：使用C18色谱柱，流动相为甲醇和0.2％的磷酸水溶液，梯度洗脱，其中有机相(甲醇)的梯度比例如下：5％(0min)～30％(5min)～65％(20min)～65％(24min)～5％(25min)～5％(30min)，检测波长为272nm。
根据本发明第二方面的方法，其中所述的高效液相色谱法的色谱条件是：使用固定相为Venusil MP C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm，Agela Technologie公司)，流动相为甲醇和0.2％的磷酸水溶液，梯度洗脱，其中有机相的梯度比例如下：5％(0min)～30％(5min)～65％(20min)～65％(24min)～5％(25min)～5％(30min)；检测波长为272nm，流速为1.0mL/min，柱温为室温，进样量为20μL。
下面对本发明的各个方面和特点作进一步的描述。本发明所引述的所 有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。
在本发明中，热淋清颗粒的原料可以是指以任何方法由中药材头花蓼提取获得提取物，该提取物可用于制备热淋清颗粒剂。在一个实施方案中，热淋清颗粒的原料是指头花蓼水提物。在一个实施方案中，头花蓼水提物由如下制法得到的：取头花蓼加水煎煮二次，每次1.5小时，煎液滤过，滤液合并，浓缩至适量，滤过，喷雾干燥，即得。
本发明的目的在于探索热淋清颗粒质量控制的新方法。本发明人从热淋清颗粒的原料头花蓼水提物粉末中，提取、分离并鉴定到一种新成分-短叶苏木酚(brevifolin)，从而为热淋清颗粒的质量控制提供了新方案。在本发明的一个有益的方法中，应用高速逆流色谱法(high-speed counter-current chromatography，HSCCC)对头花蓼水提粉末的乙酸乙酯粗提物进行第一步分离(溶剂系统为正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水＝1∶5∶1∶5)，对所得的流分进行二次分离，(溶剂系统为乙酸乙酯∶正丁醇∶0.01mol/L的磷酸氢二钾溶液4.2∶0.8∶5)，上相为固定相，主机转速为860rpm，流速为2.0mL/min，检测波长为272nm，进样量为0.25g。本发明某些实施方案可以得到纯度为96.2％和98.4％的两种产物，经结构鉴定分别为短叶苏木酚和槲皮苷(quercitrin)。其中短叶苏木酚为首次从该属植物中分离得到。本发明从头花蓼水提粉末中提取分离到短叶苏木酚；使用的高速逆流色谱法简便、快速，适合于中药有效成分的研究和单体的提取制备。
附图说明
图1描绘了头花蓼二次分离原料物、HSCCC所得流分I和流分II进 行HPLC检测的色谱图，三种物料所得图谱分别是图中的A、B、C。
图2描绘了头花蓼二次分离原料物的高速逆流色谱图
具体实施方式
通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。
A、试验中使用到的一些仪器知材料
Mk5QuilkPrep500高速逆流色谱仪(英国AECS公司)，配有聚四氟乙烯管(PTFE)离柱(管直径2.16mm，分离体积120mL，β值为0.5～0.8)，SeriesII恒流泵(Scientific System公司)，SPD-10Avp紫外可见检测器(苏州岛津仪器公司)，N2000色谱数据工作站(浙江大学智达信息工程有限公司)。
Waters1525高效液相色谱仪，Waters717型自动进样器，2996型二极管阵列检测器，Empower色谱工作站(美国waters公司)。
TSQ型三重四极杆液相色谱-串联质谱联用仪(美国San Jose公司)，Finnigan Surveyor MS泵、Finnigan Surveyor自动进样器、Xcalibur1.3工作站、LC Quan数据处理软件(美国Thermo Finnigan公司)。
