CN103145677A - 一种利用高速逆流色谱分离白木香叶片中活性成分的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用高速逆流色谱分离白木香叶片中活性成分的方法，其步骤为：常温下以渗漉法提取干燥粉碎后的白木香叶片，得到白木香叶片提取液浸膏；依次用石油醚、乙酸乙酯对该提取液浸膏各萃取3-4次，分别将石油醚萃取液和乙酸乙酯萃取液减压浓缩为浸膏；再将石油醚部位浸膏和乙酸乙酯部位浸膏分别用高速逆流色谱法分离得到活性成分A：7，4’-二甲氧基-5-羟基黄酮；将乙酸乙酯部位浸膏用硅胶柱层析粗分离后，再用高速逆流色谱分离得到活性成分B：3，5，7，3’，4’-五羟基-黄酮和活性成分C：3，5，7，4’-四羟基-黄酮。本发明分离出的活性成分损失少，分离速度快，纯度高，稳定，易于应用。
Description
【技术领域】
本发明涉及分离白木香叶片中活性成分的方法，该活性成分为抗癌活性成分和抗氧化活性成分，具体地涉及一种利用高速逆流色谱分离白木香叶片中活性成分的方法，即分离白木香叶片中抗癌和抗氧化活性成分的方法。
【背景技术】
国产沉香为瑞香科沉香属植物白木香（Aquilariasinensis(Lour.)Gilg）含有树脂的木材，是中医临床常用名贵药材，为广东著名的地产药材。白木香是国产沉香药材的来源植物，其叶片活性成分据报道具有抗氧化、镇痛、抗炎、调节糖尿病、抑制呼吸系统疾病等活性。
众所周知，癌症是当今全世界范围的医学难题。王红刚等[沉香叶抗肿瘤活性化学成分研究，林产化学与工业，2008，28(2):1-5]认为黄酮类化合物是沉香叶中所含的主要的一类化合物，并将白木香叶总提取物按极性大小分为石油醚层、乙酸乙酯层、正丁醇层、水层4个部位进行抗肿瘤活性筛选，发现乙酸乙酯层部位具有明显的抑制肿瘤细胞生长的活性；余伯阳等[中国专利，申请号200710019969.3]发现白木香叶提取物具有抑制小鼠H22肝癌的肿瘤生长作用，但该叶提取物是用溶剂提取样品原料所得的成分组成复杂的混合物，里面含有多种不同的化合物，提取物或萃取后的浸膏成分不清楚、结果难重复、成分间可能有相互作用等情况，在用药或药物研发中使用不方便，而高纯度的白木香叶抗癌作用的活性单体化合物及其分离纯化方法未见报道。
而传统的固-液柱色谱分离单体化合物时，大多需要一个月左右，同时需要使用大量的溶剂，分离成本高，对环境有很大的污染，得率一般小于5％，纯度需要多次细分才能达到95％。
高速逆流色谱（high-speed counter current chromatography，HSCCC）是一种独特的不用固态载体的液相分配色谱技术，是一种能实现连续有效分离的实用分离制备技术。在黄酮、生物碱、植物多酚、醌类、萜类、木脂素、香豆素、皂苷等天然植物化学成分的精细分离中都已有广泛的应用。在沉香药材和叶片化学成分的研究方法方面，活性成分的提取目前主要是有机溶剂浸提、柱层析等传统的方法。HSCCC技术是不用任何固态支撑体的液-液分配色谱技术，不会出现对于样品成分的不可逆吸附，对于黄酮类等容易在固-液色谱过程中被吸附和损耗的物质，是更加有效和经济的处理手段，利用HSCCC技术对白木香叶片的活性成分进行分离纯化，国内外尚未见报道。
【发明内容】
本发明的要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种高速逆流色谱法提纯白木香叶片中活性成分的方法，可以得到纯度很高的活性成分。
本发明为解决上述技术问题，采用以下技术方案：
一种利用高速逆流色谱分离白木香叶片中活性成分的方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）常温下用渗漉溶剂以渗漉法提取干燥粉碎后的白木香叶片得提取液，减压浓缩提取液后得到白木香叶片提取液浸膏；
（2）依次用石油醚、乙酸乙酯对白木香叶片提取液浸膏各萃取3-4次，分别将石油醚萃取液和乙酸乙酯萃取液减压浓缩，得到石油醚部位浸膏和乙酸乙酯部位浸膏；
（3）将石油醚部位浸膏和乙酸乙酯部位浸膏分别用高速逆流色谱法分离得到活性成分A：7，4’-二甲氧基-5-羟基黄酮；
（4）将乙酸乙酯部位浸膏用硅胶柱层析粗分离出含有目标成分的粗提物后，再将所述的粗提物用高速逆流色谱分离得到活性成分B：3，5，7，3’，4’-五羟基-黄酮和活性成分C：3，5，7，4’-四羟基-黄酮。
本发明步骤（1）中渗漉法所用的渗漉溶剂为60-80％体积浓度的丙酮水溶液或者75-95％体积浓度的乙醇水溶液，所述的渗漉溶剂的流速为2-3ml/min。
本发明中减压浓缩步骤中所用的设备为真空旋转蒸发仪。