电恒温水浴锅(广东省汕头市医用设备厂)，SY-1000E多用途恒温超声提取机(北京弘祥隆生物技术开发有限公司)，DZF-6051SH型真空干燥箱(益恒实验仪器有限公司)，AL204型电子天平(瑞士Metter Toledo公司)，Dragon-med移液枪(Toppette公司)，RE-3000旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)，Anke TGL-16B离心机(海安亭科学仪器厂)。
TENSOR37红外光谱仪(德国Bruker公司)，Bruker AvanceIII400MHz核磁共振仪(德国Bruker公司)，LCMS-IT-TOF高分辨质谱仪(日本岛津公司)。
甲醇(色谱纯，TEDIA公司)，乙醇(分析纯，天津市富宇精细化工有限公司)，乙酸乙酯(分析纯，天津市富宇精细化工有限公司)，正丁醇(分析纯，天津市光复科技发展有限公司)，醋酸(分析纯，广州化学试剂厂)，磷酸(分析纯，广州化学试剂厂)，超纯水(PureLab Ultra超纯水系统，英国ELGA公司)。
头花蓼水提物由贵州威门药业股份有限公司提供，并且是参照2010年版中国药典第992页“热淋清颗粒”项中的制法得到的，即：取头花蓼加水煎煮二次，每次1.5小时，煎液滤过，滤液合并，浓缩至适量，滤过，喷雾干燥，即得，收率10.07％。
实施例1：头花蓼水提粉末乙酸乙酯粗提物的制备
取头花蓼水提粉末150g，用10倍量的80％乙醇浸泡过夜，超声萃取30min，过滤，将滤液用旋转蒸发仪蒸干，加入150mL水溶解，过滤，滤液用乙酸乙酯萃取至上层无色。将乙酸乙酯层合并，用旋转蒸发仪蒸干，得到头花蓼水提粉末乙酸乙酯粗提物(浸膏)12.7g，密封于干燥器中备用。
实施例2：头花蓼二次分离原料物的制备
称取实施例1所得乙酸乙酯浸膏1.0g，利用HSCCC溶剂系统正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水(1∶5∶1∶5)进行分离，收集53min至74min的流分，重复该操作四次，将所收集的流分合并，用旋转蒸发仪蒸干溶剂，得到头花蓼二次分离原料物0.25g。
实施例3：高效液相色谱法测定试验品的纯度
高效液相色谱条件：固定相为Venusil MP C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm，Agela Technologie公司)，流动相为甲醇和0.2％的磷酸水溶液，梯度洗脱，其中有机相的梯度比例如下：5％(0min)～30％(5min)～65％(20min)～65％(24min)～5％(25min)～5％(30min)。检测波长为272nm，流速为1.0mL/min，柱温为室温，进样量为20μL。
用干HPLC纯度测定的头花蓼二次分离原料物供试液的制备：取实施例2所得头花蓼水二次分离原料物0.0150g，加50％甲醇水定容于10mL容量瓶中，配成浓度为1.50mg/mL的溶液，超声30min，经0.45μm的微孔滤膜滤过，滤液备用。
对上述头花蓼二次分离原料物供试液，以及HSCCC所得各流分进行检测，其中产物的纯度按面积归一化法计算，分析的典型HPLC图见图1。图1中的图A显示的是头花蓼二次分离原料物以上述HPLC法测试的HPLC图，图中显示I和II两个色谱峰，其分别对应于组分I和组分II。图1中的图B显示的是HSCCC中的流分I以上述HPLC法测试的HPLC图，图中基本上仅显示了组分I的峰。图1中的图C显示的是HSCCC中的流分II以上述HPLC法测试的HPLC图，图中基本上仅显示了组分II的峰。
实施例4：高速逆流色谱分离条件的选择
根据高速逆流色谱溶剂系统选择的黄金规则和待分离物质的性质，本研究考察了多个溶剂系统，根据分配系数公式K＝CU/CL(CU为上相中待分离物质的浓度，CL为下相中待分离物质的浓度)计算其分配系数K，结果见表1。
表1
由表1数据可知，在乙酸乙酯∶正丁醇∶0.01mol/L磷酸氢二钾溶液、乙酸乙酯∶正丁醇∶氨水和乙酸乙酯∶正丁醇∶0.025mol/L碳酸氢钠溶液系统中，成分I、II的K值与对应的α值比较为理想。但在实际分离中发现， 乙酸乙酯∶正丁醇∶氨水和乙酸乙酯∶正丁醇∶0.025mol/L碳酸氢钠溶液系统的pH值不稳定，造成待分离物的出峰时间大大推后，且有严重的拖尾现象。仅有乙酸乙酯∶正丁醇∶0.01mol/L磷酸氢二钾溶液系统出峰时间稳定。试验结果还显示，当乙酸乙酯∶正丁醇∶0.01mol/L磷酸氢二钾溶液＝4.2∶0.8∶5时，成分I、II均能得到良好的分离效果，且分离时间较短，产物纯度高(均大于95％)，该溶剂系统可用于进行分离。