本发明步骤（2）中用石油醚和乙酸乙酯对白木香叶片提取液进行萃取时，石油醚和乙酸乙酯作为萃取溶剂，其用量按照浸膏:萃取溶剂体积比=1:1，得到的石油醚部位浸膏的极性小于乙酸乙酯部位浸膏。
石油醚部位浸膏和乙酸乙酯部位浸膏经过活性鉴定，发现石油醚部位浸膏和乙酸乙酯部位浸膏均含有活性成分A：7，4’-二甲氧基-5-羟基黄酮，乙酸乙酯部位浸膏还含有活性成分B：3，5，7，3’，4’-五羟基-黄酮和活性成分C：3，5，7，4’-四羟基-黄酮。
因此，可以用以下参数条件分别对石油醚部位浸膏和乙酸乙酯部位浸膏进行高速逆流色谱分离得到活性成分A：
溶剂体系为正己烷:乙酸乙酯:甲醇:水体积比=（0.5~1.5）:（1~2）:（1~2）:（0.5~1.5），其中上相为流动相，下相为固定相。
高速逆流色谱主机顺时针转动，转速为750~900rpm，样品量40.0~60.0mg；固定相保留值为：65.4％~73.0％，流动相的流速为0.8~1.2ml/min；检测波长254nm；分离温度为17~23℃。
进样后40-66min收集活性成分A。
通过质谱和1H-NMR、13C-NMR图谱并参考相关文献确定活性成分A为7，4’-二甲氧基-5-羟基黄酮，该活性成分A又称为洋芹素-7，4’-二甲醚，其结构示为：
其中Me为甲基（-CH3）。
本发明中乙酸乙酯部位浸膏所含杂质较多，目标成分活性成分B和活性成分C含量少，直接用高速逆流色谱分离需要重复的次数多。
为了使高速逆流色谱分离顺利进行，本发明在乙酸乙酯部位浸膏分离活性成分B和活性成分C前加多一步用硅胶柱层析粗分离，使乙酸乙酯部位浸膏的目标成分富集，减少杂质，使得目标成分容易分离，用高速逆流色谱分离一次就能得到活性成分B和C的单体化合物。
具体的硅胶柱层析粗分离步骤为：先按以下体积比、顺序的石油醚-乙酸乙酯体系进行梯度洗脱：5:1→3:1→2:1→1:1→0:1，再按以下体积比、顺序的乙酸乙酯-甲醇体系进行梯度洗脱：20:1→10:1→5:1→1:1，每500ml接收为1个馏分至减压浓缩已无浸膏即更换下一梯度的洗脱剂，全部梯度的洗脱剂洗脱完成后合并薄层色谱主点相同的馏分后，对合并的各馏分进行检测确定含有活性成分B和C的馏分为含有目标成分的粗提物。根据样品洗脱的实际情况，不同洗脱体系不同梯度的接收馏分数不同，本发明中具体为石油醚-乙酸乙酯体系的5个梯度各接收馏分数目为38、17、54、129、54个，乙酸乙酯-甲醇体系4个梯度各接收馏分数目为24、41、15、20个，即共收集到400个流份，合并馏分后共得到34个组分，其中第20个组分经检测含有目标活性成分B和C，为含有目标成分的粗提物。
再用以下参数条件对乙酸乙酯部位浸膏的粗提物进行高速逆流色谱分离得到活性成分B和活性成分C：
溶剂体系为正己烷:乙酸乙酯:甲醇:水体积比=（0.5~1.5）:（0.5~1.5）:（0.5~1.5）:（0.5~1.5），其中上相为固定相，下相为流动相；
高速逆流色谱主机顺时针转动，转速为750~900rpm；样品量40.0~60.0mg，固定相保留值为：72.0％~75.9％，流动相的流速为0.8~1.2ml/min；检测波长为254nm；分离温度为17~23℃。
进样后52-72min收集活性成分B，90-120min收集活性成分C。
通过质谱和1H-NMR、13C-NMR图谱并参考相关文献确定活性成分B为3，5，7，3’，4’-五羟基-黄酮，活性成分C为3，5，7，4’-四羟基-黄酮。该活性成分B又称为槲皮素，为首次在瑞香科植物中分离得到，拓宽了该成分的原料来源，其结构示为：
该活性成分C又称为山萘酚，为首次在瑞香科植物中分离得到，拓宽了该成分的原料来源，其结构示为：
HSCCC溶剂体系应满足要求：1、不造成样品的分解和变性；2、足够高的样品溶解度；3、样品在系统中有合适的分配系数值：目标样品的分配系数K接近于1（一般K值为0.5-2.0较好，实践经验发现，K值大于2小于10时在有些样品中都能有较好的分离效果。）；4、固定相能实现足够高的保留（一般保留率要高于50％）。前两点是对所有逆流色谱都适用的，而后两点对高速逆流色谱（HSCCC）特别重要。HSCCC溶剂体系选择的方法主要有三种：参考前人体系、高效液相色谱法（HPLC）、薄层色谱法。
HPLC法检测K值原理：用HPLC分别检测已溶解样品的上、下相溶液，将上相的峰面积记为AU，下相的峰面积记为AL，则K=AU/AL。
本发明中用高速逆流色谱分离石油醚部位浸膏的溶剂体系的确定过程如下：
初步确定选用正己烷:乙酸乙酯:甲醇:水体积比（V/V）=(0.5~1.5):(1~2):(1~2):(0.5~1.5)，以正己烷:乙酸乙酯:甲醇:水（V/V）=1:1.5:1.5:1为例的溶剂体系对石油醚部位浸膏（简称样品I）进行高速逆流色谱分离，先对样品I在该溶剂体系中的分配系数（K值）进行测试，其步骤如下：