实施例5：高速逆流色谱分离制备
在分液漏斗中配置两相溶剂系统，按乙酸乙酯∶正丁醇∶0.01mol/L磷酸氢二钾溶液＝4.2∶0.8∶5的比例配置，溶液约1500mL。静置分层，其中上相为固定相，下相为流动相，超声脱气。采用单线圈、头接尾的洗脱方式，首先使管路充满固定相(上相)，主机正转，转速为860rpm，然后以2.0mL/min泵入流动相。待流动相流出，两相溶剂在柱中达到平衡状态时，取实施例2所得头花蓼二次分离原料物0.25g，溶于等体积的上下相中，用注射器进样，进样量9.7mL。用紫外检测器对流分进行检测，检测波长为272nm，同时记录色谱图，结果见图2。根据色谱图用流分收集器自动收集流分，每3min收集一管。分离时间为270min以上。
实施例6：纯度分析与结构鉴定
利用HPLC分析实施例5中HSCCC分离所得各个流分的成分，判定其纯度。利用UV、1R、LC/MS、TOF-MS、1H NMR及13C NMR对所得产物进行结构分析。
在实施例5分离的图2中，收集峰1和2的流分，分别作为流分I和流分II，利用HPLC分析HSCCC分离所得流分I和流分II的纯度。流分I经分析为单一物质，纯度为96.2％；流分II为单一物质，纯度为98.4％，结果见图1。
将流分1、2分别挥干溶剂，得到5.0mg未知物I(可称为组份I)以及78.9mg未知物II(可称为组份II)。
在一些额外的试验中，使用以上实施例1～6相同的方法，唯一差别是 在高速逆流色谱分离中使用以乙酸乙酯-正丁醇-0.01mol/L磷酸氢二钾溶液三者不同比例配制的两相溶剂系统。在一个试验中，三者比例为＝3.36∶0.8∶5，组分I和组分II在纯度达95％以上时的产量分别低于1.55mg和低于32.5mg。在一个试验中，三者比例为＝5.04∶0.8∶5，组分I和组分II在纯度达95％以上时的产量分别低于1.25mg和低于27.5mg。在一个试验中，三者比例为＝4.2∶0.64∶5，组分I和组分II在纯度达95％以上时的产量分别低于1.75mg和低于21.0mg。在一个试验中，三者比例为＝4.2∶0.96∶5，组分I和组分II在纯度达95％以上时的产量分别低于1.20mg和低于25.8mg。在一个试验中，三者比例为＝3.78∶0.88∶5，组分I和组分II在纯度达95％以上时的产量分别为4.7mg和72.5mg。在一个试验中，三者比例为＝4.62∶0.72∶5，组分I和组分II在纯度达95％以上时的产量分别为4.4mg和69.8mg。
实施例7：结构鉴定
对以上获得的未知物I和未知物II进行结构鉴定，结果如下：
未知物I：
黄棕色粉末，UVλmax(nm)MeOH：215.1，278.6，353.4。
IR(KBr)cm-1：3432.56，2927.03，1677.55，1623.02，1516.28，1396.80，1305.54，1101.89。
TOF-MS：247.0230[M-H]-，EI-MS：246.88[M-H]-，218.86，190.95，172.95。
1H-NMR(400MHz，DMSO)δ(ppm)：7.73(1H，s，H-7)，3.18(2H，m，H-8)，2.50(2H，m，H-9)。
13C NMR(101MHz，DMSO)δ(ppm)：195.49(C-10)，160.53(C-1)，149.47(C-5)，144.94(C-2)，144.18(C-4)，141.44(C-6)，140.23(C-3)，115.44(C-3a)，113.19(C-7a)，108.18(C-7)，32.97(C-9)，23.81(C-8)。
以上数据与文献[6-8]报道的短叶苏木酚一致。
未知物II：
黄色粉末，UVλmax(nm)MeOH：257.4，351.0。
IR(KBr)cm-1：3445.77，3131.92，1650.76，1358.95，1263.86，1138.46，1067.13，994.37，951.73，863.89，766.24，618.59。