1、配制溶剂体系10ml，振摇后静置分层30min，得上、下相溶液；
2、称取样品I0.4mg于具塞试管中；
3、用移液枪分别量取上相溶液2ml、下相溶液2ml都放入步骤2所述的加样试管中，将塞子塞好后，振摇10次使样品I与上、下相溶液混匀后静置分层；
4、HPLC检测样品I的K值：将分层所得的上下相分离并分别过滤后，于不同的离心管中保存，上、下相的HPLC进样量分别为10ul。
检测结果为K（上相/下相）=3.19。
一般K值的最佳范围为0.5-2，实践经验发现，K值大于2小于10，固定相有合适的保留值时，也能有较好的分离效果。以该体系的上相为流动相，下相为固定相，将固定相与流动相泵进逆流色谱主机并用压缩洁净空气排出主机内液体后测得固定相保留值为：65.4％~73.0％。根据检测结果，可采用该溶剂体系，进行分离样品。
本发明中用高速逆流色谱分离乙酸乙酯部位浸膏的粗提物的溶剂体系的确定过程如下：
初步确定选用正己烷:乙酸乙酯:甲醇:水体积比（V/V）=（0.5~1.5）:（0.5~1.5）:（0.5~1.5）:（0.5~1.5），以正己烷:乙酸乙酯:甲醇:水（V/V）=1:1:1:1为例的溶剂体系对乙酸乙酯部位浸膏的粗提物（简称样品II）进行高速逆流色谱分离，先对样品II在该溶剂体系中的分配系数（K值）进行测试，其步骤如下：
1、配制溶剂体系10ml，振摇后静置分层30min，得上、下相溶液；
2、称取样品II0.4mg于具塞试管中；
3、用移液枪分别量取上相溶液2ml、下相溶液2ml都放入步骤2所述的试管中，将塞子塞好后，振摇10次使样品II与上、下相溶液混匀后静置分层；
4、HPLC检测K值：将分层所得的上下相分离并分别过滤后，于不同的离心管中保存，上、下相的HPLC进样量分别为10ul。
检测结果为K（上相/下相）=1.59，以该体系的上相为固定相，下相为流动相，将固定相与流动相泵进逆流色谱主机并用压缩洁净空气排出主机内液体后测得固定相保留值为：72.0％~75.9％。根据检测结果，可采用该溶剂体系，进行分离样品。
一种利用高速逆流色谱分离的白木香叶片中活性成分的抗癌药物应用，其特征在于所述的活性成分B对人肝癌细胞株HepG2具有良好的抑制活性，所述的活性成分C对人肝癌细胞株HepG2具有中等的抑制活性。
与现有技术相比本发明有以下优点：
本发明相对于传统的固—液柱色谱技术，高速逆流色谱具有适用范围广、操作灵活、高效、快速、环保、制备量大、费用低等优点，减少使用溶剂80％以上，分离时间缩短10倍以上，得率提高50％以上，分离出的活性成分损失少，纯度高，稳定，易于应用。
【附图说明】
图1为分离活性成分A“7，4’-二甲氧基-5-羟基黄酮”的HSCCC图谱；
图2为分离活性成分B“3，5，7，3’，4’-五羟基-黄酮”和活性成分C“，5，7，4’-四羟基-黄酮”的HSCCC图谱；
图3为HPLC检测活性成分A纯度的图谱；
图4为HPLC检测活性成分B纯度的图谱；
图5为HPLC检测活性成分C纯度的图谱。
【具体实施方式】
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细描述：
采用原产于中山市三乡镇的白木香（土沉香）叶片为实验材料，用60-80％丙酮水溶液（V/V）或75-95％乙醇水溶液（V/V）为渗漉溶剂以2-3ml/min的流速在常温下渗漉法提取干燥粉碎后的白木香叶片得提取液，减压浓缩提取液得到白木香叶片提取液浸膏，再依次用石油醚、乙酸乙酯对白木香叶片提取液浸膏各萃取3-4次，用量按照浸膏:萃取溶剂体积比=1:1，分别将石油醚萃取液和乙酸乙酯萃取液减压浓缩后得到石油醚部位浸膏和乙酸乙酯部位浸膏；
再分别对石油醚部位浸膏和乙酸乙酯部位浸膏用高速逆流色谱进行进一步提纯。
石油醚部位浸膏用高速逆流色谱分离以正己烷:乙酸乙酯:甲醇:水（V/V）=（0.5~1.5）:（1~2）:（1~2）:（0.5~1.5）为溶剂体系，上相为流动相，下相为固定相，分离得到活性成分A：7，4’-二甲氧基-5-羟基黄酮。
乙酸乙酯部位浸膏用高速逆流色谱分离可以先以正己烷:乙酸乙酯:甲醇:水（V/V）=（0.5~1.5）:（1~2）:（1~2）:（0.5~1.5）为溶剂体系，上相为流动相，下相为固定相，进样后40-66min收集活性成分A：7，4’-二甲氧基-5-羟基黄酮；再用硅胶柱层析粗分离，合并主点相同的馏分后，确定含有目标成分的馏分为粗提物，最后对该粗提物进行高速逆流色谱分离，以正己烷:乙酸乙酯:甲醇:水（V/V）=（0.5~1.5）:（0.5~1.5）:（0.5~1.5）:（0.5~1.5）为溶剂体系，其中上相为固定相，下相为流动相；分离得到活性成分B：3，5，7，3’，4’-五羟基-黄酮和活性成分C：3，5，7，4’-四羟基-黄酮。
本发明中分离提纯所用高速逆流色谱仪器型号为：EMC-500A（北京艾美林科技有限公司），检测器为：HD-2000型紫外检测仪（上海嘉鹏科技有限公司）；
本发明中检测纯度所用高效液相色谱仪的型号为：岛津LC-10Avp，紫外检测器为：SPD-10Avp，色谱柱型号：Welch XB-C18柱（4.6*250mm，5μm），检测活性成分A的流动相体系为：乙腈：水：乙酸（V/V/V）=60：40：2，检测活性成分B和活性成分C的流动相体系为：乙腈：4％（v％）乙酸水（V/V）=55：45。
实施例1：
石油醚部位浸膏（样品I）分离出活性成分A：
1、配制1000mL的正己烷:乙酸乙酯:甲醇:水（V/V）=1:1.5:1.5:1溶剂体系，充分振摇混匀后静置分层得上、下相溶液，而后将上、下相分开并超声脱气30min后待用；
2、上相溶液作为流动相，下相溶液为固定相，开启进样泵将固定相在设备的最大流速下泵入并充满逆流色谱柱，然后开启高速逆流色谱主机和检测器、色谱工作站，在转速815rpm，流速1.0ml/min的条件下泵入流动相；
3、取50.0mg样品I于试管中溶于20ml下相至完全溶解；
4、待流动相在色谱工作站的曲线稳定后，停泵，把进样滤头放入步骤3中装有样品I的试管中，以1.0ml/min的流速把样品I泵进逆流色谱管道，样品I进完后继续以1.0ml/min的流速泵进流动相，进样后40-66min用试管收集样品I馏分，其HSCCC图谱如图1所示，经结构鉴定为7，4’-二甲氧基-5-羟基黄酮。
其中高速逆流色谱主机顺时针转动，固定相保留值为73％，检测波长为254nm；分离温度为17~23℃。
该化合物的状态及质谱、核磁共振谱数据如下：
黄色针状结晶。
ESI-MS m/z:299[M＋H]+
1H NMR(300MHz CDCl3)δ:6.53(1H，s，H-3)，6.33(1H，d，J=3.0Hz，H-6)，6.44(1H，d，J=3.0Hz，H-8)，6.99(2H，dd，J=9.0Hz，J=3.0Hz，H-3’，5’)，7.81(2H，dd，J=9.0Hz，J=3.0Hz，H-2’，6’)，12.79(1H，s，5-OH)，3.86(3H，s，-OCH3)，3.85(3H，s，-OCH3)。
13C NMR(300MHz CDCl3)δ:164.2(C-2)，104.5(C-3)，182.6(C-4)，162.8(C-5)，98.2(C-6)，165.6(C-7)，92.8(C-8)，157.9(C-9)，105.7(C-10)，123.7(C-1’)，128.2(C-2’)，114.7(C-3’)，162.3(C-4’)，114.7(C-5’)，128.2(C-6’)，55.9(-OCH3)，55.7(-OCH3)。
与王红刚等[沉香叶抗肿瘤活性化学成分研究[J].林产化学与工业.2008，28(2)：1-5]报道的洋芹素-7，4’-二甲醚基本一致，故确定为7，4’-二甲氧基-5-羟基黄酮（洋芹素-7，4’-二甲醚）。
取图1中主峰顶馏份进行HPLC检测纯度，检测结果图谱如图3所示，经面积归一化法计算可知分离的活性成分A的纯度。
乙酸乙酯浸膏用硅胶柱层析粗分离出含有目标成分的粗提物，再对该粗提物（样品II）进行高速逆流色谱分离：
1、配制1000mL溶剂体系正己烷:乙酸乙酯:甲醇:水（V/V）=1:1:
2、上相溶液为固定相，下相溶液为流动相，开启进样泵将固定相在设备的最大流速下泵入并充满逆流色谱柱，然后开启高速逆流色谱主机和检测器、色谱工作站，在转速815rpm，流速1.0ml/min的条件下泵入流动相；
3、取50.0mg样品II于试管中溶于20ml下相至完全溶解；
4、待流动相在色谱工作站的曲线稳定后，停泵，把进样滤头放入步骤3中装有样品II的试管中，以1.0ml/min的流速把样品II泵进逆流色谱管道。样品II进完后继续以1.0ml/min的流速泵进流动相，进样后52-72min用试管接收馏分I，90-120min用试管接收馏分II，其HSCCC图谱如图2所示，经结构鉴定图2中的第2峰收集的馏分I为3，5，7，3’，4’-五羟基-黄酮（槲皮素），第3峰收集的馏分II为3，5，7，4’-四羟基-黄酮（山萘酚）。
其中高速逆流色谱主机顺时针转动，固定相保留值为69％，检测波长为254nm；分离温度为17~23℃。