TOF-MS：447.0932[M-H]-。
1H-NMR(400MHz，DMSO)δ12.66(1H，s，OH-5)，10.89(1H，s，OH-7)，9.72(1H，s，OH-4’)，9.34(1H，s，OH-3’)，7.30(1H，d，J＝2.1Hz，H-2’)，7.25(1H，dd，J＝2.1，2.2Hz，H-6’)，6.88(1H，d，J＝8.3Hz，H-5’)，6.39(1H，d，J＝1.9Hz，H-8)，6.21(1H，d，J＝1.9Hz，H-6)，5.25(1H，d，J＝1.4Hz，H-1”)，3.14～4.95(4H，m，H-2”，5”)，0.81(3H，d，J＝6.0Hz，H-6”)。
13C NMR(101MHz，DMSO)δ(ppm)：177.7(C-4)，164.1(C-7)，161.2(C-5)，157.2(C-9)，156.4(C-2)，148.4(C-4’)，145.2(C-3’)，134.2(C-3)，121.1(C-6’)，120.8(C-1’)，115.6(C-5’)，115.4(C-2’)，104.0(C-10)，101.8(C-1”)，98.6(C-6)，93.6(C-8)，71.1(C-4”)，70.5(C-3”)，70.3(C-2”)，70.0(C-5”)，17.4(C-6”)。
以上数据与文献[3，9]报道的槲皮苷一致。
在进一步的研究中，本发明人发现，使用组分I即以上纯度达96.2％的短叶苏木酚作为对照品，使用上文所述HPLC条件，对本发明人照2010年版中国药典第992页“热淋清颗粒”项中的制法得到的10个不同批次的热淋清颗粒产品进行检测，结果显示10批热淋清颗粒产品均检测出短叶苏木酚，并且每批的测定值与均值之间差异不超过20％。
本发明在以上实验中，应用溶剂系统选择的黄金规则探索了12个分离系统，发现利用氨水或强酸弱碱盐将系统的pH值调至7.5左右时，能得到较佳的α值。实际试验中发现，含有氨水和NaHCO3的系统pH不稳定，容易随着温度的变化而改变，使待分离物的出峰时间大大延迟，影响分离纯化。故选用pH较为稳定的乙酸乙酯∶正丁醇∶0.01mol/L磷酸氢二钾溶液系统进行分离。在此系统的基础上考察了乙酸乙酯、正丁醇和0.01mol/L磷酸氢二钾溶液的不同比例，在综合考虑了分离度和分离时间等因素后，最终确定采用乙酸乙酯∶正丁醇∶0.01mol/L磷酸氢二钾溶液＝4.2∶0.8∶5系统进行分离。而对流动相流速、旋转管转速进行优化后发现流动相流速为2.0mL/min，旋转管转速为860rpm时分离效果最佳。在此分离条件下可以从0.25g头花蓼二次分离原料物中分离出5.0mg短叶苏木酚和78.9mg槲皮苷。
头花蓼是一种在临床上应用很广的中草药，但是关于头花蓼基础研究的相关文献和报道并不多。本发明首次应用高速逆流色谱法从头花蓼水提粉末中提取分离了一新成分单体和另一化合物单体，经结构鉴定新发现成分为短叶苏木酚；另一化合物为槲皮苷。本研究为头花蓼化学成分的系统研究提供了一种高效的方法，适合于头花蓼以及中药有效成分的分离提取，有效成分单体的制备、鉴定研究。本研究为头花蓼中新标准物质的制备、有效部位的确定以及其药理学研究奠定了基础。
以下文献资料以其全部内容并入本文，有助于对本发明有更全面的了解：
[1]吴廼居，王德仁.石莽草化学成分的研究[J].中草药，1985，16(4)：5.
[2]刘志军，戚进，朱丹妮，等.头花蓼化学成分及抗氧化活性研究[J].中药材，2008，31(7)：995.
[3]于明，李占林，李宁，等.头花蓼的化学成分[J].沈阳药科大学 学报，2008，25(8)：633.
[4]李咏梅，龚元.头花蓼的化学成分及药理研究进展[J].贵州大学学报(自然科学版).2007，24(2)：205.
[5]Ito Y，Golden rules and pitfalls in selecting optimum conditions for high-speed counter-current chromatography[J].J Chromatogr A，2005，1065：145.
[6]，田瑛，孙立敏，刘细桥，等.中药地锦草酚性成分[J].中国中药杂志，2010，35(5)：613.
[7]王晓岚，郁开北，彭树林，等.铁苋菜地上部分的化学成分研究[J].中国中药杂志，2008，33(12)：1415.
[8]林佳，李琰，徐丽珍.石榴叶的化学成分研究[J].中南药学，2005，3(2)：70.
[9]Alessandra B，Matteo P，Rokia S，et al.Chemical composition and antioxidant activity of phenolic compounds from wild and cultivated Sclerocarya birrea(Anacardiaceae)leaves[J].J.Agric.Food Chem.2003，51：6689；6689。
Claims (10)
1.从热淋清颗粒的原料头花蓼水提物中提取短叶苏木酚和/或槲皮苷的方法，该方法包括以下步骤：
(1)取头花蓼水提物，用60～95%乙醇浸泡5～24小时，超声处理10～120min，过滤，滤液蒸发干燥，残余物用水溶解，过滤，滤液用乙酸乙酯萃取至上层无色，将乙酸乙酯层合并，蒸发干燥，得到乙酸乙酯粗提物；
(2)将步骤(1)所得乙酸乙酯粗提物加载到高速逆流色谱仪(HSCCC)中，用正己烷：乙酸乙酯：甲醇：水以体积比1:4.5～5.5:0.9～1.1:4.5～5.5的混合物作为HSCCC溶剂系统进行分离，收集40～90min的流分；必要时重复此分离和收集的操作；将所述流分蒸除溶剂，得到头花蓼二次分离原料物；
(3)在分液漏斗中，按乙酸乙酯:正丁醇:0.01mol/L的磷酸氢二钾溶液=3.78～4.62：0.72～0.88：5的体积比配置约1500mL的两相溶剂系统，静置分层成称为固定相的上相和称为流动相的下相，超声脱气；
(4)采用单线圈、头接尾的洗脱方式，首先使管路充满固定相，主机正转，速度为800～900rpm，然后泵入流动相，流速为1.5～2.5mL/min，待流动相流出，两相溶剂在柱中达到平衡状态时，取步骤(2)所得头花蓼二次分离原料物，溶于等体积的上下相中，用注射器进样；
(5)用紫外检测器对流分进行检测，检测波长为270～275nm，同时记录色谱图，根据色谱图用流分收集器自动收集流分，每3min收集一管；分离时间在270min以上；
(6)收集30～40min之间出峰的流分作为流分I，200～260min之间出峰的流分作为流分II；
(7)分别除去流分I和流分II的溶剂，流分I和流分II分别相应地得到组分I和组分II，任选地分别对组分I和组分II进一步精制，组分I为短叶苏木酚，组分II为槲皮苷。
2.根据权利要求1的方法，其中步骤(1)中，所用乙醇是70～90%乙醇。
3.根据权利要求1的方法，其中步骤(1)中，乙醇浸泡的时间是8-15小时。
4.根据权利要求1的方法，其中步骤(1)中，超声处理的时间是15-60min。
5.根据权利要求1的方法，其中步骤(2)中，所述HSCCC溶剂系统是正己烷：乙酸乙酯：甲醇：水以体积比1:5:1:5的混合物。
6.根据权利要求1的方法，其中步骤(2)中，收集45～80min的流分。
7.根据权利要求1的方法，其中步骤(3)中，所述两相溶剂系统的比例为4.2:0.8:5。
8.根据权利要求1的方法，其中步骤(4)中，主机正转的转速为860rpm。
9.根据权利要求1的方法，其中步骤(4)中，向管路泵入流动相的流速为2mL/min。
10.根据权利要求1的方法，其中步骤(5)中，所述检测波长为272nm。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 201210092489 CN102659549B (zh) | 2012-04-01 | 2012-04-01 | 热淋清颗粒原料提取短叶苏木酚的方法和制剂质控方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 201210092489 CN102659549B (zh) | 2012-04-01 | 2012-04-01 | 热淋清颗粒原料提取短叶苏木酚的方法和制剂质控方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102659549A CN102659549A (zh) | 2012-09-12 |
| CN102659549B true CN102659549B (zh) | 2013-12-18 |
Family
ID=46769162
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN 201210092489 Active CN102659549B (zh) | 2012-04-01 | 2012-04-01 | 热淋清颗粒原料提取短叶苏木酚的方法和制剂质控方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102659549B (zh) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104478686B (zh) * | 2014-03-20 | 2016-06-15 | 贵州大学 | 姜黄挥发油中芳姜黄酮对照品的制备方法 |
| CN105434555A (zh) * | 2015-12-30 | 2016-03-30 | 贵州弘康药业有限公司 | 一种热淋清制剂的制作方法 |
-
2012