馏分I化合物3，5，7，3’，4’-五羟基-黄酮的状态及质谱、核磁数据如下：
黄色粉末。ESI-MS m/z:303[M＋H]+
1H NMR(300MHz，Acetone)δ:7.79(1H，d，J=3.0Hz，H-2’)，7.67(1H，dd，J=3.0，3.0Hz，H-6’)，6.99(1H，d，J=9.0Hz，H-3’)，6.51(2H，d，J=3.0Hz，H-8)，6.25(1H，d，J=3.0Hz，H-6)；
13C NMR(300MHz，Acetone)δ:148.1(C-2)，137.7(C-3)，177.2(C-4)，161.8(C-5)，98.8(C-6)，164.8(C-7)，94.2(C-8)，157.5(C-9)，103.8(C-10)，123.4(C-1’)，115.4(C-2’)，145.6(C-3’)，146.7(C-4’)，115.9(C-5’)，121.2(C-6’)。
以上数据与龚婧如等[刺五加的化学成分研究.中草药，2012，43(12):2337-2341]报道的槲皮素基本一致，故鉴定该化合物为3，5，7，3’，4’-五羟基-黄酮(槲皮素)。
馏分II化合物3，5，7，4’-四羟基-黄酮的状态及质谱、核磁数据如下：
黄色粉末；
ESI-MS m/z:287[M＋H]+
1H NMR(300MHz，Acetone)δ:8.12(2H，d，J=9.0Hz，H-2’，6’)，7.00(2H，d，J=9.0Hz，H-3’，5’)，6.52(1H，d，J=3.0Hz，H-8)，6.25(2H，d，J=3.0Hz，H-6)；
13C NMR(300MHz，Acetone)δ:176.3(C-4)，164.8(C-7)，161.8(C-5)，160.0(C-4’)，157.5(C-9)，146.8(C-2)，136.3(C-3)，130.2(C-2’，6’)，123.0(C-1’)，116.0(C-3’，5’)，103.8(C-10)，98.8(C-6)，94.2(C-8)。
以上数据与龚婧如等[刺五加的化学成分研究.中草药，2012，43(12):2337-2341]报道的山萘酚基本一致，故鉴定该化合物为3，5，7，4’-四羟基-黄酮（山萘酚）。
分别取图2中第峰2和峰3峰顶馏分进行HPLC检测纯度，峰2峰顶馏分（即活性成分B）检测结果的图谱如图4所示，经面积归一化法计算可知分离的活性成分B的纯度，峰3峰顶馏分（即活性成分C）检测结果的图谱如图5所示，经面积归一化法计算可知分离的活性成分C的纯度。
实施例1的纯度与得率结果如表1所示：
表1：
| 实施例1 | 活性成分A | 活性成分B | 活性成分C |
| 纯度（％） | 98.31 | 99.40 | 98.57 |
| 得率（％） | 25.32 | 27.79 | 9.18 |
实施例2：
以乙酸乙酯部位浸膏为逆流色谱分离原料分离出活性成分A和B、C，先以正己烷:乙酸乙酯:甲醇:水（V/V）=1.5:2:2:1.5为溶剂体系按实施例1中石油醚浸膏的分离方法分离出活性成分A，再用硅胶柱层析粗分离乙酸乙酯浸膏得到含有目标成分的粗提物，最后以正己烷:乙酸乙酯:甲醇:水（V/V）=0.5:1:1:0.5为溶剂体系分离出活性成分B、C。
其中高速逆流色谱分离活性成分A的参数为：
高速逆流色谱主机顺时针转动，转速为900rpm；样品量60.0mg，固定相保留值为：73.0％，流动相的流速为1.2ml/min；检测波长为254nm；分离温度为17~23℃；
其中高速逆流色谱分离活性成分B和C的参数为：
高速逆流色谱主机顺时针转动，转速为900rpm；样品量60.0mg，固定相保留值为75.9％，流动相的流速为1.2ml/min；检测波长为254nm；分离温度为17~23℃。
实施例2的活性成分A、B和C的鉴定结果同实施例1的相同。实施例2的活性成分A、B和C的纯度检测方法同实施例1的相同，实施例2的纯度与得率结果如表2所示：
表2：
| 实施例2 | 活性成分A | 活性成分B | 活性成分C |
| 纯度（％） | 98.03 | 98.37 | 98.46 |
| 得率（％） | 22.01 | 25.83 | 9.04 |
实施例3：
先对石油醚浸膏与乙酸乙酯浸膏分别用高速逆流色谱分离出活性成分A，其参数为：
高速逆流色谱主机顺时针转动，转速为750rpm；样品量40.0mg，固定相保留值为：65.4％，流动相的流速为0.8ml/min；检测波长为254nm；分离温度为17~23℃；
再将乙酸乙酯浸膏用硅胶柱层析粗分离，保留含有目标成分的馏分作为粗提物，最后对该粗提物进行高速逆流色谱分离，得到活性成分B和活性成分C。其中高速逆流色谱的分离参数为：
高速逆流色谱主机顺时针转动，转速为750rpm；样品量40.0mg，固定相保留值为：72％，流动相的流速为0.8ml/min；检测波长为254nm；分离温度为17~23℃；
实施例3的活性成分A、B和C的鉴定结果同实施例1的相同。实施例3的活性成分A、B和C的纯度检测方法同实施例1的相同，实施例3的纯度与得率结果如表3所示：
表3：
由实施例结果可知，本发明比传统色谱提取方法减少使用溶剂80％以上，减少了环境污染，分离时间缩短10倍以上，得率提高50％以上。
本发明分离得到的活性单体化合物属于黄酮类。用噻唑蓝（MTT）比色法测定三个化合物的体外细胞毒活性。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。
用噻唑蓝（MTT）比色法测定样品的体外细胞毒活性，实验结果表明活性成分B对人肝癌细胞株HepG2具有良好的抑制活性，其半数抑制浓度（IC50）为12.54μM（3.93μg/mL）；活性成分C对人肝癌细胞株HepG2具有中等的抑制活性，其半数抑制浓度（IC50）为38.63μM（11.05μg/mL）。活性成分A对人肝癌细胞株HepG2抑制活性差，其半数抑制浓度（IC50）>50。
活性成分A据报道广泛存在于白木香的叶片、树干、果实、花等植物体各部位中，路晶晶等[白木香叶中黄酮类成分结构与抗氧化功能的相关性研究，中国天然药物，2008，6(6):456-460]报道其具有明显的清除自由基活性（抗氧化活性）。
Claims (10)
1.一种利用高速逆流色谱分离白木香叶片中活性成分的方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）常温下用渗漉溶剂以渗漉法提取干燥粉碎后的白木香叶片得提取液，减压浓缩提取液后得到白木香叶片提取液浸膏；
（2）依次用石油醚、乙酸乙酯对白木香叶片提取液浸膏各萃取3-4次，分别将石油醚萃取液和乙酸乙酯萃取液减压浓缩，得到石油醚部位浸膏和乙酸乙酯部位浸膏；
（3）将石油醚部位浸膏和乙酸乙酯部位浸膏分别用高速逆流色谱法分离得到活性成分A：7，4’-二甲氧基-5-羟基黄酮；
（4）将乙酸乙酯部位浸膏用硅胶柱层析粗分离出含有目标成分的粗提物后，再将所述的粗提物用高速逆流色谱分离得到活性成分B：3，5，7，3’，4’-五羟基-黄酮和活性成分C：3，5，7，4’-四羟基-黄酮。
2.根据权利要求1所述的一种利用高速逆流色谱分离白木香叶片中活性成分的方法，其特征在于所述的渗漉法所用的渗漉溶剂为60-80％体积浓度的丙酮水溶液或者75-95％体积浓度的乙醇水溶液，所述的渗漉溶剂的流速为2-3ml/min。
3.根据权利要求1所述的一种利用高速逆流色谱分离白木香叶片中活性成分的方法，其特征在于所述的步骤（2）中石油醚和乙酸乙酯作为萃取剂的用量按照浸膏:萃取溶剂体积比=1:1。
4.根据权利要求1所述的一种利用高速逆流色谱分离白木香叶片中活性成分的方法，其特征在于所述的石油醚部位浸膏或乙酸乙酯部位浸膏用高速逆流色谱分离得到活性成分A的参数包括：
溶剂体系为正己烷:乙酸乙酯:甲醇:水体积比=（0.5~1.5）:（1~2）:（1~2）:（0.5~1.5），其中上相为流动相，下相为固定相；
高速逆流色谱主机顺时针转动，转速为750~900rpm；样品量40.0~60.0mg，固定相保留值为：65.4％~73.0％，流动相的流速为0.8~1.2ml/min；检测波长为254nm；分离温度为17~23℃；
进样后40-66min收集活性成分A。
5.根据权利要求1所述的一种利用高速逆流色谱分离白木香叶片中活性成分的方法，其特征在于所述乙酸乙酯部位浸膏用硅胶柱层析粗分离得到含有目标成分的粗提物包括以下步骤：
用硅胶柱层析粗分离，先按以下体积比、顺序的石油醚-乙酸乙酯体系进行梯度洗脱：5:1→3:1→2:1→1:1→0:1，再按以下体积比、顺序的乙酸乙酯-甲醇体系进行梯度洗脱：20:1→10:1→5:1→1:1，每500ml接收为1个馏分至减压浓缩已无浸膏即更换下一梯度的洗脱剂，全部梯度的洗脱剂洗脱完成后合并薄层色谱主点相同的馏分后，对合并的各馏分进行检测确定含有活性成分B和C的馏分为含有目标成分的粗提物。
6.根据权利要求1所述的一种利用高速逆流色谱分离白木香叶片中活性成分的方法，其特征在于所述的含有目标成分的粗提物用高速逆流色谱法分离得到活性成分B和活性成分C的参数包括：
溶剂体系为正己烷:乙酸乙酯:甲醇:水体积比=（0.5~1.5）:（0.5~1.5）:（0.5~1.5）:（0.5~1.5），其中上相为固定相，下相为流动相；
高速逆流色谱主机顺时针转动，转速为750~900rpm；样品量40.0~60.0mg，固定相保留值为：72.0％~75.9％，流动相的流速为0.8~1.2ml/min；检测波长为254nm；分离温度为17~23℃。
进样后52-72min收集活性成分B，90-120min收集活性成分C。
7.根据权利要求1或4所述的一种利用高速逆流色谱分离白木香叶片中活性成分的方法，其特征在于所述的活性成分A又称为洋芹素-7，4’-二甲醚，其结构示为：
8.根据权利要求1或6所述的一种利用高速逆流色谱分离白木香叶片中活性成分的方法，其特征在于所述的活性成分B又称为槲皮素，其结构示为：
9.根据权利要求1或6所述的一种利用高速逆流色谱分离白木香叶片中活性成分的方法，其特征在于所述的活性成分C又称为山萘酚，其结构示为：
10.一种权利要求1或6所述的利用高速逆流色谱分离白木香叶片中活性成分的抗癌药物应用，其特征在于所述的活性成分B对人肝癌细胞株HepG2具有良好的抑制活性，所述的活性成分C对人肝癌细胞株HepG2具有中等的抑制活性。
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Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104644880A (zh) * | 2014-12-31 | 2015-05-27 | 海南省农业科学院农产品加工设计研究所 | 一种沉香叶中黄酮的提取方法 |
| CN106831892A (zh) * | 2017-03-20 | 2017-06-13 | 山东省分析测试中心 | 一种山楂叶中黄酮单体的制备方法 |
| CN109045154A (zh) * | 2018-09-21 | 2018-12-21 | 珠海霍普金斯医药研究院股份有限公司 | 一种具有抗肿瘤作用的野生白木香叶提取物及其在制备功能饮料或保健食品中的应用 |
| CN109303333A (zh) * | 2018-09-12 | 2019-02-05 | 珠海霍普金斯医药研究院股份有限公司 | 一种改善睡眠的保健品组合物 |
| CN109528810A (zh) * | 2018-12-25 | 2019-03-29 | 珠海希望基因医药研究院有限公司 | 一种利用高速逆流色谱技术制备具有抗肿瘤作用的中药提取物的方法 |
| CN109776474A (zh) * | 2019-03-27 | 2019-05-21 | 淮阴师范学院 | 一种从野马追中分离纯化黄酮类化合物的方法 |
| CN109846921A (zh) * | 2018-12-25 | 2019-06-07 | 珠海希望基因医药研究院有限公司 | 一种利用高速逆流色谱技术制备具有抗病毒作用的中药提取物的方法 |
| CN113262258A (zh) * | 2021-06-30 | 2021-08-17 | 中国科学院昆明植物研究所 | 白木香花提取物及其药物与其制备方法和其应用 |
| CN115060813A (zh) * | 2022-05-24 | 2022-09-16 | 台州科技职业学院 | 一种筛选与纯化柑橘皮抗氧化活性成分的方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102070594A (zh) * | 2009-11-24 | 2011-05-25 | 上海中药制药技术有限公司 | 高纯度沉香四醇和4＇-甲氧基沉香四醇的分离制备方法 |
| CN102133255A (zh) * | 2011-03-08 | 2011-07-27 | 暨南大学 | 一种抗肿瘤的鬼臼类中药提取物及其制备方法与应用 |
| CN102349943A (zh) * | 2008-10-09 | 2012-02-15 | 丹东药业集团有限公司 | 核桃楸皮提取物及其制备方法 |
| CN102477023A (zh) * | 2010-11-30 | 2012-05-30 | 上海中药制药技术有限公司 | 高纯度5-羟基-3，7，4′-三甲氧基黄酮的制备方法 |
-
2013
- 2013-02-27 CN CN201310062910.8A patent/CN103145677B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102349943A (zh) * | 2008-10-09 | 2012-02-15 | 丹东药业集团有限公司 | 核桃楸皮提取物及其制备方法 |
| CN102070594A (zh) * | 2009-11-24 | 2011-05-25 | 上海中药制药技术有限公司 | 高纯度沉香四醇和4＇-甲氧基沉香四醇的分离制备方法 |
| CN102477023A (zh) * | 2010-11-30 | 2012-05-30 | 上海中药制药技术有限公司 | 高纯度5-羟基-3，7，4′-三甲氧基黄酮的制备方法 |
| CN102133255A (zh) * | 2011-03-08 | 2011-07-27 | 暨南大学 | 一种抗肿瘤的鬼臼类中药提取物及其制备方法与应用 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| 卢创新等: "槲皮素抑制肝癌HepG2 细胞的増值及促凋亡机制的研究", 《中华实用诊断与治疗杂志》, vol. 26, no. 8, 31 August 2012 (2012-08-31), pages 760 - 762 * |
| 宫静静等: "高速逆流色谱技术在中药及天然产物领域中的应用", 《中国现代中药》, vol. 9, no. 1, 31 January 2007 (2007-01-31), pages 33 - 35 * |
| 杨懋勋等: "国产沉香化学成分提取分离技术研究进展", 《广东化工》, vol. 39, no. 6, 31 December 2012 (2012-12-31), pages 139 - 140 * |
| 王红刚等: "沉香叶抗肿瘤活性化学成分研究", 《林产化学与工业》, vol. 28, no. 2, 30 April 2008 (2008-04-30), pages 1 - 5 * |
Cited By (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104644880A (zh) * | 2014-12-31 | 2015-05-27 | 海南省农业科学院农产品加工设计研究所 | 一种沉香叶中黄酮的提取方法 |
| CN106831892A (zh) * | 2017-03-20 | 2017-06-13 | 山东省分析测试中心 | 一种山楂叶中黄酮单体的制备方法 |
| CN106831892B (zh) * | 2017-03-20 | 2020-05-15 | 山东省分析测试中心 | 一种山楂叶中黄酮单体的制备方法 |
| CN109303333A (zh) * | 2018-09-12 | 2019-02-05 | 珠海霍普金斯医药研究院股份有限公司 | 一种改善睡眠的保健品组合物 |
| CN109045154A (zh) * | 2018-09-21 | 2018-12-21 | 珠海霍普金斯医药研究院股份有限公司 | 一种具有抗肿瘤作用的野生白木香叶提取物及其在制备功能饮料或保健食品中的应用 |
| CN109528810A (zh) * | 2018-12-25 | 2019-03-29 | 珠海希望基因医药研究院有限公司 | 一种利用高速逆流色谱技术制备具有抗肿瘤作用的中药提取物的方法 |
| CN109846921A (zh) * | 2018-12-25 | 2019-06-07 | 珠海希望基因医药研究院有限公司 | 一种利用高速逆流色谱技术制备具有抗病毒作用的中药提取物的方法 |
| CN109528810B (zh) * | 2018-12-25 | 2021-08-06 | 珠海希望基因医药研究院有限公司 | 一种利用高速逆流色谱技术制备具有抗肿瘤作用的中药提取物的方法 |
| CN109846921B (zh) * | 2018-12-25 | 2021-10-22 | 珠海希望基因医药研究院有限公司 | 一种利用高速逆流色谱技术制备具有抗病毒作用的中药提取物的方法 |
| CN109776474A (zh) * | 2019-03-27 | 2019-05-21 | 淮阴师范学院 | 一种从野马追中分离纯化黄酮类化合物的方法 |
| CN113262258A (zh) * | 2021-06-30 | 2021-08-17 | 中国科学院昆明植物研究所 | 白木香花提取物及其药物与其制备方法和其应用 |
| CN115060813A (zh) * | 2022-05-24 | 2022-09-16 | 台州科技职业学院 | 一种筛选与纯化柑橘皮抗氧化活性成分的方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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