- 2012-04-01 CN CN 201210092489 patent/CN102659549B/zh active Active
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| Golden rules and pitfalls in selecting optimum conditions for high-speed counter-current chromatography;Yoichiro I;《J Chromatogr A》;2005;第1065卷;145-168 * |
| Yoichiro I.Golden rules and pitfalls in selecting optimum conditions for high-speed counter-current chromatography.《J Chromatogr A》.2005,第1065卷 |
| 方炜等.高速逆流色谱法同时分离制备头花蓼中没食子酸和原儿茶酸.《天然产物研究与开发》.2011,第23卷 |
| 陈欣霞等.高速逆流色谱同时分离头花蓼中的没食子酸和短叶苏木酚酸.《中国中药杂志》.2010,第35卷(第15期), |
| 高速逆流色谱同时分离头花蓼中的没食子酸和短叶苏木酚酸;陈欣霞等;《中国中药杂志》;201008;第35卷(第15期);1957-1960 * |
| 高速逆流色谱法同时分离制备头花蓼中没食子酸和原儿茶酸;方炜等;《天然产物研究与开发》;2011;第23卷;299-303 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102659549A (zh) | 2012-09-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| He et al. | Separation of two constituents from purple sweet potato by combination of silica gel column and high-speed counter-current chromatography | |
| CN101891750A (zh) | 千金藤碱及其盐的制备方法 | |
| CN103145677A (zh) | 一种利用高速逆流色谱分离白木香叶片中活性成分的方法 | |
| CN104922196A (zh) | 小槐花总黄酮提取物的制备及质量检测方法 | |
| CN103450145A (zh) | 一种利用高速逆流色谱从苏木中分离制备巴西木素和原苏木素b的方法 | |
| CN101357933B (zh) | 二次高速逆流色谱分离射干中异黄酮类单体化合物的方法 | |
| CN102936275A (zh) | 一种丹参酮iia磺酸钠原料药中杂质的分离纯化方法 | |
| CN102659549B (zh) | 热淋清颗粒原料提取短叶苏木酚的方法和制剂质控方法 | |
| AU2020100932A4 (en) | Method for Determining Content of Kaempferol-3-O-rutinoside in Herba Et Radix Tetrastigmae Hemsleyana | |
| CN111560024B (zh) | 一种高速逆流色谱结合制备液相色谱从钩吻生物碱中分离钩吻生物碱单体的方法 | |
| CN103344717B (zh) | 一种白及高效液相色谱指纹图谱的建立方法及其标准指纹图谱 | |
| CN106496292A (zh) | 一种从栀子中同时制备6个环烯醚萜苷类成分的方法 | |
| CN103145775B (zh) | 高纯度棒柄花苷a的制备及其质量控制方法 | |
| CN103175928A (zh) | 一种软紫草和硬紫草的液相-圆二色谱（lc-cd）鉴定方法 | |
| CN103822888A (zh) | 赶黄草的质量检测方法 | |
| CN103940942B (zh) | 一种肠炎宁制剂的检测方法 | |
| CN103145729B (zh) | 银杏内酯b化合物及其制备方法 | |
| CN115368359A (zh) | 一种生物碱类抗氧化剂及其制备方法和应用 | |
| He et al. | Research progress on the separation of alkaloids from chinese medicines by column chromatography | |
| CN104557471A (zh) | 从大花红景天中同时制备克级高纯度酪醇、大花红天素及红景天苷的方法 | |
| CN103880895A (zh) | 一种利用高速逆流色谱分离纯化制备哈巴俄苷和斩龙剑苷a的方法 | |
| CN101906091B (zh) | 高速逆流色谱法一步制备分离鸢尾中鸢尾苷元的方法 | |
| CN103058859B (zh) | 一种香椿叶中没食子酸及其甲酯的同时制备及检测方法 | |
| CN102879502B (zh) | 细毡毛忍冬正品药材的检测方法 | |
| CN103130818B (zh) | 一种银杏内酯b化合物及其制备方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |